JP4495166B2

JP4495166B2 - 薬剤標的として有用なタンパク質コーディングｄｎａ配列の同定のためのコンピューターに基づく汎用的方法

Info

Publication number: JP4495166B2
Application number: JP2006542030A
Authority: JP
Inventors: クマールブラーマチャリ，サミール; ダッシュ，デバシス; シャルマ，ラマカント; クマールマヘシュワリ，ジテンドラ
Original assignee: カウンシルオブサイエンティフィクアンドインダストリアルリサーチ
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2004-01-09
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2024-01-09
Also published as: JP2007512829A; EP1690207B1; CN100570620C; IL176125A; US20050136480A1; EP1690207A1; CN1914616A; AU2004297721A1; IL176125A0; AU2004297721B2; AU2004297721B9; DE602004029391D1; WO2005057464A1; CA2548496A1

Description

本発明は、薬剤標的として有用であるタンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定する汎用的方法に関する。より具体的に、本発明は、種々の生物体のゲノム配列データー中の新規の遺伝子であって、潜在的薬剤標的として有用な遺伝子の同定方法に関する。本発明はさらに、正確なアミノ酸配列同一性シグネチャーを通して、未知機能の仮定上のオープン・リーディング・フレーム(タンパク質)についての機能を評価する方法をさらに提供する。

ハイスループット・シーケンス技術の出現は、新たにシーケンスされたゲノムにおいて新規タンパク質コーディングＤＮＡ配列(遺伝子)の同定を必要としてきた。本発明は、ペプチドライブラリーを使用することにより、ＤＮＡ配列を英数字配列へと変換する新規の方法を提供する。本発明はまた、タンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するために、１の入力層、３０のニューロンを有する隠れ層、及び１の出力層を有する人工ニューラル・ネットワーク(フィードフォワード・バックプロパゲーション・トポロジー)を使用する方法も提供する。本発明はさらに、タンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するために、５個のパラメーター、つまり、トータル・スコア、平均、ゼロ率（fraction of zeroes)、最大連続非ゼロストレッチ(maximum continuous non-zero stretch)、及び分散を有する学習関数としてシグモイドを使用してニューラル・ネットワークをトレーニングする方法を提供する。

本発明の背景技術及び従来技術の参考文献
新たにシーケンスされたゲノムにおいてタンパク質コーディングＤＮＡ配列(遺伝子)を同定する最も信頼できる方法は、他の生物から近縁のホモログを見つけることである(ＢＬＡＳＴ(Altschul, S. Fら、1990)及びＦＡＳＴＡ(Pearson, W. R., 1995))。ＤＮＡ配列中の４個のヌクレオチドは、ランダムに分布することはない。コード領域内のヌクレオチドの統計的分布は、非コード領域とは有意に異なる(Bird, A., 1987)。Hidden Markov Models(ＨＭＭ)に基づく方法は、これらの統計的性質を最も効率的に利用し(Salzberg, S. Lら、1998；Delcher, A. Lら、1999；Lukashin, A. V.及びBorodovsky, M.、1998)、そして公開されているアノテーションと比較して、ゲノムの全ての遺伝子の約９７％〜９８％を予測することができる(Delcher, A. Lら、1999)。ＨＭＭを使用して、ＧｅｎｅＭａｒｋ、Ｇｌｉｍｍｅｒなどの様々なアルゴリズムが開発されて、原核生物の遺伝子を予測してきた。Ｇｌｉｍｍｅｒ２.０は、存在する全ての方法の中で最もうまくいった方法である(Delcher, A. Lら、1999)。しかしながら、Ｇｌｉｍｍｅｒは、７〜２０％の付加的遺伝子(擬陽性)を予測してしまう。

各々の遺伝子予測方法は、固有の長所及び短所を有する(Mathe, C.ら、2002)。予測は通常トレーニング・セットに依存しているので、コード領域についての統計が、種々のゲノムに渡って変化するため欠点が生じる。また、これらの方法は、短い長さの遺伝子(１００未満のアミノ酸)を効率的に予測することができない。なぜなら、こうした遺伝子を、類似性検索又は統計分析により検出することがとても難しいからである。この問題は、遺伝子の水平移動の場合においてより大きい問題となる(Kehoe, M.Aら、1996)。この場合、これらの遺伝子のヌクレオチド配列の統計的分布は、ゲノム自身の中においても異なる。

本発明の方法は、所定の長さにおける理論上可能であるペプチドの総数と、自然において実際観察される所定の長さのペプチドの総数との間の差が、ペプチドの長さが増加するにつれて劇的に増加するという観察に基づく。例えば、理論上可能なヘプタペプチドのうちの約２％のみが、完全にシーケンスされた５６種の原核生物ゲノムのプール中で観測される。オクタペプチド・レベルでは、この数はさらに０.１％未満に低減する。さらに、自然により選ばれるこれらのペプチドの多くが、コード領域内にのみ見られ、そして理論上翻訳される非コード領域においてはかなり稀であるということに注目するのは興味深い。この観察は、我々が、コード領域と非コード領域との間を区別するために、タンパク質コード配列中に存在するペプチドの自然選別の排他性を利用することを促進する。

原理上、クエリーＯＲＦをスコアするためにより長いペプチド・ストレッチを使用することは、短いペプチドを使うことより常に好ましい(Salzberg, S.L.ら、1998)が、これは十分なデーターが、予測アルゴリズムをトレーニングするために必要とされる統計パラメーターを評価するために利用できる場合に限られる。８以上の長さのアミノ酸のペプチドを使用する場合、トレーニングパラメーターを評価する十分なデーターを得ることは難しい。これは、オクタペプチドが、２個のポリペプチド間で共有される可能性が、ヘプタペプチドが共有される可能性より低いためである。その結果、我々は、７個のアミノ酸長がＯＲＦをスコアするために最適なものであると考える。

当該方法の新規性は、ヌクレオチド配列レベルではなくアミノ酸配列レベルでタンパク質コード配列に基づいて行われるということである。当該方法が生物特異的トレーニング・セットを必要としないということが注目すべき点であり、このことは他の方法に対して明らかな利点である。他の方法とは違って、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、コード遺伝子及びその開始位置を予測するために、リボソーム結合部位、プロモーター配列、転写開始部位、又はコドン利用バイアスなどの目印を利用しない。加えて、当該方法は、ＳＡＲＳ-ＣｏＶなどの小さいゲノム(Chen, Lら、2003)についての遺伝子予測の難しさを克服する。遺伝子予測以外にも、当該方法はポリペプチドについての類似性サーチ、タンパク質に対する推定される機能付与(オリゴペプチド・モチーフの存在に基づく)、及び系統発生ドメイン分析に利用でき、当該方法の汎用性及び多様性を指し示す。

GeneMark.hmm(Lukashin及びBorodovsky、1998)、Glimmer(Salzbergら、1998)などの現在のコンピューター方法は、ＳＡＲＳなどの小さいゲノムを分析する際に困難に直面する。Hidden Markov Models(HMM)に基づく方法は、トレーニングのために数千ものパラメーターを必要とする。これは、当該方法を、小さいゲノムの分析には適していないものとする。ＳＡＲＳ-ＣｏＶゲノムの場合の問題となる化合物は、約３０ｋｂの長さである。今日までのウイルス遺伝子予測に最も適した方法であるＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶ(Chenら、2003)でさえ、トレーニングに３３のパラメーターを必要とする。GeneDecipherは、たった５個のパラメーターのみを必要とし、そして小さいゲノムを分析することもできる。出願人は、ecoli-k１２ゲノムコード領域及び非コード領域(遺伝子として報告されていないＯＲＦ)に基づいて人工ニューラル・ネットワークをトレーニングした。ウイルスゲノムについてＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒを使用して、タンパク質コード遺伝子を予測するために、更なるトレーニングが必要とされることはない。これは、他の方法に対する当該方法の明らかな利点である。

本発明の目的
本発明の主な目的は、薬剤標的として有用な、ダンパク質をコードするＤＮＡ配列(遺伝子)を予測する方法であって、コンピューターに基づく方法を提供することである。
本発明の他の主な目的は、ソフトウェアＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒを使用して、他のゲノムのＯＲＦ中に存在することがわかっているオリゴペプチドを使用して、遺伝子を同定する汎用的方法を開発することである。
本発明のさらに別の目的は、病原生物により引き起こされる疾患を管理する際に適用できる方法を開発することである。

本発明のさらに別の目的は、前述の方法を実行するためのコンピューターに基づくシステムを開発することである。

本発明のさらに別の目的は、潜在的な薬剤標的として有用であり、そして広範囲の抗菌性について薬剤のスクリーニングとして役に立ち得る新規タンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するために、並びに感染の特異診断のために有用な方法を開発することである。本発明のさらに別の目的は、種特異的又は生物特異的タンパク質コード遺伝子を同定することである。

本発明の方法のさらに別の目的は、真核生物においてタンパク質コーディングＤＮＡ配列(エキソン)を同定することである。
本発明の別の目的は、正確なアミノ酸配列同一性のシグネチャーを通して未知機能の仮定上のオープン・リーディング・フレーム(タンパク質)に機能を割り当てることである。

本発明の要約
本発明は、他のゲノムのＯＲＦ中に存在することが分かっているオリゴペプチドを使用して遺伝子を同定し、そしてＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒソフトウェアを使用して小さいゲノムを分析するために適している汎用的方法であって、以下のステップ：
既知のゲノムから、コンピューターによりアルファベット順に配列された長さ「Ｎ」のペプチドを有するペプチドライブラリーを作成し、
上記試験ゲノムを人工的に翻訳して、各リーディング・フレームにおいてポリペプチドを得て、
各ポリペプチド配列を英数字配列に変換し、ここで一の配列は、ペプチドライブラリーとの重なりに基づく各リーディング・フレームに対応する配列を有する
人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)を、英数字配列についてシグモイド学習関数でトレーニングし、
上記試験ゲノム中のタンパク質コード領域を解読し、そうして
多数の既知遺伝子及びその対応するタンパク質に位置付けられるより長いペプチド・ストレッチを同定する
を含む方法、並びに病原体により引き起こされる疾患を管理する方法であって、本発明のステップにより同定される１以上のタンパク質の機能を阻害することにより提案された薬剤候補を評価するステップを含む方法に関する。

本発明の詳細な記載
従って、本発明は、特別に開発されたソフトウェア・ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒを使用して、ゲノム中で薬剤標的として有用なタンパク質コーディングＤＮＡ配列(遺伝子)を同定する汎用的方法であって、当該方法は、以下のステップ：
既知のゲノムから、コンピューターによりアルファベット順に配列された長さ「Ｎ」のペプチドを有するペプチドライブラリーを作製し、
人工的に試験ゲノムを翻訳して各リーディング・フレームに対応するポリペプチドを得て、各ポリペプチド配列を英数字配列に変換し、ここで１の英数字配列がペプチドライブラリーとの重なりに基づく各リーディング・フレームに対応し、
人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)を、英数字配列についてシグモイド学習関数でトレーニングし、
試験ゲノムにおけるタンパク質コード領域を解読し、こうして、
多数の既知遺伝子及びその対応するタンパク質に位置されるより長いペプチド・ストレッチを同定する
を含む方法、並びに病原体により引き起こされる疾患の管理方法であって、本発明のステップにより同定される１以上のタンパク質の機能を阻害することにより、提案された薬剤候補の評価をするステップを含む方法に関する。

本発明の一の実施態様において、薬剤標的として有用であるタンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するコンピューターに基づく汎用的方法であって、以下のステップ：
・既知のゲノムから、コンピューターによりアルファベット順に配置される長さ「Ｎ」のオリゴペプチドを有するペプチドライブラリーを作成し
・当該試験ゲノムを人工的に翻訳して、各リーディング・フレームのポリペプチドを得て、
・各ポリペプチド配列を英数字配列に変換し、ここで、一の配列が、前記ペプチドライブラリーにおいてこれらのオリゴペプチドの出現に基づく各リーディング・フレームに対応し
・既知のタンパク質コーディングＤＮＡ配列及び既知の非コード領域に対応する英数字配列について、シグモイド学習関数で人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)をトレーニングし、
・上記試験ゲノム中のタンパク質コード領域を解読し、そして
・多数の既知遺伝子に位置する機能シグネチャーとして役に立つより長いペプチド・ストレッチを同定する
を含む方法が提供される。

本発明の別の実施態様では、人工ニューラル・ネットワークは、１以上の入力層、様々な数のニューロンを有する１以上の隠れ層、及び１以上の出力層を有する。

本発明のさらに別の実施態様では、隠れ層のニューロンの数は、好ましくは３０である。
本発明のさらに別の実施態様では、「Ｎ」の値が４以上である。
本発明のさらに別の実施態様では、前記シグモイド学習関数は、トータル・スコア、平均、ゼロ率、最大連続非ゼロストレッチ、及び分散を含む５個のパラメーターを有する。
本発明のさらに別の実施態様では、遺伝子を同定する方法は、他のゲノム、非限定的にＨ.インフルエンザ(H. influenzae)、Ｍ.ゲニタリウム(M. genitalium)、E.コリ(E. coli)、Ｂ.サブチリス(B. subtilis)、Ａ.フルギジス(A. fulgidis)、Ｍ.ツベルクロシス(M. tuberculosis)、Ｔ.パリダム(T. pallidum)、Ｔ.マリチマ(T. maritima)、シネコ・シスチス(Synecho cystis)、Ｈ.ピロリ(H. pylori)、及びＳＡＲＳ-ＣｏＶなどのゲノムのＯＲＦ中に存在することが分かっているオリゴペプチドを使用する。

本発明のさらに別の実施態様、請求項１に記載される方法では、当該ペプチドライブラリー・データーは、明確に本発明に使用される生物体に限定されていない生物体のいずれかからとられてもよい。

本発明のさらに別の実施態様では、Ｈ.インフルエンザの配列番号１〜４４の遺伝子セットが、前述の方法を使用することにより同定される。
本発明のさらに別の実施態様では、Ｈ.インフルエンザの配列番号１〜４４の遺伝子に対応する配列番号１７０〜２１３のタンパク質のセットが、前述の方法を使用することにより同定される。

本発明のさらに別の実施態様では、Ｈ.ピロリの配列番号４５〜６０の遺伝子セットが、前述の方法を使用することにより同定される。
本発明のさらに別の実施態様では、Ｈ.ピロリの配列番号４５〜６０の遺伝子に対応する配列番号２１４〜２２９のタンパク質のセットが、前述の方法を使用することにより同定される。

本発明のさらに別の実施態様では、Ｍ.ツベルクロシスの配列番号６１〜１６５の遺伝子セットが、前述の方法を使用することにより同定される。
本発明のさらに別の実施態様では、Ｍ.ツベルクロシスの配列番号６１〜１６５の遺伝子に対応する配列番号２３０〜３３４のタンパク質のセットが、前述の方法を使用することにより同定される。

本発明のさらに別の実施態様では、配列番号１６６〜１６９のＳＡＲＳ-コロナ・ウイルスの遺伝子セットが、前述の方法を使用することにより同定される。
本発明のさらに別の実施態様では、ＳＡＲＳ-コロナ・ウイルスの配列番号１６６〜１６９の遺伝子に対応する配列番号３３５〜３３８のタンパク質のセットが、前述の方法を使用することにより同定される。

本発明のさらに別の実施態様では、配列番号１〜１６９の遺伝子に対応する配列番号１７０〜３３８のタンパク質が、病原体により引き起こされる疾患状態を管理するために薬剤標的として、それを必要とする対象に使用される。

本発明のさらに別の実施態様では、前記病原体は、ＳＡＲＳ-コロナ・ウイルス、Ｈ.インフルエンザ、Ｍ.ツベルクロシス、及びＨ.ピロリを含む群から選ばれる。

本発明のさらに別の実施態様では、前記対象は動物である。
本発明のさらに別の実施態様では、前記対象はヒトである。
本発明のさらに別の実施態様では、前記使用は、真核生物及び多細胞生物に拡大される。

ハイスループット・シーケンス技術の出現は、新たにシーケンスされたゲノムにおいて新規のタンパク質コーディングＤＮＡ配列(遺伝子)の同定を必要とする。本発明は、ペプチドライブラリーを使用することにより、ＤＮＡ配列を英数字配列に変換する新規の方法を提供する。本発明はまた、タンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するために、１の入力層、３０のニューロンを有する１の隠れ層、及び出力層を有する人工ニューラル・ネットワーク(フィードフォワード・バックプロパゲーション・トポロジー)を使用する方法を提供する。本発明は、さらに、タンパク質コーディングＤＮＡの同定のため、５個のパラメーター、つまり、トータル・スコア、平均、ゼロ率、最大連続非ゼロストレッチ、及び分散を有する学習関数としてシグモイドを使用するニューラル・ネットワークのトレーニング法を提供する。

出願人は、自然淘汰を耐えてきた多くの生物体のタンパク質配列から得られる数百万ものペプチドを含むペプチドライブラリーと比較することにより、タンパク質コーディングＤＮＡを同定する新規のコンピューターに基づく方法を発明した。当該方法は、遺伝子同定のための新たな一般的かつ汎用的なアプローチを記載する。コンピューターによる方法は、ペプチドライブラリー及び人工ニューラル・ネットワークの使用を介して所定のＤＮＡ配列中の全ての潜在的なオープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)のなかから遺伝子候補を決定する。ペプチドライブラリーは、完全にシーケンスされた５６以上の真核生物ゲノムのタンパク質から得られる重なり合う潜在的なヘプタペプチド全てからなる。所定のクエリーＯＲＦは、ＯＲＦに渡ってライブラリー・ヘプタペプチド(ライブラリー中に存在するヘプタペプチド)の存在及び分布パターンに基づいた遺伝子として適格である。当該方法の性能は、感受性及び特異性が同時に高いことにより特徴付けられる。１０個の完全にシーケンスされた原核生物ゲノムの分析が提供されて、本発明の方法の性能を示す。

本方法はまた、病原体の特異的なペプチド・モチーフに対する代替標的又は疾患過程の原因となる宿主タンパク質標的の予測を可能にする。本方法は、多数のタンパク質コーディング遺伝子を得るために異なるペプチド長で拡張されうるし、そして真核生物及び多細胞生物に拡張され得る。

本発明は、ペプチドライブラリーを使用することによりＤＮＡ配列を英数字配列に変換する新規の方法に関し、そして本発明はまた、タンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するため、１の入力層、３０個のニューロンを有する１の隠れ層、及び出力層を有する人工ニューラル・ネットワーク(フィードフォワードバックプロパゲーション・トポロジー)の使用方法を提供する。本発明はさらに、５個のパラメーター、つまりトータル・スコア、平均、ゼロ率、最大連続非ゼロストレッチ、及び分散を有する学習関数としてシグモイドを使用してニューラル・ネットワークをトレーニングする方法に関し、そして本方法は、広範囲の抗菌作用について、薬剤スクリーニングとして役に立つ新規のタンパク質コード領域の同定に有用であり、並びに感染の具体的な診断に有用であり、そしてさらに、未だ未知機能の新たに同定されたタンパク質についての機能を評価するのに有用である。当該方法は、種又は菌株特異的タンパク質コード遺伝子の同定を可能にする。当該方法はまた、真核ゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定に広げることができる。

従って、本発明は、薬剤標的として有用なタンパク質コーディングＤＮＡ配列を同定するためのコンピューターに基づく汎用方法であって、当該方法が以下のステップ：
ａ. 既知のゲノムから、コンピューターによりアルファベット順に配列された長さ「Ｎ」のオリゴペプチドを有するペプチドライブラリーを作成し、
ｂ. 試験ゲノムを人工的に翻訳して各リーディング・フレーム内のポリペプドを獲得し、
ｃ. 各ポリペプチド配列を英数字配列へと変換し、ここで一の配列は、ペプチドライブラリー内におけるこれらのオリゴペプチドの存在に基づく各リーディング・フレームに対応し、
ｄ. シグモイド学習関数を用いて人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)を、既知のタンパク質コーディングＤＮＡ配列及び既知の非コード領域に対応する英数字配列についてトレーニングし、
ｅ. 試験ゲノム中のタンパク質コード領域を解読し、そして
ｆ. 多数の既知の遺伝子に位置する長いペプチド・ストレッチ(進化保存オリゴペプチド)であって、機能シグネチャ-として役に立つペプチド・ストレッチを同定する
を含む方法に関する。

さらに本発明の別の実施態様では、ＡＮＮは、１以上の入力層、様々な数のニューロンを有する１以上の隠れ層、そして１以上の出力層を有する。本発明のさらに別の実施態様では、隠れ層におけるニューロンの数は、好ましくは３０である。

本発明のさらに別の実施態様では、「Ｎ」の値は４以上である。
本発明のさらに別の実施態様では、シグモイド学習関数は、トータル・スコア、平均、ゼロ率、最大連続非ゼロストレッチ、及び分散を含む５個のパラメーターを有する。

本発明のさらなる実施態様では、様々なゲノム、非限定的に、Ｈ.インフルエンザ(H. influenzae)、Ｍ.ゲニタリウム(M. genitalium)、E.コリ(E. coli)、B.サブチリス(B. subtilis)、Ａ.フルギジス(A. fulgidis)、Ｍ.ツベルクロシス(M. tuberculosis)、Ｔ.パリダム(T. pallidum)、Ｔ.マリチマ(T. maritima)、シネコ・シスチス(Synecho cystis)、Ｈ.ピロリ(H. pylori)、及びＳＡＲＳ-ＣｏＶなどのゲノムのＯＲＦにおいて存在する進化的に保存されたペプチド配列を有する遺伝子を同定する方法が提供される。

本発明のさらに別の実施態様では、当該方法は、ＳＡＲＳ-コロナ・ウイルス及びＨ.インフルエンザ、Ｍ.ツベルクロシス、Ｈ.ピロリのゲノムにおいて同定される１６９の新規の遺伝子(配列番号１〜１６９)を同定する。

本発明のさらなる実施態様では、ＳＡＲＳ-コロナ・ウイルス、Ｈ.インフルエンザ、Ｍ.ツベルクロシス及びＨ.ピロリなどの病原体により引き起こされる病気の管理方法であって、当該方法が以下のステップ：
本方法により同定され、そして配列番号１〜１６９の新規の配列に対応する配列番号１７０〜３３８のタンパク質を含む群から選ばれる進化的に保存された１以上のペプチド配列の機能を阻害するための提案された薬剤候補を評価する
を含む方法が提供される。
本発明のさらに別の実施態様では、当該ペプチドライブラリー・データーは、いずれの生物から取られてもよいが、本発明において使用される生物に明確に限定されることはない。

詳細な方法論：
当該方法は、以下の５個の主要なステップ(図１において示されるように)：
１. ペプチドライブラリーを作成し、
２. 所定のゲノムを６個のリーディングフレームへ人工翻訳し、
３. 各翻訳された配列を英数字配列に変換し(一の配列が、各リーディング・フレームに対応し)、
４. 人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)をトレーニングし、
５. トレーニングされたＡＮＮを使用して遺伝子を解読する
を含む。

１. ペプチドライブラリーの作成
当該方法は、所定のゲノムにおいて遺伝子を予測するための参照ペプチドライブラリーを必要とする。本発明において、出願人は、５６個の完全にシーケンスされた原核生物ゲノム由来のタンパク質を使用した。我々のデーターベースについてのタンパク質ファイルを、ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomesからＦＡＳＴＡフォーマットで得た。特定のゲノム中で遺伝子を解析するペプチドライブラリーを製造するために、出願人は、いずれかのバイアスを避けるために、我々のデーターベースからその特定の種に属するタンパク質ファイルを除外する。例えば、Ｅ.コリ-ｋ１２ゲノムを分析するとき、Ｅ.コリの全ての株に対応するタンパク質ファイルを、データーベースから除外して、ペプチドライブラリーを作成する。これは、その生物体のペプチドから得られるシグナルを排除するために行われ、これは、新たにシーケンスされたゲノムを分析する場合に行われよう。これは、アノテーション付きタンパク質ファイルが利用できない新たにシーケンスされたゲノム上で遺伝子を予測する点で当該方法を増強する。ペプチドライブラリーを作成する一方、１のアミノ酸だけウィンドウをシフトすることにより、全ての潜在的な重なり合うヘプタペプチドが処理された。不要なペプチドを、ペプチドライブラリーから取り除き、そして各ペプチドに、当該ペプチドが存在する個々の生物体の数に基づく出現回数を与える。

当該出現回数は、コード領域におけるヘプタペプチドの保存の尺度である。ＯＲＦ中の高出現回数を有するヘプタペプチドの存在は、ＯＲＦがタンパク質コード遺伝子であるという可能性を高める。我々のアルゴリズムでは、９以上の出現回数は、ヘプタペプチドが９以上の異なる生物のタンパク質ファイル中に存在している場合、高度に保存されたヘプタペプチドとして考えられるという前提に基づいて９として取り扱われる。保存の程度をさらに区別するために、さらに高い値を使用することは価値がない。

ヘプタペプチド・ライブラリー・データーベースは、２個のカラムからなり、１つ目のカラムは、ヘプタペプチド配列のためのカラムであり、そして２つ目のカラムは、そのヘプタペプチドのスコア(出現回数)のためのカラムである。ヘプタペプチドは、辞書の順番に並び替えられる。ペプチドライブラリーデーターベースはまた、ヘプタペプチドについての他の情報、例えばそのヘプタペプチドを含むタンパク質全ての受諾番号及びＮＣＢＩアノテーションを有する。これは、与えられたＯＲＦの推定される機能を予測するために使用することができる。同じアプローチは、系統発生ドメイン分析にも使用することができる。

２.所定ゲノムの６個のリーディングフレームへの人工的翻訳
アルゴリズムにおける第二のステップは、標準的なコドン表を使用して、クエリーゲノム全体を、６個のリーディングフレームに人工的に翻訳することである。しかしながら、ユーザーが指定するコドン表が、必要に応じて使用されてもよい。出願人は、人工的な翻訳の間、ストップコドンＴＴＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡに対して「ｚ」の文字を使用し、そして標準的ではないヌクレオチドを含むトリプレット(Ｋ、Ｎ、Ｗ、Ｒ、及びＳなど)の全てについて「ｂ」の文字を使用する。

３. 各翻訳された配列の英数字配列への変換(１の配列は、各リーディング・フレームに対応する)
我々のアルゴリズムにおける次のステップは、人工的に翻訳されたアミノ酸配列であって、ストップコドン(ｚ)の停止を有するものを、英数字配列へと変換することである。出願人は、ペプチドライブラリー内の各重なり合うヘプタペプチドについてサーチし、対応する数を割り当て(出現回数)、そして英数字配列へと付け加えた。ヘプタペプチドが、ライブラリー内に存在しない場合、数字０を割り当てる。ヘプタペプチドが、開始コドンＡＴＧ、ＧＴＧ、及びＴＴＧのいずれかに対応するアミノ酸で始まる場合、出願人は、英数字配列中に「ｓ」という文字を付加する。これは、推定の開始コドンの位置を検出するために手助けとなろう。ヘプタペプチドが、文字「ｚ」を含む場合、出願人は、そのヘプタペプチドに対して「＊」という文字を付加する。こうして、英数字配列中の連続する７の「＊」(＊＊＊＊＊＊＊)は、ストップコドンのシグナルである。出願人は、文字「ｂ」を含むヘプタペプチドに文字「-」を付加する。当該シグナルは、非標準的なヌクレオチドの性質の存在を示し、そして遺伝子又は非遺伝子の一部である配列についての情報を伝えない。そうして、英数字配列は、こうして１３文字、すなわち(０〜９)の整数、「ｓ」、「＊」、及び「-」のいずれかを含むように作成される。この方法では、出願人は、全ての６個の翻訳されたタンパク質ファイルを、６の英数字配列に変換する。

４. 人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)のトレーニング
ここで使用されるニューラル・ネットワークは、マルチレイヤー・フィードフォワード・トポロジーを有する。当該ニューラル・ネットワークは、１の入力層、１の隠れ層、及び出力層からなる。これは、各ニューロンｉは、次の層の各ユニットｊに接続されている「十分に接続された」ニューラル・ネットワークである(図２)。各接続の荷重は、Ｗ_ijにより示される。入力層における各ニューロンの状態Ｉ_iは、入力データーから直接割り当てられる。一方、隠れ層ニューロンの状態は、シグモイド関数ｈ_j＝１/(１+ｅｘｐ-λ(Ｗ_j0+ΣＷ_ijＩ_i))、[式中、Ｗ_j0はバイアス荷重であり、そしてλ＝１である]を使用することにより計算される。

バックプロパゲーション・アルゴリズムは、計算された出力と所望の出力との間の差を最小化するために使用される。千回のサイクル(エポック)の繰返しが行われる。結果として、バリデーションの最小誤差を有するエポックが同定され、そして対応する荷重(Ｗ_ij)が、ＡＮＮについての最終荷重として割り当てられる。トレーニング・セット上でのネットワークトレーニングは、誤りをチェックし、そしてバック・プロパゲーションを介したバリデーション・セットを使用して最適化する。

トレーニング・セットは、ＮＣＢＩに記載されるＥ.コリ-ｋ１２の１６１０個のタンパク質コード遺伝子及びＥ.コリ-ｋ１２の３０００個のＯＲＦ(２０超のアミノ酸長の配列であり、開始コドン、停止コドンを同じフレーム内に有する配列のストレッチ)であって、遺伝子として報告されなかったもの(非遺伝子)からなる。「バリデーション・セット」は、トレーニング・セットにおいて使用されたものとは異なるＥ.コリ-ｋ１２由来の１０００の既知遺伝子及び１０００の非遺伝子を有する。「試験セット」は、同じ生物由来の別の１０００個の遺伝子及び１０００個の非遺伝子を含む。ＡＮＮのトレーニングのため、遺伝子及び非遺伝子にそれぞれ１及び０の確率値(probability value)を割り当てる。

ニューラル・ネットワークをトレーニングするため、先ず出願人は、全てのＥ.コリ-ｋ１２遺伝子及び非遺伝子を、上記方法(ステップ２及び３)により対応する英数字の配列へと変換する。ここで、遺伝子に対応する英数字配列が、非遺伝子に対応する英数字配列に比較して数字が多いということを気づくことは重要である。英数字配列が数字を多く含むことを定量するため、英数字配列から得られる５個のパラメーターを選択した。これらの５個のパラメーターは以下の：
(i). トータル・スコア
英数字配列の整数の全ての代数和。大雑把に言えば、スコアが高くなると、遺伝子として適格である可能性が高くなる。
(ii). ゼロ率
ゼロ率は、英数字配列中の０の文字の総数を配列中の文字の総数により割ったものに等しい。ゼロ率が高くなると、遺伝子として適格である可能性が低くなる。
(iii). 平均
平均は、トータル・スコアを配列の全体の長さで割ったものに等しい。平均が高くなると、遺伝子として適格である可能性が多くなる。実際、このパラメーターは、トータル・スコアと同じであるように見えるが、平均は、配列の長さを取り込んだものであるので重要である(単位長さあたりのスコア)。
(iv). 分散
分散とは、ＯＲＦ全体についての平均出現回数についての出現回数の分散である。
(ｖ). 最大連続非ゼロストレッチの長さ
である。

このパラメーターの値が高くなると、遺伝子として適格である可能性が高くなる。例えば「４５」といったの配列領域について検討すると、ここで、「４」は、ヘプタペプチドが４の生物において保存されたということを指し、そして続いて「５」は、５の生物において保存される重なり合うヘプタペプチドを指す。これらの２個のセットの間で、共通する少なくとも１の生物が存在する場合、最終的に出願人は、生物とクエリーORFとの間で共通するオクタペプチドを有する。これは、コード領域の予測における我々の信頼性レベルを高める。例えば、配列「ｓ４５４６７００００００＊＊＊＊＊＊＊」は、配列「ｓ４０５４０６０７０００＊＊＊＊＊＊＊」と比べた場合、より遺伝子である可能性が高い。これは、１個目の配列中において保存された長いペプチド・ストレッチの存在の可能性が高いからである。１個目の配列についての当該パラメーターの値は５であり、２個目の配列については２である。

英数字配列からパラメーターを計算する一方、「ｓ」、「＊」、及び「-」が文字は除かれた。

最適組合せを見つけるために、ニューラル・ネットワークは、５個のパラメーター全てを一緒に使用するようにトレーニングされる。遺伝子及び非遺伝子の英数字配列に対応するパラメーターが計算される。トレーニング、分散及び試験セットは、６個のカラムを含み、最初の５個のカラムは、５個のパラメーターの値を含み、そして最後のカラムは、遺伝子については数字の「１」を、そして非遺伝子については数字の「０」を含む。

入力層におけるニューロンの数は、入力するデーターポイントの数と同数であった。隠れ層におけるニューロンの最適数は、当該ネットワークについて最良のエポックで誤りを最小化する間に、適合と試行により決定された。５個のパラメーターの全てを計算する人工ニューラル・ネットワークについてのコンピューター・プログラムは、Ｃ言語で書かれ、そしてRed Hat Linux（登録商標）バージョン７.３又は８.０のＰＣ上で実行される。

ＡＮＮのトレーニング(アルゴリズムのステップ４)は、一般的に１回のみ行われ、そして同じトレーニングされたニューラル・ネットワークは、原核生物ゲノムのいずれかについて当該方法を実行するために利用できる。出願人が、生物特異的トレーニング・セットを使用する場合、結果は、幾つかの場合改善されるが、不十分であろう。これは、我々の方法が、ＯＲＦの英数字配列の数字の分布に基づいて遺伝子を予測するためである。つまり、遺伝子予測は、トレーニング・セットよりは使用されるペプチドライブラリーにより左右される。

５. トレーニングされたＡＮＮを使用した遺伝子の解読
ペプチドライブラリーの作成(ステップ１)及びＡＮＮのトレーニング(ステップ４)が、本発明の方法を実行するための準備段階として考えられる一方、ステップ２及びステップ３は、各ゲノム配列についての命令段階である。ゲノムを６個のリーディングフレームの全てにコンピューターにより翻訳し、そしてそれらを６個の英数字配列へと変換させた後に、ＡＮＮを用いた遺伝子解析が実行される。当該ステップは、さらに以下の５個のサブ・ステップに分けることができる：
１. ６個の英数字配列の全てを、潜在的なＯＲＦに分け(全ての潜在的な断片は、「ｓ」で始まり、「＊」で終わる)
２. ５個のパラメーター(トータル・スコア、ゼロ率、平均、分散、及び最大連続非ゼロストレッチの長さ)の全てを、全ての潜在的なＯＲＦ(「ｓ」と「＊」との間の英数字の鎖配列の全て)について計算し、
３. トレーニングされたＡＮＮを使用して、与えられた英数字の鎖に対応するＯＲＦがタンパク質コード遺伝子であるという可能性を計算し、
４. カットオフ確率値を使用することにより、タンパク質コードＯＲＦを非コードＯＲＦからから除外し、
５. 包含されたタンパク質コード領域の全てを取り除く(Shibuya、T.及びRigoutsos, i., 2002)
２個のＯＲＦが、異なる翻訳フレームにおいて予測され、その結果一つの範囲が、完全にもう一方を含む場合、それらのうちの１つのみが、実際の遺伝子であると通常信じられている。この場合、出願人は、遺伝子としての高い確率値を有するORFを報告する。同じ確率値の場合、出願人は、長いＯＲＦを遺伝子として取り扱う。

本発明の方法は、タンパク質コード領域であるクエリーＯＲＦに一致する確率値を予測する。ＡＮＮのトレーニングを、シグモイド学習関数＝１(遺伝子について確率「１」であり、そして非遺伝子について「０」である)を使用して行い；その結果、この確率値は多くの場合、０.１以下又は０.９超になる。このため、０.１〜０.９の間のカットオフ値のいずれかは、かなり似たような結果をもたらす。我々の分析では、出願人は、デフォルトのカットオフ値０.５を使用する。当該方法が、感受性及び特異性との交換を必要としないということに注目することは重要である。なぜなら、カットオフ確率の選択は、結果に重要な因果関係を有さないからである。

別の、そして更なる態様では、本発明の特徴及び利点は、開示の目的のため与えられた本発明の現在の好ましい実施態様についての以下の記載から明らかであろう。

コンピューター・プログラムの簡単な記載
１.ファイル名：genedcodchr.cxx
アプリケーション：ヌクレオチド配列(ＦＡＳＴＡファイル形式)を６個のそれぞれのフレームにける６の仮定上のポリペプチドへの翻訳
入力形式：<Program_name> <Nucleotide_file> <Output1> <Output2> <frame>
例：./genedcodchr ecoli.fna pf1 pr1 0
出力形式：AGTFYRYmGHVNMKIYTASLPTYRYGYFSHRED.....HGOIEKSDWEzDFGTRE

２.ファイル名：searchchr.cxx
アプリケーション：(入力として与えられる)ヘプタペプチド・ライブラリーサーチを介した、ポリペプチド・ファイルの英数字配列への変換
入力形式：<Program_name> 7 <peptide library file name> out Y <Input1> <Input2> <Output1> <Output2>
例：./searchchr 7 ecoli.peplib out Y pf1 pr1 bf1 br1
出力形式：s1124500001090003000020000023000000000*******0001000.....

３.ファイル名：cutf.c
アプリケーション：フォワード鎖の英数字配列からの潜在的なＯＲＦ(つまり「ｓ」〜「＊」の全領域を切り出し、そして英数字配列において「ｓ」の全ての位置を含むファイルを作る
入力形式：<Program_name> <Input file name> <Output1> <Output2>
例：./cutf bf1 unknown_bf1 bf1_location
出力形式：出力１-s1111000s00000000563*、出力２-カラム中の「ｓ」の開始位置

４.ファイル名：cutr.c
アプリケーション：リバース鎖の英数字配列から、全ての潜在的なＯＲＦ(つまり、「ｓ」〜「＊」の全領域を切り出し、そして全てのＯＲＦに対応する全ての３個のフォワード・フレームについての英数字配列中の開始位置を含むファイルを作り出す
入力形式：<Program_name> <Input file name> <Output1> <Output2>
例：./cutr br1 unknown_br1 br1_location
出力形式：出力１-*010340000222200067900000s000001000200s00230000s、出力２-「ｓ」の開始位置

５.ファイル名：stat.c
アプリケーション：５個のパラメーター：ゼロ率、平均、トータル・スコア、最大連続ストレッチの長さ、及び与えられた英数字配列についての分散を計算する。
入力形式：<Program_name> <Input file name> <Output>1
例：./stat unknown_bf1 bf1.data 1
出力形式：0.334 3.2 48 15 0.452 1

６.ファイル名：train.c
アプリケーション：フィードフォワードバックプロパゲーションアルゴリズムを用い、そしてシグモイド(＝１)を学習関数として使用する人工ニューラル・ネットワーク(１の隠れ層、１の入力層、及び１の出力層)のトレーニング
入力形式：<Program_name> <Input specification file name> <Input1> <Input2> <Input3>>output
例：./train train.spec.fast trainset.data validateset.data testset.data >train.net
出力形式：１のカラム内に最終ニューラル・ネットワーク荷重を含む出力

７.ファイル名：recognize.c
アプリケーション：トレーニングされた荷重に基づく所定のパターンの認識と、出力としての確率値の作成
入力形式：<Program_name> <Input specification file name> <Input1> <Input2> <Output>
例：./recognize recognize.spec bf1.data train.net f1.out
出力形式：pat1 probability <value>

８. ファイル名：Filter_prediction.c
アプリケーション：確率及び長さのパラメーターに基づく同じフレーム中における完全に重なるＯＲＦを取り除く
入力形式：<Program_name> <Input1> <Input2> <Output>
例：./Filter_prediction f1.out unknown_bf1 bf1.out.res
出力形式：pat1 probability <value> <integer string>

９. ファイル名：locationf.c
アプリケーション：２０未満のアミノ酸長の遺伝子を取り除き、そして残っているものの開始位置を、３個のフォワード・フレームの全てについての英数字配列で報告する
入力形式：<Program_name> <Input1> <Output> <Input2>
例：./locationf bf1.out.res bf1.out.res1 bf1_location
出力形式：<Pattern No> <Probability value> <integer string> <Start> <End>

１０. ファイル名：locationr.c
アプリケーション：２０アミノ酸未満の長さの遺伝子を取り除き、そして残っているものの開始位置を、３個のリバース・フレームの全てについての英数字配列で報告する。
入力形式：<Program_name> <Input1> <Output> <Input2>
例：./locationr br1.out.res br1.out.res1 br1_location
出力形式：<Pattern No> <Probability value> <integer string> <Start> <End>

１１. ファイル名：finalf.c
アプリケーション：３個のフォワード・フレームについて、英数字配列の開始位置及び終端位置を、対応するゲノム位置へと変換する
入力形式：<Program_name> <Input1> <Input2> <Input3> <Output>
例：./finalf bf1.out.res1 bf2.out.res1 bf3.out.res1 Final_outputf
出力形式：<Start> <End> <frame> <length> <Probability value> <integer string>

１２.ファイル名：finalr.c
アプリケーション：３個のリバース・フレームについて、英数字配列の開始位置及び終端位置を、対応するゲノム位置へと変換する
入力形式：<Program_name> <Input1> <Input2> <Input3> <Output>
例：./finalf br1.out.res1 br2.out.res1 br3.out.res1 Final_outputr
出力形式：<Start> <End> <frame> <length> <Probability value> <integer string>

１３.ファイル名：sort.c
アプリケーション：ゲノム開始位置に沿って、最終的に予測された遺伝子を降順にプリントする
入力形式：<Program_name> <Input1> <Input2> <Input3> <Output>
例：./sort Final_outputf Final_outputr OUTPUTF_with_encap OUTPUTR_with_encapOUTPUT
出力形式：<Start> <End> <Probability value>

１４.ファイル名：removeencap.c
アプリケーション：他の５個のフレーム中に見られる含まれた遺伝子を取り除く
入力形式：<Program_name> <Input1> <Input2><input3> <Output>
例：./removeencap OUTPUTF_with_encap OUTPUTR_with_encap OUTPUT OUTPUTF OUTPUTR
出力形式：<Start> <End> <frame> <length> <Probability value> <integer string>

本発明は薬剤標的として有用なタンパク質コーディングＤＮＡ配列を予測する新規のコンピューターに基づく方法に関する。当該方法において、オリゴペプチド・シグネチャ-の存在は、プローブとして使用された。当該方法は、汎用的であり、そして人工ニューラル・ネットワークに対して生物特異的トレーニング・セットを必ずしも必要としない。当該方法は、統計的分析に依存するばかりでなく、進化の選択圧に耐えてきた保存されたペプチド中に保持される生物学的情報と統合する。当該方法の論理的延長は、真核生物ゲノム中でタンパク質コーディングＤＮＡ配列(エキソン)を予測することであろう。

名前、株、受諾番号、及び他の詳細を含む本発明について使用される生物の詳細は、以下に与えられる。

以下の実施例は、本発明の例示する方法により与えられ、そして本発明の範囲を制限するように解釈すべきではない。

実施例１
ＤＮＡ配列の英数字配列への変換
我々のソフトウェアにおける当該モジュールの目的は、クエリーゲノム全体を、規定のコドン表を使用して６個全てのリーディングフレームにコンピューター翻訳することである。出願人は、人工的にゲノムを翻訳する間、ＴＴＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡに対応して文字「ｚ」を使用し、そして非標準的ヌクレオチド(Ｋ、Ｎ、Ｗ、Ｒ、及びＳなど)のいずれかを含むトリプレットの全てに対して文字「ｂ」を使用した。続いて、翻訳されたゲノム配列を、コンピューターにより英数字配列([０-９」、「ｓ」、「＊」、及び「-」)へと変換した。出願人は、ペプチドライブラリー中の重複ヘプタペプチドの各々をサーチし、対応する数字(出現回数)を割り当て、そしてそれに英数字配列を付加した。ヘプタペプチドが、ライブラリー内に存在しないならば、出願人は数字０を割り当てる。ヘプタペプチドが開始コドンＡＴＧ、ＧＴＧ、及びＴＴＧのいずれかに対応するアミノ酸で始まる場合、出願人は、文字「ｓ」を英数字配列に付加した。これは、推定の開始コドンの位置を検出するのに役に立つであろう。ヘプタペプチドが文字「ｚ」を含む場合、出願人は、そのヘプタペプチドに対して文字「＊」を付加する。こうして、英数字配列中の連続する７個の「＊」(＊＊＊＊＊＊＊)は、ストップコドンのシグナルである。出願人は、文字「ｂ」を含むヘプタペプチドについて、文字「-」を付加する。これは、非標準ヌクレオチド特性の存在を示唆する。
前述の変換は、さらに以下の６個の配列の助けを借りてさらに詳しく説明される。

実施例２
人工ニューラル・ネットワークのトレーニング
当該ソフトウェアにおける本モジュールの目的は、設計されたニューラル・ネットワーク(図２)を、指定された遺伝子番号及び非遺伝子番号でトレーニングすることである。本実施例では、トレーニング・セットは、ＮＣＢＩがタンパク質コード遺伝子として挙げている１６１０個のＥ.コリ-ｋ１２遺伝子及び遺伝子として報告されていない(非遺伝子の)３０００個のＥ.コリ-ｋ１２ＯＲＦからなる。バリデーション・セットは、トレーニング・セットにおいて使用されたものとは異なるＥ.コリ-ｋ１２由来の１０００個の既知遺伝子と１０００個の非遺伝子を有する。試験セットは、同じ生物由来の１０００個の遺伝子と１０００こ非遺伝子を含む。ＡＮＮのトレーニングのため、遺伝子及び非遺伝子は、それぞれ１と０の確率値を割り当てる。ニューラル・ネットワークをトレーニングするために、第一に、出願人は、全てのＥ.コリ-ｋ１２遺伝子及び非遺伝子を、上記方法により対応する英数字鎖へと変換する(ステップ２及び３)。英数字配列形式において２個のＥ.コリ-ｋ１２遺伝子及び２個の非遺伝子のサンプルを図３に示す。ここで、遺伝子に対応する英数字配列が、非遺伝子に対応する英数字配列に比較して数字に富むということに注目することは重要である。これは、我々の仮説を支持する。英数字配列の数字の多さを定量するために、英数字配列から得た５個のパラメーターを選択した。これらの５個のパラメーターは以下：
トータル・スコア(与えられた英数字配列内の整数の全ての代数和)、
ゼロ率(英数字配列中の０の文字の総数を、当該配列中の文字の総数で割ったもの)、
平均(トータル・スコアを当該配列の全長で割ったもの)
分散(全体のＯＲＦについての平均出現回数に対する出現回数の分散である)
最大連続非０ストレッチの長さ(中断されていない０でない数の配列中の占有率を示す)
のとおりであり、表１(ａ)及び１(ｂ)に記載される。

英数字配列からこれらのパラメーターを計算する間、文字「ｓ」、「＊」、及び「-」が除外された。非遺伝子から遺伝子を区別することに対する各パラメーターの貢献を決定するために、ニューラル・ネットワークは、５個の全てのパラメーターを同時に使用してトレーニングされる。遺伝子及び非遺伝子の英数字配列に対応するパラメーターが計算される。トレーニング、バリデーション、及び試験セットは、６個のカラムを含み、最初の５個のカラムは５個のパラメーターの値を含み、そして最後のカラムは遺伝子について「１」を、非遺伝子について「０」を含む。

実施例３
出願人は、本発明の方法を使用して１０個の原核生物ゲノムを分析した。当該方法の効率は、当該方法により予測されたタンパク質コード領域であって、ＮＣＢＩに記載されたものの割合として定義された。包含されたタンパク質コード領域の全ては、特異的に開発されたプログラムにより自動的に除外された。当該方法は、ＮＣＢＩに記載される遺伝子の平均９２.７％を、２.８％の標準偏差で予測することができる。当該方法の感度及び特異性の値の両方は、Ｍ.ツベルクロシスＨ３７ＲＶゲノムを除いて高い(図３に示される)。

実施例４
タンパク質コーディングＤＮＡ配列の開始部位の予測
本発明の方法における正確な開始部位の予測率は、Ｍ.ツベルクロシスＨ３７Ｒｖにおいて４９.５％(特異性が最も少ない)からＨ.ピロリ２６６９５において８１.１％へと変化する。出願人の方法は、開始コドンの存在と周囲のヘプタペプチドの保存性に基づいて開始位置を決定する。当該方法は、他の方法により予測されたクエリータンパク質コードＤＮＡ配列の開始部位を予測するために利用することができる。これは、単純にタンパク質配列を対応する整数配列へと変換し、次に周囲のヘプタペプチドに基づいて有効な開始部位「ｓ」を決定することにより行うことができる。出願人は、Ｅ.コリＫ-１２ゲノムからそうした３個の場合を報告し(フォワードストランドから２個、そしてリバースストランドから１個)、開始部位の予測を例示する(以下に示される)。

開始部位の予測において、数に富むこととＯＲＦの長さとの間のトレードオフが存在する。ケース１(ＰＩＤ１６１３２２７３)において、遺伝子の開始位置は、ＮＣＢＩにより８５５４０から８５６３０へと移された。当該遺伝子に対応する整数配列の視覚による検討により、従来の「ｓ」の後の領域は０で満たされており、つまり言い換えると数字に富む領域ではない(以下に記載のケース１の太字領域)。現在では開始部位はシフトし、その結果、開始部位は本発明の方法により予測される数字に富む領域の前に存在する。ケース２は、開始コドンの５’上流へのシフトの例である。なぜなら、開始コドンの上流に数字に富む領域が存在するからである(「２０１１１１１」及び１の「３」及び１の「２」)。そうして、開始部位は位置４６１１１９４から４６１１０５０へとシフトした。ケース３は、従来のＮＣＢＩ開始位置の上流に数字に富む領域が存在するリバースストランドにおける開始部位のシフトの例である(「１６５３１３１１」及び多くのほかの数字が鎖の中に存在する)。

実施例５
タンパク質コーディングＤＮＡ配列の予測
当該方法は、以下のステップ：
ｉ) http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用できる選択された生物のタンパク質配列の全てから、重複ペプチドをコンピューターにより作成し、
ｉｉ) 上で得られた長さ「Ｎ」のペプチドを、一文字アミノ酸コードに従って、アルファベット順に分類し、
ｉｉｉ) 全てのペプチド及びその固有の出現の違いの生物の目録を作り、
ｉｖ) ステップ１及び２から得られるペプチドライブラリーを使用して、ＤＮＡ配列を英数字配列に変換し、
ｖ) 英数字配列から全ての潜在的なオープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)を取り出し、
ｖｉ) タンパク質コードＤＮＡ配列及び非コードＤＮＡ配列を区別するために、改良型ニューラル・ネットワークをトレーニングし、
ｖｉｉ) トレーニング済みニューラル・ネットワークを使用して、オープン・リーディング・フレーム内のＤＮＡをコードする配列を予測し(ステップ４において得られる)、
ｖｉｉｉ) 封入されたタンパク質コーディングＤＮＡ配列を (遺伝子内の遺伝子)を取り除く
を利用することにより、公に利用できるデーターベース(ＮＣＢＩ)において、様々なゲノムについてタンパク質コーディングＤＮＡ配列を予測するために利用される。

本発明のステップを使用して、発明者は、以下の表２に記載されるようにＳＡＲＳ-コロナ・ウイルス、Ｈ.インフルエンザ、Ｍ.ツベルクロシス、及びＨ.ピロリから選択される生物のゲノムから、新たな１６９個の遺伝子を開示した。表２は、配列番号１〜配列番号１６９の配列における新規遺伝子を提供する。

ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒの系統についての感度及び特異性分析は、１０の微生物ゲノムについて行われた(図３)。ウイルスゲノムについてのＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒによる更なる分析は、本明細書中に提示されている。

ＳＡＲＳ-ＣｏＶゲノム配列：
ＧｅｎＢａｎｋデーターベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/genomes/viruses)に利用できる１８種のＳＡＲＳ-ＣｏＶ株の配列をダウンロードし、そして分析した。これらは、

を含む。タンパク質コード遺伝子に関する他の情報を、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/SARS/SAks.htmlから得た。

ウイルスゲノムについてのＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒの試験：
ウイルスゲノムについて我々の方法を試験するため、出願人は、最初にヒト呼吸器合胞体ウイルス(ＨＲＳＶ)を分析し、そしてＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒを使用してゲノムを完結した。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒの結果を、従来技術のＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶの状態と比較を行った(表３)。ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶは、ＮＣＢＩで報告された１１のうち、８個のアノテーション付きタンパク質を、擬陽性なしで予測できる。ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶは、以下の３個の遺伝子を予測できなかった：ＰＩＤ９６２９２００(位置６２６〜１０００、非構造タンパク質２(ＮＳ２))；ＰＩＤ９６２９２０５(位置４６９０〜５５８９、結合性糖タンパク質(Ｇ)))；及びＰＩＤ９６２９２０８(位置８１７１〜８４４３、マトリックスタンパク質２(Ｍ２))。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、全部で１１のうち１０のアノテーション付きタンパク質を、擬陽性なしで予測した。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒにより得ることができなかった遺伝子は、ＰＩＤ９６２９２０８(位置８１７１〜８４４３、マトリックスタンパク質２)であり、これはＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶによっても明らかに得ることができなかった。

ＨＲＳＶゲノムにおけるタンパク質コード領域の予測の成功は、新たにシーケンスされたＳＡＲＳ-ＣｏＶゲノム上でタンパク質コード領域を予測するための我々の自信を増加させる。

Ｇｅｎｅｄｅｃｉｐｈｅｒを使用したＳＡＲＳ-ＣｏＶの分析：
出願人はＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒを使用して、ＳＡＲＳ-ＣｏＶの１８株全てを分析した(詳細な結果は、上記ウェブサイト上で利用できる)。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、ＳＡＲＳ-ＣｏＶゲノム中にて全体で１５のタンパク質コード領域を予測し、それらは、ポリタンパク質１ａ、１ａｂ(Ｓａｒｓ２６２８のポリタンパク質１ａｂのＣ末端)、及び１８株の各々について知られている４個の構造タンパク質(Ｍ、Ｎ、Ｓ、及びＥ)を含む。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒはまた、使用される株のゲノム配列に基づいた６〜８の更なるコード領域を予測する。これらのさらなるコード領域の全長は、６１〜２７４アミノ酸の間で変化した。

ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、１８株全てについて共通である１２個のコード領域を予測し(表４)、そして５株に存在する１のコード領域(ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑゲノムでＳａｒｓ６３、Ｓａｒｓ６)を予測する。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、ＧＺ０１株におけるＳａｒｓ９０遺伝子を予測し、そしてＢＪ０２株特異的なＳａｒｓ１５４(ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑゲノムではＳａｒｓ３ｂ)を予測する。

これらの１２の共通のタンパク質コード領域は、６の基本的なＳＡＲＳ-ＣｏＶのタンパク質(２個のポリタンパク質及び４個の構造タンパク質)；Ｓａｒｓ２７４(ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑデーターベースでＳａｒｓ３ａ)、Ｓａｒｓ１２２(ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑデーターベースでＳａｒｓ７ａ)、Ｓａｒｓ７８(ＴＯＲ２株において、シフトした開始点を有するＯＲＦ１４/Ｓａｒｓ９ｃとして報告されている)；及び３個の新たに予測された(現在のＮＣＢＩアノテーションに関していうと擬陽性の)タンパク質コード領域Ｓａｒｓ１７４、Ｓａｒｓ６８、及びＳａｒｓ６１からなった。三個の新たに予測された遺伝子は、ポリタンパク質１ａゲノム領域内に完全に存在する。我々の方法は、細菌ゲノム中のかかる遺伝子を捨てるけれども、ウイルスゲノム中にかかる遺伝子を見出す可能性は除外されなかった。これらの遺伝子は、１８株の全てにおいて存在するので、これらは、タンパク質コード遺伝子である可能性がある。

出願人は、上記１２の遺伝子とは別に、さらに３個のコード領域、Ｓａｒｓ６３、Ｓａｒｓ１５４、及びＳａｒｓ９０を予測する。Ｓａｒｓ６３は、５株において同定され、そして残りの１３株では同定されなかった。当該コード領域は、既にＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ(Ｓａｒｓ６)に報告されている。ここで、出願人は、Ｓａｒｓ６３(ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑでＳａｒｓ６)の存在について多くコメントできない。なぜなら、Ｓａｒｓ６３は、５株において同定され、そして残りの１３株で同定されないからである。これは、当該領域において非同義突然変異が高密度で存在するためである。２個のコード領域Ｓａｒｓ１５４(ＮＣＢＩでｓａｒｓ３ｂ)、及びＳａｒｓ９０(ＧＺ０１株において新たに予測された）は、１の株についてのみ同定される。これらの２個のコード領域は、１の株のみにおいて同定されるので、これらは、ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶ分析(Chenら、2003)により提案されているように、タンパク質コード領域である可能性は低い。ことなる株におけるこれらの３の遺伝子の位置は、表５に提供される。

ペプチドライブラリーが、種々の生物のゲノム配列から作られるので、与えられたタンパク質の進化的な起源を追跡することができる。当該タンパク質が、ウイルスゲノム中に存在することがわかっているヘプタペプチドを多く含む場合、当該タンパク質は、ウイルス起源であると考えられる。出願人は、５個のコアタンパク質(２個のポリタンパク質及び３個の構造タンパク質、Ｍ、Ｎ、及びＳ)がウイルス起源であることを発見した。３個の新たな予測を含む残りは、原核生物起源である。出願人が、同じＤＮＡ領域から、異なるフレームで、異なる起源由来のペプチドを含むタンパク質を得ることは関心が高い。ここで、同じＤＮＡ配列が、どのように生物起源及びウイルス起源の両方をコードできるかは興味深い。これは、これらの新たなタンパク質コード遺伝子が、他の既知ウイルスゲノム配列に対するホモロジーに基づく従来の試行で検出されなかった理由を説明するかもしれない。

従来のシステム-ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶとの比較：
ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒ、Ｚｃｕｒｖｅ＿ＣｏＶの結果と、ＳＡＲＳ-ＣｏＶのＵｒｂａｎｉ株及びＴＯＲ２株についての既知のアノテーションとの比較を表６ａと６ｂに示す。
一般的に、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒの結果は、既知のアノテーションと十分一致している。Ｕｒｂａｎｉ株の場合、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、Ｓａｒｓ８４(Ｘ５)、Ｓａｒｓ６３(Ｘ３)、及びＳａｒｓ１５４(Ｘ２)を除く既知の遺伝子の全てを予測する。Ｓａｒｓ８４(Ｘ５)及びＳａｒｓ６３(Ｘ３)は、ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶによりサポートされるが、一方Ｓａｒｓ１５４(Ｘ２)は、いずれの方法によっても予測されない。ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、当該株において４の新たな遺伝子であって、ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶによりサポートされない遺伝子を予測する。これらの４個の遺伝子のうちＳａｒｓ７８が、ＴＯＲ２株についてＯＲＦ１４/Ｓａｒｓ９ｃとして既に知られているということは注目すべきである。これは、当該遺伝子がＵｒｂａｎｉ株に存在する可能性を支持する。しかしながらＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶは、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒによりサポートされない２の新たな遺伝子を予測する。

ＴＯＲ２株についてのＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒ予測は、Ｕｒｂａｎｉ株についての予測と同一である。この株では、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒは、９の既知遺伝子を予測するが、既知のアノテーションを有する６個の遺伝子を予測することを失敗する。これらの６個の遺伝子は：Ｓａｒｓ１５４(ＯＲＦ４)、Ｓａｒｓ９８(ＯＲＦ１３)、Ｓａｒｓ６３(ＯＲＦ７)、Ｓａｒｓ４４(ＯＲＦ９)、Ｓａｒｓ３９(ＯＲＦ１０)、及びＳａｒｓ８４(ＯＲＦ１１)である。これらの中で、Ｓａｒｓ１５４(ＯＲＦ４)及びＳａｒｓ９８(ＯＲＦ１３)は、ＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶによっても見逃されている。Ｓａｒｓ４４(ＯＲＦ９)及びＳａｒｓ３９(ＯＲＦ１０)は、長さがかなり短いＯＲＦであり(それぞれ、４４及び３９アミノ酸)、そして様々なＳＡＲＳ株に渡って一致していないということに注目すべきである。Ｓａｒｓ６３(ＯＲＦ７)は、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒにより、５のほかの株において予測されたが、本明細書中で考慮された２の株においては予測されなかった。

突然変異分析：
１８株全てにわたりＳａｒｓ１７４、Ｓａｒｓ６８、及びＳａｒｓ６１をコードする新たに予測されたタンパク質について、複数の配列アライメント(ＣｌｕｓｔａｌＷ)を使用した分析は、
１. Ｓａｒｓ６８は、ＳＩＮ２６７７株において、８０位にてＧＡＴ→ＧＧＴ(Ｄ→Ｇ)の一箇所の点突然変異を有し、
２. Ｓａｒｓ１７４は、ＧＺ０１株において２０４位にてＣＧＡ→ＣＧＣへの、そしてＢＪ０４株において４４７位にてＣＴＧ→ＣＴＴへのアミノ酸変化のない点突然変異を有し、
３. Ｓａｒｓ６１は、ＧＺ０１株において、１１９位にてＣＴＧ→ＣＡＧ(Ｌ→Ｑ)への一箇所の点突然変異を有する
を示す。

これらの新たに予測された３個の遺伝子は、重大な突然変異なしに１８株全てにおいて存在し、そして非冗長データーベースにおいてＢＬＳＴＰで重要なヒットを有さない。これは、これらの３個のタンパク質がＳＡＲＳ-ＣｏＶに特異的な重大な生物学的機能を有しうるということを指し示す。その結果、これらのコード配列は、ＳＡＲＳに対する薬剤標的候補として役に立ち得る。

機能付与：
まとめると、本出願人は、ＳＡＲＳ-ＣｏＶにおいて１５個のコード領域を予測し、その中で、四つの構造タンパク質(Ｍ、Ｎ、Ｓ、及びＥ)の機能は、既に割れ当てられた。ポリタンパク質１ａｂは、レプリカーゼ活性のみを割り当てられたが、我々の分析は、当該レプリカーゼ活性が、Ｓａｒｓ２６２８(ＯＲＦ１ａｂのＣ末端)断片と関連するということを示唆する。全長１ａｂポリタンパク質は、６の機能的なシグネチャーを含み、その中でポリタンパク質ｌａは、代謝酵素(表７ａ)と関連するシグネチャーを含む。少なくとも５の異なる生物中で類似の機能を有するタンパク質中に存在するペプチド(７以上のアミノ酸長)に基づいて、機能がポリタンパク質に割り当てられた。他の予測された遺伝子/タンパク質コード領域は、より少ないゲノム中に存在するペプチドを含む。これらのペプチドに基づいて出願人は機能を提案するが、低い信頼性しか有さなかった(表７ｂ)。これらの発見についての生物学的関連は、依然として検討されないままである。

上の記載から、出願人は、ＳＡＲＳ-ＣｏＶにおいてＳａｒｓ７８を含む４個の新しい遺伝子を開示した。当該分析は、さらに、ＯＲＦ・Ｓａｒｓ１５４(Ｓａｒｓ３ｂとしてＲｅｆｓｅｑに記載される)が、コード領域ではないようであるというＺＣＵＲＶＥ＿ＣｏＶ(Chenら、2003)の発見を裏付ける。出願人は、２個のポリペプチド１ａｂとｌａに機能を割り当てた。１ａｂポリタンパク質のＣ末端の複製関連機能に加えて、出願人の分析は、ポリタンパク質ｌａが、代謝酵素様機能と関連しうるということを示唆する。全てにおいて、６個のペプチド・シグネチャーは、ＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒにより新たに予測されるタンパク質を含む他の９個のタンパク質についての推定の機能を示唆した。

利点：
１. 本発明の主要な利点は、リボソーム結合部位、プロモーター配列、転写開始部位、又はコドン利用バイアスなどの外部の証拠を使用することなく、タンパク質コーディングＤＮＡ配列を予測する新たな方法を提供することである。
２. タンパク質コーディングＤＮＡ配列の統計分析方法であって、進化の選択圧に耐えた保存されたペプチド中に保持される生物学的情報を利用する方法を提供する。
３. タンパク質コード遺伝子の開始部位の簡単な予測方法を提供する。
４. 生物特異的、株特異的タンパク質コーディングＤＮＡ配列を検出する方法を提供する。
５. 潜在的な薬剤標的として使用しうる新規のタンパク質コーディングＤＮＡ配列を提供する。

図１はＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒの論理回路を示す。図２は、ニューラル・ネットワークのアーキテクチャを示す。図３は、１０の生物についてのＧｅｎｅＤｅｃｉｐｈｅｒの結果の分析を示す。

Claims

オリゴペプチドを用いて、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定するコンピューターに基づく方法であって、以下のステップ：
ａ. 既知のゲノム内のタンパク質配列をコードする領域から選択されるオリゴペプチドを含むペプチドライブラリーデーターであって、当該ペプチドライブラリーが、鎖長「Ｎ」のオリゴペプチド及び既知ゲノムにおけるその出現回数を含み、ここで当該Ｎの値が４以上である上記データーをコンピューターにより作成する工程；
ｂ. 翻訳されたゲノムから得られたポリペプチド配列を、英数字配列にコンピューターにより変換する工程であって、当該英数字配列が、既知のタンパク質をコードする配列に対応する領域、並びに既知のタンパク質をコードしないＤＮＡ配列に対応する領域を含み、これにより各ＯＲＦに対応する１の英数字配列を提供し、ここで当該英数字配列は、既知のゲノムから得たポリペプチド配列内のペプチドライブラリーの各オリゴペプチドの出現回数により決定される工程；
ｃ. シグモイド学習関数を用いてコンピューターにより人工ニューラル・ネットワーク(ＡＮＮ)をトレーニングして、既知のゲノムにおける既知のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に対応する英数字配列の領域、及び当該既知のゲノムにおける既知の非コード領域に対応する英数字の配列の領域を学習させる工程；
ｄ. コンピューターにより試験ゲノムを翻訳して、各ＯＲＦにおけるポリペプチド配列を取得する工程；
ｅ. コンピューターにより上記試験ゲノムから得たポリペプチド配列を、英数字配列に変換し、それにより各ＯＲＦに対応する１の英数字配列を提供する工程であって、ここで当該英数字配列が、当該試験ゲノムから得たポリペプチド配列の中における上記ペプチドライブラリーの各オリゴペプチドの出現回数により決定される工程；
ｆ．当該トレーニング済みのＡＮＮを用いてタンパク質をコードするＤＮＡ配列に対応する試験ゲノムの英数字配列の領域を同定する工程；及び
ｇ．試験ゲノムにおいて同定されたタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、使用者に通知する工程
を含み、ここで当該工程の全てがコンピューター上で行われる、前記方法。
前記人工ニューラル・ネットワークが、１以上の入力層、様々な数のニューロンを有する１以上の隠れ層、及び１以上の出力層を有する、請求項１に記載の方法。
前記隠れ層におけるニューロンの数が、３０である、請求項１に記載の方法。
前記「Ｎ」の値が４以上である、請求項１に記載の方法。
前記シグモイド学習関数が、トータル・スコア、平均、ゼロ率、最大連続非ゼロストレッチ、及び分散を含む５個のパラメーターを有する、請求項１に記載の方法。
前記遺伝子同定方法が、非限定的にＨ.インフルエンザ(H. influenzae)、Ｍ.ゲニタリウム(M. genitalium)、Ｅ.コリ(E. coli)、Ｂ.サブチリス(B. subtilis)、Ａ.フルギジス(A. fulgidis)、Ｍ.ツベルクロシス(M. tuberculosis)、Ｔ.パリダム(T. pallidum)、Ｔ.マリチマ(T. maritima)、シネコ・シスチス(Synecho cystis)、Ｈ.ピロリ(H. pylori)、及びＳＡＲＳ-ＣｏＶなどのゲノムを含む他のゲノムのＯＲＦにおいて存在することが分かっているオリゴペプチドを使用する、請求項１に記載の方法。
前記ペプチドライブラリー・データーが、Ｈ.インフルエンザ(H. influenzae)、Ｍ.ゲニタリウム(M. genitalium)、Ｅ.コリ(E. coli)、Ｂ.サブチリス(B. subtilis)、Ａ.フルギジス(A. fulgidis)、Ｍ.ツベルクロシス(M. tuberculosis)、Ｔ.パリダム(T. pallidum)、Ｔ.マリチマ(T. maritima)、シネコ・シスチス(Synecho cystis)、Ｈ.ピロリ(H. pylori)、及びＳＡＲＳ-ＣｏＶからなる群から選ばれる生物から取得される、請求項１に記載の方法。