JP4478486B2 - ビスホスホン酸誘導体及びその塩並びに放射性骨診断剤 - Google Patents
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Description
本発明は、放射性核種で標識するに好適な骨親和性のビスホスホン酸誘導体およびその放射性骨診断剤用途に関する。
近年、核医学的手法における骨格のシンチグラフィーは初期段階の骨疾患を診断する上で重要な検査となってきている。骨シンチグラフィーのイメージング剤として、薬剤投与後から撮像までの時間を短縮し、かつ高いシンチグラフィー画質を得るためには、骨親和性の他に高い尿中排泄や血液、組織からのクリアランス等が要求される。
今日では、放射性同位元素で標識されたリン酸化合物が用いられているが、最初に試みられたのは、99m-テクネチウムで標識された無機ポリリン酸類であった。99m-テクネチウムで標識された無機ポリリン酸類は、水溶液中で加水分解をおこしてモノリン酸塩になるため血液からのクリアランスが低いという問題があった。
今日では、放射性同位元素で標識されたリン酸化合物が用いられているが、最初に試みられたのは、99m-テクネチウムで標識された無機ポリリン酸類であった。99m-テクネチウムで標識された無機ポリリン酸類は、水溶液中で加水分解をおこしてモノリン酸塩になるため血液からのクリアランスが低いという問題があった。
この問題を解決するために、Yano等は99m-テクネチウムで標識された有機ジホスホン酸であるTc-99m-エタン-1-ヒドロキシ-1-ジホスホネート第一スズ（Tc-99m-HEDP）を報告している（特許文献１及び非特許文献１）。この化合物は血液からのクリアランスが比較的速いため、薬剤の投与後、より速い時間に骨シンチグラフィー検査を行うことが可能となり、現状においては Tc-99m-HEDPの類似化合物である99m-テクネチウム標識リン酸化合物、即ち、メタンジホスホン酸（MDP）、3,3-ジホスホノプロパン-1,2-ジカルボン酸（DPD）およびヒドロキシメタンジホスホン酸（HMDP）等の有機ジホスホン酸を99m-テクネチウムで標識した化合物が広く用いられている。これらは骨シンチグラフィー製剤で、骨の石灰化の行われている部位に集積すると共に、薬剤の投与後撮像までの待ち時間がより短縮されてはいるものの、投与後約３時間の待ち時間が必要であり十分短いとは言えない。
一般に、骨シンチグラフィーを行う際に用いたイメージング剤の血液および／または軟組織からのクリアランスが遅くまた尿中への排泄が遅いと、バックグラウンドを低下させる時間が必要であるため、薬剤の投与後から撮像までの待ち時間が長くなる。
そこで、尿中排泄を早めることでバックグラウンドを速やかに低下させ、もってコントラストの向上を図る方法も開発されている（特許文献２）が、実用化には至っていない。
米国特許第３，７３５，００１号明細書
特開２００１−１１４７９２公報
J.Nucl.Med.14,73,(1973)
そこで、尿中排泄を早めることでバックグラウンドを速やかに低下させ、もってコントラストの向上を図る方法も開発されている（特許文献２）が、実用化には至っていない。
かかる状況に鑑み、本発明は、投与早期から骨と血液との高い放射能集積比を与える放射性骨診断剤として有用な化合物の提供を目的とする。
本発明によれば、上記目的は、下記化学式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸誘導体及びその塩によって達成される。
（上記式（Ｉ）中、Ｘはビスホスホン酸化合物の残基、Ｔはトリシン、Ａはピリジン誘導体またはホスフィン誘導体、Ｍは金属原子を示す。）
本発明の化合物は、骨親和性を有するビスホスホン酸化合物を、二官能配位子である6−ヒドラジノピリジン−3−カルボキシル酸（ＨＹＮＩＣ）を介して放射性核種と結合させた化合物である。とりわけ、ＨＹＮＩＣのカルボキシル末端にビスホスホン酸化合物を化学結合させ、ＨＹＮＩＣのヒドラジノ末端に２つのコリガンドすなわちトリシンとピリジン誘導体またはホスフィン誘導体を用いて金属原子を配位させた点に特徴を有する。金属原子として放射性核種を用いた場合は、放射性骨診断剤として有用である。
かくして、本発明によれば、上記化学式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸誘導体又はその塩（ただし、Ｍで表される金属原子は放射性核種）を有効成分として含有してなる放射性骨診断剤が提供される。
本発明の化合物は、従来の放射性骨診断剤（例えば、99ｍTc−HMDP ）に比べ、投与早期から骨への高い集積を示し、さらに血液クリアランスも従来の放射性骨診断剤と同等であるので、投与早期において高い骨／血液放射能集積比が得られ、投与後１時間で測定が可能となる。
上記化学式（Ｉ）で示される本発明の化合物中、Ｘで示される基は、ビスホスホン酸化合物の残基であれば特に制限はなく、例えば、ＨＹＮＩＣのカルボキシル末端に直接又はリンカー等を付加されて化学結合したビスホスホン酸化合物の残基を示し、好ましくは、Ｐ−Ｃ−Ｐ結合を有するアルファ−ジェミナル−ビスホスホン酸、その誘導体またはこれらの塩の残基である。当該ビスホスホン酸は公知のビスホスホン酸化合物であってよい。
公知のビスホスホン酸化合物としては、メタンジホスホン酸（MDP）、ヒドロキシメタンジホスホン酸（HMDP）、1-ヒドロキシエタン-1,1-ビスホスホン酸（EHDP）、ジメチルアミノメチレンジホスホン酸（DMAD）、3,3-ジホスホノプロパン-1,2-ジカルボン酸（DPD）、4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,1-ビスホスホネート（一般名：アレンドロネート）、〔1-ヒドロキシ-3-（メチルペンチルアミノ）プロピリデン〕ビスホスホネート（一般名：イバンドロネート）、〔（シクロヘプチルアミノ）-メチレン〕ビスホスホネート（一般名：インカドロネート）、（1-ヒドロキシエチリデン）ビスホスホネート（一般名：エチドロネート）、〔3-（ジメチルアミノ）-1-ヒドロキシプロピリデン〕ビスホスホネート（一般名：オルパドロネート）、（ジクロロメチレン）ビスホスホネート（一般名：クロドロネート）、〔1-ヒドロキシ-2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチリデン〕ビスホスホネート（一般名：ゾレドロネート）、〔〔（4-シクロフェニル）チオ〕-メチレン〕ビスホスホネート（一般名：チルドロネート）、（6-アミノ-1-ヒドロキシヘキシリデン）ビスホスホネート（一般名：ネリドロネート）、（3-アミノ-1-ヒドロキシプロピリデン）ビスホスホネート（一般名：パミドロネート）、〔1-ヒドロキシ-2-（3-ピリジニル）-エチリデン〕ビスホスホネート（一般名：リセドロネート）、〔1-ヒドロキシ-3-（1-ピロリジニル）-プロピリデン〕ビスホスホネート、〔1-ヒドロキシ-2-イミダゾ-(1,2a)ピリジン-3-イルエチリデン〕ビスホスホネート等が挙げられる。これらの中、4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,1-ビスホスホネート（一般名：アレンドロネート）、（6-アミノ-1-ヒドロキシヘキシリデン）ビスホスホネート（一般名：ネリドロネート）、（3-アミノ-1-ヒドロキシプロピリデン）ビスホスホネート（一般名：パミドロネート）などの末端にアミノ基を備えた化合物は、リンカー等を付加して誘導体化する必要が無く、ＨＹＮＩＣのカルボキシル末端に直接化学結合できる点で好都合である。
かくして、本発明の化合物の好ましい実施形態によれば、下記の化学式（I-1）で示されるビスホスホン酸誘導体及びその塩が提供される。
（上記式（I-1）中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−（式中ｎは０又は１〜９の整数、好ましくは２〜５の整数）、Ｒ２はＨ、ＯＨまたはハロゲン原子、Ｔはトリシン、Ａはピリジン誘導体またはホスフィン誘導体、Ｍは金属原子を示す。）
特に好ましい化合物は、上記の化学式（I-1）で示される化合物であって、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは２〜５の整数）、Ｒ２がＨ、ＯＨまたはＣｌのものである。
上記化学式（Ｉ）で示される本発明の化合物中、Ａはピリジン誘導体またはホスフィン誘導体を表わす。ピリジン誘導体としては、ニコチン酸、アセチルピリジン、3-ピリジンスルホン酸、3，5-ジカルボン酸ピリジンなどが挙げられる。ホスフィン誘導体としては、トリフェニルホスフィン-3-モノスルホン酸ナトリウムなどのトリフェニルホスフィンが挙げられる。これらの化合物は、夫々、下記に示される構造を有する。
これらのピリジン誘導体またはホスフィン誘導体は、ＨＹＮＩＣのヒドラジノ末端において、トリシンとともにコリガンドとして作用し、金属原子をＨＹＮＩＣのヒドラジノ末端に配位結合させる。コリガンドとしてトリシン２分子を使用することも考えられるが、その場合、後記データで示されるように、血液クリアランスが悪化する。これに対し、コリガンドとしてトリシン１分子とピリジン誘導体またはホスフィン誘導体１分子を用いた本発明の化合物の場合、高い骨集積を保ったまま、良好な血液クリアランスを達成できる。
上記化学式（Ｉ）で示される本発明の化合物中、Ｍで表される金属原子は、ＨＹＮＩＣのヒドラジノ末端において上記２つのコリガンドによって配位結合するものであれば特に限定されない。本発明の化合物を放射性骨診断剤として使用する場合は、金属原子Ｍは放射性核種であることが好ましく、かかる放射性核種としては、テクネチウム、インジウム、レニウムなどが例示され、より具体的には、99m−テクネチウム、111−インジウム、186−レニウムなどが例示される。
本発明の化合物は、以下の方法により合成される。まず、Boc−HYNICの活性エステル体Boc−HYNIC−テトラフルオロフェノール（TFP）と4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,1-ビスホスホネート（4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-bisphosphonate(HBP)）などの末端にアミノ基を備えたビスホスホン酸化合物またはその誘導体とを反応させ、その後、Boc基を脱保護することにより、HYNICとビスホスホン酸化合物の反応生成物（例えばHYNIC−HBP）を合成する。そして、当該反応生成物に、トリシン、ピリジン誘導体またはホスフィン誘導体の存在下、金属原子を混合し、生成物を分離・精製することにより、本発明の化合物が得られる。例えば、99m−テクネチウムでの標識を行う場合、SnCl2、トリシンおよびピリジン誘導体またはホスフィン誘導体の存在下、上記反応生成物（例えばHYNIC−HBP）に99mTcO４ −を加え、その後、逆相HPLCなどを用いて分離・精製を行うことにより、ビスホスホン酸誘導体を有効成分とする放射性骨診断剤が得られる。別法として、トリシンおよびピリジン誘導体またはホスフィン誘導体を用いてHYNICに金属を錯化させた後、HYNICにビスホスホン酸化合物を反応させてもよい。
本発明のビスホスホン酸誘導体またはその塩を有効成分とする放射性骨診断剤は、当該有効成分以外に、薬学的に許容可能な範囲内であれば、ＰＨ調整剤、界面活性剤、安定化剤、緩衝剤、溶解剤、賦形剤などを含有していてもよい。
本発明に係る化合物は、例えば、静脈投与又は患部周囲に経皮投与することにより、診断剤として使用することができる。本発明に係る化合物を診断剤として用いる場合、その投与後における検出方法としては、用いた金属の性質に応じて種々の方法を用いることができる。例えば、金属原子が放射性金属である場合は、SPECT又はPETといった画像診断法を用いることがでる。
本発明の化合物の投与量は従来の診断剤と実質的に同様であり、例えば、99mTcを用いた診断剤の投与量は、37MBq/kg〜1,850MBq/kg、好ましくは185MBq/kg〜740MBq/kg程度である。投与量は化合物の種類、使用する放射性核種の種類、患者の年齢、体重、症状、投与方法、他剤との併用等により適宜増減される。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
なお、以下の例において、実験方法は下記に従った。
[実験方法]
試薬・機器
99mTc-過テクネチウム酸（99mTc-pertechnetate (99mTcO4 -)）は99Mo-99mTcジェネレータより溶出した生理食塩水溶液を用いた。
標識化合物の精製および分析において、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）はナカライテスク社製 Cosmosil 5C18-AR-300（商品名）カラム(4.6 x 150mm)を用い、10 mMテトラブチルアンモニウムヒドロキシド（tetrabutylammonium hydroxide）および5% エタノール（ethanol）を含有する0.2M リン酸緩衝液（phosphate buffer）(pH6.0)で30分間、流速1.0mL/minで行った。
薄層クロマトグラフィー(TLC)はMerck社Art 5553（商品名）を用い、アセトンを展開溶媒として行った。
セルロースアセテート膜電気泳動(CAE)は、富士写真フィルム社のSeparax-SP（商品名）を用い、ベロナール緩衝液(pH 8.6, I=0.05)、0.8 mA/cmで泳動した。
[実験方法]
試薬・機器
99mTc-過テクネチウム酸（99mTc-pertechnetate (99mTcO4 -)）は99Mo-99mTcジェネレータより溶出した生理食塩水溶液を用いた。
標識化合物の精製および分析において、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）はナカライテスク社製 Cosmosil 5C18-AR-300（商品名）カラム(4.6 x 150mm)を用い、10 mMテトラブチルアンモニウムヒドロキシド（tetrabutylammonium hydroxide）および5% エタノール（ethanol）を含有する0.2M リン酸緩衝液（phosphate buffer）(pH6.0)で30分間、流速1.0mL/minで行った。
薄層クロマトグラフィー(TLC)はMerck社Art 5553（商品名）を用い、アセトンを展開溶媒として行った。
セルロースアセテート膜電気泳動(CAE)は、富士写真フィルム社のSeparax-SP（商品名）を用い、ベロナール緩衝液(pH 8.6, I=0.05)、0.8 mA/cmで泳動した。
以下の例で用いた略号は、下記のとおりである。
[略号]
99mTcO4 -：99mTc-過テクネチウム酸（99mTc-pertechnetate）、
Boc：ｔ−ブトキシカルボニル基、
HYNIC：6−ヒドラジノピリジン−3−カルボキシル酸、
HBP：4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,1-ビスホスホネート（4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-bisphosphonate）、
TFP：テトラフルオロフェノール、
tricine：トリシン、
AP：３−アセチルピリジン（3-acetylpyridine）、
NIC：ニコチン酸（nicotinic acid）、
CA：3，5-ジカルボン酸ピリジン（3,5-pyridinedicarboxylic acid）、
SA：3-ピリジンスルホン酸（3-pyridine sulfonic acid）、
TPPMS：トリフェニルホスフィン-3-モノスルホン酸ナトリウム（sodium triphenylphosphine-3-monosulfonate）、
HMDP：ヒドロキシメタンジホスホン酸、
TEA：トリエチルアミン（triethylamine）、
DCC：ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexylcarbodiimide)、
TFA：トリフルオロ酢酸、
anisole：アニソール、
DMF：N,N’-ジメチルホルムアミド。
[略号]
99mTcO4 -：99mTc-過テクネチウム酸（99mTc-pertechnetate）、
Boc：ｔ−ブトキシカルボニル基、
HYNIC：6−ヒドラジノピリジン−3−カルボキシル酸、
HBP：4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,1-ビスホスホネート（4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-bisphosphonate）、
TFP：テトラフルオロフェノール、
tricine：トリシン、
AP：３−アセチルピリジン（3-acetylpyridine）、
NIC：ニコチン酸（nicotinic acid）、
CA：3，5-ジカルボン酸ピリジン（3,5-pyridinedicarboxylic acid）、
SA：3-ピリジンスルホン酸（3-pyridine sulfonic acid）、
TPPMS：トリフェニルホスフィン-3-モノスルホン酸ナトリウム（sodium triphenylphosphine-3-monosulfonate）、
HMDP：ヒドロキシメタンジホスホン酸、
TEA：トリエチルアミン（triethylamine）、
DCC：ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexylcarbodiimide)、
TFA：トリフルオロ酢酸、
anisole：アニソール、
DMF：N,N’-ジメチルホルムアミド。
〔実施例１〕
99m Tc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)の合成
以下に示すように、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)を下記１〜８で表される工程によって調製した。
99m Tc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)の合成
以下に示すように、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)を下記１〜８で表される工程によって調製した。
HYNIC-HBP (7) の合成 (スキーム（Scheme）１及び２)
Boc-HYNIC-TFP(4) は、小野ら(Nuclear Medicine and Biology, 28,215-224 (2001))の方法に従い合成した(Scheme 1)。別途合成したHBP(5) (10.3 mg, 0.04 mmol)を水1.33 mLに溶解し、TEA(34.4 μL, 0.25 μmol)を加えた。この溶液に、アセトニトリル（acetonitrile）1.33 mLに溶解したBoc-HYNIC-TFP(4) (17.8 mg, 0.04 mmol)を加え、室温で2時間攪拌後、逆相HPLC(YMC社Hydrosphere C18(商品名)カラム(150 x 20 mm)、1%ギ酸を含有する水:1%ギ酸を含有するアセトニトリル（acetonitrile）= 90 : 10、流速16.0 mL/min)で精製することにより、Boc-HYNIC-HBP(6) を収率36.7%で得た。
Boc-HYNIC-TFP(4) は、小野ら(Nuclear Medicine and Biology, 28,215-224 (2001))の方法に従い合成した(Scheme 1)。別途合成したHBP(5) (10.3 mg, 0.04 mmol)を水1.33 mLに溶解し、TEA(34.4 μL, 0.25 μmol)を加えた。この溶液に、アセトニトリル（acetonitrile）1.33 mLに溶解したBoc-HYNIC-TFP(4) (17.8 mg, 0.04 mmol)を加え、室温で2時間攪拌後、逆相HPLC(YMC社Hydrosphere C18(商品名)カラム(150 x 20 mm)、1%ギ酸を含有する水:1%ギ酸を含有するアセトニトリル（acetonitrile）= 90 : 10、流速16.0 mL/min)で精製することにより、Boc-HYNIC-HBP(6) を収率36.7%で得た。
ESI-MS 計算値 C15H26N4O10P2 (M-H)- : m/z 483, 測定値483
さらに、Boc-HYNIC-HBP(6)5mgにTFA 450 μL、anisole 50 μLを加え、10分攪拌し、その後N2ガスにてTFAを除去した。さらに残渣をエーテルで充分洗浄後、水を加え、HYNIC-HBPを溶解させ、その溶液を凍結乾燥させることにより、HYNIC-HBP (7)を定量的に得た。
ESI-MS 計算値 C10H18N4O8P2 (M-H)- : m/z 383, 測定値383
99m Tc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP) (8) の合成 (Scheme ３)
0.1 Mホウ酸緩衝液（borate buffer）(pH 9.5)に溶解したHYNIC-HBP 溶液40 μL (0.15 mg/40 μL)に10 mM クエン酸緩衝液（citrate buffer）(pH 5.2)に溶解したtricine 200 μL (30 mg/mL)、AP 200μL (10 μL/mL)、および99mTcO4 - 200 μL (370 MBq/mL)、および0.1N HClに溶解したSnCl2・2H2O 25 μL (1 mg/mL)を添加し、95℃で35分間反応後、10分間室温に放置し、逆相HPLCにより精製することにより、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)を得た。放射化学的純度は逆相HPLC、CAEおよびTLCにより分析した。
0.1 Mホウ酸緩衝液（borate buffer）(pH 9.5)に溶解したHYNIC-HBP 溶液40 μL (0.15 mg/40 μL)に10 mM クエン酸緩衝液（citrate buffer）(pH 5.2)に溶解したtricine 200 μL (30 mg/mL)、AP 200μL (10 μL/mL)、および99mTcO4 - 200 μL (370 MBq/mL)、および0.1N HClに溶解したSnCl2・2H2O 25 μL (1 mg/mL)を添加し、95℃で35分間反応後、10分間室温に放置し、逆相HPLCにより精製することにより、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)を得た。放射化学的純度は逆相HPLC、CAEおよびTLCにより分析した。
〔実施例２〕
HYNIC-HBPに対する 99m Tcの配位部位の検討
0.1M ホウ酸緩衝液（borate buffer）(pH 9.5)に溶解したHYNIC-TFP溶液40 μL (0.15 mg/40 μL)に10 mM クエン酸緩衝液（citrate buffer）(pH 5.2)に溶解したtricine 200 μL (30 mg/mL)、AP 200 μL (10 μL/mL)、および99mTcO4 - 200 μL (370 MBq/mL)、および0.1N HClに溶解したSnCl2・2H2O 25 μL (1 mg/mL)を添加し、95℃で35分間反応後、10分間室温に放置した後、逆相HPLC (0.1% TFAを含有する水(A)と0.1% TFAを含有するアセトニトリル（acetonitrile）（B）をA : B=90 : 10からA : B=50 : 50へ20分間で、さらにA : B=0 : 100へ10分間で変換するグラジエント（gradient）、流速1.0mL/min)にて精製した。その後、0.1 Mホウ酸緩衝液（borate buffer）(pH 9.5)に溶解したHBP(5) (5 mg/mL)と室温で1時間反応させることで、プレラベル（prelabel）法により作製した 99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)を得た。この化合物と実施例１で得られたポストラベル(postlabel)法による99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)とを逆相HPLCにより分析した。
HYNIC-HBPに対する 99m Tcの配位部位の検討
0.1M ホウ酸緩衝液（borate buffer）(pH 9.5)に溶解したHYNIC-TFP溶液40 μL (0.15 mg/40 μL)に10 mM クエン酸緩衝液（citrate buffer）(pH 5.2)に溶解したtricine 200 μL (30 mg/mL)、AP 200 μL (10 μL/mL)、および99mTcO4 - 200 μL (370 MBq/mL)、および0.1N HClに溶解したSnCl2・2H2O 25 μL (1 mg/mL)を添加し、95℃で35分間反応後、10分間室温に放置した後、逆相HPLC (0.1% TFAを含有する水(A)と0.1% TFAを含有するアセトニトリル（acetonitrile）（B）をA : B=90 : 10からA : B=50 : 50へ20分間で、さらにA : B=0 : 100へ10分間で変換するグラジエント（gradient）、流速1.0mL/min)にて精製した。その後、0.1 Mホウ酸緩衝液（borate buffer）(pH 9.5)に溶解したHBP(5) (5 mg/mL)と室温で1時間反応させることで、プレラベル（prelabel）法により作製した 99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)を得た。この化合物と実施例１で得られたポストラベル(postlabel)法による99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)とを逆相HPLCにより分析した。
その結果、両者共に、保持時間9.8分に溶出され、これらは同一の化合物であることが示された。これによりプレラベル（prelabel）法及びポストラベル(postlabel)法の何れで製造しても、99mTcがビスホスホネート構造に配位せずにHYNIC部位に特異的に配位することが示された。
〔実施例３〕
血液からの放射能消失
1群4匹のWistar系雄性ラット(200-230 g)に99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)または99mTc-HMDP 250 μL (370-740 kBq)を静脈内投与後、経時的( 2、5、7、10、15、20、30、40、50、60分後)に動脈血を採取し、その重量と放射能を測定した。
血液からの放射能消失
1群4匹のWistar系雄性ラット(200-230 g)に99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)または99mTc-HMDP 250 μL (370-740 kBq)を静脈内投与後、経時的( 2、5、7、10、15、20、30、40、50、60分後)に動脈血を採取し、その重量と放射能を測定した。
その結果を図１に示す。モーメント解析法によりクリアランス値（CLEARANCE）を算出した結果、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)は0.17 mL/min、99mTc-HMDPは0.21 mL/minを示し、有意な差は認められなかった。
〔比較例１〕
99ｍＴｃ−ＭＡＧ３−ＨＢＰの合成及びラット体内動態
（１）Tr-MAG3-HBPの合成
塩化トリチル(1) (25.0 g, 90 mmol)とメルカプト酢酸(2) (8.3 g, 90 mmol)を45 mLのDMFに溶解させ、室温で48時間撹拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を100 mLのクロロホルムに溶解させ、6 N NaOHをゆっくりと加えた。沈殿した白色結晶を蒸留水で洗浄することによりトリチルメルカプト酢酸（Tritylmercaptoacetic Acid） (3) (22.3 g, 74.3%)を得た。
99ｍＴｃ−ＭＡＧ３−ＨＢＰの合成及びラット体内動態
（１）Tr-MAG3-HBPの合成
塩化トリチル(1) (25.0 g, 90 mmol)とメルカプト酢酸(2) (8.3 g, 90 mmol)を45 mLのDMFに溶解させ、室温で48時間撹拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を100 mLのクロロホルムに溶解させ、6 N NaOHをゆっくりと加えた。沈殿した白色結晶を蒸留水で洗浄することによりトリチルメルカプト酢酸（Tritylmercaptoacetic Acid） (3) (22.3 g, 74.3%)を得た。
1H NMR (CDCl3): δ 7.43-7.19 (overlapped m,15H), 3.03 (s,2H). FAB-MS calcd for C21H18O2S (M- H)-: m/z 333. Found: 333.
トリチルメルカプト酢酸（Tritylmercaptoacetic Acid）(3) (10.0 g, 30 mmol)を150 mLのクロロホルムに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）(3.45 g, 30 mmol)を溶液に加えた。25 mLのクロロホルムに溶解したDCC(7.4 g, 36 mmol)を反応溶液に室温にて滴下した。室温で18時間撹拌後、溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルに懸濁させた。濾過の後、濾液を減圧留去し、残渣をヘキサンで洗浄することにより未精製の化合物(4) (3.64 g)を得た。グリシルグリシルグリシン（Glycylglycylglycine）(0.73 g, 3.87 mmol)を22 mLの蒸留水に溶かし、1 N NaOHでpHを8.8に調節した。20 mLのDMFに溶解した未精製の化合物(4)(2.00 g)をグリシルグリシルグリシン（glycylglycylglycine）水溶液に滴下した。40℃で3時間撹拌後、溶媒を減圧留去し、残渣を30 mLの希塩酸(pH 2-3)に懸濁させ、クロロホルムにより抽出した。無水（anhydrous）CaSO4にて乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣をクロロホルム-メタノール-酢酸 (50:10:1)を移動相としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−［（トリチルメルカプト）アセチル］グリシルグリシルグリシン（N-[(Tritylmercapto)acetyl]glycylglycylglycine (Tr-MAG3)） (5) (501 mg)を白色結晶として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 7.23-7.44 (overlapped m,15H), 4.13 (s,4H), 3.65 (s,2H), 3.47 (s,2H). FAB-MS calcd for C27H27N3O5S (M+ H)+: m/z 506. Found: 506.
HBP(7)はKiecykowskiの方法により合成した。
Tr-MAG3 (5)(100 mg、0.198 mmol)とテトラフルオロフェノール（tetrafluorophenol）(38.8 mg、0.220 mmol)を14 mLのクロロホルムに溶解させ、6 mLのクロロホルムに溶解したDCC (45.8 mg、0.220 mmol)を反応溶液に室温にて滴下した。室温で1時間撹拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を適量の酢酸エチルに懸濁させ、濾過後、濾液を減圧留去し、未精製の化合物(6)を得た。次に化合物(7)(57.0 mg、0.229 mol)を3 mLの蒸留水に懸濁させ、トリエチルアミン（triethylamine）(139 mg、1.37 mmol)を懸濁液に加えた。数秒の撹拌により懸濁液は透明になった。4 mLのアセトニトリルに溶解した化合物(6)を反応溶液に加え、更にトリエチルアミン（triethylamine）(23.1 mg, 0.229 mmol)を加えた後、室温で3時間撹拌した。その後、逆相HPLCにて精製し、凍結乾燥することにより[1-ヒドロキシ-1-ホスホノ-4-[2-[2-[2-(2-トリチルメルカプトアセチルアミノ)アセチルアミノ]アセチルアミノ]アセチルアミノ]ブチル]ホスホン酸（[1-Hydroxy-1-phosphono-4-[2-[2-[2-(2-tritylmercaptoacetylamino)acetylamino]acetyl- amino]acetylamino]butyl]phosphonic Acid（Tr-MAG3-HBP (8)）） (50.3 mg, 34.5%)を白色結晶として得た。逆相HPLCは、ナカライテスク社のCosmosil 5 C18-AR-300（商品名）(10 x 150 mm)カラムを用いて、0.1%のTFAを含有する水(A) : アセトニトリル(B)をA : B = 75 : 25から30分でA : B = 60 : 40へ30分間で変換するグラジエント（gradient）法により、流速4.7 mL/minで行った。
Tr-MAG3 (5)(100 mg、0.198 mmol)とテトラフルオロフェノール（tetrafluorophenol）(38.8 mg、0.220 mmol)を14 mLのクロロホルムに溶解させ、6 mLのクロロホルムに溶解したDCC (45.8 mg、0.220 mmol)を反応溶液に室温にて滴下した。室温で1時間撹拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を適量の酢酸エチルに懸濁させ、濾過後、濾液を減圧留去し、未精製の化合物(6)を得た。次に化合物(7)(57.0 mg、0.229 mol)を3 mLの蒸留水に懸濁させ、トリエチルアミン（triethylamine）(139 mg、1.37 mmol)を懸濁液に加えた。数秒の撹拌により懸濁液は透明になった。4 mLのアセトニトリルに溶解した化合物(6)を反応溶液に加え、更にトリエチルアミン（triethylamine）(23.1 mg, 0.229 mmol)を加えた後、室温で3時間撹拌した。その後、逆相HPLCにて精製し、凍結乾燥することにより[1-ヒドロキシ-1-ホスホノ-4-[2-[2-[2-(2-トリチルメルカプトアセチルアミノ)アセチルアミノ]アセチルアミノ]アセチルアミノ]ブチル]ホスホン酸（[1-Hydroxy-1-phosphono-4-[2-[2-[2-(2-tritylmercaptoacetylamino)acetylamino]acetyl- amino]acetylamino]butyl]phosphonic Acid（Tr-MAG3-HBP (8)）） (50.3 mg, 34.5%)を白色結晶として得た。逆相HPLCは、ナカライテスク社のCosmosil 5 C18-AR-300（商品名）(10 x 150 mm)カラムを用いて、0.1%のTFAを含有する水(A) : アセトニトリル(B)をA : B = 75 : 25から30分でA : B = 60 : 40へ30分間で変換するグラジエント（gradient）法により、流速4.7 mL/minで行った。
1H NMR (DMSO-d6): δ 8.22 (t,1H), 8.18 (t,1H), 8.10 (t,1H), 7.81 (t,1H), 7.25-7.36 (overlapped m,15H), 3.63-3.76 (overlapped m,6H), 2.98 (q,2H), 2.85 (s,2H), 1.67-1.85 (overlapped m,4H). IS-MS calcd for C31H38N4O11P2S (M+ H)+: m/z 737. Found: 737.
（２） 99m Tc-MAG3-HBPの合成
0.1 mgのTr-MAG3-HBP (8)にTFA 200 μL、トリエチルシラン（trietylsilane ）10 μLを加えトリチル基を脱保護し、N2ガスにてTFAを除去した。残渣に0.1 M ホウ酸緩衝液80 μL (pH 9.5)を加え、塩化スズの0.1 Mクエン酸溶液6 μL (1 mg/ml)および99mTcO4 - 200 μL (370 MBq/mL)を加え、1 N NaOHにてpH 8-9に調整し、95℃で1時間反応させた。その後、逆相HPLCにて精製することにより99mTc-MAG3-HBP (10)を放射化学的収率73 %、放射化学的純度95 %以上で得た。逆相HPLCはナカライテスク社の Cosmosil 5C18-AR-300（商品名）カラム(4.6 x 150mm)を用い、10 mM テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（tetrabutylammonium hydroxide）および10% エタノール（ethanol）を含有する0.2Mリン酸緩衝液（phosphate buffer）(pH6.0)で60分間、流速1.0mL/minで行った。
0.1 mgのTr-MAG3-HBP (8)にTFA 200 μL、トリエチルシラン（trietylsilane ）10 μLを加えトリチル基を脱保護し、N2ガスにてTFAを除去した。残渣に0.1 M ホウ酸緩衝液80 μL (pH 9.5)を加え、塩化スズの0.1 Mクエン酸溶液6 μL (1 mg/ml)および99mTcO4 - 200 μL (370 MBq/mL)を加え、1 N NaOHにてpH 8-9に調整し、95℃で1時間反応させた。その後、逆相HPLCにて精製することにより99mTc-MAG3-HBP (10)を放射化学的収率73 %、放射化学的純度95 %以上で得た。逆相HPLCはナカライテスク社の Cosmosil 5C18-AR-300（商品名）カラム(4.6 x 150mm)を用い、10 mM テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（tetrabutylammonium hydroxide）および10% エタノール（ethanol）を含有する0.2Mリン酸緩衝液（phosphate buffer）(pH6.0)で60分間、流速1.0mL/minで行った。
（３） 99m Tc-MAG3-HBPのラット体内分布
下記実施例４と同様にして99mTc-MAG3-HBPのラット体内分布を測定した結果を図２に示す。99mTc-MAG3-HBPは99mTc-HMDPと比較して、投与早期から骨(BONE)への有意に高い放射能集積を示したが、一方、血液(BLOOD)クリアランスは遅延したため、その結果、投与早期における骨/血液放射能集積比(BONE/BLOOD RATIO)が向上しなかった。
ビスホスホネート構造とは独立して生体内で安定な99mTc単核錯体を導入した化合物である99mTc-MAG3-HBPは、99mTc-HMDPに比べ投与早期から有意に高い骨集積性を示し、薬剤設計の有用性が示された。しかしながら99mTc-MAG3-HBPは99mTc-HMDPに比べ、血液クリアランスが遅延したため、骨/血液放射能比は向上しなかった。この血液クリアランスの遅延は、99mTc-MAG3-HBP骨格に起因する高い蛋白結合率に由来していると考えられる。
下記実施例４と同様にして99mTc-MAG3-HBPのラット体内分布を測定した結果を図２に示す。99mTc-MAG3-HBPは99mTc-HMDPと比較して、投与早期から骨(BONE)への有意に高い放射能集積を示したが、一方、血液(BLOOD)クリアランスは遅延したため、その結果、投与早期における骨/血液放射能集積比(BONE/BLOOD RATIO)が向上しなかった。
ビスホスホネート構造とは独立して生体内で安定な99mTc単核錯体を導入した化合物である99mTc-MAG3-HBPは、99mTc-HMDPに比べ投与早期から有意に高い骨集積性を示し、薬剤設計の有用性が示された。しかしながら99mTc-MAG3-HBPは99mTc-HMDPに比べ、血液クリアランスが遅延したため、骨/血液放射能比は向上しなかった。この血液クリアランスの遅延は、99mTc-MAG3-HBP骨格に起因する高い蛋白結合率に由来していると考えられる。
〔実施例４〕
ラット体内分布の検討
1群4-8匹(99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP) : 5分(n=4)、10、30分(n=8)、60分(n=6)、99mTc-HMDP : (n=4))のWistar系雄性ラット(200-230 g)に99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)または99mTc-HMDP 250 μL (370-740 kBq)を静脈内投与後、経時的(5、10、30、60分後)に屠殺、臓器を摘出し、それぞれの重量と放射能を測定した。
ラット体内分布の検討
1群4-8匹(99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP) : 5分(n=4)、10、30分(n=8)、60分(n=6)、99mTc-HMDP : (n=4))のWistar系雄性ラット(200-230 g)に99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)または99mTc-HMDP 250 μL (370-740 kBq)を静脈内投与後、経時的(5、10、30、60分後)に屠殺、臓器を摘出し、それぞれの重量と放射能を測定した。
その結果を図３及び表１〜２に示した。図３から、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)は99mTc-HMDPに比べ、投与早期から骨(BONE)への有意に高い放射能集積を示し、また、血液(BLOOD)からの放射能消失は、投与後10分においてやや遅延したが、99mTc-HMDPと同程度の値を示し、その結果、骨と血液との放射能集積比(BONE/BLOOD RATIO)は投与早期から有意に向上した。また、99mTc-(HYNIC-HBP)(tricine)(AP)は、下記表２に示すとおり、その他の非特異的臓器への放射能集積は99mTc-HMDP（表１）と同様、ほとんど認められなかった。
〔実施例５〕
コリガンドとしてAPの代わりに、NIC、CA、SAおよびTPPMSのそれぞれを用いた以外、実施例１と同様の方法で本発明の化合物を合成した。また、コリガンドとしてtricine２分子を用いた以外、実施例１と同様の方法で化合物を合成し、対照として用いた。これらの化合物のラット体内分布データを実施例４と同様にして得た。その結果を表３〜７に示す。
コリガンドとしてAPの代わりに、NIC、CA、SAおよびTPPMSのそれぞれを用いた以外、実施例１と同様の方法で本発明の化合物を合成した。また、コリガンドとしてtricine２分子を用いた以外、実施例１と同様の方法で化合物を合成し、対照として用いた。これらの化合物のラット体内分布データを実施例４と同様にして得た。その結果を表３〜７に示す。
これらの結果から、コリガンドとしてtricine２分子を用いた場合（表７）、実施例４のAPを用いた場合（表２）に比べて骨への集積性が低く、また血液クリアランスも大きく遅延したため、後者に比べて骨/血液放射能集積比が低下した。これに対し、TPPMS（表６）およびNIC （表３）を用いた場合は、他のピリジン誘導体に比べ血液クリアランスの遅延傾向が見られたが、AP（表２）と同様に骨への高い集積性が見られた。コリガンドとしてAP（表２）、SA（表５）およびCA（表４）を使用した場合は、骨への親和性、および血液クリアランスともに良好で高い骨/血液放射能集積比が得られ、また、問題となるような非標的組織への放射能分布もほとんど観察されなかった。コリガンドとしてAP、SAおよびCAを使用した場合は、体内分布実験、分配係数、HPLCの保持時間が類似していたことを考慮すると、コリガンドの違いが錯体の物性に与える影響が少ないと考えられ、そのため、標識後、HPLC分析において単一のピークが観察されることが多いことから精製が容易であり、その結果、放射化学的純度が高い標識体を得やすいことがわかった。また、本発明のビスホスホン酸誘導体は、99mTc−HMDPの血液クリアランスの良さと比較例１に示した99mTc−MAG3の投与早期での骨集積の良さの両方を兼ね備えた化合物といえる。
Claims (5)
- 下記の化学式（I-1）で示される、ビスホスホン酸誘導体及びその塩。
Ｒ ２ はＨ、ＯＨまたはハロゲン原子、
Ｔはトリシン、
Ａはニコチン酸、アセチルピリジン、３−ピリジンスルホン酸、３，５−ジカルボン酸ピリジンおよびトリフェニルホスフィンからなる群より選ばれたもの、
Ｍは金属原子を示す。） - 上記式（I-1）中、Ｒ ２ はＨまたはＯＨ、Ｍで表される金属原子は放射性核種である、請求項１に記載のビスホスホン酸誘導体及びその塩。
- 上記式（I-1）中、Ｒ １ のｎが３である、請求項１又は２に記載のビスホスホン酸誘導体及びその塩。
- 請求項１〜３の何れか１項に記載のビスホスホン酸誘導体又はその塩（ただし、Ｍで表される金属原子は放射性核種）を有効成分として含有してなる放射性骨診断剤。
- Ｍで表される金属原子は99m−テクネチウム、111−インジウムおよび186−レニウムからなる群より選ばれる放射性核種である請求項４に記載の放射性骨診断剤。
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