JP4485926B2 - 遠心チップと遠心分離法 - Google Patents

Description

本発明は遠心を用いて細胞などを分離する技術に関する。

細胞などの分離を行うには比重の異なる溶液を重層して遠心することで、細胞をその比重で分離することが生化学分野では一般的に行われている。

他方、微細加工技術を用いることで従来の生化学レベル・細胞レベルにおける分析・反応を小型集積・高速化する様々なマイクロ流体チップが開発されている。これらのチップの特徴の一つは、マイクロメートルの微小な流路に流体を流すことができ、そのために層流の形成が容易になることである。従って２つの層流は壁がなくても境界を維持して互いに混ざり合うことは無い。

一般に遠心を用いる分離では、チューブ内にパーコールなどの比重の異なる溶液を積層して用いる関係上、あまり小さな体積の分離には適していない。一般にはｍＬオーダーのチューブを用いる。しかしながら、近年の生化学の発展は、分析機器の高感度化が進み、また、検体を同時に検査するマルチプルアッセイとハイスループットスクリーニングが主流となり、このため、試料用液の微量化が進んでいる。最も微量化が遅れているのが遠心を用いる分離分野である。

本発明では、極微量の試料用液からの遠心分離による細胞や顆粒の分離を可能にする遠心チップと遠心分離方法を提供する。

回転軸を中心に回転する回転板に遠心分離用チップを取り付ける。遠心分離用チップは、基板上に比重の異なる複数の溶液を供給する流路と、これらの流路が集合して分離領域として機能するひとつの分離チャンバーと、前記分離チャンバーから分岐する複数の流路から形成されるものとする。すべての流路の入口と出口にリザーバを配し、前記流路に比重の異なる複数の溶液を供給するとともに、流路に接合するすべての入口のリザーバの回転軸からの距離が等しくかつ、及び前記分離チャンバーから分岐する複数の流路に接合する出口側のリザーバの液面がそれぞれ回転軸からの距離を等しくする。

（実施例１）
図１は本発明に係わる遠心分離装置の概要を示す構成図である。１は回転板であり、表面に本発明に係わる遠心チップを実装するスペース２が形成されている。スペース２は遠心チップが容易に着脱可能な構成とされる。回転板１はモータ３により、所定の速度で水平に回転させられる。４は光源であり、回転板１に実装された遠心チップの分離部を照射する。５はレンズであり、遠心チップの分離部を透過した光を集光する。レンズ５で集光された光はミラー６で反射されて、高速カメラ７で撮像される。８はパソコンであり、高速カメラ７撮像された遠心チップの分離部を分析し、モータ３に対する速度信号を計算して、モータ３の速度を制御する。

実施例１によれば、遠心中にカメラ７で試料の分離状態を観察しながら分離ができる。分離の度合いをパソコン８が備えるモニター（図示しない）を見ながら、あるいは、パソコン８の備えるプログラムでモータ３の回転速度を制御し、最適な分離を行うことができる。観測の一例を示すと以下のようである。例えば、モータ３を１８００ｒｐｍで回転させ、光源４、レンズ５、カメラ７よりなる光学系で、スペース２に実装された遠心チップの分離部の画像観察を行う。ここで、遠心チップが光源を横切るときの１秒あたりの数が高速カメラ１３の画像取り込みレートの倍数になるように回転数を制御する。これにより、回転している遠心チップの画像を静止状態のように撮影することができる。たとえば３０フレーム／秒のカメラを用いて、撮像すると、３０×Ｎ／秒（Ｎ：整数および整数の分数）の回転数で遠心を行えばよい。よって、上記１８００ｒｐｍで遠心を行えば、ちょうど静止したような画像が得られる。複数のチップを同時に撮像する場合は、取り込んだ画像を遠心チップごとの画像にパソコン８上で切り分けることで、各チップの画像を得ることができる。

（実施例２）
図２は、実施例１の遠心分離装置に適用するのに好適な遠心チップ１００の構成を模式的に示す平面図である。図３は、図２に示した遠心チップ１００のリザーバ部分に着目して断面にして示した構成を模式的に示す斜視図である。

１１、１２、１３は複数の独立した比重の異なる溶液を供給する流路であり、一端が、それぞれ、リザーバ２１−２３に接続され、他端が分離チャンバー１７に接続される。分離チャンバー１７の他端には、排出用流路１４，１５，１６が接続され、排出用流路１４，１５，１６の他端には、それぞれ、リザーバ２４−２６が接続される。各流路に連通したリザーバ２１−２６のうち、リザーバ２３には試料を含む最も低比重の溶液、２２、２１はその順に比重の高い溶液が入っている。この状態でモータ３を回転させ、遠心をかけると、分離チャンバー１７には、遠心の加速度のかかる方から順に３１，３２，３３のように、比重の高い順の溶液の層ができる。試料の成分の内、最も比重の高い溶液層３１の比重より高い比重の成分は溶液層３１の中に入り、その次に比重が低いが、最も低い比重より比重の高い成分は溶液層３２の中に入り、最も低い比重より比重の低い成分は溶液層３３の中に入る。それぞれの成分は、対応する層に対応する排出用流路１４，１５，１６を介して、リザーバ２４−２６に回収される。ここで、３０は、遠心初期の遠心の加速度の方向に見た液面高さの差である。この液面高さの差により、各溶液は層流状態で矢印の方向３５に流れ、分離チャンバー１７で層流の中に分離された成分が排出用流路１４，１５，１６に流出してくる。ここで重要なのは、最も比重の低い溶液でリザーバ２１−２３の液面高さおよび２４−２６の液面高さが揃うようにすることで各流路内の液の流れの乱れを防ぐことである。

この遠心チップ１００の構成は以下のようである。流路１１−１６および分離チャンバー１７は、例えば、ＰＤＭＳの基板の片面に鋳型で形成され、リザーバ２１−２６は、当該基板の他面にガラス加工により形成されて貼り付けられる。前記流路１１−１６とリザーバ２１−２６とは、基板を貫通する穴により連通するものとされる。チップの外寸はほぼ３０×３０ｍｍとする。図では扇形をしているが、回転板１のスペース２に装填できる形であれば良くチップの外形の制約は無い。まず、基板に流路１１−１６および分離チャンバー１７を形成するための鋳型について説明する。

鋳型は量産のためのものである。洗浄したガラス基板あるいはシリコン基板を酸素プラズマで５分間アッシングし、表面に付着している有機物を除去する。光感光性レジストであるＳＵ８−２５をスピンコートする。スピンコートは５００ｒｐｍで１０秒間、続いて２０００ｒｐｍ３０秒間で良好な結果を得ている。ＳＵ８−２５をスピンコートでガラス基板上に一様に展開したものを、７５℃で１分間続いて１００℃５分間ホットプレート上でプレベークして、結果として、２５μｍの厚さのＳＵ８−２５層を形成する。図２に示す流路１１−１６と分離チャンバー１７に対応する形を透かしにしたクロムマスクを用いて１５秒間紫外線露光する。７５℃で３分間、続いて１００℃で５分間ホットプレートでベークする。ＳＵ−８デベロッパーを用い、所定のマニュアルに従い現像する。イソプロパノールで未重合部分を除去し、１６０℃で３０分間ベークして鋳型を得る。結果として、ガラス基板あるいはシリコン基板上に、高さが２５μｍの流路１１−１６と分離チャンバー１７の突起の形ができる。ここで、流路１１−１６の幅は５０μｍとし、分離チャンバー１７の幅（入出流路の取り付け位置間）は４ｍｍ、分離チャンバー１７の遠心方向の幅は１５０μｍ（＝５０μｍ×３）とする。

次に、この鋳型を用いた遠心チップの作成法を述べる。ガラス基板あるいはシリコン基板上に突起の高さが２５μｍの流路１１−１６と分離チャンバー１７の形を持つ鋳型の周辺を、１．５ｍｍの高さの壁で囲う。この壁の内側のサイズは、チップの外寸の３０×３０ｍｍとする。この壁の内側に、マニュアルどおりに調製したＰＤＭＳモノマー混合液を脱気し、７５℃３０分間空気恒温槽で加熱重合させ、ＰＤＭＳを重合させる。この際、ＰＤＭＳモノマー混合液層の厚さが均一になるように、壁の上面にシリコンウエハーを載せてはさみつけるのが良い。なお、壁は、単にＰＤＭＳモノマー混合液を保持するためだけであるから、ガラス板でも、シリコン板でも良い。重合したＰＤＭＳから上記壁、シリコンウエハーおよび鋳型を剥がすと、ＰＤＭＳの一面に流路１１−１６と分離チャンバー１７の部分が凹んだ基板４１が得られる。図３では、流路１１−１３が基板４１の一面に形成されている状態を示す。

次に、基板４１の流路とリザーバとの接続位置にポンチで２ｍｍφの貫通孔４３、４４、４５を開ける。次いで、基板４１（ＰＤＭＳ）の流路１１−１６と分離チャンバー１７が形成された面に、別途用意した３０ｍｍ角の１ｍｍ厚のガラス板４２を酸素プラズマで１０秒間アッシングし両者を貼り付ける。これで基板４１の一面の流路１１−１６と分離チャンバー１７対応の凹部がガラス板４２で塞がれて流路１１−１６と分離チャンバー１７が完成する。

次に、基板４１の流路と分離チャンバーの形成された面と反対の面に、ガラス板を張り合わせて形成したリザーバ２１−２３を貼り付ける。リザーバとＰＤＭＳは共有結合で貼り付けることができる。この際、基板４１に形成した貫通孔４３，４４，４５で、それぞれの流路１１−１３とリザーバ２１−２３とが連通するようになされる。図３では、流路１１−１３が基板４１の貫通孔４３，４４，４５を介して、基板４１の他面に貼り付けられたリザーバ２１−２３と連通している状態を示す。図３は、基板４１の両面が使用されていることが分かりやすいように、一部についての断面で示したので、リザーバ２４−２６と流路１４−１６の関係が表れていないが、図３と同様であることは容易に分かる。また、分離チャンバー１７が、流路１１−１３と同様に、基板４１の片面に形成されていることも容易に分かる。なお、リザーバ２１−２３はガラス板で形成したから、図３では、これらは、厚みを持っている形で表示されるべきであるが、煩雑になるので、輪郭の線の表示にとどめた。さらに、ここでは、リザーバ２１−２３はガラス板を張り合わせて形成するものとしたが、所定の厚さのガラス板にリザーバ２１−２３をモールドした形で形成して、この板を貼り付けるものとしても良い。

リザーバ２１−２３について見ると、リザーバ２１−２３の回転中心側の上面には、溶液注入用の穴４６，４７，４８が設けられるとともに、リザーバ２１−２３は基本的には分離壁５１，５２で独立したものとされるが、この分離壁５１，５２は、溶液注入用の穴４６，４７，４８の近辺で上部が切り欠かれている。

図３を参照しながら、図２に示したような状態になるように、遠心チップ１００のリザーバ２１−２３に溶液を入れる方法について説明する。まず、溶液注入用の穴４８から、最も比重の低い溶液をリザーバ２３に注入する。このとき、リザーバ２１−２３の分離壁５１，５２の切り欠きから、他のリザーバ２２、２１にも流入するように多量の溶液をリザーバ２３に注入する。リザーバ２１−２３が全て最も比重の低い溶液で満たされた状態で遠心をかけると流路１１−１６の全て、分離チャンバー１７に最も比重の低い溶液が行き渡る。出口側のリザーバ２４−２６の液面が共通になったところで遠心を停止する。この状態で、リザーバ２２，２１に溶液注入用の穴４７，４６から、それぞれ、より比重の高い溶液をそれぞれリザーバの容積と同程度の量だけ注入する。その結果、リザーバ２２，２１では、最も比重の低い溶液が溢れ出して、より比重の高い溶液に置換される。さらに、リザーバ２３には、分離対象を含む試料溶液を注入する。この段階が、図２に示す状態である。この状態で遠心チップ１００を回転板１のスペース２に実装してモータ３により遠心をかけると、図２に示すように、比重に応じた溶液層ができ、試料溶液中の成分が、その比重に応じて溶液層に分離される。

（実施例３）
図４は、実施例３の遠心チップ１００の構成を模式的に示す平面図である。図２に示した実施例２の遠心チップ１００と対比して明らかなように、実施例３の遠心チップ１００は試料側リザーバ６１，６２と回収側リザーバ６３，６４が回転中心１０からの距離が異なる。このため、回転させた場合のＧはリザーバ６１，６２のほうがリザーバ６３，６４よりも大きくかかる。このため液は矢印６９の方向に流れる。それぞれのリザーバからの流路６５−６８は分離チャンバー７０に連結される。この例では、溶液は２種類とした例であり、遠心中に溶液は試料側リザーバ６１，６２から回収側リザーバ６３，６４に液落差に対応した遠心力差により流れる。このときも入口側および出口側における高比重溶液面と試料側の低比重溶液面の遠心中心からの距離が等しいことが重要となる。そのため、実施例２と同様、低比重溶液が高比重溶液を覆う形でリザーバ６３，６４に入れられるのが良い。同様に回収部のリザーバ６３，６４の液面の高さも揃える必要がある。これらに差があると、分離チャンバー７０での２液層が形成されない。

実施例３でも、遠心チップ１００のディメンジョンは、実施例２と同等である。図５は実施例３の分離チャンバー７０を取り出して模式的に示す斜視図である。遠心によりＧのかかる方向に１００μｍで厚みは２５μｍである。分離部の両端には厚みは２５μｍで幅が５０μｍの流路６５，６６および６７，６８に連結されている。すなわち、図３に示す基板４１の片面に形成される流路１１−１３および、図示しなかったが、分離チャンバー１７と同じである。
（分離部の動作説明）
図６は低比重溶液流路５５と高比重溶液流路５６との２流路が結合した分離チャンバー７０における被分離物質の移動の様子を模式的に示す図である。ここでは、実施例３の遠心チップでヒト赤血球とヒトリンパ球の分離を試みた例について説明する。

まず、チップのリザーバ６１，６２に２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンあるいはＢＡＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を入れ、流路６５−６８および分離チャンバー７０全体に上記溶液を満たし、３０分間放置し、流路表面を２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンあるいはＢＳＡでコーティングする。この操作は細胞の非特異吸着を防止する上で重要な操作である。次に、ＰＢＳで洗浄し、流路６５−６８および分離チャンバー７０内の過剰なＢＳＡなどを除去する。次に、試料側（低比重溶液）のリザーバ６２と回収側（高比重溶液）のリザーバ６１にＰＢＳを満たす。このとき、２本の流路に一定の圧がかかる（２本の流路に同じ液量の液が流れる）様に、上述したリザーバ間の分離壁の切り欠きの上まで液を入れる。次に、回収側（高比重溶液）のリザーバ６１に比重を１．０７７に調製した溶液を添加し、１８００ｒｐｍで回転、遠心をかけ、予め流路中に低比重溶液と高比重溶液を満たしておく。操作はすべて室温で行う。その後、試料側（低比重溶液）に試料混合液を添加し、１８００ｒｐｍで回転、遠心をかける。このとき、図１で説明した光学系で分離チャンバー７０の画像観察を行うと、図６に示すように、分離チャンバー７０においては、低比重溶液と高比重溶液は２層の層流となり、大きな黒丸で示す赤血球は高比重溶液に移動し、小さい白丸で示すリンパ球は低比重溶液に残ることが観察できる。

図７は低比重溶液流路１３と中比重溶液流路１２と高比重溶液流路１１の３流路が結合した分離チャンバー１７における被分離物質の移動の様子を模式的に示す図である。ここでは、実施例１の遠心チップで血清の分離を試みた例について説明する。

まず、図６を参照して説明したのと同様にして、試料側（低比重溶液）流路１３と２つの回収側（中比重溶液および高比重溶液）流路１２，１１および分離チャンバー１７を洗浄する。ここでは、低比重溶液の比重は、ほぼ、１に、中比重溶液の比重は１．０７７に、高比重溶液の比重は１．１１３に調整して用いる。洗浄後、試料側（低比重溶液）のリザーバ２３と回収側（中、高比重溶液）のリザーバ２２，２１に低比重溶液を満たす。このとき、３本の流路に一定の圧がかかる（３本の流路に同じ液量の液が流れる）様に、上述したリザーバ間の分離壁５１の切り欠きの上まで液を入れる。次に、回収側（中、高比重溶液）のリザーバ２２，２１に比重を１．０７７および１．１１３に調製した溶液を、それぞれ、添加し、１８００ｒｐｍで回転、遠心をかけ、予め流路中に低比重溶液、中、高比重溶液を満たしておく。操作はすべて室温で行う。その後、試料側（低比重溶液）リザーバ２３に試料（血清）混合液を添加し、１８００ｒｐｍで回転、遠心をかける。このとき、図１で説明した光学系で分離チャンバー７０の画像観察を行うと、図７に示すように、分離チャンバー１７においては、低比重溶液、中高比重溶液および高比重溶液が３層の層流となり、大きな黒丸で示す赤血球は高比重溶液に移動し、星印で示す多核球は中高比重溶液に移動し、小さい白丸で示すヒト単核球は低比重溶液に残ることが観察できる。

ここで、図１を参照して説明したように、遠心チップ１００の回転速度、高速カメラ１０１の画像取り込みレートを適当に調整すれば、これらの分離状態を静止画像の状態で撮影することができる。

本発明に係わる遠心分離装置の概要を示す構成図である。 実施例１の遠心分離装置に適用するのに好適な遠心チップ１００の構成を模式的に示す平面図である。 図２に示した遠心チップ１００のリザーバ部分に着目して断面にして示した構成を模式的に示す斜視図である。本発明に係る第２の製造工程を示す図である。 実施例３の遠心チップ１００の構成を模式的に示す平面図である。 実施例３の分離チャンバー７０を取り出して模式的に示す斜視図である。 低比重溶液流路５５と高比重溶液流路５６との２流路が結合した分離チャンバー７０における被分離物質の移動の様子を模式的に示す図である。 低比重溶液流路１３と中比重溶液流路１２と高比重溶液流路１１の３流路が結合した分離チャンバー１７における被分離物質の移動の様子を模式的に示す図である。

符号の説明

１…回転板、２…スペース、３…モータ、４…光源、５…レンズ、６…ミラー、７…高速カメラ、８…パソコン、１０…回転中心、１１，１２，１３，１４，１５，１６，６５，６６，６７，６８，７１，７２，７３，７４，７５，７６…流路、１７，７０…分離チャンバー、２１，２２，２３，２４，２５，２６，６１，６２．６３，６４…リザーバ、４１…基板、４２…ガラス板、４３，４４，４５…貫通孔、４６，４７，４８…溶液注入用の穴、５１，５２…分離壁、１００…遠心チップ。

Claims (7)

1. 回転板を回転させるモータと、
   前記モータに回転させられる軸を中心に回転する回転板と、
   前記回転板の面に取り付けられる遠心分離用チップと、
   を備える遠心分離装置であって、
   前記遠心分離用チップは比重の異なる複数の溶液をそれぞれ供給される複数の流路と、
   前記流路が集合するひとつの分離チャンバーと、
   前記分離チャンバーから分岐する複数の流路と、
   を備えるとともに、
   前記分離チャンバーに溶液を供給する複数の流路と、前記分離チャンバーから分岐する複数の流路の端部にはそれぞれ複数のリザーバを備え、かつ、前記分離チャンバーに溶液を供給する前記複数の流路につながる複数のリザーバに所定の比重の溶液を保持するとともに、該リザーバの一つに被分離試料を入れる、
   ことを特徴とする遠心分離装置。
2. 前記比重の異なる複数の溶液を供給される流路につながる前記複数のリザーバの位置が回転軸からの距離が等しく、かつ、前記前記分離チャンバーから分岐する複数の流路につながる前記複数のリザーバの位置が回転軸からの距離が等しい構造であることを特徴とする請求項1記載の遠心分離装置。
3. 回転板を回転させるモータと、
   前記モータに回転させられる軸を中心に回転する回転板と、
   前記回転板の面に取り付けられる遠心分離用チップと、
   を備える遠心分離装置による分離方法であって、
   前記遠心分離用チップは比重の異なる複数の溶液をそれぞれ供給される複数の流路と、
   前記流路が集合するひとつの分離チャンバーと、
   前記分離チャンバーから分岐する複数の流路と、
   を備えるとともに、
   前記分離チャンバーに溶液を供給する複数の流路と、前記分離チャンバーから分岐する複数の流路の端部にはそれぞれ複数のリザーバを備え、かつ、前記分離チャンバーに溶液を供給する前記複数の流路につながる複数のリザーバに所定の比重の溶液を保持させるとともに、該リザーバの一つに被分離試料を入れ、該リザーバから分離チャンバーに遠心により搬送される溶液が、前記比重に対応した層を形成して、前記被分離試料を比重に対応して分離する、
   ことを特徴とする遠心分離法。
4. 回転板を回転させるモータと、
   前記モータに回転させられる軸を中心に回転する回転板と、
   前記回転板の面に取り付けられる遠心分離用チップと、
   を備える遠心分離装置に適用できる遠心分離用チップであって、
   前記遠心分離用チップは比重の異なる複数の溶液をそれぞれ供給される複数の流路と、
   前記流路が集合するひとつの分離チャンバーと、
   前記分離チャンバーから分岐する複数の流路と、
   を備えるとともに、
   前記分離チャンバーに溶液を供給する複数の流路と、前記分離チャンバーから分岐する複数の流路の端部にはそれぞれリザーバを備える、
   ことを特徴とする遠心分離用チップ。
5. 前記分離チャンバーに溶液を供給する流路につながる複数のリザーバの位置が回転軸からの距離が等しく、かつ、前記分離チャンバーから分岐する複数の流路の端部につながる複数のリザーバの位置が回転軸からの距離が等しい構造であることを特徴とする請求項４記載の遠心分離用チップ。
6. 前記遠心分離用チップの流路と前記分離チャンバーが形成される基板の面と反対の面に前記リザーバが形成され、前記リザーバの一端と前記流路の一端とが基板を貫通する孔により連通されている請求項４または５記載の遠心分離用チップ。
7. 前記遠心分離用チップの比重の異なる複数の溶液を供給される流路の一端に連通されているリザーバは、前記連通している孔の反対位置の一部で、複数のリザーバを分離している分離壁が切り欠かれている請求項４〜６のいずれか記載の遠心分離用チップ。

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