JP4515266B2 - Novel proteins derived from mammals that negatively regulate cell surface expression of antigen presentation-related molecules such as B7-2 molecules or MHC class II molecules and use thereof - Google Patents

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Description

本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものである。  The present invention relates to a novel mammal-derived protein that negatively regulates the expression on the cell surface of antigen presentation-related molecules such as B7-2 molecules or MHC class II molecules, and uses thereof.

ウイルスは、ヒトに感染し、巧みに免疫学的排除を回避し、持続感染、潜伏感染する。この現象は、ヘルペスウイルスや肝炎ウイルスにてよく認められるが、最近になって、（１）ウイルスの発現する蛋白が、免疫認識に重要な抗原提示関連分子（ＭＨＣ等）の細胞表面における発現を抑制し、（２）これにより、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）によるウイルス認識を逃れ、ウイルスが免疫学的排除を回避し得ることが分かってきた（例えば、文献１：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０００ Ｓｅｐ：１３（３）：３６５−３７４および文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００ Ｊｕｎ：７４（１１）：５３００−５３０９参照）。
より具体的には、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＫ３，Ｋ５蛋白（それぞれ「ＭＩＲ１」「ＭＩＲ２」ともいう）、およびマウスγヘルペスウイルス−６８（ＭＨＶ−６８）のＫ３蛋白といったウイルス蛋白は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能し、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面における発現を負に制御することが分かってきた。これらのウイルス蛋白は、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインと呼ばれるリガーゼ活性の触媒部位を共通に有し、このドメインを介してＭＨＣクラスＩ分子をユビキチン化する。このユビキチン化は、ＭＨＣクラスＩ分子の迅速なエンドサイトーシスと分解を誘導する。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスは、このようなＫ３，Ｋ５蛋白の作用（免疫抑制作用）によってＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面における発現を抑制し、免疫学的排除を巧みに回避する。
上記のように、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白による免疫抑制機構を有しているが、本発明者は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白の機能解析を進めるうち、これらウイルス蛋白をコードする遺伝子は哺乳類ゲノムに由来し、これらウイルス蛋白の機能類似分子をコードする遺伝子が哺乳類ゲノム、特にヒトゲノムにも存在しているのではないかと考えた。
そして、もしそのような免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等を見出すことができれば、ヒトの免疫調節機構の解明に役立つばかりでなく、例えば免疫抑制を効率良く人為的に行う方法の開発などにも利用でき、さらにこの方法は、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療などに応用可能であると考えた。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白の機能類似分子である、免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等の哺乳類由来の新規タンパク質を見出し、その利用方法を提供することにある。Viruses infect humans, skillfully avoiding immunological exclusion, persistent infections, and latent infections. This phenomenon is often observed in herpes virus and hepatitis virus. Recently, (1) the protein expressed by the virus shows the expression on the cell surface of antigen presentation related molecules (MHC, etc.) important for immune recognition. (2) It has been found that this can escape viral recognition by cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer cells (NK), and the virus can avoid immunological exclusion (eg, literature) 1: Immunity, 2000 Sep: 13 (3): 365-374 and Reference 2: Journal of Virology, 2000 Jun: 74 (11): 5300-5309).
More specifically, viral proteins such as the K3 and K5 proteins of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) (also referred to as “MIR1” and “MIR2”, respectively) and the K3 protein of mouse γ herpesvirus-68 (MHV-68) are: It has been found that it functions as an E3 ubiquitin ligase and negatively regulates cell surface expression of MHC class I molecules. These viral proteins have in common a catalytic site for ligase activity called BKS-PHD / LAP zinc finger domain, and ubiquitinate MHC class I molecules through this domain. This ubiquitination induces rapid endocytosis and degradation of MHC class I molecules. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus suppresses the expression of MHC class I molecules on the cell surface by such an action (immunosuppressive action) of the K3 and K5 proteins, and skillfully avoids immunological exclusion.
As described above, Kaposi's sarcoma-related herpesviruses and the like have an immunosuppressive mechanism using viral proteins such as the K3 and K5 proteins. The genes encoding viral proteins were derived from the mammalian genome, and it was thought that genes encoding functionally similar molecules of these viral proteins may also exist in the mammalian genome, particularly the human genome.
And if human homologs with such immunosuppressive function can be found, it will not only help elucidate the mechanism of human immune regulation, but also, for example, to develop methods for efficiently and artificially suppressing immunosuppression In addition, this method was considered to be applicable to the suppression of rejection during cell and organ transplantation and the treatment of autoimmune diseases.
The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to find a novel protein derived from mammals such as a human homolog having an immunosuppressive function, which is a functionally similar molecule of a viral protein such as the K3 and K5 proteins. It is to provide the usage method.

本発明者は、上記の課題に鑑み、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログをヒトゲノムにて探索した結果、ヒトホモログとして複数の遺伝子・タンパク質を同定した。さらに詳細な機能解析を進めた結果、複数のタンパク質に免疫認識に重要な抗原提示関連分子（Ｂ７−２共刺激分子やＭＨＣクラスＩＩ分子）の細胞表面における発現を抑制する免疫抑制作用が認められ、機能上も上記Ｋ３，Ｋ５蛋白と類似すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｐ）の発明を含むものである。
Ａ） 以下の（ａ）又は（ｂ）記載の哺乳類由来のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｂ） 上記Ａ）のタンパク質であって、抗原提示関連分子であるＢ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｃ） 上記Ｂ）のタンパク質であって、Ｂ７−２分子をユビキチン化するタンパク質。
Ｄ） 上記Ａ）〜Ｃ）の何れかに記載のタンパク質であって、抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｅ） 上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載のタンパク質であって、ヒト又はマウス由来のＥ３ユビキチンリガーゼであるタンパク質。
Ｆ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質に対する抗体。
Ｇ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
Ｈ） 上記Ｇ）の遺伝子であって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
Ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子。
Ｊ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかの遺伝子を含む組換え発現ベクター。
Ｋ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかのの遺伝子が導入された形質転換体。
Ｌ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかのの遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質、または、上記Ｇ）又はＨ）の遺伝子を含む免疫抑制剤。
Ｎ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法。
Ｏ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質と同様に、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法。
Ｐ） 下記（１）〜（３）の何れかの物質と、下記（４）〜（７）の何れかの物質とを用いることを特徴とする上記Ｍ）又はＮ）記載のスクリーニング方法。
（１） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質
（２） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記▲１▼のタンパク質または上記▲２▼の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記（６）の部分タンパク質の改変体
Ｑ） 上記Ｎ）〜Ｐ）の何れかに記載のスクリーニング方法を用いて得られた免疫疾患治療薬。
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものであり、前述したとおり、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自已免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用できるほか種々の有用性を有するという効果を奏する。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。As a result of searching for human homologues of the K3 and K5 proteins in the human genome, the present inventor has identified a plurality of genes / proteins as human homologues. As a result of further detailed functional analysis, immunosuppressive action that suppresses the expression on the cell surface of antigen presentation-related molecules (B7-2 costimulatory molecules and MHC class II molecules) important for immune recognition is recognized in multiple proteins. As a result, the present inventors have found that it is similar in function to the K3 and K5 proteins, and completed the present invention.
That is, the present invention includes the following A) to P) as medically or industrially useful methods and substances.
A) A protein derived from a mammal according to the following (a) or (b).
(A) A protein consisting of any amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16.
(B) In any amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. And a protein that negatively regulates the expression of antigen-presenting molecules on the cell surface.
B) The protein of A) above, which negatively regulates the expression on the cell surface of the B7-2 molecule that is an antigen presentation related molecule.
C) The protein of B) above, which ubiquitinates the B7-2 molecule.
D) The protein according to any one of the above A) to C), which negatively controls the expression on the cell surface of an MHC class II molecule that is an antigen presentation related molecule.
E) The protein according to any one of A) to D) above, which is a human or mouse-derived E3 ubiquitin ligase.
F) An antibody against the protein according to any one of A) to E) above.
G) A gene encoding the protein according to any one of A) to E) above.
H) The gene of G) above, which has any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 as an open reading frame region.
I) hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15, and A gene that encodes a protein that negatively regulates the expression of antigen-presenting molecules on the cell surface.
J) A recombinant expression vector comprising the gene of any one of G) to I) above.
K) A transformant into which any of the genes G) to I) is introduced.
L) A gene detection instrument using, as a probe, at least a part of the base sequence in the gene of any one of G) to I) or a complementary sequence thereof.
M) An immunosuppressive agent comprising the protein according to any one of A) to E) above or the gene of G) or H) above.
N) A screening method for a substance that regulates the action of the protein according to any one of A) to E) above.
O) A screening method for a substance having an action of negatively controlling the expression of an antigen-presenting molecule on the cell surface, similar to the protein described in any of A) to E) above.
P) The screening method according to M) or N) above, wherein any one of the following substances (1) to (3) and any one of the following substances (4) to (7) are used.
(1) The protein according to any one of A) to E) (2) The partial protein of the protein according to any one of A) to E), wherein at least the transmembrane protein in the amino acid sequence of the full-length protein Partial protein containing region (3) Protein of (1) above or variant of partial protein of (2) (4) B7-2 molecule or MHC class II molecule (5) B7-2 molecule or MHC class II molecule Variant (6) Partial protein of B7-2 molecule or MHC class II molecule, comprising at least a transmembrane region or an intracellular region in the vicinity thereof in the amino acid sequence of the full-length protein (7) ) Partial protein variants Q) A therapeutic drug for immune diseases obtained using the screening method according to any one of N) to P) above.
The present invention relates to a novel mammal-derived protein that negatively regulates the expression of B7-2 molecule or MHC class II molecule on the cell surface and use thereof, as described above, development of a new immunosuppressive method, cell, It can be used for suppression of rejection during organ transplantation, treatment of autoimmune diseases, development of new drugs, and other usefulness.
Other objects, features, and advantages of the present invention will be fully understood from the following description. The benefits of the present invention will become apparent from the following description with reference to the accompanying drawings.

図１（ａ）は、本発明のタンパク質ｃ−ＭＩＲのアミノ酸配列を示す図であり、図１（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲが抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図２は、ｃ−ＭＩＲを恒常的に発現する細胞を用いて、ｃ−ＭＩＲが抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図３（ａ）〜（ｄ）は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の発現がどのように抑制されるのかその抑制機構を調べるために、Ｂ７−２分子の蛋白合成、分解、移動を検討した結果を示す図である。
図４（ａ）および図４（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子が速やかにエンドサイトーシスされるかどうかを調べた結果を示す図である。
図５は、Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに十分であるかどうかを、キメラ蛋白を用いて調べた結果を示す図である。
図６（ａ）〜（ｃ）は、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つかどうかを調べた結果を示す図である。
図７（ａ）〜（ｃ）は、Ｂ７−２分子のユビキチン化が、ｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかを調べた結果を示す図である。
図８（ａ）〜（ｄ）は、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２分子との分子間相互作用がＢ７−２分子のユビキチン化およびそのダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかを調べた結果を示す図である。
図９は、ｃ−ＭＩＲの分子機構を説明する図である。
図１０は、本発明のタンパク質ＨＳＰＣ２４０のアミノ酸配列を示す図である。
図１１は、ＨＳＰＣ２４０が抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図１２（ａ）・（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の発現抑制が抗原提示機能を抑制する結果を示す図である。FIG. 1 (a) is a view showing the amino acid sequence of the protein c-MIR of the present invention, and FIG. 1 (b) shows whether c-MIR has an action of suppressing the expression of an antigen presentation-related molecule. It is a figure which shows the result investigated by the method.
FIG. 2 is a diagram showing the results of investigating by flow cytometry whether c-MIR has an action of suppressing the expression of antigen presentation-related molecules using cells that constantly express c-MIR.
3 (a) to 3 (d) show the protein synthesis, degradation, and migration of the B7-2 molecule in order to investigate how the expression of the B7-2 molecule is suppressed by c-MIR. It is a figure which shows the result.
FIG. 4 (a) and FIG. 4 (b) are diagrams showing the results of examining whether or not B7-2 molecule is rapidly endocytosed by c-MIR.
FIG. 5 is a diagram showing the results of examining whether the transmembrane region and cytoplasmic region of B7-2 molecule are sufficient for down-regulation of B7-2 molecule via c-MIR, using a chimeric protein. .
FIGS. 6A to 6C are diagrams showing the results of examining whether the BKS-PHD / LAP domain of c-MIR has E3 ubiquitin ligase activity.
FIGS. 7A to 7C are diagrams showing the results of examining whether ubiquitination of B7-2 molecules is essential for downregulation of B7-2 molecules via c-MIR.
8A to 8D are diagrams showing the results of examining whether the intermolecular interaction between c-MIR and B7-2 molecule is essential for ubiquitination of B7-2 molecule and its down-regulation. It is.
FIG. 9 is a diagram for explaining the molecular mechanism of c-MIR.
FIG. 10 shows the amino acid sequence of the protein HSPC240 of the present invention.
FIG. 11 is a diagram showing the results of examining by flow cytometry whether HSPC240 has an action of suppressing the expression of antigen presentation-related molecules.
12 (a) and 12 (b) are diagrams showing the results of suppression of the antigen presentation function by suppressing the expression of MHC class II molecules and B7-2 molecules by c-MIR.

本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
（Ｉ）本発明のタンパク質、及びその遺伝子の構造
本発明者は、前記ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログの存在について調査検討を進めた結果、Ｋ３，Ｋ５蛋白の機能ドメインであるＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフを持ち、二次構造が類似するヒトホモログとして６つの遺伝子・タンパク質を同定した。
配列番号１、３、５、７、９、及び１１には、それぞれ上記６つの遺伝子ｃ−ＭＩＲ、ＨＳＰＣ２４０、４３１７１、ＸＰ−０５５２７６、ＣＡＤ２８５２９、２０４４５の各塩基配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされる各アミノ酸配列と共に示される。また、上記６つの遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の各アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に示される。上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０については、それぞれ図１（ａ）および図１０にもアミノ酸配列が示される。図１（ａ）中、「ＴＭ１」はｃ−ＭＩＲの第１膜貫通領域と、「ＴＭ２」は第２膜貫通領域と判定された領域である。ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフは、第１膜貫通領域よりもアミノ末端側に存在する。上記ＨＳＰＣ２４０については、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフが図１０において下線で示される。
上記ｃ−ＭＩＲについて詳細な解析を進めた結果、後の実施例において詳述するように、その作用・性質について以下の知見が得られた。
（１）ｃ−ＭＩＲは、抗原提示関連分子の１つであるＢ７−２共刺激分子（Ｂ７−２分子）をユビキチン化し、その細胞表面における発現を負に制御する。
（２）Ｂ７−２分子のユビキチン化は、Ｂ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスとライソゾームにおける分解とを引き起こす。つまり、ｃ−ＭＩＲは、Ｂ７−２分子をユビキチン化し、これにより、Ｂ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスと分解とを誘導する。
（３）ｃ−ＭＩＲは、その膜貫通領域を介してＢ７−２分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域に結合する。この結合がＢ７−２分子のユビキチン化に不可欠である。
（４）ｃ−ＭＩＲは、さらに、他の抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現をも負に制御する。
（５）ｃ−ＭＩＲは、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白と同様にＥ３ユビキチンリガーゼとして機能し、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインがリガーゼ活性を持つ触媒部位である。
このように、ｃ−ＭＩＲには、Ｂ７−２分子さらにＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する作用、換言すれば、これら抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。よって、ｃ−ＭＩＲは、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示関連分子の発現を調節する調節因子と考えられる。
また、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子である上記ＨＳＰＣ２４０についても、機能解析の結果、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御する作用、換言すれば、抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。同様に、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子である残り４つの分子についても抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有している可能性が極めて高く、本発明のタンパク質は、抗原提示関連分子の発現を抑制し、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示・免疫認識を調節する調節因子ということができる。
さらに、本発明者は、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログをクローニングする共に、その機能解析を行った。配列番号１３及び１５には、それぞれ上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログの各塩基配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされる各アミノ酸配列と共に示される。また、上記２つの遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の各アミノ酸配列が、配列番号１４及び１６に示される。
上記ｃ−ＭＩＲのマウスホモログについて、Ａ２０細胞にその遺伝子を導入し、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各発現を調べた結果、ＭＨＣクラスＩＩ分子の特異的抑制が認められた。また、上記ＨＳＰＣ２４０のマウスホモログについて、Ａ２０．２Ｊ細胞にその遺伝子を導入し、Ｂ７−２分子、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各発現を調べた結果、Ｂ７−２分子の特異的抑制が認められた。これらの結果より、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログについてもヒト遺伝子と同様に、抗原提示関連分子のうちの何れかの分子の発現を特異的に抑制する機能を持っていると考えられる。
さらに、ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の特異的抑制は、強力に抗原提示機能を抑制することも明らかとなった。それゆえ、ｃ−ＭＩＲは過剰免疫反応を抑制している可能性が示唆される。これらはウイルス免疫回避分子の起源に興味ある視点を与えるものと考えられ、また、これらの生理機能の解明により新たな免疫制御機構が見えてくるものと考えられる。
尚、本発明のタンパク質は、上記８つの分子に限定されるものではなく、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。即ち、本発明のタンパク質には、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質、のみならず、（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質、も含まれる。
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
本発明の遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。
また、本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡ・ＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡ・ＲＮＡは、センス鎖となるコード鎖であっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。また、本発明の遺伝子配列の一部を利用して得られるｓｉＲＮＡも有用である。
さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
さらに、本発明に係る遺伝子は、上記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子に限定されるものではなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
（ＩＩ）本発明のタンパク質、及びその遺伝子の利用方法（有用性）
Ｂ７−２分子は、抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞等）の表面にてＴ細胞への抗原提示を助け、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の免疫シナプス形成のモジュレーターとして機能する。免疫シナプス形成はＴ細胞を活性化させる。また、Ｂ７−２分子によるシグナル伝達は、自己免疫疾患の進行に関係している。
本発明のタンパク質は、上記Ｂ７−２分子などの抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用を有し、ヒト免疫系において免疫認識に重要な抗原提示を調節する調節因子と考えられることから、本発明のタンパク質、及びその遺伝子は、ヒト免疫制御機構の解明に有用なばかりでなく、医学上および産業上種々の利用が可能である。例えば、免疫抑制剤として免疫抑制を効率良く人為的に行う方法の開発などにも利用でき、さらに、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療などに本発明のタンパク質・遺伝子は応用可能である。
また、本発明のタンパク質、及びその遺伝子の哺乳類ホモログは、モデル動物を用いた免疫抑制効果を調べる実験等に有用であり、このような哺乳類ホモログも本発明に含まれる。例えば、マウスなどの小動物を用いて拒絶反応モデルを作製し、免疫抑制効果をｉｎ ｖｉｖｏにて検討する実験等に有用である。実際、本発明者は、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログをクローニングし、その機能解析を行ったところ、前述のとおり、ヒト遺伝子と同様にＢ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を特異的に抑制する機能が認められた。
さらに、本発明のタンパク質、及びその遺伝子は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）のスクリーニングに有用である。例えば、（１）本発明のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法、あるいは、（２）本発明のタンパク質と同様に、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法、等に利用可能である。上記（１）の本発明のタンパク質の作用を調節する物質とは、例えば、本発明のタンパク質と標的分子（Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等）との結合を阻害し、本発明のタンパク質の免疫抑制作用を阻害する物質や、あるいは反対に、本発明のタンパク質の免疫抑制作用を高める物質等が挙げられる。このような物質は、免疫疾患の治療薬や診断薬として利用可能であり、そのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、上記ｃ−ＭＩＲは、その膜貫通領域を介してＢ７−２分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域に結合し、この結合がＢ７−２分子のユビキチン化に不可欠である（後の実施例参照）ことから、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ）において、下記（１）〜（３）のいずれかの物質と下記（４）〜（７）のいずれかの物質とを発現させ、両分子の結合を阻害する分子等を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法などが挙げられる。
（１） 上記ｃ−ＭＩＲなどの本発明のタンパク質
（２） 本発明のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記（１）のタンパク質または上記（２）の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記▲６▼の部分タンパク質の改変体
上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓやＭｙｃ等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）ｃ−ＭＩＲ等の本発明のタンパク質の膜貫通領域や、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降−免疫ブロット法を用いてｃ−ＭＩＲとＢ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト以外のタンパク質、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
（ＩＩＩ）本発明の組換え発現ベクター等
本発明の組換え発現ベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものであり、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明の形質転換体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ｃ−ＭＩＲやそのホモログの更なる機能解析、これらのタンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明の遺伝子検出器具は、本発明の上記遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いている。遺伝子検出器具は、種々の条件下での本発明の遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用できる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明の抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の検出・測定などに利用でき、その他、診断用・治療用などに利用できる可能性がある。
（ＩＶ）本発明に係る遺伝子、タンパク質等の取得方法
〔ＩＶ−１：遺伝子の取得方法〕
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
例えば、上記各ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒト又はマウスのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、ヒトｃ−ＭＩＲおよびその類似分子の間で良好に保存されている領域（例えば、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメイン）の中から選択し、ヒトやマウス、その他の生物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ｃ−ＭＩＲと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト又はマウスのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
〔ＩＶ−２：タンパク質の取得方法〕
本発明に係るタンパク質の取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上記各ｃＤＮＡ配列を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上記各ｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ ストラタジーン社製）を利用してもよい。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られており、一方、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、後の実施例において作製した変異タンパク質ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ（ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー領域に変異を導入したタンパク質）は、標的分子をユビキチン化することができなかった。
〔ＩＶ−３：遺伝子検出器具〕
遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものである。例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができ、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）などを挙げることができる。
尚、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
〔ＩＶ−４：組換え発現ベクター及び形質転換体〕
組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
〔ＩＶ−５：抗体〕
抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
以下、本発明のタンパク質であるｃ−ＭＩＲ、さらにＨＳＰＣ２４０について行った機能解析の結果について、図面を参照しながら説明する。
〔実施例１：カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＫ３，Ｋ５蛋白の機能・構造ホモログとしてのｃ−ＭＩＲの同定〕
セレーラゲノミクス社のデータベースから、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログを検索した。その結果、アミノ酸配列全体のレベルでは、Ｋ３，Ｋ５蛋白と高い相同性を持つ配列は見つからなかったが、一つのクローンｈＣＰ３６２７９は、Ｋ３，Ｋ５蛋白と、二次構造、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー、および当該ジンクフィンガーの位置が共通していた。ｈＣＰ３６２７９のアミノ末端側の配列がデータベースでは欠けていたので、キャップトラッピング（ｃａｐ−ｔｒａｐｐｉｎｇ）法を用いた５’ＲＡＣＥ解析を行うことにより、ＮＫ細胞株ＹＴＳからｈＣＰ３６２７９の全長アミノ酸配列を決定した。その配列を図１（ａ）に示す（同配列は、配列表の配列番号２にも示される）。図中、下線のＴＭ１、ＴＭ２は、ＰＨＤｈｔｍプログラムによって予測された膜貫通領域であり、他の下線は、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー構造に重要なアミノ酸残基である。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、この転写産物は、ＢＪＡＢ細胞および２９３Ｔ細胞においても見出された。
本発明者は、この新規タンパク質を「ｃｅｌｌｕｌａｒ ＭＩＲ（ｃ−ＭＩＲ）」と命名した。そして、このｃ−ＭＩＲとＫ３，Ｋ５蛋白との機能的類似性を調べるため、エレクトロポレーション法によりＨｉｓタグ付のｃ−ＭＩＲを一過性にＢＪＡＢ細胞に発現させ、免疫認識に重要な抗原提示関連分子の細胞表面における発現をｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によって解析した。その結果を図１（ｂ）に示す。
図中、ＭＨＣ Ｉ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２は、抗原提示関連分子であり、それぞれＭＨＣクラスＩ分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の表面発現レベルを調べた結果である。上記実験では、ＧＦＰ−ｃ−ＭＩＲベクターをＢＪＡＢ細胞にトランスフェクションさせ、導入後２４時間してから上記各分子の表面発現レベルおよびＧＦＰの発現レベルをフローサイトメトリー法によって解析した。図の縦軸はＭＨＣクラスＩ分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の表面発現レベルを、横軸はＧＦＰの発現レベルをそれぞれ示す。
同図に示すように、ｃ−ＭＩＲの発現が高くなるにつれてＢ７−２分子の細胞表面における発現は負に制御された（つまり、発現が抑制された）が、ＭＨＣクラスＩ分子およびＩＣＡＭ−１分子の発現は負に制御されなかった。また、Ｆｌａｇタグ付のｃ−ＭＩＲを発現させて調べた場合も、同様の結果が得られた（データ示さず）。
さらにｃ−ＭＩＲの詳細な機能解析のため、ｃ−ＭＩＲを恒常的に過剰発現するようＢＪＡＢ細胞を改変し（この細胞を以下、「ｃ−ＭＩＲ細胞」という）、種々の抗体を用いたフローサイトメトリー法によって抗原提示（免疫認識）関連分子の細胞表面における発現を検討した。その結果を図２に示す。
図中、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２、ＣｌａｓｓＩ、ＣｌａｓｓＩＩ（ＤＲ）は、抗原提示関連分子であり、それぞれＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の表面発現レベルを調べた結果である。また図中、ｃ−ＭＩＲは、遺伝子導入によりｃ−ＭＩＲを発現させた上記ｃ−ＭＩＲ細胞について調べた結果であり、Ｃｏｎｔは、そのような発現をさせていない対照用のＢＪＡＢ細胞について調べた結果であり、Ｍｅｒｇｅは、両者の結果を重ね合わせたものである（ｃ−ＭＩＲ細胞の結果を白抜きで示す）。
同図に示すように、Ｂ７−２分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現は顕著に負に制御されたが、ＭＨＣクラスＩ分子およびＩＣＡＭ−１分子は負に制御されなかった。このように、新規タンパク質ｃ−ＭＩＲには、Ｂ７−２分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を特異的に抑制する作用が認められた。
〔実施例２：上記ｃ−ＭＩＲはＢ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスとライソゾームによる分解を誘導する〕
上記ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の発現がどのように抑制されるのかその抑制機構を調べるために、Ｂ７−２分子の蛋白合成、分解、移動を検討した。そのため、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を、３５Ｓメチオニンと３５Ｓシステインとによって３０分間パルス標識した後、所定期間（０ｈ，１ｈ，３ｈ，６ｈ）追跡した。各期間経過後、細胞を溶解し、抗Ｂ７−２抗体（上パネル）または抗ＭＨＣ Ｉ抗体（下パネル）で免疫沈降した結果を図３（ａ）に示す。
Ｂ７−２分子はグリコシル化の程度が高いため、成熟Ｂ７−２分子は未成熟なものよりゆっくりと移動した。一方、成熟ＭＨＣ Ｉ分子は未成熟なものよりゆっくり移動することはなかったが、これはおそらくグリコシル化の程度が低いためと考えられる。また、同図に示すように、追跡開始時（０時）に対照細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）の両細胞で観察された未成熟Ｂ７−２分子の量はほぼ同じであったが、対照細胞（Ｃｏｎｔ）では成熟Ｂ７−２分子の量は６時間まで実質的に減少しなかったのに対して、ｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）では１時間後すでに成熟Ｂ７−２分子の量はかなり少なかった。この結果は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の急速な分解が誘導されることを示すものである。
標的分子の急速な分解は、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白を発現するＢＪＡＢ細胞においても観察され、この分解はライソゾームで起こることが報告されている。そこで、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の分解がライソゾームで起こるのかどうかを検討した。実験では、ｃ−ＭＩＲ細胞を１０μＭ ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で２〜４時間処理した後、抗Ｂ７−２抗体（上パネル）または抗アクチン抗体（下パネル）でイムノブロット解析に供した。その結果を図３（ｂ）に示す。ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で細胞を処理すると、ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを阻害することによりライソゾーム内のｐＨが上がる。その結果、同図に示すように、Ｂ７−２蛋白の発現は安定的に増加した。
さらに、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で処理した後、図３（ａ）の実験と同様にパルス追跡（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）解析を行うことによって、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１がＢ７−２分子の分解を阻害する結果が得られた（図３（ｃ）参照：図中「Ｂａｆｉｌｏ＋」はｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で処理したもの、一方「Ｂａｆｉｌｏ−」は対照用のＤＭＳＯで処理したもの）。これらの結果は、ｃ−ＭＩＲがＢ７−２分子を標的としてライソゾームにて分解させることを示すものである。
次に、Ｂ７−２分子の細胞内動態をＥｎｄｏ−Ｈ（ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ）による消化実験によって調べた。Ｂ７−２分子があるグリカンで修飾されると、Ｅｎｄｏ−Ｈの消化に耐性となるが、それはＢ７−２分子が少なくとも中間ゴルジに到達していることを示している。実験では、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）またはｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を３５Ｓメチオニンと３５Ｓシステインとによって３０分間パルス標識し、１５〜３０分追跡した。各期間経過後、細胞を０．１％ＳＤＳ含有溶解バッファーにて溶解し、抗Ｂ７−２抗体で免疫沈降した。その後、各サンプルは、Ｅｎｄｏ−Ｈ（＋）またはなし（−）で消化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。その結果を図３（ｄ）に示す。図中、★印はＥｎｄｏ−Ｈ耐性のＢ７−２分子を示す。同図に示すように、３０分後、対照細胞およびｃ−ＭＩＲ細胞において、Ｅｎｄｏ−Ｈ耐性のＢ７−２分子の量はほぼ同じであり、Ｂ７−２分子の細胞内動態はＢ７−２分子が中間ゴルジに達するまで影響を受けていないことがこの実験結果より示された。
上記の実験結果より、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子のエンドサイトーシスが亢進する可能性が考えられた。この可能性を確かめるため、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）−ｂａｓｅｄエンドサイトーシス解析を行った。その結果を図４（ａ）に示す。
上記実験では、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を４℃にてＰＥ共役抗Ｂ７−２抗体で染色し、非結合抗体除去のためＰＢＳで洗浄した後、３７℃で１０分間または３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞内へ内部化していない抗体を酸性溶液で除去し、内部化した蛍光シグナルをフローサイトメーターで測定した。これらの結果は、同図の「１０」「３０」と記したパネルに示される。蛍光のバックグラウンドレベルを決定するため、ＰＥ共役抗Ｂ７−２抗体で染色後、細胞の表面にある抗体を酸性溶液で除去し、バックグラウンドレベルをフローサイトメーターで測定した。この結果は、同図の「０」と記したパネルに示されると共に、「１０」「３０」のパネルにも太線で示される。「Ｐｒｅ」と記したパネルは、細胞表面にある抗体を除去する前のＢ７−２分子の細胞表面発現レベルを示すものである。
同図に示すように、１０分間インキュベーションすると、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内部への顕著な蛍光シグナルが観察された。一方、対照細胞では細胞内へのシグナルは観察されなかった。また、３０分間インキュベーション後、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内への蛍光シグナルに増加は認められず、対照細胞では依然として細胞内へのシグナルは観察されなかった。これらの結果は、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の急速なエンドサイトーシスが１０分以内に起こることを示すものである。また、同様の実験をＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）について行ったところ、ｃ−ＭＩＲ細胞ではＭＨＣ Ｉのエンドサイトーシスは亢進しなかった（データ示さず）。
さらに、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の急速なエンドサイトーシスを確認するため、ｃ−ＭＩＲ細胞および対照細胞を３７℃でＦＩＴＣ標識した抗Ｂ７−２抗体と２時間反応させた後、共焦点顕微鏡によってＢ７−２分子の局在を調べた。その結果を図４（ｂ）に示す。同図に示すように、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内にＢ７−２分子が観察されたが、対照細胞では観察されなかった。以上の結果は、ｃ−ＭＩＲがＢ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスを誘導することを示すものである。
〔実施例３：Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域が、ｃ−ＭＩＲの標的の特異性に関係している〕
本発明者は、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白の機能に関し、ＣＤ８キメラ蛋白を用いた解析によって、標的分子の膜貫通領域および細胞質領域が、Ｋ３，Ｋ５蛋白を介した標的分子のダウンレギュレーション（発現抑制）に十分であることを以前示した。そこで、Ｂ７−２分子の同領域がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに十分であるか調べるため、ＨＬＡ−Ａ２およびＢ７−２分子についてＣＤ８キメラ蛋白を作製した（これらキメラ蛋白をそれぞれ「ＣＤ８／Ａ２」「ＣＤ８／Ｂ７−２」という）。ＣＤ８／Ａ２、ＣＤ８／Ｂ７−２は、それぞれ、ＣＤ８αの細胞外領域のカルボキシル末端にＨＬＡ−Ａ２分子およびＢ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域を含んでいる。これらのＣＤ８キメラ蛋白を対照用のＢＪＡＢ細胞またはｃ−ＭＩＲ細胞に発現させ、ＣＤ８の細胞表面における発現をフローサイトメトリー法によって調べた。その結果を図５に示す。
ＢＪＡＢ細胞表面にはＣＤ８は発現していないため、上記の実験により標的分子のダウンレギュレーションを良好に検出できる。図５に示すように、いずれのＣＤ８キメラ蛋白も対照用のＢＪＡＢ細胞では効率良く発現した。一方、ｃ−ＭＩＲ細胞ではＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白は十分発現したが、ＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白は十分な発現が見られなかった。この結果は、Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域が、ｃ−ＭＩＲの標的の特異性に関与していることを示すものである。
〔実施例４：ｃ−ＭＩＲは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能する〕
前述のように、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白については、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーがＥ３ユビキチンリガーゼの機能ドメインであることが示されている。そこで、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つかどうか調べるため、Ｋ３蛋白においてそのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー（８〜５７番目のアミノ酸残基）をｃ−ＭＩＲのもの（７８〜１３７番目のアミノ酸残基）に置換したキメラ蛋白を作製した（このキメラ蛋白を以下「Ｚｎ ＭＩＲ−Ｋ３」という）。そして、このキメラ蛋白がＫ３の標的分子であるＭＨＣ Ｉに対するリガーゼ活性を持ち、その細胞表面における発現を抑制するかどうか調べた。あわせて、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー領域に変異を導入し、これをＫ３のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーと置換したキメラ蛋白も作製した（このキメラ蛋白を以下「ｍＺｎ ＭＩＲ−Ｋ３」という）。上記の変異とは、亜鉛（Ｚｎ）結合部位の４つのシステイン（８０，８３，１２３，１２５番目）をセリンに置換したものである。これらのキメラ蛋白と野生型のＫ３蛋白をＡ７細胞に発現させ、ＭＨＣ Ｉの表面発現をｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によって調べた。その結果を図６（ａ）に示す。
同図に示すように、Ｚｎ ＭＩＲ−Ｋ３蛋白は、ＭＨＣ Ｉの表面発現を十分ダウンレギュレーションした。ｍＺｎ ＭＩＲ−Ｋ３蛋白では、ＭＨＣ Ｉの表面発現をダウンレギュレーションできなかったため、このダウンレギュレーションはＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメイン依存的といえる。この結果は、ｃ−ＭＩＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つことを示すものである。
このことをさらに確かめるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ自己ユビキチン化解析を行った。具体的には、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインの野生型または変異型をＧＳＴのカルボキシル末端に融合させ、精製したこのＧＳＴ融合蛋白をＡＴＰ、フリーのユビキチン、Ｅ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）の混合物を用いて自己ユビキチン化解析に供した。その結果を図６（ｂ）に示す。同図に示すように、野生型のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを含むＧＳＴ融合蛋白（図中、ｃ−ＭＩＲ）では、抗ユビキチン抗体（α−Ｕｂｉ）により自己ユビキチン化（ｕｂ−ＧＳＴ）がはっきりと観察されたが、ＧＳＴ単独のもの（図中、ＧＳＴ）および変異型のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを含むＧＳＴ融合蛋白（図中、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ）では、自己ユビキチン化は観察されなかった。この結果は、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つことを示すものである。
さらに、Ｂ７−２分子がｃ−ＭＩＲによってユビキチン化されるか調べるため、ＨＡで標識したユビキチンおよび野生型（ｗｔ）のｃ−ＭＩＲ（または、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを改変した変異型のｃ−ＭＩＲ（ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ））とＢ７−２分子とを共発現させた。そして、各細胞溶解物を抗Ｂ７−２抗体で免疫沈降した後、抗ＨＡ抗体（上段パネル）または抗Ｂ７−２抗体（中央パネル）を用いたイムノブロット解析に供した。その結果を図６（ｃ）に示す。同図に示すように、野生型のｃ−ＭＩＲ（図中、ｃ−ＭＩＲ）を発現させた場合、抗ＨＡ抗体および抗Ｂ７−２抗体のブロット結果は、ユビキチン化されたＢ７−２（ｕｂ−Ｂ７−２）をはっきりと示したが、野生型のｃ−ＭＩＲを発現させなかった場合（図中、Ｃｏｎｔ）および変異型のｃ−ＭＩＲを発現させた場合（図中、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ）では、ユビキチン化は観察されなかった。尚、各細胞溶解物におけるｃ−ＭＩＲおよびｍＺｎ ｃ−ＭＩＲの発現量を確認するため、抗Ｈｉｓ抗体でブロットした結果を下段のパネルに示す。
以上の結果、ｃ−ＭＩＲは、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインを介して、Ｂ７−２分子に対するＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することが示された。
〔実施例５：ユビキチン化は、ｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに不可欠である〕
これまで、ｃ−ＭＩＲが、▲１▼Ｂ７−２分子の細胞表面における発現の調節因子（モジュレーター）であること、▲２▼Ｂ７−２分子に対する新規Ｅ３ユビキチンリガーゼであることを示した。しかし、ユビキチン化が、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現のダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかは不明確である。この点を確かめるため、野生型のｃ−ＭＩＲ（ｗｔ−ｃ−ＭＩＲ）とＢ７−２分子をユビキチン化できなかったｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ変異体をエレクトロポレーション法によってＢＪＡＢ細胞に一過性に発現させ、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によってＢ７−２分子の細胞表面における発現を調べた。その結果を図７（ａ）に示す。同図に示すように、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲは、Ｂ７−２分子の発現を抑制しなかった。
次に、ＣＤ８キメラ蛋白を用いて次のような実験を行った。ＫＳＨＶのＫ５蛋白は、標的分子の細胞質に位置するリジン残基をユビキチン化することが知られている。そこで、ｃ−ＭＩＲについても同様であるか調べるため、前述のＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白においてＢ７−２分子の細胞質領域に位置するリジン残基のすべてをＰＣＲベースの変異導入法によってアルギニンに改変し、さらに、そのアミノ末端にＦｌａｇタグでエピトープ標識した（このキメラ蛋白を「Ｂ７−ＫＲ」という）。さらに、上記改変を施さないＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白についても、Ｆｌａｇタグでエピトープ標識した（このキメラ蛋白を「ｗｔ−Ｂ７」という）。
上記Ｂ７−ＫＲまたはｗｔ−Ｂ７を、ＨＡタグ付のユビキチンおよびｃ−ＭＩＲと共に２９３Ｔ細胞に共発現させ、図６（ｃ）と同様の実験に供した。その結果を図７（ｂ）に示す。同図に示すように、抗ＨＡ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体によるブロット解析の結果、ｗｔ−Ｂ７ではｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化（図中、ｕｂ−Ｆｌａｇ−ＣＤ８ ｃｈｉｍｅｒａ）が観察されたが、Ｂ７−ＫＲではｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化は観察されなかった。
Ｂ７−２分子のユビキチン化と、その発現抑制（ダウンレギュレーション）との関係を調べるため、ｗｔ−Ｂ７およびＢ７−ＫＲをＢＪＡＢ細胞（対照細胞）およびｃ−ＭＩＲ細胞に発現させ、ＣＤ８の表面発現レベルをフローサイトメトリー法により比較した。その結果を図７（ｃ）に示す。同図に示すように、ｗｔ−Ｂ７の発現はｃ−ＭＩＲ細胞において抑制されたが、Ｂ７−ＫＲの発現はｃ−ＭＩＲ細胞において抑制されなかった。この結果は、Ｂ７−２分子の細胞質領域のリジン残基のユビキチン化がそのダウンレギュレーションに必要であることを示すものである。
〔実施例６：分子間の相互作用を通じてのＢ７−２分子の特異的ユビキチン化とダウンレギュレーション〕
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、標的分子への結合を通じて機能すると考えられるので、次に、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２との分子間相互作用を調べた。図７（ｂ）の実験に用いたｗｔ−Ｂ７と同じ分子であるＣＤ８−Ｂ７とｃ−ＭＩＲとを２９３Ｔ細胞に単独または共発現させた後、その細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、ｃ−ＭＩＲを認識する抗Ｖ５抗体でイムノブロット解析に供した。その結果を図８（ａ）の上段パネルに示す。
同図に示すように、ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７を共発現させた場合のみ、ｃ−ＭＩＲに対応する特異的バンドが検出されたので、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２との分子間相互作用が確認された。また、ＣＤ８キメラ蛋白の発現量、ｃ−ＭＩＲの発現量を、それぞれ抗Ｆｌａｇ抗体（中央パネル）、抗Ｖ５抗体（下段パネル）で確認した。
ところで、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白については、その膜貫通領域が標的分子の膜貫通領域との結合を介して特異的ターゲッティングに関与することが報告されている。仮にｃ−ＭＩＲと標的分子との結合が同様であるとすれば、前記ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ変異体は野生型の膜貫通領域を有しているので、標的分子との結合能を有すると考えられる。この仮説を確かめるため、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲを図８（ａ）と同じ実験に供した。その結果を図８（ｂ）に示す。同図に示すように、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７を共発現させた場合のみ、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲに対応する特異的バンドが検出された。尚、図８（ａ）（ｂ）の両実験において、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７の結合体のほうがｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７の結合体より容易に検出されたが、これは野生型のｃ−ＭＩＲ結合体の不安定性によるものと考えられる。
ｃ−ＭＩＲによるＢ７−２分子の特異的ダウンレギュレーションが分子間の相互作用によるものか調べるため、前記ＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白を用いた実験を行った。ＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白の細胞表面における発現はｃ−ＭＩＲ細胞においてダウンレギュレートされなかったからである（図５参照）。ＣＤ８／Ａ２はそのアミノ末端にＦｌａｇエピトープタグを持つよう改変された（このキメラ蛋白を「ＣＤ８−Ａ２」という）。そして、ＣＤ８−Ａ２またはＣＤ８−Ｂ７を２９３Ｔ細胞においてｍＺｎ ｃ−ＭＩＲと共発現させ、免疫沈降−イムノブロット法によって分子間相互作用を調べた。尚、このように本実験ではｍＺｎ ｃ−ＭＩＲを用いたが、これはｃ−ＭＩＲ結合体の検出が容易なためである。本実験では、ＣＤ８−Ａ２発現細胞およびＣＤ８−Ｂ７発現細胞の各細胞溶解物を抗ＨＡ抗体または抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、抗Ｖ５抗体（上段）または抗Ｆｌａｇ抗体（中央）でイムノブロット解析を行った。その結果を図８（ｃ）に示す。両細胞の溶解物について抗Ｖ５抗体でイムノブロット解析を行った結果についてもあわせて下段に示される。
同図に示すように、ＣＤ８−Ｂ７とｍＺｎ ｃ−ＭＩＲとは共沈降したが、ＣＤ８−Ａ２とｍＺｎ ｃ−ＭＩＲとは共沈降しなかった。この結果は、分子間相互作用がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子の特異的ダウンレギュレーションに不可欠であることを示すものである。
次に、分子間相互作用とユビキチン化との関係を調べるため、上記ＣＤ８−Ａ２およびＣＤ８−Ｂ７について図７（ｂ）と同様の実験に供した。その結果を図８（ｄ）に示す。同図に示すように、ＣＤ８−Ａ２と比べてＣＤ８−Ｂ７では十分なユビキチン化（ｕｂ−ＣＤ８ ｃｈｉｍｅｒａ）が観察された。この結果は、分子間相互作用がｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化およびその後の標的分子のダウンレギュレーションに不可欠であることを示すものである。
以上の実験結果から考えられるｃ−ＭＩＲの分子機構を図９に示す。同図に示すように、ｃ−ＭＩＲはＢ７−２分子と膜貫通部位を介して結合する。その後、ＰＨＤ／ＬＡＰドメイン（ＰＨＤ）に結合しているＥ２ユビキチンコンバーティング酵素（Ｅ２）より、ユビキチン（Ｕｂｉ）がＢ７−２分子の細胞内領域にあるそれぞれのリジン残基（Ｋ）に輸送され、Ｂ７−２分子がユビキチン化される。ユビキチン化されたＢ７−２分子は、細胞表面からエンドサイトーシスされ、ライソゾームへ運ばれ分解される。
〔実施例７：上記ｃ−ＭＩＲの機能的・構造的類似分子ＨＳＰＣ２４０〕
上記ｃ−ＭＩＲと同族の新規ヒトＥ３ユビキチンリガーゼについて探索を行った結果、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子として５つの遺伝子・タンパク質を同定した。図１０には、このうちＨＳＰＣ２４０のアミノ酸配列が示される（配列表の配列番号４にも同配列が示される）。図中、下線はＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフを示す。このＨＳＰＣ２４０が抗原提示関連分子の発現を抑制するかどうか調べた。具体的には、ＢＪＡＢ細胞にＨＳＰＣ２４０を一過性に発現させ、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ／ＤＲ）分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現をフローサイトメトリー法により調べた。その結果を図１１に示す。同図に示すように、ＨＳＰＣ２４０の発現によってＢ７−２分子の発現は顕著に抑制されたが、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＣＡＭ−１各分子の発現は抑制されなかった。この結果は、ＨＳＰＣ２４０が、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を特異的に抑制すること、および、ｃ−ＭＩＲと同様に抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を持つことを示すものである。
〔実施例８：ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の発現抑制は、強力に抗原提示機能を抑制する〕
ｃ−ＭＩＲ発現Ａ２０．２Ｊ細胞を作成し、ＯＶＡ３２３−３３９特異的Ｉ−Ａｄ拘束性Ｔｈ１ ｃｌｏｎｅ，４２−６Ａ用いて、ＯＶＡまたはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する抗原提示機能をＩＬ−２の産生を指標に調べた。図１２（ａ）にＯＶＡを用いた結果、図１２（ｂ）にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを用いた結果を示す。点線はコントロール細胞の結果を示し、実線はｃ−ＭＩＲ過剰発現細胞の結果を示す。また、ＯＶＡは２４時間、ペプチドは６時間後にＥＬＩＳＡにて培養上清中のＩＬ−２を測定した。この結果から明らかなように、ＯＶＡまたはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する抗原提示機能は著明な抑制が認められた。An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.
(I) Protein of the present invention and the structure of the gene
As a result of investigating and investigating the existence of the human homologue of the K3, K5 protein of the KSHV, the present inventor has a BKS-PHD / LAP zinc finger motif that is a functional domain of the K3, K5 protein, and has similar secondary structures. Six genes and proteins were identified as human homologs.
In SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11, the nucleotide sequences of the six genes c-MIR, HSPC240, 43171, XP-055276, CAD28529, and 20445 are represented by open reading frames (ORFs), respectively. Shown with each amino acid sequence encoded by the region. The amino acid sequences of the proteins encoded by the six genes are shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12, respectively. As for c-MIR and HSPC240, amino acid sequences are also shown in FIG. 1 (a) and FIG. 10, respectively. In FIG. 1A, “TM1” is a c-MIR first transmembrane region, and “TM2” is a second transmembrane region. The BKS-PHD / LAP zinc finger motif is present on the amino terminal side of the first transmembrane region. For the HSPC240, its BKS-PHD / LAP zinc finger motif is underlined in FIG.
As a result of a detailed analysis of the c-MIR, the following knowledge about the action and properties was obtained, as will be described in detail in the following examples.
(1) c-MIR ubiquitinates a B7-2 costimulatory molecule (B7-2 molecule), which is one of antigen presentation-related molecules, and negatively controls its expression on the cell surface.
(2) Ubiquitination of the B7-2 molecule causes rapid endocytosis of the B7-2 molecule and degradation in the lysosome. That is, c-MIR ubiquitinates the B7-2 molecule, thereby inducing rapid endocytosis and degradation of the B7-2 molecule.
(3) c-MIR binds to the transmembrane region of B7-2 molecule or an intracellular region in the vicinity thereof through the transmembrane region. This binding is essential for ubiquitination of the B7-2 molecule.
(4) c-MIR also negatively regulates the expression on the cell surface of MHC class II molecules, which are other antigen presentation related molecules.
(5) c-MIR functions as an E3 ubiquitin ligase like the above K3 and K5 proteins, and its BKS-PHD / LAP zinc finger domain is a catalytic site having ligase activity.
Thus, c-MIR has an action to negatively control the expression of B7-2 molecule and MHC class II molecule on the cell surface, in other words, an immunosuppressive action to suppress the expression of these antigen presentation-related molecules. It was. Therefore, c-MIR is considered to be a regulator that regulates the expression of antigen presentation-related molecules in the human immune system by such immunosuppressive action.
In addition, as a result of functional analysis, HSPC240, which is a structurally similar molecule of c-MIR, as a result of functional analysis, negatively controls the expression of B7-2 molecule on the cell surface, in other words, suppresses the expression of antigen presentation-related molecules. An immunosuppressive effect was observed. Similarly, it is highly likely that the remaining four molecules that are structurally similar molecules of c-MIR have an action of suppressing the expression of antigen presentation-related molecules. It can be said to be a regulatory factor that suppresses expression and regulates antigen presentation and immune recognition in the human immune system by such immunosuppressive action.
Furthermore, the present inventor cloned the mouse homologues of the c-MIR and HSPC240 and analyzed their functions. SEQ ID NOs: 13 and 15 show the respective base sequences of the mouse homologues of c-MIR and HSPC240, together with the respective amino acid sequences encoded by the open reading frame (ORF) region. In addition, the amino acid sequences of the proteins encoded by the above two genes are shown in SEQ ID NOs: 14 and 16, respectively.
The c-MIR mouse homologue was introduced into A20 cells and examined for expression of MHC class I molecules and MHC class II molecules. As a result, specific suppression of MHC class II molecules was observed. Moreover, as a result of introducing the gene of the above mouse homologue of HSPC240 into A20.2J cells and examining the expression of B7-2 molecule, MHC class I molecule, and MHC class II molecule, specific suppression of B7-2 molecule Was recognized. From these results, it is considered that the mouse homologues of c-MIR and HSPC240 also have a function of specifically suppressing the expression of any of the antigen presentation-related molecules, similar to human genes.
Furthermore, it was also clarified that specific inhibition of MHC class II molecules and B7-2 molecules by c-MIR strongly suppresses the antigen presentation function. Therefore, it is suggested that c-MIR may suppress the hyperimmune reaction. These are thought to give an interesting perspective on the origin of viral immune evasion molecules, and it is considered that a new immune control mechanism can be seen by elucidating their physiological functions.
The protein of the present invention is not limited to the above eight molecules, and may be a mutant protein in which a part thereof is modified. That is, the protein of the present invention includes not only (a) a protein comprising any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16, but also (b) sequence Amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in any one of the amino acid sequences shown in Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16. And a protein that negatively regulates the expression of antigen-presenting molecules on the cell surface.
The above “one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” means substitution, deletion, insertion, or the like by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis. And / or a number that can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less) amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. Thus, the protein of (b) is a mutant protein of the protein of (a), and the “mutation” here means a mutation introduced artificially mainly by a known mutant protein production method. However, it may be a product obtained by isolating and purifying a similar mutant protein that exists in nature.
The protein according to the present invention may contain an additional polypeptide. Examples of the case where such a polypeptide is added include a case where the protein of the present invention is epitope-tagged by His, Myc, Flag, or the like.
The gene of the present invention is a gene encoding the protein of the above (a) or (b), and has any nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15. A gene having an open reading frame region and a modified gene obtained by modifying a part of the base sequence are included.
The “gene” of the present invention includes DNA and RNA. DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof. The DNA / RNA may be double-stranded or single-stranded, and the single-stranded DNA / RNA may be a sense strand or an antisense strand (antisense strand). Can be used as a probe or as an antisense drug). Moreover, siRNA obtained by utilizing a part of the gene sequence of the present invention is also useful.
Furthermore, the “gene” of the present invention includes sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences) in addition to the sequence encoding the protein (a) or (b). It may be a thing.
Furthermore, the gene according to the present invention is not limited to the gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 as the ORF region. A gene that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence shown in 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 is included. The above “stringent conditions” means that hybridization occurs only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity exists between sequences. Means that.
The hybridization is described in J. Org. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989), and the like. Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize).
(II) Protein of the present invention and method for using the gene (usefulness)
The B7-2 molecule helps antigen presentation to T cells on the surface of antigen-presenting cells (dendritic cells, B cells, etc.) and functions as a modulator of immune synapse formation between T cells and antigen-presenting cells. Immune synapse formation activates T cells. In addition, signal transduction by the B7-2 molecule is related to the progression of autoimmune diseases.
The protein of the present invention has an immunosuppressive action that suppresses the expression of antigen presentation-related molecules such as the B7-2 molecule, and is considered to be a regulator that regulates antigen presentation important for immune recognition in the human immune system. The protein of the present invention and its gene are not only useful for elucidating the human immune regulatory mechanism, but also can be used in various medical and industrial applications. For example, it can be used for the development of a method for efficiently and manually performing immunosuppression as an immunosuppressant, and further, the protein of the present invention can be used for suppression of rejection during cell and organ transplantation, treatment of autoimmune diseases, etc. Genes are applicable.
In addition, the protein of the present invention and the mammalian homologue of the gene thereof are useful in experiments for examining immunosuppressive effects using model animals, and such mammalian homologues are also included in the present invention. For example, it is useful for experiments in which a rejection model is prepared using a small animal such as a mouse and the immunosuppressive effect is examined in vivo. In fact, the present inventors cloned the mouse homologues of c-MIR and HSPC240 and analyzed their functions. As described above, the inventors specifically identified the expression of B7-2 molecules or MHC class II molecules as in human genes. A function to suppress it was observed.
Furthermore, the protein of the present invention and its gene are useful for screening drug candidate molecules (drug discovery targets). For example, (1) a method for screening a substance that regulates the action of the protein of the present invention, or (2) a cell surface of an antigen presentation-related molecule such as a B7-2 molecule or an MHC class II molecule, similar to the protein of the present invention It can be used in a screening method for substances having an action of negatively controlling expression in The substance that regulates the action of the protein of the present invention described in (1) above, for example, inhibits the binding between the protein of the present invention and a target molecule (such as B7-2 molecule or MHC class II molecule), and the protein of the present invention Examples thereof include substances that inhibit the immunosuppressive action of the present invention, and conversely substances that enhance the immunosuppressive action of the protein of the present invention. Such substances can be used as therapeutic agents or diagnostic agents for immune diseases, and screening methods thereof are also included in the present invention.
As the screening method of the present invention, various conventionally known methods for examining the presence / absence of binding between substances and the presence / absence of dissociation can be applied and are not particularly limited. For example, the c-MIR binds to the transmembrane region of the B7-2 molecule or the intracellular region in the vicinity thereof through the transmembrane region, and this binding is indispensable for the ubiquitination of the B7-2 molecule (following Therefore, in the cell-free system, any of the following substances (1) to (3) and any of the following substances (4) to (7) are expressed. And a screening method for detecting molecules that inhibit the binding of both molecules from the candidate molecules by ELISA.
(1) The protein of the present invention such as c-MIR
(2) The partial protein of the protein of the present invention, wherein the partial protein includes at least the transmembrane region in the amino acid sequence of the full-length protein.
(3) The protein of (1) above or a modified form of the partial protein of (2) above
(4) B7-2 molecule or MHC class II molecule
(5) Modified B7-2 molecule or MHC class II molecule
(6) A partial protein of a B7-2 molecule or MHC class II molecule, which includes at least a transmembrane region or an intracellular region in the vicinity thereof in the amino acid sequence of the full-length protein.
(7) Modified partial protein of (6) above
The above-mentioned “(protein) variant” means that one or several (preferably 7 or less, more preferably 5 or less, more preferably 3 or less) amino acids of the protein are substituted, deleted or inserted. , And / or an added variant, when the protein is labeled with a tag such as His or Myc, or when the protein is fused with a fluorescent protein (GFP, luciferase, etc.) or another protein It is used in the meaning including the case where it is modified by phosphorylation or sugar chain bonding.
Needless to say, the screening method of the present invention is not limited to the above-described method, and screening may be performed in cells using cultured cells or the like instead of screening in a cell-free system.
In addition, (1) the transmembrane region of the protein of the present invention such as c-MIR, the transmembrane region of the B7-2 molecule or MHC class II molecule or the intracellular region in the vicinity thereof is fixed to the column and bound thereto. Methods of searching for substances, and (2) methods of searching for substances that inhibit the binding of c-MIR to B7-2 molecules or MHC class II molecules using immunoprecipitation-immunoblotting. Various conventionally known methods for examining the presence or absence or the presence or absence of dissociation can be applied to the screening method of the present invention.
Furthermore, in the screening method of the present invention, screening may be performed using proteins other than humans, for example, mouse homologs, rat homologs, and other homologs of other organisms.
(III) Recombinant expression vector of the present invention
The recombinant expression vector of the present invention comprises the gene of the present invention encoding the protein (a) or (b), for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, Alternatively, a recombinant expression vector into which cDNA having any one of the nucleotide sequences shown in 15 is inserted can be mentioned. For the production of a recombinant expression vector, a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, but is not particularly limited.
The transformant of the present invention is a transformant into which the gene of the present invention encoding the protein (a) or (b) is introduced. Here, “gene introduced” means that the gene is introduced into a target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). The “transformant” means not only cells / tissues / organs but also animals. The target animal is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice and rats. In particular, rodents such as mice and rats are widely used as experimental animals and pathological model animals, and many inbred strains have been created, and technologies for fertilized egg culture, in vitro fertilization, etc. are in place. Mice are preferred as experimental animals and pathological model animals, and knockout mice and the like can be used for further functional analysis of the above-mentioned protein c-MIR and its homologs, development of diagnostic methods for diseases involving these proteins, and treatment methods thereof. Useful for development.
The gene detection instrument of the present invention uses at least a part of the base sequence or its complementary sequence in the gene of the present invention as a probe. The gene detection instrument can be used for detection and measurement of the expression pattern of the gene of the present invention under various conditions. Examples of the gene detection instrument of the present invention include a DNA chip in which the probe that specifically hybridizes with the gene of the present invention is immobilized on a substrate (carrier).
The antibody of the present invention is an antibody obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein (a) or (b) or a partial peptide thereof as an antigen. The antibody of the present invention can be used for detection and measurement of the protein of the present invention, and may be used for diagnosis and treatment.
(IV) Methods for obtaining genes, proteins, etc. according to the present invention
[IV-1: Gene acquisition method]
The method for obtaining the gene according to the present invention is not particularly limited, and DNA fragments containing each of the above gene sequences are isolated and cloned by various methods based on the sequence information disclosed above. Can do.
For example, a probe that specifically hybridizes with a partial sequence of each of the above cDNA sequences may be prepared, and a human or mouse genomic DNA library or cDNA library may be screened. As such a probe, any probe of any sequence / length may be used as long as it specifically hybridizes to at least a part of each cDNA sequence or its complementary sequence. Moreover, what is necessary is just to perform about each step in the said screening on the conditions used normally.
The clone obtained by the above screening can be analyzed in more detail by preparing a restriction enzyme map and determining its nucleotide sequence (sequencing). From these analyses, it can be easily confirmed whether a DNA fragment containing the gene sequence according to the present invention has been obtained.
In addition, the sequence of the probe is selected from a region (for example, BKS-PHD / LAP zinc finger domain) that is well conserved between human c-MIR and its similar molecules, and human, mouse, other If a genome DNA (or cDNA) library of an organism is screened, there is a high possibility that a gene encoding a homologous molecule or a similar molecule having the same function as that of c-MIR can be isolated and cloned.
As a method for obtaining the gene according to the present invention, there is a method using an amplification means such as PCR in addition to the above screening method. For example, among the above cDNA sequences, primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences), and human or mouse genomic DNA (or cDNA) is prepared using these primers. By performing PCR or the like as a template and amplifying a DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the gene according to the present invention can be obtained.
[IV-2: Protein acquisition method]
The method for obtaining the protein according to the present invention is not particularly limited. For example, a recombinant expression vector into which each cDNA sequence is introduced is prepared, and microorganisms or animal cells such as Escherichia coli and yeast are prepared by a well-known method. The protein according to the present invention can be easily obtained by expressing and purifying the protein encoded by the cDNA as a transformant by incorporating the protein into a transformant.
When introducing a foreign gene into the host in this way, there are various expression vectors and hosts that incorporate a promoter that functions in the host for the expression of the foreign gene. do it. The method for extracting the produced protein varies depending on the host used and the nature of the protein, but the target protein can be purified relatively easily by using a tag or the like.
The method for producing the mutant protein is not particularly limited. For example, a site-directed mutagenesis method (Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995), etc.), a base using the PCR method is used. Using a known mutant protein production method such as a method for producing a mutant protein by introducing a point mutation into a sequence, or a mutant strain production method by inserting a transposon, one or more bases in the nucleotide sequence of each cDNA described above Can be made by modifying such that substitutions, deletions, insertions, and / or additions are made. In addition, a commercially available kit (eg, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, manufactured by Stratagene) may be used for the production of the mutant protein.
Many examples of mutant proteins produced as described above have the same activity and function as the wild type. On the other hand, mutations are introduced so that the activity and function are abnormal. Many have already been made. For example, the mutant protein mZn c-MIR (a protein in which a mutation was introduced into the BKS-PHD / LAP zinc finger region of c-MIR) prepared in a later example could not ubiquitinate the target molecule.
[IV-3: Gene detection instrument]
The gene detection instrument uses a partial base sequence or its complementary sequence in the gene of the present invention as a probe. For example, a DNA chip formed by immobilizing an oligonucleotide (probe) on a substrate (carrier) can be mentioned. Here, the “DNA chip” mainly means a synthetic DNA chip using a synthesized oligonucleotide as a probe, but also includes an affixed DNA microarray using a cDNA such as a PCR product as a probe.
The sequence used as a probe can be determined by a conventionally known method for identifying a characteristic sequence from a cDNA sequence. For example, SAGE: Serial Analysis of Gene Expression Method (Science 276: 1268, 1997; Cell 88: 243, 1997; Science 270: 484, 1995; Nature 389: 300, 1997; U.S. Pat. No. 5,695,937).
In addition, what is necessary is just to employ | adopt a well-known method for manufacture of a DNA chip. For example, when a synthetic oligonucleotide is used as an oligonucleotide, the oligonucleotide may be synthesized on a substrate by a combination of a photolithography technique and a solid phase DNA synthesis technique. On the other hand, when cDNA is used as an oligonucleotide, it may be pasted on a substrate using an array machine.
Similarly to a general DNA chip, a perfect match probe (oligonucleotide) and a mismatch probe in which one perfect base substitution is performed in the perfect match probe may be arranged to further improve the accuracy of gene detection. Furthermore, in order to detect different genes in parallel, a plurality of types of oligonucleotides may be fixed on the same substrate to constitute a DNA chip.
[IV-4: Recombinant expression vector and transformant]
The recombinant expression vector contains the gene of the present invention. The specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence may be appropriately selected in order to reliably express the gene, and this and the gene according to the present invention incorporated into various plasmids may be used as an expression vector.
In order to confirm whether or not the gene of the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell, various markers may be used. For example, a gene that is deleted in the host cell is used as a marker, and a plasmid containing this marker and the gene of the present invention is introduced into the host cell as an expression vector. Thus, the introduction of the gene of the present invention can be confirmed from the expression of the marker gene. Alternatively, the protein according to the present invention may be expressed as a fusion protein. For example, the green fluorescent protein GFP (Green Fluorescent Protein) derived from Aequorea jellyfish may be used as a marker, and the protein according to the present invention may be expressed as a GFP fusion protein. Good.
The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, including cells derived from humans or mice, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematode Caenorhabditis elegans X Oocytes, cultured cells of various mammals (rats, rabbits, pigs, monkeys, etc.), cultured cells of insects such as Drosophila melanogaster, silkworm, etc., but are not particularly limited.
A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. .
[IV-5: Antibody]
The antibody is an antibody obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein of the present invention or a partial peptide thereof as an antigen. Known methods include, for example, literature (Harlow et al., “Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988))”, Iwasaki et al., “Monoclonal antibody hybridomas and ELISA, Kodansha (1991)”. The antibody prepared in this way is effective for detecting the protein of the present invention.
Hereinafter, the results of functional analysis performed on c-MIR, which is the protein of the present invention, and HSPC240 will be described with reference to the drawings.
[Example 1: Identification of c-MIR as a function / structure homologue of K3, K5 protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)]
Human homologues of KSHV K3 and K5 proteins were searched from a database of Selera Genomics. As a result, at the level of the whole amino acid sequence, a sequence having high homology with K3 and K5 proteins was not found. However, one clone hCP36279 was found to have K3 and K5 proteins, secondary structure, BKS-PHD / LAP zinc finger. , And the zinc finger position was common. Since the amino terminal sequence of hCP36279 was lacking in the database, the full-length amino acid sequence of hCP36279 was determined from the NK cell line YTS by performing 5 ′ RACE analysis using a cap-trapping method. The sequence is shown in FIG. 1 (a) (the same sequence is also shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). In the figure, the underlined TM1 and TM2 are transmembrane regions predicted by the PHDhtm program, and the other underlined are amino acid residues important for the BKS-PHD / LAP zinc finger structure. This transcript was also found in BJAB cells and 293T cells by RT-PCR analysis.
The inventor has named this novel protein “cellular MIR (c-MIR)”. In order to investigate the functional similarity between this c-MIR and the K3, K5 proteins, His-tagged c-MIR is transiently expressed in BJAB cells by electroporation, and is an antigen important for immune recognition. Expression on the cell surface of the display-related molecule was analyzed by two-color flow cytometry. The result is shown in FIG.
In the figure, MHC I, ICAM-1, and B7-2 are antigen presentation-related molecules, and are the results of examining the surface expression levels of MHC class I molecule, ICAM-1 molecule, and B7-2 molecule, respectively. In the above experiment, the GFP-c-MIR vector was transfected into BJAB cells, and 24 hours after introduction, the surface expression level of each molecule and the expression level of GFP were analyzed by flow cytometry. In the figure, the vertical axis represents the surface expression level of MHC class I molecule, ICAM-1 molecule, and B7-2 molecule, and the horizontal axis represents the expression level of GFP.
As shown in the figure, the expression of B7-2 molecule on the cell surface was negatively controlled (that is, the expression was suppressed) as the expression of c-MIR increased, but the MHC class I molecule and ICAM-1 Molecular expression was not negatively controlled. Similar results were obtained when c-MIR with a Flag tag was expressed and examined (data not shown).
Further, for detailed functional analysis of c-MIR, BJAB cells were modified so that c-MIR is constantly overexpressed (this cell is hereinafter referred to as “c-MIR cell”), and flow using various antibodies. The expression of antigen-presenting (immunorecognition) -related molecules on the cell surface was examined by cytometry. The result is shown in FIG.
In the figure, ICAM-1, B7-2, Class I, and Class II (DR) are antigen presentation-related molecules, respectively, ICAM-1, B7-2 molecule, MHC class I molecule, and MHC class II (HLA-DR). It is the result of examining the surface expression level of the molecule. In the figure, c-MIR is the result of examining the c-MIR cell in which c-MIR was expressed by gene transfer, and Cont was examined for a control BJAB cell not having such expression. This is a result and Merge is the result of superimposing both results (the results of c-MIR cells are shown in white).
As shown in the figure, expression of B7-2 molecule and MHC class II molecule on the cell surface was significantly negatively controlled, but MHC class I molecule and ICAM-1 molecule were not negatively controlled. Thus, the novel protein c-MIR was found to specifically suppress the expression of B7-2 molecules and MHC class II molecules.
[Example 2: c-MIR induces rapid endocytosis of B7-2 molecule and degradation by lysosome]
In order to examine how the expression of the B7-2 molecule is suppressed by the c-MIR, the protein synthesis, degradation, and migration of the B7-2 molecule were examined. Therefore, BJAB cells (Cont) and c-MIR cells (c-MIR) 35 With S-methionine 35 After 30 minutes of pulse labeling with S cysteine, it was followed for a predetermined period (0h, 1h, 3h, 6h). FIG. 3 (a) shows the results of cell lysis after each period and immunoprecipitation with anti-B7-2 antibody (upper panel) or anti-MHC I antibody (lower panel).
Due to the high degree of glycosylation of the B7-2 molecule, the mature B7-2 molecule migrated more slowly than the immature one. On the other hand, mature MHC I molecules did not migrate more slowly than immature ones, probably because of the lower degree of glycosylation. Moreover, as shown in the figure, the amount of immature B7-2 molecules observed in both control cells (Cont) and c-MIR cells (c-MIR) at the start of follow-up (0 o'clock) was almost the same. However, in control cells (Cont) the amount of mature B7-2 molecules did not substantially decrease until 6 hours, whereas in c-MIR cells (c-MIR), mature B7 The amount of -2 molecules was quite low. This result indicates that c-MIR induces rapid degradation of the B7-2 molecule.
Rapid degradation of the target molecule was also observed in BJAB cells expressing KSHV K3 and K5 proteins, and this degradation has been reported to occur in lysosomes. Therefore, it was examined whether degradation of B7-2 molecule induced by c-MIR occurs in lysosomes. In the experiment, c-MIR cells were treated with 10 μM bafilomycin A1 for 2 to 4 hours, and then subjected to immunoblot analysis with anti-B7-2 antibody (upper panel) or anti-actin antibody (lower panel). The result is shown in FIG. When cells were treated with bafilomycin A1, vacuolar H + -Inhibiting ATPase raises the pH in lysosomes. As a result, as shown in the figure, the expression of B7-2 protein increased stably.
Further, after treatment with bafilomycin A1, pulse-chase analysis was performed in the same manner as in the experiment of FIG. 3 (a) to obtain a result of bafilomycin A1 inhibiting the degradation of the B7-2 molecule ( (See FIG. 3 (c): “Bafilo +” treated with bafilomycin C1 while “Bafilo-” treated with control DMSO). These results indicate that c-MIR is degraded by lysosomes targeting the B7-2 molecule.
Next, the intracellular kinetics of the B7-2 molecule was examined by digestion experiments with Endo-H (endo-β-N-acetylglucosaminedase H). When the B7-2 molecule is modified with a glycan, it becomes resistant to Endo-H digestion, indicating that the B7-2 molecule has reached at least the intermediate Golgi. In the experiment, BJAB cells (Cont) or c-MIR cells (c-MIR) were used. 35 With S-methionine 35 Pulse labeled with S-cysteine for 30 minutes and followed for 15-30 minutes. After each period, the cells were lysed with 0.1% SDS-containing lysis buffer and immunoprecipitated with anti-B7-2 antibody. Each sample was then digested with Endo-H (+) or None (-) and separated by SDS-PAGE. The result is shown in FIG. In the figure, an asterisk indicates an Endo-H resistant B7-2 molecule. As shown in the figure, after 30 minutes, the amount of Endo-H resistant B7-2 molecule is almost the same in control cells and c-MIR cells, and the intracellular kinetics of B7-2 molecule is B7-2 molecule. The experimental results show that is not affected until it reaches the intermediate Golgi.
From the above experimental results, it was considered that c-MIR may promote endocytosis of the B7-2 molecule. In order to confirm this possibility, FACS (Fluorescence-activated cell sorter) -based endocytosis analysis was performed. The result is shown in FIG.
In the above experiment, BJAB cells (Cont) and c-MIR cells (c-MIR) were stained with PE-conjugated anti-B7-2 antibody at 4 ° C., washed with PBS to remove unbound antibody, and then at 37 ° C. Incubated for 10 or 30 minutes. After incubation, the antibody that was not internalized into the cells was removed with an acidic solution, and the internalized fluorescence signal was measured with a flow cytometer. These results are shown in the panels labeled “10” and “30” in FIG. To determine the background level of fluorescence, after staining with PE-conjugated anti-B7-2 antibody, the antibody on the surface of the cells was removed with an acidic solution, and the background level was measured with a flow cytometer. This result is shown on the panel labeled “0” in the figure, and also on the “10” and “30” panels with bold lines. The panel labeled “Pre” shows the cell surface expression level of the B7-2 molecule before removing the antibody on the cell surface.
As shown in the figure, when the cells were incubated for 10 minutes, c-MIR cells observed a remarkable fluorescent signal inside the cells. On the other hand, no signal was observed in the control cells. In addition, after 30 minutes of incubation, no increase was observed in the intracellular fluorescence signal in c-MIR cells, and no signal was observed in control cells. These results indicate that rapid endocytosis of the B7-2 molecule induced by c-MIR occurs within 10 minutes. Further, when a similar experiment was performed on MHC class I molecules (MHC I), MHC I endocytosis was not enhanced in c-MIR cells (data not shown).
Furthermore, to confirm the rapid endocytosis of B7-2 molecule induced by c-MIR, c-MIR cells and control cells were reacted at 37 ° C. with FITC-labeled anti-B7-2 antibody for 2 hours. The localization of the B7-2 molecule was examined by a confocal microscope. The result is shown in FIG. As shown in the figure, B7-2 molecules were observed intracellularly in c-MIR cells, but not in control cells. These results indicate that c-MIR induces rapid endocytosis of the B7-2 molecule.
[Example 3: The transmembrane region and cytoplasmic region of the B7-2 molecule are related to the specificity of the c-MIR target]
The present inventor, regarding the functions of KSHV K3 and K5 proteins, analyzed by using CD8 chimeric protein, the transmembrane region and the cytoplasmic region of the target molecule were down-regulated (expression suppression) via the K3 and K5 proteins. ) Was previously shown to be sufficient. Therefore, in order to examine whether the same region of the B7-2 molecule is sufficient for downregulation of the B7-2 molecule via c-MIR, CD8 chimeric proteins were prepared for the HLA-A2 and B7-2 molecules (these chimeric proteins). Are referred to as “CD8 / A2” and “CD8 / B7-2” respectively). CD8 / A2 and CD8 / B7-2 each contain a transmembrane region and a cytoplasmic region of HLA-A2 molecule and B7-2 molecule at the carboxyl terminus of the extracellular region of CD8α. These CD8 chimeric proteins were expressed in control BJAB cells or c-MIR cells, and the expression of CD8 on the cell surface was examined by flow cytometry. The result is shown in FIG.
Since CD8 is not expressed on the surface of BJAB cells, down-regulation of the target molecule can be detected well by the above experiment. As shown in FIG. 5, all CD8 chimeric proteins were efficiently expressed in the control BJAB cells. On the other hand, CD8 / A2 chimeric protein was sufficiently expressed in c-MIR cells, but CD8 / B7-2 chimeric protein was not sufficiently expressed. This result indicates that the transmembrane region and cytoplasmic region of the B7-2 molecule are involved in the specificity of the c-MIR target.
[Example 4: c-MIR functions as an E3 ubiquitin ligase]
As described above, for KSHV K3 and K5 proteins, BKS-PHD / LAP zinc fingers are shown to be functional domains of E3 ubiquitin ligase. Therefore, in order to examine whether or not the BKS-PHD / LAP zinc finger of c-MIR has E3 ubiquitin ligase activity, its BKS-PHD / LAP zinc finger (amino acid residues 8 to 57) in c3 protein is c-MIR. A chimeric protein was prepared by substituting the amino acid residues (the 78th to 137th amino acid residues) (this chimeric protein is hereinafter referred to as “Zn MIR-K3”). And it was investigated whether this chimeric protein has ligase activity with respect to MHC I which is a target molecule of K3, and suppresses the expression on the cell surface. In addition, a chimeric protein was also prepared by introducing a mutation into the BKS-PHD / LAP zinc finger region of c-MIR and substituting it with the KKS BKS-PHD / LAP zinc finger (hereinafter referred to as “mZn MIR-”). K3 "). The above mutation is one in which four cysteines (80th, 83rd, 123rd, 125th positions) in the zinc (Zn) binding site are substituted with serine. These chimeric proteins and wild-type K3 protein were expressed in A7 cells, and the surface expression of MHC I was examined by a two-color flow cytometry method. The result is shown in FIG.
As shown in the figure, Zn MIR-K3 protein sufficiently down-regulated the surface expression of MHC I. In mZn MIR-K3 protein, since the surface expression of MHC I could not be down-regulated, it can be said that this down-regulation is BKS-PHD / LAP domain-dependent. This result indicates that c-MIR has E3 ubiquitin ligase activity.
To further confirm this, in vitro self-ubiquitination analysis was performed. Specifically, a BKS-PHD / LAP domain wild-type or mutant type of c-MIR was fused to the carboxyl terminus of GST, and this purified GST fusion protein was purified from ATP, free ubiquitin, E1, E2 (UbcH5a). The mixture was used for self-ubiquitination analysis. The result is shown in FIG. As shown in the figure, in the GST fusion protein (c-MIR in the figure) containing a wild-type BKS-PHD / LAP domain, self-ubiquitination (ub-GST) is clearly observed by anti-ubiquitin antibody (α-Ubi). However, no self-ubiquitination was observed in the GST alone (GST in the figure) and the GST fusion protein containing the mutant BKS-PHD / LAP domain (mZn c-MIR in the figure). . This result indicates that the BKS-PHD / LAP domain of c-MIR has E3 ubiquitin ligase activity.
Furthermore, in order to investigate whether the B7-2 molecule is ubiquitinated by c-MIR, ubiquitin labeled with HA and wild-type (wt) c-MIR (or a mutant c modified from the BKS-PHD / LAP domain) are used. -MIR (mZn c-MIR)) and B7-2 molecule were co-expressed. Each cell lysate was immunoprecipitated with anti-B7-2 antibody, and then subjected to immunoblot analysis using anti-HA antibody (upper panel) or anti-B7-2 antibody (middle panel). The result is shown in FIG. As shown in the figure, when wild-type c-MIR (in the figure, c-MIR) was expressed, the blot results of anti-HA antibody and anti-B7-2 antibody showed that ubiquitinated B7-2 (ub -B7-2) was clearly shown, but when wild-type c-MIR was not expressed (Cont in the figure) and when mutant c-MIR was expressed (mZn c-MIR in the figure) ), Ubiquitination was not observed. In addition, in order to confirm the expression level of c-MIR and mZn c-MIR in each cell lysate, the results of blotting with anti-His antibody are shown in the lower panel.
As a result, c-MIR was shown to function as an E3 ubiquitin ligase for the B7-2 molecule via its BKS-PHD / LAP zinc finger domain.
[Example 5: Ubiquitination is essential for downregulation of the B7-2 molecule via c-MIR]
So far, it has been shown that c-MIR is (1) a regulator of the expression of B7-2 molecule on the cell surface (modulator) and (2) a novel E3 ubiquitin ligase for B7-2 molecule. However, it is unclear whether ubiquitination is essential for down-regulation of cell surface expression of the B7-2 molecule. In order to confirm this point, the mZn c-MIR mutant that failed to ubiquitinate wild-type c-MIR (wt-c-MIR) and B7-2 molecule was transiently expressed in BJAB cells by electroporation. Then, the expression on the cell surface of the B7-2 molecule was examined by a two-color flow cytometry method. The result is shown in FIG. As shown in the figure, mZn c-MIR did not suppress the expression of B7-2 molecule.
Next, the following experiment was performed using the CD8 chimeric protein. The KSHV K5 protein is known to ubiquitinate a lysine residue located in the cytoplasm of the target molecule. Therefore, in order to investigate whether c-MIR is the same, all lysine residues located in the cytoplasmic region of the B7-2 molecule in the CD8 / B7-2 chimeric protein described above were changed to arginine by PCR-based mutagenesis. In addition, the amino terminus was epitope-tagged with a Flag tag (this chimeric protein is referred to as “B7-KR”). Furthermore, the CD8 / B7-2 chimeric protein not subjected to the above modification was also epitope-tagged with a Flag tag (this chimeric protein is referred to as “wt-B7”).
The B7-KR or wt-B7 was co-expressed in 293T cells together with HA-tagged ubiquitin and c-MIR and subjected to the same experiment as in FIG. 6 (c). The result is shown in FIG. As shown in the figure, as a result of blot analysis using anti-HA antibody and anti-Flag antibody, ubiquitination via c-MIR (in the figure, ub-Flag-CD8 chimera) was observed in wt-B7. In -KR, c-MIR-mediated ubiquitination was not observed.
In order to investigate the relationship between ubiquitination of B7-2 molecule and its expression suppression (down-regulation), wt-B7 and B7-KR were expressed in BJAB cells (control cells) and c-MIR cells, and CD8 surface expression Levels were compared by flow cytometry. The result is shown in FIG. As shown in the figure, wt-B7 expression was suppressed in c-MIR cells, but B7-KR expression was not suppressed in c-MIR cells. This result indicates that ubiquitination of lysine residues in the cytoplasmic region of the B7-2 molecule is necessary for its down-regulation.
Example 6: Specific ubiquitination and down-regulation of B7-2 molecule through intermolecular interactions
Since E3 ubiquitin ligase is thought to function through binding to a target molecule, the intermolecular interaction between c-MIR and B7-2 was examined next. After CD8-B7 and c-MIR, which are the same molecules as wt-B7 used in the experiment of FIG. 7 (b), were expressed alone or co-expressed in 293T cells, the cell lysate was immunoprecipitated with anti-Flag antibody. , And subjected to immunoblot analysis with an anti-V5 antibody that recognizes c-MIR. The result is shown in the upper panel of FIG.
As shown in the figure, since a specific band corresponding to c-MIR was detected only when c-MIR and CD8-B7 were co-expressed, intermolecular interaction between c-MIR and B7-2 Was confirmed. In addition, the expression level of CD8 chimeric protein and the expression level of c-MIR were confirmed with anti-Flag antibody (middle panel) and anti-V5 antibody (lower panel), respectively.
Incidentally, it has been reported that the transmembrane region of KSHV K3 and K5 proteins is involved in specific targeting through binding to the transmembrane region of the target molecule. If the binding between c-MIR and the target molecule is the same, the mZn c-MIR mutant has a wild-type transmembrane region, and is considered to have the binding ability to the target molecule. . In order to confirm this hypothesis, mZn c-MIR was subjected to the same experiment as FIG. The result is shown in FIG. As shown in the figure, a specific band corresponding to mZn c-MIR was detected only when mZn c-MIR and CD8-B7 were co-expressed. In both experiments of FIGS. 8A and 8B, the mZn c-MIR and CD8-B7 conjugates were detected more easily than the c-MIR and CD8-B7 conjugates. This is thought to be due to the instability of the c-MIR conjugates.
In order to examine whether the specific down-regulation of the B7-2 molecule by c-MIR is due to the interaction between molecules, an experiment using the CD8 / A2 chimeric protein was performed. This is because the expression on the cell surface of the CD8 / A2 chimeric protein was not down-regulated in c-MIR cells (see FIG. 5). CD8 / A2 was modified to have a Flag epitope tag at its amino terminus (this chimeric protein is referred to as “CD8-A2”). Then, CD8-A2 or CD8-B7 was coexpressed with mZn c-MIR in 293T cells, and the intermolecular interaction was examined by immunoprecipitation-immunoblot method. As described above, mZn c-MIR was used in this experiment because it is easy to detect a c-MIR conjugate. In this experiment, each cell lysate of CD8-A2-expressing cells and CD8-B7-expressing cells was immunoprecipitated with anti-HA antibody or anti-Flag antibody, and immunoblot analysis was performed with anti-V5 antibody (upper) or anti-Flag antibody (middle). Went. The result is shown in FIG. The results of immunoblot analysis of both cell lysates with anti-V5 antibody are also shown below.
As shown in the figure, CD8-B7 and mZn c-MIR co-precipitated, but CD8-A2 and mZn c-MIR did not co-precipitate. This result indicates that intermolecular interactions are essential for the specific down-regulation of B7-2 molecules via c-MIR.
Next, in order to investigate the relationship between intermolecular interaction and ubiquitination, the above CD8-A2 and CD8-B7 were subjected to the same experiment as in FIG. 7B. The result is shown in FIG. As shown in the figure, sufficient ubiquitination (ub-CD8 chimera) was observed in CD8-B7 compared to CD8-A2. This result indicates that intermolecular interactions are essential for c-MIR-mediated ubiquitination and subsequent target molecule down-regulation.
The molecular mechanism of c-MIR considered from the above experimental results is shown in FIG. As shown in the figure, c-MIR binds to the B7-2 molecule via a transmembrane site. Thereafter, ubiquitin (Ubi) is transported to each lysine residue (K) in the intracellular region of the B7-2 molecule from the E2 ubiquitin converting enzyme (E2) bound to the PHD / LAP domain (PHD). The B7-2 molecule is ubiquitinated. The ubiquitinated B7-2 molecule is endocytosed from the cell surface, transported to lysosomes and degraded.
[Example 7: Functional and structurally similar molecule HSPC240 of c-MIR]
As a result of searching for a novel human E3 ubiquitin ligase homologous to c-MIR, five genes / proteins were identified as structurally similar molecules of c-MIR. FIG. 10 shows the amino acid sequence of HSPC240 (the same sequence is also shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing). In the figure, the underline indicates the BKS-PHD / LAP zinc finger motif. It was examined whether HSPC240 suppresses the expression of antigen presentation-related molecules. Specifically, HSBC240 is transiently expressed in BJAB cells, and MHC class I molecule (MHC I), MHC class II (MHC II / DR) molecule, ICAM-1 molecule, and B7-2 molecule on the cell surface. Expression was examined by flow cytometry. The result is shown in FIG. As shown in the figure, the expression of B7-2 molecule was remarkably suppressed by the expression of HSPC240, but the expression of each molecule of MHC I, MHC II, and ICAM-1 was not suppressed. This result indicates that HSPC240 specifically suppresses the expression of B7-2 molecule on the cell surface and suppresses the expression of antigen-presenting-related molecules like c-MIR. .
[Example 8: Inhibition of expression of MHC class II molecule and B7-2 molecule by c-MIR strongly suppresses antigen presentation function]
c-MIR-expressing A20.2J cells were prepared and OVA 323-339 Specific IA d Using restricted Th1 clone, 42-6A, OVA or OVA 323-339 The antigen presentation function for the peptide was examined using IL-2 production as an index. As a result of using OVA in FIG. 12A, FIG. 12B shows OVA. 323-339 The result using a peptide is shown. The dotted line shows the result of the control cell, and the solid line shows the result of the c-MIR overexpressing cell. In addition, IL-2 in the culture supernatant was measured by ELISA after 24 hours for OVA and 6 hours for the peptide. As is apparent from this result, OVA or OVA 323-339 The antigen presentation function for the peptide was markedly suppressed.

産業上の利用の可能性Industrial applicability

本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものであり、前述したとおり、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用できるほか種々の有用性を有する。したがって、本発明は、各種医薬品産業等、広く医療の発展に寄与するものと考えられる。  The present invention relates to a novel mammal-derived protein that negatively regulates the expression of B7-2 molecule or MHC class II molecule on the cell surface and use thereof, as described above, development of a new immunosuppressive method, cell, It can be used to suppress rejection during organ transplantation, treat autoimmune diseases, and develop new drugs. Accordingly, the present invention is considered to contribute widely to medical development in various pharmaceutical industries.

Claims (12)

以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに記載のタンパク質：
（ａ）配列番号２または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または１４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有しているタンパク質；および
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の７８〜１３７番目からなるタンパク質。 The protein according to any one of the following (a) to (c) :
(A) shown in SEQ ID NO: 2 or 1 4 protein consisting luer amino acid sequence;
(B) in luer amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 1 4, one or several amino acid substitution, deletion, insertion, and / or added in the amino acid sequence, and, E3 ubiquitin ligase A protein having activity ; and
(C) a protein consisting of positions 78 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御する、請求の範囲１記載のタンパク質。The protein according to claim 1 , which negatively controls the expression of B 7-2 molecule on the cell surface. ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する、請求の範囲１に記載のタンパク質。Controlling the cell surface expression of the M HC Class II molecules negatively, the protein according to claim 1, wherein. 請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質に対する、抗体。To the protein according to any one of the ranges 1-3 claims, antibody. 請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質をコードする、遺伝子。Encoding the protein according to any one of the range 1-3 of claims genes. 配列番号１または１３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する、請求の範囲５記載の遺伝子。Having a base sequence that Ru shown in SEQ ID NO: 1 or 1 3 as an open reading frame region, a gene of the range 5 wherein claims. 配列番号１または１３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有しているタンパク質をコードする、遺伝子。A DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising a base sequence complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 1 3, and encodes a protein having an E3 ubiquitin ligase activity, gene. 請求の範囲５〜７の何れか１項に記載の遺伝子を含む、組換え発現ベクター。In any one of the range 5-7 according containing the gene described recombinant expression vector. 請求の範囲５〜７の何れか１項に記載の遺伝子が導入された、形質転換体。Gene according to any one of the range 5-7 according was introduced, the transformant. 請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質、または、請求の範囲５〜７の何れか１項に記載の遺伝子を含む、免疫抑制剤。Protein according to any one of the range 1-3 of claims or comprises a gene of any one of the range 5-7 according immunosuppressive agent. 請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質と、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子とを用いることを特徴とする、請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を調節する物質のスクリーニング方法。 The protein according to any one of claims 1 to 3 , wherein the protein according to any one of claims 1 to 3 and a B7-2 molecule or an MHC class II molecule are used. Screening methods for substances that modulate the E3 ubiquitin ligase activity . 請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質と、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子とを用いることを特徴とする、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有している物質のスクリーニング方法。A method for screening a substance having E3 ubiquitin ligase activity, comprising using the protein according to any one of claims 1 to 3 and a B7-2 molecule or an MHC class II molecule .
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