JP4504689B2 - 除草剤の標的としてのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ - Google Patents

Description

本発明は、除草剤の新規標的としてのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．１．２．１）、並びに、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、これが存在しない場合には成長遅延状態やクロロティックリーフとなる、配列番号３及び該核酸配列の機能的等価物、又は配列番号７及び該核酸配列の機能的等価物を含む核酸配列に関する。さらに、本発明は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを阻害する除草剤活性を有する化合物の同定方法における、上記核酸配列、配列番号３若しくは配列番号７の機能的類似体、又は上記核酸配列の１つによりコードされるポリペプチドの使用、並びに、上記方法により同定された化合物の除草剤としての使用に関する。

特定の標的を阻害することにより除草剤を同定する基本的な原理は公知である（例えば米国特許第５，１８７，０７１号、ＷＯ９８／３３９２５号、ＷＯ００／７７１８５号）。一般に、除草剤の新規標的となる可能性のある酵素を検出することが非常に望まれている。その理由は、既知の標的に対して作用する除草剤の有効成分は耐性の確立という問題があるためであり、活性範囲ができる限り広く、環境にやさしく、また毒性学的に適合性があり、及び／又は適用率が低いことにより区別される新規な除草剤有効成分を同定するための努力が常になされている。

実際には、新規な標的の検出は常に非常に困難である。なぜなら、代謝経路回転の一部である酵素の阻害は、植物の成長に対してさらなる影響を及ぼすことはない。その理由は、植物が、その存在が知られていない他の代謝経路に転換するか、あるいは阻害される酵素が代謝経路を律速するものではない可能性があるためである。さらに、植物ゲノムは高度に機能的な冗長性により区別される。シロイヌナズナゲノムにおいては、昆虫又は哺乳動物の場合と比較して機能的に等価な酵素が多くの遺伝子ファミリーに見出される（Nature, 2000, 408(6814):796-815）。この仮説は、今までのところ、シロイヌナズナにＴ−ＤＮＡ又はトランスポゾンを挿入することによる大きな遺伝子のノックアウト手法が、予想されたよりも低い表現型の発現をもたらしたという事実により実験的に確認されている（Curr. Op. Plant Biol. 4, 2001, pp.111-117）。

本発明の目的は、植物の成長に必須の新規標的、又はその阻害によって植物成長が低減する新規標的を同定すること、並びに、除草剤活性を有する化合物の同定に好適な方法を提供することである。

本発明者は、上記目的が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）を除草剤の新規標的とし、以下のＳＨＭＴの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列：
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｃ）配列番号３に対して少なくとも９１％の同一性を有する一部領域を含む、配列番号３の核酸配列の機能的等価物；並びに
以下を含む核酸配列：
ａ）配列番号７に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｃ）配列番号７に対して少なくとも８８％の同一性を有する一部領域を含む、配列番号７の核酸配列の機能的等価物、
を用いることにより達成されることを見出した。

「含んでいる（comprising）」又は「含む（comprise）」という用語は、核酸又はアミノ酸配列を参照する場合、本発明に係る核酸配列が、３’末端又は５’末端に付加的な核酸配列を含む可能性があることを意味すると理解される。ここで、付加的な核酸配列の長さは、本発明に係る核酸配列の５’末端及び３’末端において２０００ｂｐを超えず、好ましくは５’末端において１５００ｂｐで３’末端で１００ｂｐである。

さらに、本明細書で使用される用語は以下に定義する。

「アフィニティタグ」：
これは、そのコード核酸配列を、通常のクローニング手法を用いて、直接又はリンカーにより本発明に係る核酸配列と融合させうるペプチド又はポリペプチドを指す。アフィニティタグは、全細胞抽出物からのアフィニティクロマトグラフィーによる組換え標的タンパク質の単離、濃縮及び／又は特定の精製に役立つ。上記リンカーは、プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン又は第Ｘａ因子の切断部位）を含むことが有利であり、それによりアフィニティタグは必要な場合に標的タンパク質から切り出すことができる。一般的なアフィニティタグの例は、例えばquiagen及びhilden製の「Ｈｉｓタグ」、「Ｓｔｒｅｐタグ」、「Ｍｙｃタグ」（Invitrogen, Carlsberg）、キチン結合ドメイン及びインテインからなるNew England Biolabs製のタグ、New England Biolabs製のマルトース結合タンパク質（ｐＭａｌ）、及びNovagen製のＣＢＤタグとして知られるタグがある。アフィニティタグは、標的タンパク質をコードする配列と共に、コード核酸配列の５’末端又は３’末端に結合させうる。

「アンチセンス又は共抑制法」：
これは、遺伝子発現の抑制（低減）のための技術であり、抑制しようとする天然遺伝子の一部をコードする遺伝子（対象の実験において特定される）を、好適なプロモーターの制御下にて「センス」又は「アンチセンス」配向でモデル植物に形質転換するものである。一般に、天然遺伝子の転写の抑制は、適当な方法を用いて検出することができるが、この抑制の程度は、このようにして作出されたトランスジェニック植物においては種々の程度である。従って、この技術によって、生物に対する、発現が低減されている遺伝子の影響を研究することができる（概説については、Trends in Plant Science, 2000, 5(9), 394-396参照）。

「酵素活性／活性アッセイ」：
酵素活性という用語は、酵素が基質をある産物に変換する能力をいう。酵素活性は、産物の増大、基質（若しくは出発物質）の低減、又は特定の補因子の低減、あるいは上記パラメータの少なくとも２つの組み合わせを、時間経過の関数として調べる活性アッセイとして知られている方法において測定することができる。

「セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの生物学的活性」：
本発明の目的のため、上記用語は、成長及び生存能力がセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、好ましくはグリオキシソームセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの存在により付与されることを意味する。グリオキシソームセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの生物学的活性を有するタンパク質の活性が阻害されると、植物の成長が抑制されたり、成長が停止したり又は死に至る。

「発現カセット」：
発現カセットは、少なくとも１つの遺伝子制御配列（プロモーターなど）と機能的に連結した本発明に係る核酸配列、及び有利にはさらなる制御配列（ターミネーターなど）を含むものである。発現カセットの核酸配列は、例えばゲノムＤＮＡ配列若しくは相補的ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ配列とすることができ、半合成又は完全合成類似体であってもよい。これらの配列は、直鎖状又は環状で、染色体とは別に又はゲノム中に組み込まれて存在することができる。対象の核酸配列は、合成してもよいし若しくは天然に得てもよく、又は合成ＤＮＡ成分と天然ＤＮＡ成分との混合物であってもよい。あるいは、種々の生物に由来する種々の異種遺伝子断片から構成されるものであってもよい。

本発明においては、人工核酸配列もまた、それらが細胞又は生物において本発明に係る核酸配列によりコードされるＳＨＭＴの生物学的活性を有するポリペプチドを発現可能である限り好適である。例えば、合成ヌクレオチド配列は、形質転換しようとする生物のコドン用法に関して最適化されるように作製することができる。

上記ヌクレオチド配列は全て、公知の方法において化学合成により、例えば二重らせんの個々の重複する相補的ヌクレオチド単位の断片縮合などにより、ヌクレオチド単位から作製することができる。オリゴヌクレオチドは、化学的に、例えばホスホアミダイト法（Voet, Voet, 2^nd Edition, Wiley Press New York, pp. 896-897）を用いる公知の方法により合成することができる。発現カセットを調製する場合には、種々のＤＮＡ断片を、リーディングが正確な配向でありかつ正確なリーディングフレームを有するヌクレオチド配列が得られるように操作することができる。核酸断片は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)；T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)；及びAusubel, F.M. et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994)に記載されているような一般的なクローニング手法により互いに連結することができる。

「機能的連結」：
機能的（operable又はfunctional）連結は、調節配列の各々又は遺伝子制御配列の各々が、コード配列を発現させる場合に目的の機能を果たすような、調節配列又は遺伝子制御配列の配列の順序を意味するものと理解される。

「機能的等価物」：
これは、本明細書においては、配列番号３の核酸配列又は配列番号３の一部と標準的な条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞又は生物において、ＳＨＭＴの生物学的活性を有するポリペプチドを発現可能な核酸配列を意味する。従って、用語「機能的等価物」はまた、配列番号７の核酸配列又は配列番号７の一部とハイブリダイズし、かつ細胞又は生物においてＳＨＭＴの生物学的活性を有するポリペプチドを発現可能な核酸配列を含む。

ハイブリダイゼーションを実施するためには、例えば、保存領域又はその他の領域の短いオリゴヌクレオチド、約１０〜５０ｂｐ長、好ましくは１５〜４０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドを用いるのが有利である。このようなオリゴヌクレオチドは、他の関連遺伝子との比較により、当業者に公知の方法で決定することができる。しかし、本発明に係る核酸のこれより長い１００〜５００ｂｐの断片、又は完全配列をハイブリダイゼーションに用いてもよい。用いた核酸／オリゴヌクレオチドのより長い断片又は完全配列に応じて、あるいは、ハイブリダイゼーションにどのタイプの核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いるかに応じて、これらの標準的条件は変わってくる。こうして、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０℃低くなる。

標準的ハイブリダイゼーション条件とは、核酸に応じて、例えば、濃度０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）のバッファー水溶液中での４２〜５８℃の温度、さらに、５０％ホルムアミドの存在下では、例えば、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中での４２℃の温度、を意味するものと理解すべきである。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣ及び約２０〜６５℃、好ましくは約３０〜４５℃の温度が有利である。また、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合には、ハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣ及び約３０〜６５℃、好ましくは約４５〜５５℃の温度が有利である。ここに記載したこれらのハイブリダイゼーション温度は、例示のため、長さが約１００ヌクレオチドで、Ｇ＋Ｃ含量が５０％で、ホルムアミドが存在しない核酸について計算した融解温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、例えば、Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989のような遺伝学の専門書に記載されており、当業者が熟知している式を用いて、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、又はＧ＋Ｃ含量の関数として、計算することができる。当業者は、以下の文献からハイブリダイゼーションについてのさらに詳しい情報を得ることができる：Ausubel et al.（編）、1985, "Current Protocols in Molecular Biology"、John Wiley & Sons, New York；Hames and Higgins（編）、1985、"Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown（編）、1991、Essential Molecular Biology：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。

さらにまた配列番号３の機能的等価物は、配列番号３に対して特定の程度の相同性を有する一部領域を含む核酸配列、またさらには、特にセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸配列の天然又は人工の変異体を意味すると理解される。配列番号３に対して特定の程度の同一性を有する一部領域を含む核酸配列の例は、上述した配列番号７及びその機能的等価物である。

従って、本発明はまた、例えば上記核酸配列の改変によって得られるヌクレオチド配列を含む。例えば、そのような改変は、当業者に周知の技術、例えば「部位特異的突然変異誘発」「エラープローンＰＣＲ」「ＤＮＡシャフリング」（Nature 370, 1994, pp.389-391）又は「付着伸張法（Staggered Extension Process）」（Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261）などにより行いうる。かかる改変の目的は、例えば、制限酵素の切断部位のさらなる挿入、配列を末端切断するためのＤＮＡの除去、コドン最適化のための塩基の置換、又は別の配列の付加でありうる。改変型核酸配列によりコードされるタンパク質は、核酸配列の変更にもかかわらず、所望の機能を保持する必要がある。

用語「機能的等価物」はまた、目的の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列にも関する。この場合、用語「機能的等価物」は、そのアミノ酸配列が配列番号４に対し少なくとも９１％の所定の％の同一性又は相同性を有する一部領域を含むタンパク質を意味する。

従って、機能的等価物は、本明細書に記載する配列の天然に存在する変異体、及び例えば化学合成により得られるコドン用法を最適化した人工の核酸配列、並びにそれらから誘導されるアミノ酸配列を含む。

「遺伝子制御配列」：
用語「遺伝子制御配列」は、用語「調節配列」と同等であるとみなされる。これは、真核生物又は原核生物における、本発明に係る核酸の転写、及び適当であれば翻訳に影響を及ぼす配列である。その例としては、プロモーター又は「エンハンサー」配列として知られる配列である。これらの制御配列に加えて、又はこれらの配列の代わりに、これらの配列の天然の調節は、実際の構造遺伝子の前に依然として存在していてもよく、適当な場合には、天然の調節をなくして、標的遺伝子の発現が改変（すなわち増大又は低減）されるように遺伝的に改変してもよい。制御配列の選択は、宿主生物又は出発生物に応じて異なる。遺伝子制御配列は、さらに遺伝子の５’非翻訳領域、イントロン又は非コード３’領域を含みうる。制御配列は、さらに、相同組換え又は宿主生物ゲノムへの挿入を可能とする配列、あるいはゲノムからの除去を可能とする配列を意味するものと理解される。遺伝子制御配列は、さらにプロモーター、プロモーター配列又は最小プロモーター配列、発現に関する性質を改変することが可能な、クロマチン構造に影響を及ぼす配列（例えばマトリックス付着領域（ＭＡＲ））を含みうる。従って、遺伝子制御配列は、例えば、組織特異的発現がさらに特定のストレス要因に依存するという事実にも影響を受ける。このような配列は、例えば、水ストレス、アブシジン酸（Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135）、高温及び低温ストレス（Plant Cell 1994, (6): 251-264）、並びに熱ストレス（Molecular & General Genetics, 1989, 217(2-3): 246-53）について記載されている。

「相同性」：
２つの核酸配列又はポリペプチド配列間の「相同性」は、各々のケースで、配列全長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって規定され、この同一性は、プログラムアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（Wisconsin Package Version 10.0、ウィスコンシン大学、遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ）、Madison, USA）を用いたアラインメントによって、ポリペプチドについては下記のパラメーター：
ギャップ重み：８ 長さ重み：２
平均マッチ：２９１２ 平均ミスマッチ：−２００３
核酸については下記のパラメーター：
ギャップ重み：５０ 長さ重み：３
平均マッチ：１０．０００ 平均ミスマッチ：−９．０００
を設定して、計算する。

以下本明細書において、用語「同一性」は、「相同」又は「相同性」という用語の代わりに同義に使用される。

「変異」：
核酸配列又はアミノ酸配列の「変異」は、１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆転又は挿入を含み、これはまた１以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失により標的タンパク質の対応するアミノ酸配列の変化をもたらし、かつ標的タンパク質の機能的特性は、全体として本質的に保持されているものである。

「天然の遺伝的環境」：
これは、起源の生物における天然の染色体の遺伝子座を意味する。ゲノムライブラリーの場合には、核酸配列の天然の遺伝的環境は、少なくとも一部が保持されることが好ましい。この環境は、核酸配列の少なくとも５’又は３’に隣接し、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、特に好ましくは少なくとも５００ｂｐ、非常に特に好ましくは少なくとも１０００ｂｐ、最も好ましくは少なくとも５０００ｂｐの配列の長さである。

「植物」：
本発明の目的において、「植物」は、植物細胞、植物組織、植物器官、又は植物個体、例えば種子、塊茎、花、花粉、果実、苗木、根、葉、茎、又は他の植物部分である。さらに、用語「植物」は、増殖部位、例えば種子、果実、苗木、挿木、塊茎、切枝又は根塊を意味するものと理解される。

「反応時間」：
これは、活性に関する有意な知見が得られるまで活性アッセイを行うのに必要な時間を意味し、アッセイで使用するタンパク質の特異的活性、及び採用する方法、及び使用する機器の感度に応じて異なる。当業者であれば、反応時間の決定を容易に理解できる。測光法に基づいて除草剤活性を有する化合物を同定する方法の場合には、反応時間は例えば０〜１２０分である。

「組換えＤＮＡ」：
これは、組換えＤＮＡ技術により作製されうるＤＮＡ配列の組み合わせを意味する。

「組換えＤＮＡ技術」：
これは、一般的に、ＤＮＡ配列を融合するための既知の技術をいう（例えばSambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている）。

「複製起点」：
これは、微生物及び酵母における、本発明に係る発現カセット又はベクターの複製（倍化）を保証するものであり、例えば、大腸菌のｐＢＲ３２２ ｏｒｉ又はＰ１５Ａ ｏｒｉ（Sambrook et al.: “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）、及び酵母のＡＲＳ１ ｏｒｉ（Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068）がある。

「リポーター遺伝子」：
これは、容易に定量可能なタンパク質をコードする。形質転換効率又は形質転換の部位若しくは時期の評価は、これらの遺伝子を用いて、増殖アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ又は耐性アッセイにより、あるいは、光度測定（固有色）又は酵素活性によって、実施することができる。これに関しては、以下に挙げるようなリポータータンパク質が特に好ましい（Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999；13(1)：29-44）。「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）（Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996；389(1)：44-47；Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6：325-330；Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5)：912-8, 1997）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ（Giacomin, Plant Sci 1996, 116：59-72；Scikantha, J Bact 1996, 178：121；Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10：324-414）、及びルシフェラーゼ遺伝子、一般的にはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子若しくはβグルコルニダーゼ遺伝子（Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907）、又はＵｒａ３遺伝子など。

「選択マーカー」：
これは抗生物質に対する耐性を付与する。これに関する例として、下記のものを挙げることができる：アミノグリコシド系の抗生物質であるネオマイシン（Ｇ４１８）、カナマイシン、及びパロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Deshayes A et al., EMBO J. 4（1985）2731-2737）；ｈｙｇｒｏ遺伝子（Marsh JL et al., Gene. 1984；32(3)：481-485）、ｓｕｌ遺伝子（Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990；15(1)：127-136）、ハイグロマイシン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０１１９３）及びブレオマイシン抗生物質ゼオシンに対する耐性を付与する、Ｓｈｅ−ｂｌｅ遺伝子。選択マーカー遺伝子のさらに別の例として、２−デオキシグルコース−６−リン酸（ＷＯ９８／４５４５６号）又はホスフィノトリシンなどに対する耐性を付与する遺伝子、あるいは、代謝拮抗物質に対する耐性を付与するもの、例えば、ｄｈｆｒ遺伝子（Reiss, Plant Physiol.（Life Sci. Adv.）13（1994）142-149）が挙げられる。その他の好適な遺伝子として、ｔｒｐＢ又はｈｉｓＤ（Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85（1988）8047-8051）のような遺伝子がある。これら以外の好適な遺伝子としては、下記のものが挙げられる：マンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＷＯ９４／２０６２７号）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）遺伝子（McConlogue, 1987：Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory編）又はアスペルギルス・テレウスデアミナーゼ（Tamura K. et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59（1995）2336-2338）。

「形質転換」：
これは、異種ＤＮＡを原核細胞又は真核細胞に導入する方法を意味する。形質転換細胞という用語は、形質転換方法自体の産物のみならず、形質転換により作製されたトランスジェニック生物のトランスジェニック子孫の全てを意味する。

「標的／標的タンパク質」：
これは、本発明に係る核酸配列によりコードされるポリペプチドであって、典型的には酵素の形態、又は、例えば、構造タンパク質、発生タンパク質、調節タンパク質（例：転写因子）、キナーゼ、ホスファターゼ、受容体、チャネルサブユニット、輸送タンパク質、酵素複合体に対して基質若しくは活性調節を付与する調節サブユニットなどの形態でありうる。標的又は作用部位の全ては、それらの機能的な存在が生存又は正常な発生及び成長に必須であるという特徴を有する。

「トランスジェニック」：
これは、本発明に係る核酸配列、核酸配列を含む発現カセット若しくはベクター、又は上記核酸配列、発現カセット若しくはベクターで形質転換された生物を指し、トランスジェニックという用語は、標的タンパク質の核酸配列若しくは標的タンパク質の核酸配列と機能的に連結された遺伝的制御配列、又はこれらの可能な組み合わせのいずれかが天然の遺伝的環境にはないか又は組換え手法により改変されている、遺伝子操作方法により作製された構築物のすべてを意味する。これに関し、改変は、例えば、対象の核酸配列の１以上のヌクレオチド残基を変異することにより達成しうる。

本発明に係る核酸配列によりコードされるポリペプチドは、ピリドキサル−リン酸依存的セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ；Ｅ．Ｃ．２．１．２．１）の生物学的活性を示す。ＳＨＭＴは、実際、全ての細胞種に存在する。この酵素は最初にウサギの肝臓から単離され（Schirch and Mason, JBC 238, pp. 1032-1037, 1963）、その後、多数の生物（例えば植物など）から単離されている。

植物ＳＨＭＴの阻害剤はまだ報告がない。ミドリムシ（Euglena gracilis）由来のＳＨＭＴは、ミリモル濃度の種々のアミノ酸（例えばグリシン、セリン、システイン）により阻害されうる（Sakamoto et al., Agricultural and Biological Chemistry, 1991, 55(9), 2243-2249）。マイクロモル濃度のアミノ酸類似体（Ｏ−アミノ−Ｄ−セリン）は、ヒツジＳＨＭＴに対して阻害作用を有する（Baskaran et al., Biochemistry, 1989, 28(25), 9607-9612）。さらに、ミモシン（植物アミノ酸）は光結合によりＣＨＯ細胞由来のＳＨＭＴと結合しうるが、それを阻害しないことが知られている（Lin et al. JBC 271, pp. 2548-2556, 1996）。

細胞質及びミトコンドリアのＳＨＭＴ形態は、種々の代謝経路に関与し、植物において区別されうる。さらに、色素体ＳＨＭＴの存在が提唱されている（Douce et al. Trends in Plant Science 6, pp. 167-176, 2001）。細胞質ＳＨＭＴ形態は、セリンからグリシンへの可逆反応を触媒することによりプリン及びメチオニンの代謝にＣ１単位を提供することに関与している。ヒツジの細胞質ＳＨＭＴタンパク質配列は、配列番号４に対して５５．０９％の同一性を有し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３５６２３で登録されている。

アラビドプシスにおいては、５つのＳＨＭＴ遺伝子（ＳＨＭ１−５）が見出されており、このうち２つ、すなわちＳＨＭ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２７１７２６、配列番号に対する同一性７８．６５％；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４９０Ｍ９、配列番号４に対する同一性８３．７１％）及びＳＨＭ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０４９５２、配列番号４に対する同一性８３．６２％）はミトコンドリアに局在していると考えられるが、ＳＨＭ３、ＳＨＭ４及びＳＨＭ５は細胞質形態をとる（McClung et al. Plant Physiol. 123, pp381-391, 2000）。エンドウ由来のミトコンドリアＳＨＭＴがさらに記載されている（エンドウマメ（Pisum sativum）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３４８９９、配列番号４に対する同一性８３．５２％；Turner et al. JBC 267, pp. 13528-13534, 1992）。ジャガイモ（Solanum tuberosum）由来のミトコンドリアＳＨＭＴをコードする配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２５８６３、配列番号３に対する同一性９０．６２％、配列番号４に対する同一性９０．４５％、配列番号７に対する同一性８６．８％）、フラベリア・プリングレイ（Flaveria pringlei）由来のミトコンドリアＳＨＭＴをコードする配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４９３５８、配列番号４に対する同一性８６．４４％）もまた公知である。さらに、ミトコンドリアＳＨＭＴを含むと考えられるトマト（Lycopersicon esculentum）ＥＳＴ核酸配列もまた存在する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＷ０４００７９、配列番号３に対する同一性９０．０５６％）。

生化学的にＳＨＭＴ活性がまったく検出されないミトコンドリアを有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）変異体（ステム植物）が文献に記載されている。これらの変異体においては、周囲ＣＯ_２濃度において光合成が阻害され、植物は生存できない。ステム植物は、ＣＯ_２濃度が上昇した場合にのみ完全に生存することができ、周囲ＣＯ_２濃度に移された後にはクロロティック（chlorotic）となり、死滅するものもある（Somerville and Somerville, Plant Physiol. 67, 1981, pp.666-671；Somerville and Somerville, J. Exp. Bot. 34, 1983, 415-424）。変異を有するステム植物のミトコンドリアＳＨＭ遺伝子は知られていない。ＳＨＭ１の転写産物のサイズ及び量は、野生型と比較してステム変異体において変わらない。Beckmannら（Planta 202, pp. 379-386, 1997）によって、ＳＨＭ１遺伝子の可能性ある機能欠損変異がこの変異型の表現型に寄与するものではないと考えられる。それは、第２のＳＨＭＴ、すなわちＳＨＭ２によって補償されるためである。ミトコンドリアＳＨＭＴが植物に必須であり、それゆえ除草剤の好適な標的となる可能性があり、またこれはまだ明確に証明されていない。

驚くべきことに、本発明の範囲内において、配列番号３を含む核酸によりコードされる遺伝子産物は除草剤の標的として好適であることが見出された。タバコ（Nicotiana tabacum）においては目的の標的タンパク質の発現の低減を標的化することによっていずれの場合にも裏づけされている。これらの植物は、除草剤の適用によりもたらされる表現型と類似の表現型を有する。観察された症候のなかには、成長の遅延やクロロティックリーフがあり、また場合によっては植物全体又は植物の一部が死滅する。

本発明は、植物ＳＨＭＴ（本明細書において以下、簡便にするため単に「ＳＨＭＴ」ともいう）、好ましくはミトコンドリアＳＨＭＴ、及び除草剤の新規標的のためのそれらの使用に関する。「ＳＨＭＴ」という用語は、好ましくはミトコンドリアＳＨＭＴを意味する。本発明の特許請求の範囲は、ＳＨＭＴの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であり、以下の核酸：
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｃ）配列番号３に対して少なくとも９１％の同一性を有する一部領域を含む配列番号３の核酸配列の機能的等価物、
を含む。

本明細書においては、ミトコンドリアＳＨＭＴをコードする核酸配列が好ましい。

ｃ）に記載の核酸配列の例としては、配列番号３に対して１００％の同一性を有する一部領域を含む配列番号７である。従って、本発明の特許請求の範囲はまた、ＳＨＭＴの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であり、以下の核酸：
ａ）配列番号７に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｃ）配列番号７に対して少なくとも８８％の同一性を有する、配列番号７の核酸配列の機能的等価物、
を含む。

用語「ＳＨＭＴ」の定義から明らかなように、本明細書においては、ミトコンドリアＳＨＭＴをコードする核酸配列が好ましい。

上記核酸配列を、本明細書において以下、「本発明に係る核酸配列」という。

本発明に係る核酸配列によりコードされるポリペプチドの量の低減は、植物において成長の遅延及びクロロティックリーフを引き起こす。ポリペプチドの低減とは、ポリペプチドの量が組換え方法により低減することを意味する。このようにして改変された植物は、このポリペプチドに関して遺伝的に改変されていないが、同一の成長条件下で遺伝的に操作した植物の遺伝子型と同一の遺伝子型を有する植物と比較する。

本発明はまた、望ましくない植物の防除に好適な除草剤の新規標的となりうる、本発明に係る核酸の遺伝子産物に関する。

望ましくない植物は、広い意味で、望ましくない位置に成長する植物すべてを意味するものと理解され、例えば以下のものである：
下記属に属する双子葉の雑草：
カラシ（Sinapis）、マメグンバイナズナ（Lepidium）、ヤエムグラ（Galium）、ハコベ（Stellaria）、マトリカリア（Matricaria）、アンセミス（Anthemis）、ハキダメギク（Galinsoga）、アカザ（Chenopodium）、イラクサ（Urtica）、セネシオ（Senecio）、ヒユ（Amaranthus）、スベリヒユ（Portulaca）、オナモミ（Xanthium）、サンシキヒルガオ（Convolvulus）、サツマイモ（Ipomoea）、タデ（Polygonum）、セスバニア（Sesbania）、ブタクサ（Ambrosia）、キルシウム（Cirsium）、ヒレアザミ（Carduus）、ノゲシ（Sonchus）、ナス（Solanum）、イヌガラシ（Rorippa）、ロタラ（Rotala）、アゼトウガラシ（Lindernia）、オドリコソウ（Lamium）、クワガタソウ（Veronica）、イチビ（Abutilon）、イメックス（Emex）、チョウセンアサガオ（Datura）、スミレ（Viola）、チシマオドリコソウ（Galeopsis）、ケシ（Papaver）、ヤグルマギク（Centaurea）、シャジクソウ（Trifolium）、キンポウゲ（Ranunculus）、タンポポ（Taraxacum)
下記属に属する単子葉の雑草：
ヒエ（Echinochloa）、エノコログサ（Setaria）、キビ（Panicum）、ヒメシバ（Digitaria）、アワガエリ（Phleum）、イチゴツナギ（Poa）、ウシノケグサ（Festuca）、オヒシバ（Eleusine）、ビロードキビ（Brachiaria）、ライグラス（Lolium）、イヌムギ（Bromus）、カラスムギ（Avena）、カヤツリグサ（Cyperus）、モロコシ（Sorghum）、カモジグサ（Agropyron）、ギョウギシバ（Cynodon）、ミズアオイ（Monochoria）、テンツキ（Fimbristyslis）、オモダカ（Sagittaria）、ハリイ（Eleocharis）、フトイ（Scirpus）、スズメノヒエ（Paspalum）、カモノハシ（Ischaemum）、ナガボノウルシ（Sphenoclea）、タツノツメガヤ（Dactyloctenium）、コヌカグサ（Agrostis）、スズメノテッポウ（Alopecurus）、セイヨウヌカボ（Apera）。

配列番号３の機能的等価物は、配列番号３に対して、少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、９３％及び９４％、好ましくは少なくとも９５％又は９６％、特に好ましくは少なくとも９７％又は９８％、特に非常に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する一部領域を含む。

配列番号４の機能的等価物は、配列番号３に対して、少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、９３％及び９４％、好ましくは少なくとも９５％又は９６％、特に好ましくは少なくとも９７％又は９８％、特に非常に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する一部領域を含む。

配列番号７の機能的等価物は、配列番号７に対して、少なくとも８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、特に好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する。

配列番号３又は配列番号３の一部は、対応する全長遺伝子を単離することができる方法により、ハイブリダイゼーションプローブの調製に用いることができる。同様に、配列番号７又は配列番号７の一部を用いることができる。これらのプローブの調製及び実験手順は公知である。例えば、ＰＣＲにより放射性又は非放射性のプローブを個々に作製し、好適に標識されたオリゴヌクレオチドを使用し、続いてハイブリダイゼーション実験を行うことにより実施することができる 。この目的に必要な技術は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されている。対象のプローブは、標準的な技法により修飾することができ（Ｌｉｔ．ＳＤＭ又はランダム突然変異誘発法）、さらに別の目的で、例えば他の生物における対応する配列を分析するために、ｍＲＮＡ及び対応するコード配列と特異的にハイブリダイズするプローブとして用いることができる。

さらに、上記プローブは、配列同一性に基づいて、配列番号３（又は配列番号７）の他の植物種に由来する機能的等価物の検出及び単離にも使用することができる。本明細書においては、対象の配列番号３（又は配列番号７）の配列の一部又は全部を、対象の植物種のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、あるいは電子的データベースの機能的等価物の配列のコンピュータ検索において使用することができる。

好ましい植物種は、上述した望ましくない植物である。

本発明はさらに、以下：
ａ）本発明に係る核酸配列と機能的に連結させた遺伝子制御配列；又は
ｂ）さらなる機能的配列；又は
ｃ）上記ａ）及びｂ）の組み合わせ、
を含む発現カセットに関する。

本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系において使用することが可能なＳＨＭＴを発現するための、上記発現カセットの使用、及び、上記構成要素ａ）及びｂ）又はｃ）を含む発現カセットの使用であって、ａ）の核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％及び７０％、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、特に好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、非常に特に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する一部領域を含む上記使用に関する。従って、配列番号３に対して少なくとも６０％の同一性を有する一部領域を含む上記ａ）の核酸配列はまた、少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、好ましくは少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％及び７０％、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、特に好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、非常に特に好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列番号７の機能的等価物を含む。上記の発現カセットの実施形態はいずれも、本明細書において以下、本発明に係る発現カセットと称する。

好ましい実施形態において、本発明に係る発現カセットは、コード配列の５’末端にプロモーターを、３’末端に転写終止シグナルを含み、必要であれば、さらにＳＨＭＴをコードする挿入核酸配列と機能的に連結した別の遺伝子制御配列を含む。

本発明に係る発現カセットはまた、例えば１つのポリヌクレオチド上の個々の核酸配列の組み合わせ（複数の構築物）又は細胞内における複数のポリヌクレオチド上の個々の核酸配列の組み合わせ（共形質転換）によって、あるいは連続的な形質転換によって提供することも可能である。

本発明に係る発現カセット又は本発明に係る発現カセットを含むベクターのための上記構成要素ａ）の有利な遺伝子制御配列の例は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ、若しくはλ−ＰＬプロモーターなどであり、これらはすべて、グラム陰性細菌株においてＳＨＭＴを発現させるのに用いることができる。

さらに有利な遺伝子制御配列の例は、例えば、プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２（これらはいずれもグラム陽性菌株においてＳＨＭＴを発現させるために用いることができる）、又は酵母若しくは真菌由来プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、ＡＯＸ１及びＧＡＰ（これらはすべて酵母菌株においてＳＨＭＴを発現させるために用いることができる）がある。

昆虫細胞における発現に好適な遺伝子制御配列の例は、多角体プロモーター及びｐ１０プロモーターである（Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55）。

細胞培養物においてＳＨＭＴを発現するための有利な遺伝子制御配列は、ポリアデニル化配列に加えて、例えばウイルス起源のシミアンウイルス４０真核性プロモーターに由来するもの、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス又はシミアンウイルス４０のプロモーターなどがある。

植物においてＳＨＭＴを発現するための別の有利な遺伝子制御配列は、植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ［Franck et al., Cell 21(1980) 285-294］、ＰＲＰ１［Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)］、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ＬＥＢ４、ＵＳＰ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ＮＯＳ；ＦＢＰａｓｅＰ（ＷＯ９８／１８９４０号）、又はユビキチン若しくはファセオリンプロモーターであり、特に、植物プロモーター若しくは植物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーターなどのウイルス起源のプロモータが特に好ましい（Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294；Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812）。構成的プロモーター、例えばアグロバクテリウムのノパリンシンターゼプロモーター、ＴＲ二重プロモーター、アグロバクテリウムのＯＣＳ（オクトピンシンターゼ）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649）、液胞ＡＴＰａｓｅサブユニットのプロモーター、又はコムギプロリンリッチタンパク質のプロモーター（ＷＯ９１／１３９９１号）がさらに好ましい。

発現カセットは、遺伝子制御配列として化学的に誘導可能なプロモーターを含んでいてもよく、かかるプロモーターを用いると、植物において外因性遺伝子の発現を特定の時点に制御することができる。このようなプロモーター、例えば、ＰＲＰ１プロモーター（Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361-366（1993））、サリチル酸誘導プロモーター（ＷＯ９５／１９４４３号）、ベンゼンスルホンアミド誘導プロモーター（ＥＰ−Ａ−０３８８１８６号）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Gatz et al., Plant J. 2, 397-404（1992））、アブシジン酸誘導プロモーター（ＥＰ−Ａ−０３３５５２８号）、又はエタノール若しくはシクロヘキサノン誘導プロモーター（ＷＯ９３／２１３３４号）を用いることができる。

さらに、好適なプロモーターは、組織特異的又は器官特異的発現を付与するものであり、例えば、葯、卵巣、花序及び花器、葉、気孔、トリコーム、茎、維管束組織、根及び種子における発現を付与するプロモーターである。上記構成的プロモーターの他の好適なプロモーターとしては、特に葉特異的発現を指令するプロモーターである。特に例示すべきプロモーターは、ジャガイモ細胞質ＦＢＰａｓｅプロモーター（ＷＯ９７／０５９００号）、ルビスコ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ）ＳＳＵ（小サブユニット）プロモーター又はジャガイモ由来のＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245）である。さらに好ましいプロモーターは、種子及び植物胚における発現を制御するものである。種子特異的プロモーターの例は、ファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号；Bustos MM et al., Plant Cell. 1989;1(9):839-53）、２Ｓアルブミン遺伝子のプロモーター（Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262:12196-12201）、レグミンプロモーター（Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2):326-331）、ＵＳＰ（未知の種子タンパク質）プロモーター（Baumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3):459-67）、ナピン遺伝子プロモーター（Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199:515-519）、スクロース結合タンパク質プロモーター（ＷＯ００／２６３８８号）又はＬｅＢ４プロモーター（Baumlein H et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128；Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090）である。

遺伝子制御配列として好適な別のプロモーターは、例えば、塊茎、貯蔵根又は根に特異的なプロモーター、例えばクラスＩパタチンプロモーター（Ｂ３３）、ジャガイモカテプシンＤインヒビタープロモーター、スターチシンターゼ（ＧＢＳＳ１）プロモーター、又はスポラミンプロモーターなど、果実特異的プロモーター、例えばトマト由来の果実特異的プロモーター（ＥＰ−Ａ４０９６２５号）など、果実成熟特異的プロモーター、例えばトマト由来の果実成熟特異的プロモーター（ＷＯ９４／２１７９４号）など、花序特異的プロモーター、例えばフィトエンシンターゼプロモーター（ＷＯ９２／１６６３５号）又はＰ−ｒｒ遺伝子のプロモーター（ＷＯ９８／２２５９３号）など、あるいは色素体有色体特異的プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＷＯ９７／０６２５０号）、又はダイズホスホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８７９９９も参照のこと）、あるいは別の結節特異的プロモーター（ＥＰ−Ａ２４９６７６号に記載）が挙げられる。

さらなる機能的配列ｂ）は、限定するものではないが、例えば、ＳＨＭＴと直接又は場合によりプロテアーゼ切断部位を含んでもよいリンカーを介して融合させた、リポーター遺伝子、複製起点、選択マーカー及びアフィニティタグとして知られるもの、を意味するものと理解される。別の好適なさらなる機能的配列は、産物がアポプラスト、色素体、液胞、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、小胞体（ＥＲ）に標的化されるようにする配列、あるいは、そのような機能配列がないために産物が形成された細胞小器官（例えば細胞質）に維持されるようにする配列である（Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423）。

本発明においては、本発明に係る核酸配列及び／又は本発明に係る発現カセットを少なくとも１コピー含むベクターである。

プラスミド以外にも、ベクターは、当業者が熟知しているその他のあらゆるベクターを包含すると理解すべきであり、例えば、ファージや、ＳＶ４０、ＣＭＢ、バキュロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、又は線状若しくは環状ＤＮＡを挙げることができる。これらのベクターは、宿主生物における自律複製又は染色体複製が可能であり、染色体複製が好ましい。

ベクターの別の実施形態では、本発明に係る核酸構築物は線状ＤＮＡの形態で生物に導入し、非相同又は相同的組換えにより宿主生物のゲノムに組み込むこともできる。この線状ＤＮＡは、線状化されたプラスミド、又はベクターとしての核酸構築物のみ、あるいは用いた核酸配列からなるものであってもよい。

さらに、原核生物又は真核生物発現系については、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual.” 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第１６節及び第１７節に記載されている。別の有利なベクターはHellensら（Trends in plant science, 5, 2000）に記載されている。

さらに、本発明に係る発現カセット及びそれから誘導されるベクターを用いて、ＳＨＭＴを組換えにより産生する目的で、細菌、シアノバクテリア、酵母、糸状菌及び藻類、並びに非ヒト真核細胞（例えば昆虫細胞）を形質転換することができ、好適な発現カセットの作製はそれを発現させようとする生物により異なる。

さらに有利な実施形態では、本発明に係る方法で用いる核酸配列を単独で生物に導入することも可能である。

核酸配列のほかに、別の遺伝子を生物に導入する場合には、単一のベクターでそれらすべてを一緒に生物に導入するか、あるいは、個々の遺伝子をそれぞれ１つのベクターで生物に導入することができ、各種ベクターは同時に導入しても、順次導入してもよい。

本発明において、本発明に係る核酸、発現カセット若しくはベクターの対象生物への導入（形質転換）は、基本的に、当業者に公知のあらゆる方法により行うことができる。

微生物の場合、当業者であれば、Sambrook, J. et al., (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press、von F.M. Ausubel et al., (1994) "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons；D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)；Kaiser et al., (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press；又はGuthrie et al., "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic Pressの教科書に好適な方法を見出すことができる。

双子葉植物の場合には、植物の形質転換と植物組織又は植物細胞からの植物の再生について記載されている方法を一過性又は安定な形質転換に用いることができる。好適な方法は、バイオリスティック法（微粒子銃）又はプロトプラストの形質転換（例えば、Willmitzer, L., 1993 Transgenic Plants. : Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise（H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P.Stadler編）, Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge）、エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション、及びアグロバクテリウム媒介遺伝子導入がある。上記の方法は、例えばB. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. Kung and R. Wu編, Academic Press (1993) 128-143；及びPotrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Biol. 42 (1991) 205-225）に記載されている。

アグロバクテリウムを用いる形質転換及び形質転換に使用するベクターは当業者に公知であり、文献に多く記載されている（Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711）。媒介ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に対して相同な配列を有するために相同組換えによりアグロバクテリウムのＴｉ又はＲｉプラスミドに組み込むことができる。このプラスミドはさらに、Ｔ−ＤＮＡを導入するために必要なｖｉｒ領域を含む。媒介ベクターはアグロバクテリウムにおいて複製することができない。媒介ベクターは、ヘルパープラスミドを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入することができる（共役）。バイナリーベクターは大腸菌及びアグロバクテリウムの両方において複製することができる。これらは、マーカー遺伝子の選択、並びにＴ−ＤＮＡの右側及び左側境界領域と隣接するリンカー又はポリリンカーを含む。これらは、直接アグロバクテリウムに形質転換することができる（Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187）；ＥＰＡ０１２０５１６号；Hoekema, : The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V；Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46；及びAn et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287）。

アグロバクテリウムに基づくベクターを用いた単子葉植物の形質転換もまた記載されている（Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506；Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271-282；Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34；Wilmink et al, Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80；May et al; Biotechnology 13 (1995) 486-492；Conner and Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992) 550-555；Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265）。単子葉植物の形質転換のための別の系は、バイオリスティック手法（微粒子銃）を用いた形質転換（Wan and Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48；Vasil et al; Biotechnology 11 (1992), 667-674；Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325；Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性とした細胞のエレクトロポレーション、及びガラスファイバーを用いたＤＮＡの導入である。特に、トウモロコシの形質転換については反復的に文献に記載されている（ＷＯ９５／０６１２８号；ＥＰ０５１３８４９Ａ１号；ＥＰ０４６５８７５Ａ１号；ＥＰ０２９２４３５Ａ１号；Fromm et al, Biotechnology 8 (1990), 833-844；Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618；Koziel et al, Biotechnology 11(1993) 194-200；Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726）。

他の穀類種、例えばオオムギ（Wan and Lemaux、上記参照；Ritala et al、上記参照）及びコムギ（Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297）の形質転換もまたその成功例が記載されている。

本発明に係るベクターで形質転換したアグロバクテリウムは、植物、特に、シロイヌナズナなどの実験植物、又は、穀類、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ニンジン、トウガラシ、ナタネ、タピオカ、キャッサバ、クズ、マンジュギク、アルファルファ、レタス及び各種樹木、堅果及びブドウなどの作物植物を形質転換する公知の方法、例えば、表皮処理した葉又は葉切片をアグロバクテリウム溶液に浸けた後、適当な培地中で培養する方法に用いることができる。

遺伝子改変した植物細胞は、当業者に公知のあらゆる方法により再生させることができる。かかる方法は、S.D. Kung and R. Wu、Potrykus、又はHofgen and Willmitzerによる上記で引用した刊行物に見ることができる。

本発明に係る核酸配列を含む発現カセット又は上記発現カセットを含むベクターの上記実施形態の１つを用いた形質転換により作出したトランスジェニック生物、及び発現によりトランスジェニック生物から得ることができる組換えＳＨＭＴもまた本発明の範囲内である。本発明に係る発現カセットを含むトランスジェニック生物の、例えば組換えタンパク質を得るための使用、及び／又は当該生物のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系における使用は、同様に本発明の範囲内である。

組換え発現のために好ましい生物は、細菌、酵母、コケ、藻類及び真菌のみならず、真核細胞系も含まれる。

好ましいコケは、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）、及びKryptogamen [Cryptogamia], Vol.2, Moose, Farne [Mosses, Ferns], 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515)に記載される他のコケである。

好ましい細菌は、例えば、エッシュリヒア属、アーウィニア属、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属又はシアノバクテリア属由来の細菌、また例えばシネコシスティス属又はアナベナ属由来の細菌である。

好ましい酵母は、カンジダ、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンセヌラ又はピヒアである。

好ましい真菌は、アスペルジルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、アシュビア（Ashbya）、ノイロスポラ（Neurospora）、フサリウム（Fusarium）、ボーベリア（Beauveria）、モルティエレラ（Mortierella）、サポロレグニア（Saprolegnia）、ピチウム（Pythium）、又はIndian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995)に記載される他の真菌である。

好ましい植物は、特に単子葉作物植物、例えば、穀類種（コムギ、オオムギ、ソルガム若しくはアワ、ライムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ又はオートムギ、及びサトウキビ）から選択される。本発明に係るトランスジェニック植物はさらに、特に、双子葉作物植物、例えば、アブラナ科（Brassicaceae）（アブラナ、クレソン、アラビドプシス、キャベツ若しくはキャノーラなど）、マメ科（Leguminosae）（ダイズ、アルファルファ、エンドウ、ビーン若しくはラッカセイなど）、ナス科（Solanaceae）（ジャガイモ、タバコ、トマト、ナスビ若しくはトウガラシなど）、キク科（Asteraceae）（ヒマワリ、マンジュギク、レタス若しくはキンセンカなど）、ウリ科（Cucurbitaceae）（メロン、カボチャ／スカッシュ、ズッキーニなど）、又はアマニ、綿、麻、アマ、アカトウガラシ、ニンジン、サトウダイコン、あるいは種々の樹木、果実及びブドウのつる種から選択される。

原則として、トランスジェニック動物、例えば線虫（C. elegans）もまた好適な宿主生物である。

また、公に入手可能な又は市販の発現系及びベクターを使用することも好ましい。

大腸菌細菌において使用するために記載すべきベクターは、典型的に、市販の融合及び発現ベクターｐＧＥＸ［Pharmacia Biotech Inc；Smith, D.B.及びJohnson, K.S.（1988）Gene 67：31-40］、ｐＭＡＬ（New England Biolabs、マサチューセッツ州ベヴァリー）、並びに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、又はプロテインＡを含むｐＲＩＴ５（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＴｒｃベクター（Amann et al.（1988）Gene 69：301-315）、CLONTECH社（カリフォルニア州パロアルト）製の「ｐＫＫ２３３−２」、並びに、Storatagene社（La Jolla）製の「ｐＥＴ」及び「ｐＢＡＤ」ベクター系である。

酵母に使用するためのベクターは、下記のものがある：ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al.（1987）Embo J. 6：229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan及びHerskowitz,（1982）Cell 30：933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al.（1987）Gene 54：113-123）、並びに、ｐＹＥＳ誘導体、ｐＧＡＰＺ誘導体、ｐＰＩＣＺ誘導体、並びに、「ピキア発現キット」のベクター（Invitrogen Corporation（カリフォルニア州サンジエゴ）製）。糸状菌に使用するためのベクターは、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J.(1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F.Pberdy et al.編, p.1-28, Cambridge University Press: Cambridgeに記載されている。

あるいは、昆虫細胞発現ベクターも有利に用いることができ、例えば、組換えバキュロウイルスにより感染されるＳｆ９、Ｓｆ２１又はＨｉ５細胞において発現させることができる。これらの例としては、ｐＡｃ系のベクター（Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）及びｐＶＬ系のベクター（Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39）がある。使用可能な他のものとして、バキュロウイルス発現系「MaxBac 2.0 Kit」及び「Insect Select System」（Invitrogen製、Carlsbad）又は「BacPAK Baculovirus Expression System」（CLONTECH製、Palo Alto, CA）がある。昆虫細胞は、真核性タンパク質を過剰発現させるために特に好適である。なぜなら、昆虫細胞は細菌や酵母においては不可能なタンパク質の翻訳後修飾を行うことができるためである。当業者であれば、昆虫細胞の培養操作、及びタンパク質発現のための感染方法を、公知の方法と同様に実施しうることを理解しうる（Luckow and Summers, Bio/Tech. 6, 1988, pp.47-55；Glover and Hames (編) DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244）。

植物細胞又は藻類細胞は、遺伝子を有利に発現させるために用いることができる別の細胞である。植物発現ベクターの例は、Becker, D. et al.（1992） "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20：1195-1197、又はBevan, M.W.（1984） "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12：8711-8721に報告されている。

さらに、本発明に係る核酸配列は哺乳動物細胞において発現させることができる。好適な発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣであり、これについては、Seed, B.（1987）Nature 329：840又はKaufman et al.（1987）EMBO J. 6：187-195に記載されている。本発明において好ましく用いられるプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス又はシミアンウイルス４０のプロモーターなどのウイルス由来のものである。これ以外にも、原核又は真核生物発現系について、Sambrook et al., Molecular Cloning：A laboratory Manual. 2^nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第１６節及び１７節に記載されている。また、別の有利なベクターが、Hellensら（Trends in plant science, 5, 2000）に記載されている。

トランスジェニック生物の上記実施形態は全て、用語「本発明に係るトランスジェニック生物」となる。

本発明はさらに、除草剤活性を有する試験化合物の同定方法における、ＳＨＭＴの核酸配列又はアミノ酸配列の使用に関する。既に上述したように、用語「ＳＨＭＴ」は、好ましくはミトコンドリアＳＨＭＴを含む。除草剤活性を有する阻害剤の同定方法は全て、以下本明細書中「本発明に係る方法」という。

本発明に係る方法の、本明細書において以下に記載する実施形態は、好ましくは以下を含む核酸配列：
ａ）本発明に係る核酸配列；又は
ｂ）配列番号３に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％及び７０％、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、特に好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、非常に特に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する一部領域を含む、配列番号３の核酸配列の機能的等価物、
によりコードされるＳＨＭＴの使用に基づくものである。

上記のｂ）の核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも６０％の同一性を有する一部領域を含むものであり、従って、少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、好ましくは少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％及び７０％、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、特に好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、非常に特に好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、配列番号７の機能的等価物を含む。ｂ）の核酸配列は、ＳＨＭＴの酵素活性、好ましくは生物学的活性を有するポリペプチドである。

本発明に係る、除草剤活性を有する物質の同定方法は、以下のステップを含む：
ｉ）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（好ましくはミトコンドリアセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）の酵素活性、好ましくは生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、又は核酸分子によってコードされるポリペプチドを、１以上の試験化合物と、該試験化合物が該核酸分子又は該核酸によりコードされるポリペプチドと結合するような条件下で接触させるステップ；
ｉｉ）上記試験化合物が、上記ｉ）のポリペプチドと結合するか否かを検出するステップ；又は
ｉｉｉ）上記試験化合物が、上記ｉ）のポリペプチドの活性を低減又は阻止するか否かを検出するステップ；
ｉｖ）上記試験化合物が、上記ｉ）の核酸の転写、翻訳又は発現を低減又は阻止するか否かを検出するステップ。

本発明に係る、除草剤活性を有する化合物を同定するための好ましい方法は、以下のステップを含む：
ｉ）前述の核酸分子、又は核酸分子によってコードされるポリペプチドを、１以上の試験化合物と、該試験化合物が該核酸分子又は該核酸によりコードされるポリペプチドと結合するような条件下で接触させるステップ；
ｉｉ）上記試験化合物が、上記ｉ）のポリペプチドと結合するか否かを検出するステップ；又は
ｉｉｉ）上記試験化合物が、上記ｉ）のポリペプチドの活性を低減又は阻止するか否かを検出するステップ；
ｉｖ）上記試験化合物が、上記ｉ）の核酸の転写、翻訳又は発現を低減又は阻止するか否かを検出するステップ。

上記方法のステップ（ｉｉ）において行う検出は、タンパク質とリガンドとの相互作用を同定する技法を用いて実施することができる。これに関して、試験化合物又は酵素のいずれかは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、放射性同位体、化学発光標識又は酵素標識などを含みうる。酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼが挙げられる。その後行う検出は、標識により異なり、当業者に周知である。

この点に関し、本発明に関連してハイスループット法（ＨＴＳ）に適した５つの好ましい実施形態を記載する。

１．質量の関数としての蛍光分子の平均拡散速度を、蛍光相関分光学（ＦＣＳ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1994）11753-11575）により少量のサンプルで測定することができる。ＦＳＣを用いて、ＳＨＭＴと結合したとき必然的に起こる試験化合物の質量変化、若しくは変化した拡散速度を測定することにより、タンパク質／リガンド相互作用を測定することができる。本発明に係る方法は、蛍光分子で標識した試験化合物の結合を測定するために直接設計することができる。あるいは、本発明に係る方法は、蛍光分子により標識された化学参考化合物が別の試験化合物と置き換わるように設計することもできる（置換アッセイ）。このようにして同定される化合物は阻害剤として好適でありうる。

２．蛍光偏光は、偏光を発するように偏光で励起された静止蛍光団の特徴を利用する。しかしながら、蛍光団は励起状態の間に回転する場合に、放射された蛍光の偏光が事実上消失する。同一条件下（例えば、温度、粘度、溶媒）において、回転は分子サイズの関数であり、それにより蛍光団が結合した残基のサイズに関する知見を読み取り値から得ることができる（Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300）。本発明に係る方法は、蛍光標識した試験化合物のＳＨＭＴへの結合を測定することにより直接設計することができる。あるいは、本発明に係る方法はまた、１に記載したように「置換アッセイ」の形態とすることもできる。このようにして同定される化合物は阻害剤として好適でありうる。

３．蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、好適な条件下における空間上で隣接する２つの蛍光分子の間の非放射線エネルギー移動に基づくものである。その条件は、供与分子の発光スペクトルが受容分子の励起スペクトルと重複することである。ＳＨＭＴ及び試験化合物の蛍光標識を用いて、その結合をＦＲＥＴにより測定することができる（Cytometry 34, 1998, pp. 159-179）。あるいは、本発明に係る方法はまた、１に記載したように「置換アッセイ」の形態とすることもできる。ＦＲＥＴ技術の特に好適な実施形態は「均一系時間分解蛍光」（ＨＴＲＦ）であり、Packard BioScienceにより入手することができる。このようにして同定される化合物は阻害剤として好適でありうる。

４．飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）と組み合わせた表面活性化レーザー脱着／イオン化（Surface-enhanced laser desorption/ionization：ＳＥＬＤＩ）により、支持体上の分子の高速分析が可能であり、これを用いて、タンパク質−リガンド相互作用を分析することができる（Worral et al.(1998) Anal. Biochem. 70：750-756）。好ましい実施形態では、ＳＨＭＴを好適な支持体に固定化し、次いでこれを試験化合物と一緒にインキュベートする。１回以上の好適な洗浄ステップの後、ＳＨＭＴとさらに結合した試験化合物の分子を前記方法により検出することができ、このようにして、阻害剤を選択する。この方法で同定される化合物は阻害剤として好適でありうる。

５．表面プラズモン共鳴の測定は、試験化合物が、表面に固定化したタンパク質と結合する際の、該表面での屈折率の変化に基づくものである。表面での質量濃度の規定変化については、屈折率の変化が、すべてのタンパク質及びポリペプチドについてほぼ同じであるため、この方法は、原則として、あらゆるタンパク質に適用することができる（Lindberg et al., Sensor Actuators 4（1983）299-304；Malmquist Nature 361（1993）186-187）。この測定は、例えば現在１日当たり最大３８４サンプルを処理するBiacore（Freiburg）より入手可能な表面プラズモン共鳴に基づく自動分析装置で行うことができる。本発明に係る方法は、試験化合物のＳＨＭＴへの結合を直接測定するために設計することもできるし、あるいは本発明に係る方法はまた、１に記載したように「置換アッセイ」の形態とすることもできる。このようにして同定される化合物は阻害剤として好適でありうる。

上記方法により同定される物質はすべて、その後、本発明に係る方法の別の実施形態において、その除草剤活性について試験することができる。

さらに、Ｘ線構造解析によるＳＨＭＴの三次元構造の解明を通じた分子モデリング法によって、除草剤活性成分についてのさらなる候補物質を検出することも可能である。X線構造解析に必要なタンパク質結晶の調製、並びに、関連する測定値と、それに続くこれら測定値の評価、タンパク質中の結合部位の検出、そして推定阻害剤構造の予測は、当業者には公知である。原則として、前記方法により同定された化合物の最適化は、分子モデリング法によっても可能である。

ステップｉ）及びｉｉ）に基づいて行う本発明に係る方法の好ましい実施形態は、以下からなる：
ａ）本発明に係るトランスジェニック生物においてＳＨＭＴを発現させる、又は天然にＳＨＭＴを含む生物を成長させるステップ；
ｂ）ステップａ）の、トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物における、部分的に精製された形態又は均質に精製された形態のSHMTを試験化合物と接触させるステップ；並びに
ｃ）試験化合物とインキュベートしなかった場合のＳＨＭＴ活性と比較して、試験化合物とインキュベートした場合のＳＨＭＴ活性について、SHMT活性を低減又は阻止する化合物を選択するステップ。

従って、前述の核酸配列に基づいて、本方法は、以下のステップを含みうる：
ａ）トランスジェニック生物において、配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、又は遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、又は配列番号３に対して少なくとも９１％の同一性を有する一部領域を含む配列番号３の核酸配列の機能的等価物、又は配列番号３に対して少なくとも６０％の同一性を有する一部領域を含む核酸配列によりコードされるミトコンドリア植物セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現させるか、あるいは
配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、又は遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、又は配列番号３に対して少なくとも９１％の同一性を有する一部領域を含む配列番号３の核酸配列の機能的等価物、又は配列番号３に対して少なくとも６０％の同一性を有する一部領域を含む核酸配列によりコードされる植物セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを天然に含む生物を培養するステップ；
ｂ）トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物中のステップａ）のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを、部分的に又は均質に精製した形態で、試験化合物と接触させるステップ；並びに
ｃ）ステップａ）のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を低減又は阻止する試験化合物を選択するステップであって、ここで試験化合物と共にインキュベートしたセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を、試験化合物と共にインキュベートしていないセリンヒドロキシメチルトランスフェラーぜの活性と比較するものである、上記ステップ。

また、配列番号３に対して少なくとも６０％の同一性を有する一部領域を含む、上記ａ）の核酸配列はまた、少なくとも４６％の同一性を有する配列番号７の機能的等価物を含む。機能的等価物に関して、上述した好ましいものを適用することができる。

ＳＨＭＴを含む溶液は、元の生物又は本発明にかかる発現カセットで形質転換させたトランスジェニック生物の溶解物から構成されてもよい。適切であれば、ＳＨＭＴは、慣用法により部分的に精製してもよいし、又は完全に精製してもよい。現在のタンパク質精製技術に関する一般的な概要は、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6に記載されている。ＳＨＭＴを組換えにより得る場合には、アフィニティタグとの融合物の形態をとるタンパク質を、当業者に公知のようにアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。本発明に係るｉｎ−ｖｉｔｒｏ法においては、ＳＨＭＴの必須補因子、すなわちリン酸ピリドキサルが、十分な量、すなわち、一般的には酵素１ｍｏｌ当たり５０〜６００ｍｍ、好ましくは８０〜５００ｍｍ存在することに留意すべきである。

ｉｎ−ｖｉｔｒｏ法に必要なＳＨＭＴは、このようにして、本発明に係るトランスジェニック生物から異種発現により、又はＳＨＭＴ活性を有するポリペプチドを含む生物から、好ましくは望ましくない植物から単離することができる。用語「望ましくない植物」は、上述した種を意味するものと理解される。

除草性化合物を同定するために、ＳＨＭＴを試験化合物と共にインキュベートする。反応時間後、ＳＨＭＴ活性を、上記方法の１つにより非阻害ＳＨＭＴの活性と比較して測定する。本発明に係るポリペプチドが阻害される場合には、本発明に係る非阻害ポリペプチドの活性と比較して活性の有意な低減が観察される。その低減の結果は、少なくとも１０％、有利には少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、特に好ましくは少なくとも５０％、最大１００％の低減（阻止）である。マイクロモル範囲の酵素濃度に基づいて、試験化合物濃度が１０^−４Ｍ、好ましくは１０^−５Ｍ、特に好ましくは１０^−６Ｍにおいて少なくとも５０％の阻害が好ましい。

ＳＨＭＴ酵素活性は、例えば活性アッセイにより、すなわち適当な基質と補因子と共に、該基質又は補因子の変換をモニターしながら、ＳＨＭＴをインキュベートすることにより測定することができる。

好適な基質の例は、セリン又はグリシンであり、好適な補因子の例は、テトラヒドロ葉酸塩又はＣ１−テトラヒドロ葉酸塩である。適当であれば、前述の化合物の誘導体であって、検出可能な標識、例えば蛍光標識、放射性同位体標識又は化学発光標識などを含む誘導体を使用することも可能である。

例えば、ＳＨＭＴ活性は、本発明においては放射活性方法を用いて測定することができる（Bourguignon et al. Biochem. J. 255, pp. 169-178, 1988）。

しかしながら、SHMT酵素活性はまた、C1-テトラヒドロ葉酸塩からのテトラヒドロ葉酸塩の分離に基づいてクロマトグラフィー分離方法を行い、その後ＵＶ分光解析により該クロマトグラフィーで得られたピークの集積からテトラヒドロ葉酸塩及びC1-テトラヒドロ葉酸塩の量を定量解析することにより、測定することも可能である。クロマトグラフィー分離は、好ましくは逆相クロマトグラフィー(RPC)、例えばＨＰＬＣシステム又はＦＰＬＣシステムを用いて実施する。このクロマトグラフィーの原理、並びにこれに使用するバッファー及び装置は当業者に公知であり、例えば、「Introduction to Modern Liquid Chromatography」L.R. Snyder及びJ.J. Kirkland, 2nd Edition. John Wiley & Sons, 1979に記載されている。

概して、ＲＰＣにおいて慣用され、当業者に公知の移動相を用いる。

活性アッセイにおいて使用すべき基質（例えばセリン）の量は、１〜１００μｇ／ｍｌの酵素に基づいて、１〜５０ｍＭであり、テトラヒドロ葉酸塩の量は１〜１０ｍＭである。

特に好ましい実施形態において、基質の変換は、ＳＨＭＴ反応とＮＡＤ依存的メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＭＴＤ）による触媒反応及び３４０ｎｍにおける測光に基づいて、Stover及びSchirch（Anal. Biochem. 202, pp. 82-88）に記載の方法の変法を用いて、光度的にモニターした。

ステップｉ）及びｉｉｉ）に基づく本発明にかかる方法の好ましい実施形態は、以下のステップからなる：
ａ）本発明に係るトランスジェニック生物を作出するステップ；
ｂ）試験物質をａ）のトランスジェニック生物及び同種の非トランスジェニック生物に適用するステップ；
ｃ）該試験物質の適用後にトランスジェニック生物及び非トランスジェニック生物の成長又は生存を判定するステップ；
ｄ）トランスジェニック生物の成長と比較して非トランスジェニック生物の成長の低減又は生存の低減をもたらす試験物質を選択するステップ。

本実施形態において、除草剤活性を有する阻害剤の選択のためのステップｃ）における成長の差異は、少なくとも１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、特に好ましくは４０％、非常に特に好ましくは５０％である。

本実施形態におけるトランスジェニック生物は、細菌、酵母、真菌、植物又は真核細胞系、好ましくは植物、細菌又は酵母であり、慣用法により容易に形質転換可能なものである。例えば、本発明に係るポリペプチドをコードする配列を形質転換により導入した、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、タバコ（Nicotiana tabacum）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は大腸菌（E. coli）である。従って、これらのトランスジェニック生物は、本発明に係るポリペプチドを阻害する化合物に対する耐性が増大している。大腸菌及びサッカロミセス・セレビシエは、特に選択される生物である。その理由は、これらのゲノムはその全体が配列決定されており、「ノックアウト」変異体の作製に容易に用いることができるためである（例えば、Methods in Yeast Genetics, Kaiser, Michaelis, Mitchell (編) CSHL Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994: 73-85）。

しかしながら、上記方法はまた、成長調節活性を有する物質の同定にも用いることができる。本実施形態において、使用するトランスジェニック生物は植物である。さらに、ステップｄ）は、トランスジェニック生物の成長と比較して非トランスジェニック生物の成長の変化をもたらす試験化合物の選択を含む。成長の変化とは、本実施形態においては、特に長期的な成長の低減を発現しうる、植物の栄養生長の阻害を意味するものと理解される。従って、処理植物は成長不良を示し、さらにこれらの葉は暗色となる。また、成長の変化は、経時的な成熟過程の変化、植物の側分枝成長の促進の阻害、発生段階の短縮又は延長、立ち安定性の増大、多量の芽、花、葉、果実、種子、根及び塊茎の成長、植物（例えばテンサイ、サトウキビ及び柑橘果実など）中の糖含量の増大、植物（例えば穀類又はダイズなど）中のタンパク質含量の増大、あるいはゴムの木におけるゴム流量の刺激を意味するものと理解される。

また、本発明に係る方法においては、本発明に係る方法において多数の試験化合物を用いることも可能である。試験化合物の群が標的に影響を及ぼす場合には、その後、個々の試験化合物を直接単離することもできるし、又は試験化合物を種々の下位群に分類することもできる。例えば、試験化合物が複数の異なる成分から構成される場合には、本発明に係る方法において異なる試験化合物の数を低減するために分類を行うことができる。続いて、本発明に係る方法を個々の試験化合物又は試験化合物の関連する下位群を用いて反復実施する。サンプルの複雑度に応じて、上述したステップを反復して、好ましくは本発明に係る方法に従って同定した下位群が少数の試験化合物又は１つの試験化合物を含むようになるまで反復して行うことができる。

その後、本発明に係る方法により同定された化合物はいずれも、除草活性についてｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。除草活性について化合物を試験する方法の１つは、マイクロタイタープレートにおいてウキクサの１つであるコウキクサ（Lemna minor）を使用することである。測定しうるパラメータは、クロロフィル含量及び光合成速度の変化である。また、化合物を直接望ましくない植物に適用することも可能であり、例えば成長の制限により、除草活性を同定することも可能である。

本発明に係る方法は又はイスループット法又はハイスループットスクリーニング法（ＨＴＳ）において実施することが有利でありうる。

ＨＴＳにより、多数の異なる化合物を同時に試験することが可能となる。

本発明に係る１以上の核酸分子、本発明に係る核酸配列を含む１以上のベクター、本発明に係る核酸配列の少なくとも１つを含む１以上のトランスジェニック生物、又は本発明に係る核酸配列によりコードされる１以上の（ポリ）ペプチドを含む支持材の使用により、実際にＨＴＳを実施することができる。使用する支持材は、固体又は液体とすることができ，好ましくは固体、特に好ましくはマイクロタイタープレートである。上記支持材はまた、本発明に包含される。最も広く用いられている技術に従って、一般に２００μｌの容量を含むことができる９６ウエル、３８４ウエル及び１５３６ウエルのマイクロタイタープレートを用いる。マイクロタイタープレートに加えて、対応するマイクロタイタープレートと適合するＨＴＳシステムの別の構成要素、例えば多数の装置、材料、自動ピペット装置、ロボット、自動プレートリーダー及びプレートウォッシャーなどは市販されている。

マイクロタイタープレートに基づくＨＴＳシステムの他、「フリーフォーマットアッセイ」として知られるもの、又はサンプル間に物理的障壁のないアッセイ系、例えばJayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 19 (1994) 161418；Chelsky, “Strategies for Screening Combinatorial Libraries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995)；Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763；及び米国特許第５，９７６，８１３号に記載のアッセイを使用することも可能である。

本発明はさらに、本発明に係る方法により同定される化合物に関する。これらの化合物は、以下、「選択化合物」という。該化合物は、１０００ｇ／ｍｏｌ未満、有利には５００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは４００ｇ／ｍｏｌ未満、特に好ましくは３００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。除草剤活性を有する化合物は、１ｍＭ未満、好ましくは１μＭ未満、特に好ましくは０．１μＭ、非常に特に好ましくは０．０１μＭ未満のＫｉ値を有する。

通常、本発明に係る方法により同定される化合物はまた、その農業上有用な塩の形態で存在してもよい。好適な農業上有用な塩は、主に、これらの陽イオンの塩、又はこれらの酸の酸付加塩であり、その陽イオン又は陰イオンは、本発明に係る方法により同定される、除草剤活性を有する化合物の除草活性に有害な影響を及ぼすものではない。

選択化合物が非対称置換α炭素原子を含む場合、これらはさらに、ラセミ体、エナンチオマー混合物、純粋なエナンチオマーの形態で存在してもよく、あるいは、これらのキラル置換体である場合には、ジアステレオマー混合物の形態であってもよい。

選択化合物は、化学的に合成された物質であってもよいし又は微生物により産生される物質であってもよく、例えば、細胞抽出物、又は例えば植物、動物又は微生物に見出すことができる。反応混合物は、細胞不含抽出物であってもよいし、細胞又は細胞培養物を含んでもよい。好適な方法は当業者に公知であり、一般的には、例えばAlberts, Molecular Biology the cell, 3^rd Edition (1994)の例えば第１７章に記載されている。

候補試験化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、有機小物質、ホルモン、ＰＮＡなどであってもよい（Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198及び該文献に引用される参照文献）。

選択化合物は、望ましくない植物の防除に用いることができ、必要であれば、例えばジャガイモなどの落葉又は例えば綿などの乾燥のため、及び成長調節剤として用いることができる。選択化合物を含む除草性組成物は、非作物領域に対して植物の良好な防除を行う。コムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ及び綿などの作物においては、これらは、作物植物に対して何ら有意な損傷を与えることなく、広葉雑草及びイネ科雑草に対して作用する。この作用は、特に低い適用量においても観察される。選択化合物は、上述した有害植物の防除に用いることができる。

有利なことには、適用方法に応じて、選択化合物、若しくはそれらを含む組成物をさらに多種の作物植物に用いて、望ましくない植物を除去することもできる。好適な作物としては、例えば、下記のものが挙げられる：
タマネギ（Allium cepa)、パイナップル（Ananas comosus)、落花生（Arachis hypogaea)、アスパラガス（Asparagus officinalis)、サトウダイコンアルチッシマ種（Beta vulgaris spec. altissima)、サトウダイコンラパ種（Beta vulgaris spec. rapa)、セイヨウアブラナ変種ナパス（Brassica napus var. napus)、セイヨウアブラナ変種ナポブラシカ（Brassica napus var. napobrassica)、アブラナ変種シルベストリス（Brassica rapa var. silvestris)、チャ（Camellia sinensis)、ベニバナ（Carthamus tinctorius)、ヒッコリーイリノイネンシス（Carya illinoinensis)、レモン（Citrus limon)、オレンジ（Citrus sinensis)、アラビカコーヒー（Coffea arabica)（ロブスタコーヒー（Coffea canephora)、リベリカコーヒー（Coffea liberica))、キュウリ（Cucumis sativus)、ギョウギシバ（Cynodon dactylon)、ニンジン（Daucus carota)、アブラヤシ（Elaeis guineensis)、エゾヘビイチゴ（Fragaria vesca)、ダイズ（Glycine max)、リクチワタ（Gossypium hirsutum)、（キワタ（Gossypium arboreum)、アジアワタ（Gossypium herbaceum)、ワタビチホリウム（Gossypium vitifolium))、ヒマワリ（Helianthus annuus)、パラゴムノキ（Hevea brasiliensis)、オオムギ（Hordeum vulgare)、ホップ（Humulus lupulus)、サツマイモ（Ipomoea batatas)、カシグルミ（Juglans regia)、レンズマメ（Lens culinaris)、アマ（Linum usitatissimum)、トマト（Lycopersicon lycopersicum)、リンゴ種（Malus spec.)、キャッサバ（Manihot esculenta)、アルファルファ（Medicago sativa)、バショウ種（Musa spec.)、タバコ（Nicotiana tabacum （N. rustica))、オリーブ（Olea europaea)、イネ（Oryza sativa)、ライマメ（Phaseolus lunatus)、サヤインゲン（Phaseolus vulgaris)、ヨーロッパトウヒ（Picea abies)、マツ種（Pinus spec.)、エンドウ（Pisum sativum)、セイヨウミザクラ（Prunus avium)、モモ（Prunus persica)、セイヨウナシ（Pyrus communis)、スグリ（Ribes sylvestre)、トウゴマ（Ricinus communis)、サトウキビ（Saccharum officinarum)、ライムギ（Secale cereale)、ジャガイモ（Solanum tuberosum)、モロコシ（Sorghum bicolor （s. vulgare))、カカオ（Theobroma cacao)、アカツメクサ（Trifolium pratense)、コムギ属アエスチバム（Triticum aestivum)、マカロニコムギ（Triticum durum)、ソラマメ（Vicia faba)、ブドウ（Vitis vinifera)、トウモロコシ（Zea mays）。

さらに、選択化合物はまた、育種（組換え法など）のために除草剤の作用に耐性を有する作物において用いることもできる。かかる作物の作出は本明細書において後述する。

本発明はさらに、除草性組成物の製造方法に関し、該方法は、選択化合物を好適な補助剤と共に製剤化し、作物防除剤を得ることを含むものである。

本発明は同様に、成長調節組成物の製造方法に関し、該方法は、選択化合物を好適な補助剤と共に製剤化し、作物防除剤を得ることを含むものである。

この場合、選択化合物は、例えば、直接スプレー可能な水溶液、粉末、懸濁液、また非常に高度に濃縮された水性、油性若しくはその他の懸濁液若しくは分散液、乳液、油性分散液、ペースト、倍散剤、散布用材料、又は顆粒の形態で、あるいは、噴霧、霧化、散粉、散布又は給水といった手段により製剤化することができる。この使用形態は、意図する用途及び選択化合物の性質に依存するが、どんな場合でも、選択化合物の最も微細な分布を確実にしなければならない。除草剤組成物は、除草剤として有効な量の少なくとも１つの選択化合物、及び除草剤組成物の製剤化において一般に使用される補助剤を含む。

乳剤、ペースト又は水性若しくは油性製剤及び分散可能な濃縮物（ＤＣ）の調製については、選択化合物を、油又は溶媒中に溶解又は分散させることができる。さらに、均質にする目的で別の製剤用補助剤を添加することも可能である。しかしながら、選択化合物から液体又は固形濃縮物を調製することも可能であり、必要であれば、溶媒又は油と、場合によっては液体又は固形濃縮物を含むさらなる補助剤、及びこれらの濃縮物を、水で希釈することが適切である。以下においては、水に溶解可能又は分散可能な（湿潤可能な）固形製剤について、乳化可能な濃縮物（ＥＣ、ＥＷ）、懸濁液（ＳＣ）、溶解可能な濃縮物（ＳＬ）、分散可能な濃縮物（ＤＣ）、ペースト、ピル、湿潤可能な粉末又は顆粒を記載する。さらに、好適な粉剤若しくは顆粒剤又は錠剤は、有効成分の磨耗又は早期放出を防止する固形被膜を行ってもよい。

原則として、用語「補助剤」は、以下のクラスの化合物を意味するものと理解される：消泡剤、増粘剤、湿潤剤、濃縮剤、分散剤、乳化剤、殺菌剤及び／又はチキソトロープ剤。当業者であれば、上記薬剤の意味を理解することができる。

ＳＬ、ＥＷ及びＥＣは、対象の構成成分を単に混合することで調製することができる。粉剤は、特定種のミル（例えばハンマーミル）において混合又は粉砕することで調製することができる。ＤＣ、ＳＣ及びＳＥは、通常、湿潤混合により調製することができ、さらに補助剤又は選択化合物を含み得る有機相を添加することによりＳＣからＳＥを調製することも可能である。この調製物は公知である。展着及び粉末のための材料である粉剤は、有効成分と固形担体とを一緒に混合するか又は同時に粉砕することにより調製することが有利でありうる。顆粒は、例えば被覆顆粒、含浸顆粒及び均質顆粒があり、これらは選択化合物と固形担体とを結合することにより調製することができる。当業者であれば、例えば以下の文献に記載されている、これらの調製についてさらなる詳細を理解することができる：米国特許第３，０６０，０８４号、ＥＰ−Ａ７０７４４５号（液体濃縮物に関して）；Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48；Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57及びこれ以下参照；ＷＯ９１／１３５４６号、米国特許第４，１７２，７１４号、米国特許第４，１４４，０５０号、米国特許第３，９２０，４４２号、米国特許第５，１８０，５８７号、米国特許第５，２３２，７０１号、米国特許第５，２０８，０３０号、ＧＢ２，０９５，５５８号、米国特許第３，２９９，５６６；Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961；Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989；並びにMollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim（Federal Republic of Germany）, 2001）。

本発明に係る製剤に好適な不活性液体及び／又は固体担体は、当業者に周知であり、以下に挙げるような液体添加剤である：中〜高沸点の鉱油留分、例えば灯油又はディーゼル油、さらには、コールタール油、並びに、植物又は動物油、脂肪族、環状及び芳香族炭化水素、例えば、パラフィン、テトラヒドロフタレン、アルキル化ナフタレン若しくはそれらの誘導体、アルキル化ベンゼン若しくはそれらの誘導体、アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びシクロヘキサノール、シクロヘキサノンのようなケトン、又は強い極性溶媒、例えば、N-メチルピロリドンのようなアミン又は水。

固形担体の例としては、土類鉱物、例えばシリカ、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、石灰岩、石灰、白亜、木幹（bole）、黄土、粘土、白雲石、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、土類合成物質、肥料、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、並びに植物由来の産物、例えばシリアルミール、樹皮ミール、樹木ミール及び堅果ミール、セルロース粉末又は他の担体が挙げられる。

当業者であれば、本発明に係る製剤に好適な界面活性物質（サーファクタント）の多様性を理解でき、例えば、芳香族スルホン酸（例：リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸）の、脂肪酸の、アルキル−及びアルキルアリールスルホネートの、アルキルスルホネートの、ラウリルエーテルスルフェートの、及び脂肪アルコールスルフェートのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩；並びに、硫酸化ヘキサ−、ヘプタ−及びオクタデカノールの、脂肪アルコールグリコールエーテルの塩；スルホン化ナフタレン及びその誘導体とホルムアルデヒドとの縮合体、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドとの縮合体、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチル−、オクチル−又はノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、脂肪アルコール／酸化エチレン縮合体、エトキシル化ひまし油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、リグニン亜硫酸パルプ廃液又はメチルセルロースが挙げられる。

除草性組成物、又は選択化合物は、出芽前又は出芽後に適用しうる。特定の作物植物が選択化合物を十分には許容しない場合には、選択化合物と植物とがほとんど接触しないように、もし接触する場合には感受性の作物植物の葉に接触し、選択化合物が土壌表面の表面下に又は表面にむきだしで成長する好ましくない植物の葉に到達するように、散布装置を用いて選択化合物を散布する適用手法を用いてもよい（適用後、一時停止）。

意図する目的、季節、標的植物及び成長期に応じて、選択化合物の適用率は０．００１〜３．０、好ましくは０．０１〜１．０ｋｇ／ｈａである。

本発明を、以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これは限定を意図するものではない。

除草剤の標的がさらにＳＨＭＴの生物学的活性を有するタンパク質の同定方法を可能にするものと仮定する。これは、作用部位としてＳＨＭＴを標的とする除草剤、例えば除草剤活性を有する選択化合物、により阻害されない又は限定的な程度にしか阻害されないものである。本明細書の以下において、このようにＳＨＭＴと異なるタンパク質をＳＨＭＴ変異体という。上述したのと同様に、用語「ＳＨＭＴ」はミトコンドリアＳＨＭＴを意味することが好ましい。

好ましい実施形態では、以下の核酸配列：
ｉ）配列番号７に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｉｉ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｉｉｉ）配列番号７に対して少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、好ましくは少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％及び７０％、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、特に好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、非常に特に好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、配列番号７の核酸配列の機能的等価物、
を含む核酸配列の変異体を作製するための方法は、下記のステップを含む：
ａ）異種系又は無細胞系における上記核酸によりコードされるタンパク質を発現させるステップ；
ｂ）核酸の改変によるタンパク質のランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を行うステップ；
ｃ）改変型遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定するステップ；
ｄ）相互作用をあまり示さないタンパク質の誘導体を同定するステップ；
ｅ）除草剤を適用した後のタンパク質の生物学的活性をアッセイするステップ；
ｆ）除草剤に対する生物学的活性が改変された核酸配列を選択するステップ。

上記方法により選択される配列は、生物に有利に導入することができる。従って本発明はさらに、上記方法によって作製される生物に関する。当該生物は、植物であることが好ましく、特に上記作物植物が好ましく、特にジャガイモ、タバコ、アマニ、アブラナ、ダイズ、オオムギ、トウモロコシ、ワタ、コムギ、パイナップル、パパイヤ又はエンドウが非常に好ましい。

次に、植物個体を再生させ、選択化合物に対する耐性を植物個体で確認する。

植物において、選択化合物に対する耐性を付与することができる改変タンパク質及び／又は核酸は、部位特異的突然変異誘発として知られる方法によって、上記核酸配列から作製することができる。例えば標的タンパク質の安定性及び／若しくは酵素活性、又は本発明の前記阻害剤の結合などの特性は、このような突然変異誘発を用いて、高度の標的様式で、改善又は改変することができる。

例えば、植物において、有利に用いることができる部位特異的突然変異誘発方法は、Zhuらにより記載されている（Nature Biotech., 第18巻、2000, 5月：555-558）。

加えて、改変は、ランダム突然変異誘発にｄＩＴＰを用いるSpeeら（Nucleic Acids Research, 第21巻、第3号、1993：777-78）により記載されたＰＣＲ法、あるいは、Rellosら（Protein Expr. Purif., 5, 1994：270-277）によるさらに改善された方法によって、行うことができる。

また、これらの改変型タンパク質及び／又は核酸の作製は、Stemmerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第91巻、1994：10747-10751）により記載された分子進化のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え法、あるいは、Mooreら（Nature Biotechnology 第14巻, 1996：458-467）により記載されたＰＣＲと組換え法の組合せによっても、実施可能である。

タンパク質の突然変異誘発のための別の手法がGreenerらによりMethods in Molecular Biology（第57巻、1996：375-385）に記載されている。ＥＰ−Ａ−０９０９８２１号には、微生物大腸菌ＸＬ−１ Ｒｅｄを用いて、タンパク質を改変する方法が記載されている。この微生物は、複製の間に、導入された核酸に突然変異を発生させ、これによって、遺伝情報の改変を引き起こす。有利な核酸及びこれらによりコードされるタンパク質は、改変型核酸又は改変型タンパク質を単離し、耐性試験を実施することにより、容易に同定することができる。これらの核酸又はタンパク質を植物に導入すると、これらは、そこで耐性を発揮することができ、従って、除草剤に対する耐性をもたらす。

別の突然変異誘発及び選択方法は、例えば、種子又は花粉をｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発し、本発明の阻害剤の存在下で耐性対立遺伝子を選択した後、改変された耐性対立遺伝子の遺伝的及び分子同定を行なうことからなるもの；さらには、濃度が連続的に増加する本発明の阻害剤の存在下で、培養物を培養することにより、組織培養物中の耐性の突然変異誘発及び選択を実施することからなるものなどの方法がある。この方法で、化学／物理的突然変異誘発処理による自発的突然変異率の増大を利用してもよい。前述したように、微生物を用いて、改変型遺伝子を単離することもでき、その場合、該微生物は、本発明の方法で用いられる核酸によりコードされるタンパク質の外因性又は組換え活性を呈示し、かつ、本発明に従い同定された阻害剤に対する感受性を有する。本発明の阻害剤の濃度を増加しながら、培地で微生物を増殖させると、本発明の標的の耐性変異体の選択及び進化が可能になる。同様に、突然変異頻度は、突然変異誘発処理によって高めることができる。

さらに、核酸の特異的改変方法も利用可能である（Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第96巻、8768-8773及びBeethem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第96巻、8774-8778）。これらの方法により、タンパク質において、阻害剤との結合に重要なアミノ酸を、機能的に同等であるが、阻害剤の結合を阻止するアミノ酸によって置換することが可能となる。

本発明はさらに、生物学的活性が改変された遺伝子産物をコードする塩基配列を作製する方法に関するが、その際、生物学的活性は、それが増大するように改変される。「活性の増大」とは、元の生物又は元の遺伝子産物と比較して、少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも３０％高い、特に好ましくは少なくとも５０％高い、非常に特に好ましくは少なくとも１００％高い活性を意味するものとして理解される。さらに、本発明の物質及び／又は組成物が、核酸配列及び／又はそれらによってコードされた遺伝子産物と、もはや結合しない、あるいは、もはや正しく結合しないように、生物学的活性を改変することもできる。本発明が意図する「もはや〜しない」、又は「もはや正しく〜しない」とは、上記物質が、元の遺伝子産物又は元の核酸と比較して、改変型核酸及び／又は遺伝子産物と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に特に好ましくは少なくとも８０％少なく結合する、あるいは、まったく結合しないことを意味するものとして理解される。

従って本発明のさらに別の態様は、本発明の前記方法により改変されたトランスジェニック植物に関する。

本発明の方法により見出される物質及び／又はこれら物質を含む組成物に対して耐性の遺伝的に改変されたトランスジェニック植物は、本発明の除草剤同定方法に用いる核酸配列を過剰発現させることにより作出してもよい。本発明は従って、本発明の方法によって見出される物質に耐性のトランスジェニック植物を作出する方法に関し、該方法は、これら植物における、以下の核酸配列：
ａ）配列番号７に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｃ）配列番号７に対して少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、好ましくは少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％及び７０％、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、特に好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、非常に特に好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、配列番号７の核酸配列の機能的等価物、
を含む核酸を過剰発現するステップを含む。

同様の方法は、例えばLermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75-83に記載されている。

耐性植物を作出するための本発明に係る前記方法により、非選択的除草剤に対して耐性を有する有用植物の開発と組み合わせて、活性が可能な限り完全で、かつ、植物種とは独立した新規除草剤（いわゆる非選択的除草剤）の開発が可能になる。非選択的除草剤に対して耐性の有用植物については、すでに何度か説明してきた。本明細書においては、耐性を生み出す原理を次のように区別しうる：
ａ）除草剤の標的として作用するタンパク質を顕著に過剰産生することにより、また、除草剤の標的として作用するタンパク質の過剰量のために、該細胞においてこのタンパク質が果たす機能が除草剤の適用後さえも維持されることによる、突然変異方法又は組換え方法を用いた、植物における耐性の発生
ｂ）除草剤の標的として作用するタンパク質の改変型を導入し、新しく導入した改変型タンパク質の機能が、除草剤の悪影響を受けないような、植物の改変
ｃ）新規なタンパク質／新規なＲＮＡを導入するが、その際、低分子量物質の除草作用に応答する、該タンパク質又は核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡなど）の化学的構造を改変し、これにより、改変された構造が除草作用の発生を阻止する、すなわち、除草剤が標的ともはや相互作用できないようにする、植物の改変
ｄ）植物に導入される新規な遺伝子で、標的の機能を置換し、これによって、代替経路として知られるものを形成する
ｅ）標的の機能を、植物に存在する別の遺伝子、若しくはその遺伝子産物によって引き継がせる。

従って、本発明は、新規除草剤を開発するための、上記配列番号７の核酸配列及びその機能的等価物を有するＴ−ＤＮＡの挿入により影響を受ける遺伝子を有する植物の使用を包含する。当業者は、相同的核酸を同定する別の方法について熟知しており、これは、例えば、別の植物において、例えば、トランスポゾンの使用など、類似配列を用いて行なう。従って、本発明はまた、別の植物における、配列番号７の核酸配列、遺伝暗号に基づいてこれら配列から誘導される配列、及び／又はそれらの誘導体への外来核酸の挿入のための、別の挿入突然変異誘発方法の使用に関する。

トランスジェニック植物は、これについても前述した通常の形質転換方法により、本発明の発現カセットの前記使用形態の１つを用いて作製される。

組換えにより発現させたＳＨＭＴの発現効率は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、苗条分裂組織増殖又は発芽試験により測定することができる。さらに、性質及びレベルに関して改変されたＳＨＭＴ遺伝子の発現、並びに、ＳＨＭＴ阻害剤に対する耐性に及ぼす影響については、試験植物を用いて、温室実験で試験することができる。

一般的ＤＮＡ操作及びクローニング方法
例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、核酸のニトロセルロース及びナイロン膜への転写、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養、並びに、組換えＤＮＡの配列分析などのクローニング方法は、Sambrook et al., （1989）（Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN 0-87969-309-6）、及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6に記載されているように、実施した。

植物のための分子生物学的手法及び植物形質転換法は、Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998)；Reither et al., Methods in Arabidopsis Research, World scientific press (1992)；及びArabidopsis: A Laboratory Manual (2001), ISBN 0-87969-573-0に記載されている。

以下に用いる細菌株（大腸菌ＤＨα、ＸＬ−Ｉ Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１ＤＥ（３））は、Stratagene、BRL Gibco又はInvitrogen, Carlsberg, CAから入手した。クローニングに用いることができるベクターは、ｐＣＲ、Ｔ７ＣＴ ＴＯＰＯ、ｐＣＲ Ｔ７／ＮＴ ＴＯＰＯ、及びｐＣＲ ２．１ ＴＯＰＯ（Invitrogen）、並びにｐＵＣ１９（Amersham Pharmacia, Freiburg）、及びベクターｐＢｉｎＡＲ（Hofgen及びWillmitzer, Plant Science 66（1990）、221-230）である。

実施例１：植物形質転換ベクターのｃＤＮＡライブラリーの作製
植物の形質転換に直接使用することができるベクターにおいてｃＤＮＡライブラリー（以下、「バイナリ−ｃＤＮＡライブラリー」と称する）を作製するため、種々の植物組織からｍＲＮＡを単離し、cDNA Synthese Kit（Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg）を用いて二本鎖ｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、Ｔ_{１２−１８}オリゴヌクレオチドを製造業者の説明書に従って用いて行った。サイズ分画を行った後、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを製造業者の説明書に従って連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）で突出部分を平滑末端化し、ｃＤＮＡ集団を平均化した。Kohci et al., 1995, Plant Journal 8, 771-776の方法に従って、表１に示す条件下でオリゴヌクレオチドＮ１を用いたＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。

得られたＰＣＲ産物をPCR purification kit（Qiagen, Hilden）のカラムマトリクスに結合させ、３００ｍＭ ＮａＰバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％ＳＤＳで溶出した。ＤＮＡを沸騰水浴中で５分かけて変性し、続いて６０℃にて２４時間かけて再生させた。５０μｌのＤＮＡをヒドロキシアパタイトカラムにアプライし、カラムを１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＰバッファー、ｐＨ６．８で３回洗浄した。結合した一本鎖ＤＮＡは１３０ｍＭ ＮａＰバッファー、ｐＨ６．８で溶出させ、エタノールで沈殿させ、４０μｌの水に溶解させた。２０μｌを上記のさらなるＰＣＲ増幅に使用した。さらなるｓｓＤＮＡ濃縮の後、上記の通り３回目のＰＣＲ増幅を行った。

上記の通り作製したｃＤＮＡ集団を導入するための植物形質転換ベクターは、ベクターｐＵＣ１８をＳｂｆＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ベクター断片を精製した後、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて突出部分を平滑末端化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Stratagene）で再度連結することにより作製した。得られた構築物を以下ｐＵＣ１８ＳｂｆＩ−と称する。

最初に、ベクターｐＢｉｎＡＲをＮｏｔＩで切断し、その末端を平滑末端化して、ベクターを再度連結し、ＳｂｆＩで切断し、平滑末端化し、ベクターを再度連結した後、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた断片を、アグロバクテリウムによる植物の形質転換が可能であり、トランスジェニック植物にカナマイシン耐性を付与する植物形質転換用バイナリーベクターｐＰＺＰ（Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994）の誘導体に連結した。このように作製した構築物は以下ｐＳｕｎ１２／３５Ｓと称する。

オリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２（表２参照）、並びにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ｐＵＣ１８ＳｂｆＩ−を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。得られた断片をＳｍａＩで切断したｐＳｕｎ１２／３５Ｓに連結し、ｐＳｕｎｂｌｕｅｓ２を得た。ＮｏｔＩで切断後、エビアルカリホスファターゼ（Roche Diagnostics, Mannheim）で脱リン酸化し、ベクター断片を精製した後、ｐＳｕｎｂｌｕｅｓ２を同様に正規化したＮｏｔＩ切断ｃＤＮＡ集団と連結した。大腸菌Ｘｌ−１ｂｌｕｅ（Stratagene）に形質転換した後、得られたクローンをマイクロタイタープレートに播いた。バイナリーｃＤＮＡライブラリーは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下にて「センス」及び「アンチセンス」配向でｃＤＮＡを含むため、タバコ植物への形質転換後にはこれらのｃＤＮＡは「共抑制」及び「アンチセンス」効果を発揮し得る。

実施例２：タバコ植物の形質転換及び分析
バイナリーｃＤＮＡライブラリーの選択クローンをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８Ｃ１：ｐＧＶ２２６０（Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777-4788）に形質転換し、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン選択においてインキュベートした。バイナリークローンｎｔ００２００１０３５ｒ及びｎｔ００２００１０３６ｒでのタバコ植物（Nicotiana tabacum cv. Samsun NN）の形質転換に用いた材料は、ＹＥＢ培地でＯＤ６００が０．８〜１．６となるよう希釈した陽性形質転換アグロバクテリウムコロニーの一晩培養物とした。滅菌植物のリーフディスク（それぞれ約１ｃｍ^２）をペトリ皿において１：５０アグロバクテリウム希釈液と共に５〜１０分間インキュベートした。この後、２％スクロース（２ＭＳ培地）及び０．８％バクトアガーを添加したムラシゲ−スクージ培地（Physiol. Plant. 15(1962), 473）において２５℃にて２日間暗室でインキュベートした。この培養を、１６時間明反応／８時間暗反応の光周期で２日後まで継続し、５００ｍｇ／ｌクラホラン（セフォタキシムナトリウム）、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、１ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ｍｇ／ｌナフチル酢酸及び１．６ｇ／ｌグルコースを添加したＭＳ培地で週周期において継続した。再生させたシュートをカナマイシン及びクラホランを添加したＭＳ培地に移した。トランスジェニック植物系統Ｐ＿０００００００３１５をこのようにして作出した。

クローンｃＤＮＡのトランスジェニック系統のゲノムへの組み込みは、オリゴヌクレオチドＧ１及びＧ２（表２参照）及び対象のトランスジェニック系統から調製したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより検出した。この目的のため、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを製造業者（MoBiTec, Gottingen）の説明書に従って好ましく使用した。形質転換に使用したクローンであるバイナリーｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンは、陽性対照としてＰＣＲ反応の鋳型として使用した。同一サイズ又は適切であれば種々の制限酵素による切断後に得られる同一の制限パターンを有するＰＣＲ産物は、対応するｃＤＮＡが組み込まれていることの裏付けとなった。このようにして、クローンｎｔ００２００１０３５ｒの挿入物が上記表現型を有するトランスジェニック植物において検出された。

さらに、ストリンジェントな条件下でクローンｎｔ００２００１０３５ｒのｃＤＮＡとハイブリダイズした約１．７ｋｂのｍＲＮＡの抑制は、対照植物（Nicotiana tabaccum, Varietat Samsun NN）と比較してトランスジェニック植物の葉組織において検出された。この目的のため、ｎｔ００２００１０３５ｒ挿入物のプローブをHigh-prime DNA labelingキット（Roche, Mannheim）を用いて標識した。このプローブを関連するトランスジェニック植物及び対照植物の組織に由来する総ＲＮＡ又はｍＲＮＡのハイブリダイゼーションに使用した。ここで、ＲＮＡは、標準的な方法により分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした（Schleicher and Schull, Dassel, Germany）。

シュートを土壌に移した後、温室において、２〜２０週間にわたり表現型の発現について植物を観察した。トランスジェニック植物系統Ｐ＿０００００００３１５は表現型が類似していた。ｎｔ００２００１０３５ｒ挿入物を有していた系統Ｐ＿０００００００３１５の４つの植物（１８／８、１８／３２、１８／７５及び１８／７７）は、２週間後に顕著な増殖の遅延を示し、クロロティックリーフも生じ、場合によっては壊死が観察された。さらに系統１８／７５は実質的に全く根を発生せず、最終的に約６週間後に死滅する程度の損傷を負った。

実施例３：クローンの配列分析
ｃＤＮＡ（ヌクレオチド５０６〜６５２）のクローンｎｔ００２００１０３５ｒのキメラｃＤＮＡの一部（配列番号１）は、植物ＳＨＭＴと高度の同一性を有するペプチド断片（配列番号２）をコードする。タバコＥＳＴデータベースを用いたＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, pp. 403-410）による配列アライメントによって、配列番号１の一部領域に対して９９％以上の同一性を有し、ミトコンドリアＳＨＭＴと高度の同一性を有する別のクローンが明らかとなった。これらのクローンの１つ（クローンｎｔ００６１０００２３、配列番号３）を配列決定したところこれはキメラであった。１８０アミノ酸のミトコンドリアＳＨＭＴペプチド（配列番号２）をコードする配列番号３の一部領域は、ミトコンドリアＳＨＭＴペプチド断片をコードする配列番号１の３７８ｂｐの領域を含む。ヌクレオチド１１位、２６２位及び３３３位を除いて配列番号１のＳＨＭＴをコードする一部領域と同一性を有する別の非キメラクローン（ｎｔ００６０４３０６３、配列番号５）もまたタバコ植物に形質転換した。得られたトランスジェニック植物の表現型は系統Ｐ＿０００００００３１５の植物と同一であった。

従って、ＳＨＭＴをコードする配列の天然の発現は植物にとって必須であり、その発現の低下は実施例２に示す表現型に見られるように損傷をもたらすことが、驚くべきことに初めて示された。よって、ＳＨＭＴが除草剤の標的として適切であることが示された。

ｎｔ００６０４３０６３ｒの配列に基づいて、５’−ＲＡＣＥを、製造業者の説明書（SMART-Kit, Clontech）に従ってタバコｃＤＮＡで実施した。このようにして得られた全長ＳＨＭＴ ｃＤＮＡの配列を決定した（配列番号７）。１塩基（８１位）を除いて、この配列は配列番号５の重複領域（ヌクレオチド１２８８〜１７６０）と同一であった。配列番号７は１８３５塩基長であり、５１８アミノ酸長のポリペプチドをコードする（ヌクレオチド５６〜１６０９、配列番号８）１５５４ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。配列番号７とジャガイモミトコンドリアＳＨＭＴとの間に最大の同一性が見いだされた（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ２５８６３と８６．８％の同一性）。

実施例４：大腸菌における発現
ミトコンドリアＳＨＭＴをコードするアラビドプシスｃＤＮＡ（ＳＨＭ１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２７１７２６）を大腸菌で過剰発現させ、植物ＳＨＭＴ活性を有する活性タンパク質を作製した。

この目的のため、ＡＪ２７１７２６のコード領域をＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーから増幅し、標準的な方法によりベクターｐＣＲ ２．１ ＴＯＰＯに連結した（構築物ＳＨＭＴ１及びＳＨＭＴ２、表８）。続いて、得られた構築物を特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅し、得られた断片を発現ベクターｐＣＲ Ｔ７／ＣＴ ＴＯＰＯ及びｐＣＲ Ｔ７／ＮＴ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に連結した（構築物ＳＨＭＴ３−６、表７）。このようにして、Ｃ末端又はＮ末端ヘキサヒスチジンタグとの融合タンパク質を作製した。クローニングステップにおける表８に示すオリゴヌクレオチドの使用によって、ＳＨＭＴのＮ末端が切断された形態が得られ、これにより機能的発現を妨げる可能性のあるミトコンドリア移行配列が排除された。ＳＨＭＴのミトコンドリア移行配列は明確には知られていないため、種々のＮ末端切断形態を作製した。欠失すべき領域を特定するため、文献を参照することが可能である（Turner et al., JBC 19, pp.13528-13534, 1992）。

以下の標準的な条件（例えばSambrook, J. et al.(1989) “Molecular cloning: A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載）、すなわちアニーリング温度４５〜５５℃、及び重合時間それぞれ１０００ｂｐ当たり６０秒を３６サイクル行って、ＰＣＲを実施した。鋳型及びその鋳型のために使用したプライマーは、アニーリング温度と共に表７に示す。

ＰＣＲ産物を表７に示すベクターに連結し、大腸菌に形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ（Invitrogen）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）又はＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（Stratagene）などの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において、ＩＰＴＧで誘導して発現を実施した。標準的なプロトコール（Invitrogen）に従った。

ＳＨＭＴ６及びＳＨＭＴ７の発現産物をＮｉ−アガロースにおけるアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。これは製造業者の説明書に従って行った（Qiagen）。

実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系
記載のようにして植物ミトコンドリアからＳＨＭＴを単離し、本発明に従って放射活性法により測定した（Bourguignon et al., Biochem. J. 255, pp. 169-178, 1988）。実施例４において組換え発現させたＳＨＭＴタンパク質の活性は、必要であれば精製して、本発明の方法を用いて測定した。

あるいは、ＳＨＭＴ反応は、テトラヒドロ葉酸塩及びＣ１−テトラヒドロ葉酸塩の分離に基づく、ＨＰＬＣを用いた分離方法によりアッセイした。この方法において、１〜１００μｇのミトコンドリアＳＨＭＴを含む酵素含有アッセイ水溶液（０．４ ５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭテトラヒドロ葉酸塩、２０ｍＭセリン、５６ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．４）を、振とうしながら３０分間インキュベートし、アッセイ溶液１００ｍｌ当たり０．１ｍｌの０．３６Ｍ ＨＣｌで変性し、高速遠心（１００００ｇ）を５分間行うことにより沈殿から取り出した。

Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（３．５μｍ ４．６×１０ｍｍ；サンプル温度１０℃、カラム温度２５℃；流速１ｍｌ／分；λ＝２８８ｎｍ）でＨＰＬＣを実施し、サンプルの導入後、カラムを９５％バッファーＡ（５％体積のアセトニトリル水溶液）で０．５分かけて洗浄した。０〜１００％バッファーＢ（水）の勾配をかけて６分で分析用分離を行った。

さらに、酵素活性は、Stover及びSchirch（Anal. Biochem. 202, pp. 82-88）に記載の方法と同様にして測定した。本発明の方法は、ＳＨＭＴ反応とＮＡＤ依存的メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＭＴＤ）により触媒される反応、及び３４０ｎｍにおける光度測定の組み合わせに基づく。このために必要な補酵素ＭＴＤの量は、以下のように大腸菌におけるサッカロミセス・セレビシエＭＴＤの組換え発現により入手した。Appling及びWest（Methods in Enzymology 281, pp. 178-188）に記載のようにゲノムＤＮＡからＭＴＤをコードする核酸断片を単離した後、これをベクターｐＣＲ ２．１ ＴＯＰＯにクローニングした。得られる構築物をオリゴヌクレオチド5’-TTTTTCTTTAGACAGTTCTACGTTC-3’及び5’-ATGTCGAAGCCTGGTCGTA-3’を用いたＰＣＲにより増幅した。以下の標準的な条件（例えば、Sambrook, J. et al.(1989) “Molecular cloning: A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載）、すなわちアニーリング温度５５℃、重合時間それぞれ１０００ｂｐ当たり６０秒を３６サイクル行ってＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を発現ベクターｐＣＲ Ｔ７／ＣＴ−ＴＯＰＯ（構築物ＭＴＤ）に連結し、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ（Invitrogen）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）又はＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（Stratagene）などの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において発現させた。標準的なプロトコール（Invitrogen）を行った。構築物ＭＴＤの発現産物は、製造業者の指示（Qiagen）にしたがってＮｉ−アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。

配列表

Claims (10)

1. 除草剤活性を有する化合物の同定方法における、
   （ｉ）以下の核酸配列の１つを有する核酸分子：
   （ａ）配列番号７に示される核酸配列、若しくは
   （ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導される核酸配列、若しくは
   （ｃ）配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、又は
   （ｉｉ）上記核酸配列の１つによりコードされるポリペプチド
   の使用。
2. 除草剤活性を有する物質の同定方法であって、以下のステップ：
   ｉ）以下の核酸配列の１つを有する核酸分子：
   （ａ）配列番号７に示される核酸配列、若しくは
   （ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導される核酸配列、若しくは
   （ｃ）配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、又は
   上記核酸配列の１つをコードするポリペプチド
   を、１以上の試験化合物と、該試験化合物が該核酸分子又は該核酸によりコードされるポリペプチドと結合するような条件下で接触させるステップ；並びに
   ｉｉ）試験化合物が、ｉ）のポリペプチドと結合するか否かを検出するステップ；あるいは
   ｉｉｉ）試験化合物が、ｉ）のポリペプチドの活性を低減又は阻止するか否かを検出するステップ；あるいは
   ｉｖ）試験化合物が、ｉ）の核酸の転写、翻訳又は発現を低減又は阻止するか否かを検出するステップ、
   を含む、上記方法。
3. 以下のステップ：
   ａ）トランスジェニック生物において、以下の核酸配列の１つ：
   （ａ）配列番号７に示される核酸配列、若しくは
   （ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導される核酸配列、若しくは
   （ｃ）配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列
   によりコードされる植物セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現させるか、あるいは上記核酸配列の１つによりコードされる植物セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを天然にコードする生物を培養するステップ；
   ｂ）トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物中のステップａ）のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを、部分的に又は均質に精製した形態で、試験化合物と接触させるステップ；並びに
   ｃ）ステップａ）のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を低減又は阻止する試験化合物を選択するステップであって、ここで試験化合物と共にインキュベートしたセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を、試験化合物と共にインキュベートしていないセリンヒドロキシメチルトランスフェラーぜの活性と比較するものである、上記ステップ、
   を含む、請求項２記載の方法。
4. ステップｃ）において、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を、クロマトグラフィーの単離、並びにテトラヒドロ葉酸塩及びＣ１−テトラヒドロ葉酸塩の定量により測定する、請求項３記載の方法。
5. 以下のステップ：
   ａ）以下の核酸配列：
   （ａ）配列番号７に示される核酸配列、若しくは
   （ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導される核酸配列、若しくは
   （ｃ）配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列
   の少なくとも１つを含有し、細菌、酵母、真菌、動物若しくは植物又はそれらの細胞から選択される非ヒトトランスジェニック生物又は細胞を作出するステップ；
   ｂ）試験物質を、ａ）のトランスジェニック生物又は細胞及び同種の非トランスジェニック生物又は細胞に適用するステップ；
   ｃ）試験物質の適用後にトランスジェニック生物又は細胞及び非トランスジェニック生物又は細胞の成長又は生存を判定するステップ；
   ｄ）トランスジェニック生物又は細胞の成長と比較して非トランスジェニック生物又は細胞の成長の低減又は生存の低減をもたらす試験物質を選択するステップ、
   を含む、請求項２記載の方法。
6. 植物又は酵母において行う、請求項５記載の方法。
7. 成長調節活性を有する物質の同定方法であって、以下のステップ：
   ａ）配列番号７に示される核酸配列、又は遺伝暗号の縮重に基づいて配列番号８に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導される核酸配列、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有し、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含有するトランスジェニック植物を作出するステップ；
   ｂ）試験物質を、ａ）のトランスジェニック植物及び同種の非トランスジェニック植物に適用するステップ；
   ｃ）試験物質の適用後のトランスジェニック植物及び非トランスジェニック植物の成長又は生存を判定するステップ；並びに
   ｄ）トランスジェニック植物の成長と比較して非トランスジェニック植物の成長の変化をもたらす試験物質を選択するステップ、
   を含む、上記方法。
8. 物質がハイスループットスクリーニングにおいて同定される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 配列番号７の核酸配列の変異体によりコードされる改変型遺伝子産物を作製する方法であって、以下のステップ：
   ａ）異種系又は無細胞系において配列番号７によりコードされるタンパク質を発現するステップ；
   ｂ）核酸の改変によりタンパク質のランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を行うステップ；
   ｃ）改変型遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定するステップ；
   ｄ）相互作用を非改変型遺伝子産物よりも示さないタンパク質の誘導体を同定するステップ；
   ｅ）除草剤の適用後にタンパク質の生物学的活性をアッセイするステップ；並びに
   ｆ）除草剤に対する生物学的活性が改変された核酸配列を選択するステップ、
   を含む、上記方法。
10. 請求項９のステップｆ）に従って選択された配列を生物に導入する、請求項９記載の方法。