JP4475983B2 - Bmal1を阻害する方法 - Google Patents
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Description
影響を与えることが示された(図4)。しかし、C/EBPδを誘導する分化誘導剤のひとつで
あるDexのみで細胞を処理した際にはBMAL1 mRNA発現量の上昇は認められなかった。また、分化誘導剤のいずれか単独処理に比較して2種類以上の誘導剤処理によりBMAL1 mRNA発現量の増加が認められた(図3)。以上の結果より、脂肪細胞分化過程におけるBMAL1の発現量の増加は、C/EBPファミリーを中心に、PPARγおよびその他の転写因子の協調的な作
用によることが示唆された。
討した。その結果、BMAL1はPPARγ2の発現を直接的に制御するものではないことが示さ
れた(図7)。
。一方、アデノウイルスベクターを用いてBMAL1を3T3-L1前駆脂肪細胞に過剰発現させたところ、多くの脂肪代謝酵素遺伝子の発現量が増加することを明らかにした16)。以上の結果より脂肪細胞分化においてBMAL1は脂質代謝酵素遺伝子群の発現調節ならびにその結果おこる脂肪の蓄積に関与していることが示唆された。
阻害作用があることを確認した。脂肪組織においてPPARγの発現に日内変動が示されるこ
とから、チアゾリジン系薬剤にはこの日内変動に対応した至適投与時間帯が存在する。この時間帯としては就寝前が好適であるが、薬剤に徐放性を付与することにより就寝前から就寝後短時間に有効血中濃度を維持できる機能を薬剤に与えることができる。
細胞の培養
マウス胚由来3T3-L1細胞((財)ヒューマンサイエンス振興財団)ならびにマウス胎児由来NIH3T3細胞((財)ヒューマンサイエンス振興財団)は10%仔牛血清(Cell Culture Technologies)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、日水製薬(株))に、2mM グルタミン(和光純薬工業(株))、1μg/mL アンホテリシンB(ICN Biomedicals)、1%抗生物質混
合溶液を添加し10%NaHCO3によりpH7.4に調整した培地を用いて、37℃、飽湿、5%CO2条件下で培養した。ヒト胎児腎由来HEK293細胞((財)ヒューマンサイエンス振興財団)は10%ウシ胎児血清(FBS, Cell Culture Technologies)を含むイーグルMEM(日水製薬(株))に上記の添加物を加え、同様の条件下で培養した。抗生物質混合溶液は400μg/mL 硫酸カ
ナマイシン(明治製菓(株))、400μg/mL 硫酸ストレプトマイシン(明治製菓(株))、
200μg/mL ビクシリン(アンピシリンナトリウム、明治製菓(株))、20μg/mL ビクリ
ン(硫酸アミカシン、ブリストル・マイヤーズスクイブ)をPBSに溶解し、ろ過滅菌したものを使用した。
3T3-L1細胞を60mm組織培養用ディッシュに撒き、接触阻害の状態まで培養した。その後、10%FBS、10μg/mL インスリン・ウシ膵臓製(シグマ アルドリッチ(株))、5μg/mL
トランスフェリン(和光純薬工業(株))、20pMトリヨードチロニン(ナカライテスク(株))、0.18mMアデニン(Merck)、3mM グルタミン、1μg/mL アンホテリシンB、1%抗生
物質混合溶液を含むDMEM:Ham's F-12培地(大日本製薬(株))=3:1混合培地(以下、分化用培地)中に、分化誘導剤である0.25μM デキサメタゾン(Dex、和光純薬工業(株))、50
0μM イソブチルメチルキサンチン(IBMX、和光純薬工業(株))を添加し、分化誘導用培
地として3日間培養した。その後、分化用培地に交換し培養を続け、さらに数日間培養を続けた。NIH3T3細胞に関しては上記の分化用培地にさらに5μM pioglitazone(武田薬品
工業より分与)あるいは50μM 5,8,11,14-eicosatetraynoic acid(ETYA,Cayman Chmical)
を加え、同様の条件下で培養を行った。
細胞をPBSで洗い、TRI REAGENT(商標)試薬(シグマ アルドリッチ(株))を用いて添付のプロトコールに従いtotal RNAを抽出した。混入したDNAによる影響を除くため、total RNA 10μgをDNase(RT grade、和光純薬工業(株))2unitsにより37℃、15分間の処理
を行った。その後、フェノール抽出処理、ならびにクロロホルム抽出処理を行い、エタノール沈殿によりtotal RNAを精製した。精製されたtotal RNAを適当量のH2Oにより溶解し、以下の実施例に使用した。
DNase処理をしたtotal RNA 1μgを0.8μM オリゴdTプライマー((株)ベックス)お
よび1mM dNTPs(インビトロジェン(株))を含むReaction buffer中で 60℃、5分間、次いで37℃、10分間反応させた。その後、Reverse Transcriptase(和光純薬工業(株))200unitsを加えて37℃、60分間、次いで95℃、15分間の反応を行った。
メガ(株))、0.4mM dNTPs、75KBq [α−32P]dCTP(HAS)、0.2μM各種プライマー、及
び2.5units Taq DNA polymerase(プロメガ(株))を含む反応液中において、以下の条件下でPCRを行った。
下記に示すプライマーを用いて3T3-L1細胞より抽出したゲノムDNAからPCRによりBMAL1遺伝子のプロモーター領域を増幅した。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、QIAquick Extraction Kit ((株)キアゲン)を用いてアガロースゲルより抽出した。得られた精製DNAをKpnI(New England Biolabs Inc.)およびXhoI(New E
ngland Biolabs Inc.)で消化した。次いで同様にKpnIとXhoIで消化したpGL3 basic v
ector(プロメガ(株))中にこのDNAをサブクローニングした。得られたリポーター遺伝子を用いて1-1-6に準じてRepotrer Gene Assayを行った。
50~70% confluentの状態のHEK293細胞に、リポーター遺伝子、発現ベクターおよび内部標準ベクターであるウミシイタケルシフェラーゼコントロールレポーターベクター (プロメガ(株))をFugene6 Transfection Reagent (ロッシュ・ダイアグノスティックス(株))を用いてリポソーム法により導入した。導入48時間後、PBSを用いて細胞を洗い、Passive Lysis Buffer(プロメガ(株))により細胞を溶解した。次いで検体中のルシフェラーゼ活性は、Dual-Luciferase Reporter Assay Kit(プロメガ(株))を用いて測定した。
全長BMAL1 cDNAを鋳型として、以下のプライマーを用いて、PCRを行った。得られたDNA断片をアガロース電気泳動により精製した後、QIAquick Extraction Kit を用いてアガロースゲルより抽出した。得られた精製DNAをEcoRI(New England Biolabs Inc.)および
XbaI(New England Biolabs Inc.)で消化した。次いで同様にEcoRIとXbaIで消化した
p3XFLAG-CMVTM -14発現ベクター(シグマ アルドリッチ(株))中にこのDNAをサブクローニングした。
1-1-7に従い作成した全長BMAL1発現ベクターあるいは、
p3XFLAG-CMVTM -14発現ベクターをFugene6 Transfection Reagentを用いてリポソーム法によりNIH3T3細胞に導入した。遺伝子導入細胞を100mm組織培養用ディシュに希釈して培養し、ネオマイシン(Calbiochem)耐性(405μg/mL)を指標に2週間、細胞のセレクション
を行った。形成されたコロニーをクローニングシリンダー(旭テクノグラス(株))を用いて回収し、得られたクローンを継代的に培養した。BMAL1の発現量はWestern Blot法により確認した。
細胞を0.25%トリプシン(インビトロジェン(株))を用いてディシュより剥離した。細胞を冷PBSで洗浄した後、Buffer A中に懸濁し、ボルテックスにより細胞を破壊した。その後5000rpm、1分間遠心して上清を除き、再びBuffer Aを加えて5000rpm、1分間遠心した。得られた沈殿をBuffer C中に懸濁し、4℃で30分間ローテーションを行った。その後、15,000rpmで15分間遠心し、上清を核タンパク質抽出液とした。
Buffer C;10mM HEPES-KOH(pH7.8)、10mM KCl、0.1mM EDTA(pH8.0)、5mM MgCl2(和光純薬工業(株))、20%グリセロール(関東化学(株))、1mM(±)-DTT、0.5mM PMSF、2μg/mL
ロイペプチン。
調製した核タンパク質(10μg)をLammeli buffer中において100℃、3分間処理し、10
%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。その後、セミドライ法を用いてゲル中のタンパク質をポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜(日本エイドー(株))上に転写した。核タンパク質を転写したPVDF膜を3%スキムミルク(和光純薬工業(株))中においてブロッキングした後、抗FLAG抗体(シグマ アルドリッチ(株))、次いでアルカリフォスターゼを結合させた抗マウスIgG抗体(プロメガ(株))と反応させた。その後、アルカリフォスターゼの発色基質である5-bromo-4-chloro-3-indolyl-1-phosphate(プロメガ(株))、およびnitro-bluetetrazolium(プロメガ(株))を用いて染色し、FLAG融合BMAL1タンパク質を検出した。
分化11日後の細胞を冷4%ホルマリン(和光純薬工業(株))/PBSを用いて固定した。固定した後にホルマリンを除き、2~3回蒸留水で洗い、室温にてよく乾燥させた。その後、2-プロパノール(和光純薬工業(株))を用いて調製した0.5% Oil Red O溶液と蒸留水との3:2混合液をWhatman No.1フィルターでろ過し、ろ液を細胞に加えて1時間染色した。染色後、70%エタノールならびに蒸留水で洗浄し、その後風乾させた。
前駆脂肪細胞である3T3-L1細胞の脂肪細胞分化に伴うBMAL1 mRNAの発現量の変化をRT-PCR法により検討した(図2)。その際、脂肪細胞分化に伴い増加することが知られているPPARγ8)ならびにaP28)のmRNA発現量を測定し、脂肪細胞への分化の程度を確認した。また
、内部標準としてGAPDH mRNAの発現量を測定した。その結果、BMAL1 mRNAの発現量は脂肪細胞分化に伴い増加することが示された(図2)。
BMAL1の発現量を調節している因子の解明を試みた。まず、3T3-L1細胞の分化誘導剤であるIBMX、DEXおよびインスリンを様々な組み合わせで添加し、72時間培養した。その後RNAを抽出し、各分化誘導剤処理によるBMAL1 mRNAの発現量の変化をRT-PCR法により検討した(図3)。その結果、各分化誘導剤による単独処理に比較して2種類以上の分化誘導剤の組み合わせによりBMAL1の発現がより強く誘導された。しかしながら2種類以上の分化誘導剤におけるいずれの組み合わせにおいてもBMAL1の発現量に差異は見られなかった。
BMAL1プロモーター活性に与える影響をReporter Gene Assayにより検討した。その結果、C/EBPγあるいはC/EBPδの存在によりBMAL1プロモーター活性はコントロールの約4
倍の活性を示した。またPPARγ1はRXR共存下においてBMAL1プロモーター活性をコント
ロールの約2倍に上昇させた(図4)。
前述したように脂肪細胞分化に伴い、BMAL1の発現量が増加することが明らかになり、この増加はC/EBPαおよびδが転写レベルで直接的に強い影響を与えていることが示され
た。これらのことはBMAL1が脂肪細胞分化において重要な役割を演じていることを示唆している。そこで通常の条件下では脂肪細胞分化能を有しないNIH3T3細胞を用いてBMAL1の脂肪細胞分化誘導能を検討した。NIH3T3細胞に全長BMAL1発現ベクターあるいは空のベクターを導入し、これらを恒常的に発現する細胞、すなわちBMAL1過剰発現細胞(B細胞)ならびにベクター遺伝子過剰発現細胞(V細胞)をクローニングした。それら細胞内でのBMAL1の発現はWestern Blot法により確認した(図5A)。次にIBMX、Dex、FBS、インスリンおよびpioglitazoneあるいはETYAを添加し、これら細胞クローンに対する分化誘導を試みた。Oil Red O染色ならびに検鏡により脂肪細胞への分化能を検討したところ、B細胞はpioglitazoneあるいはETYAのいずれのリガンド添加によっても脂肪滴の蓄積、すなわち脂肪細胞への分化が確認された(図5BおよびC)。その一方でコントロール(VならびにWT) 細胞においては脂肪滴の存在は認められなかった(図5BおよびC)。
B細胞、V細胞ならびにNIH3T3細胞野生株(WT)をpioglitazone存在下でIBMX、Dex、FBSおよびインスリン添加により、脂肪細胞へと分化誘導した。分化0日目および11日目の細胞からRNAを抽出して脂肪細胞関連遺伝子の発現量をRT-PCR法により検討した。その結果、分化誘導後11日目のB細胞において、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPAR、脂肪細胞のマーカー遺伝子であるaP2ならびに脂肪細胞特異的糖輸送担体である
Glut4の発現量の顕著な増加が確認された。それに対してコントロール(VおよびWT)細胞ではその増加はわずかであった (図6)。
前節において、通常の分化誘導では脂肪細胞へと分化しないNIH3T3細胞がBMAL1の過剰発現により形態ならびに遺伝子発現においても脂肪細胞分化能を獲得することが明らかとなった(図5および6)。そこで脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPARγ2の
発現が直接BMAL1によって制御されているか否かを、PPARγ2遺伝子のプロモーター領域
を挿入したリポーター遺伝子を用いて検討した。その際にC/EBPδをポジティブコントロ
ールとして用いた。C/EBPδはPPARγ2のプロモーター領域に結合し、その活性を増加す
ることが知られている24,25)。本実験においてもC/EBPδはPPARγ2プロモーター活性を
約8倍増加させた(図7)。その一方でBMAL1/CLOCKはPPARγ2プロモーター活性には影響
を与えなかった(図7)。
とが確認された(図2)。また、ヒト間葉系幹細胞を脂肪、軟骨芽および骨芽細胞へと分化させたところ脂肪細胞への分化時にのみBMAL1の発現上昇が確認された16)。これらの結果より脂肪細胞分化時におけるBMAL1発現量の増加は特定の株化細胞において起こる現象ではなく、脂肪細胞分化の本質に密接に関連したものであることが示唆された。
が示された(図4)。また、脂肪細胞分化誘導シグナル伝達機構ではC/EBPδはグルココ
ルチコイドレセプターによって発現誘導されることが知られている26)。このグルココルチコイドレセプターのリガンドであるDexのみで処理を行った細胞では有意なBMAL1 mRNAの発現量の増加は見られなかった(図3)。脂肪細胞分化過程においてC/EBPδは単独では
分化誘導作用が認められずC/EBPδと協調することで分化に相加的に作用することが知ら
れている27,28)。これらのことより、脂肪細胞分化過程におけるBMAL1の発現量の増加はC/EBPα、δの直接的な強い影響を受けているが、いずれか単独の因子による作用ではな
くC/EBPファミリー、PPARγ1およびγ2、あるいはその他の脂肪細胞分化の経過と共に
発現してくる転写因子の協調的な影響である可能性が示された。
細胞分化の進行におけるBMAL1の役割を明らかにする目的でPPARγ2の発現に対する影響
を検討した。PPARγ2遺伝子のプロモーター活性に対するBMAL1の影響を検討したところ
、BMAL1はその活性に影響を与えなかった(図7)。
以上の結果よりBMAL1はPPARγ2の発現に直接的な影響を与えることなく脂肪細胞分化を
促進することが示された。
次に、3T3-L1細胞に転写活性能を欠いたBMAL1を過剰発現させ、そのドミナントネガティブ効果による脂肪細胞分化への影響ならびに脂肪細胞分化過程におけるBMAL1の機能解析を行った。
C末端欠損BMAL1発現ベクターの作製
転写活性部位を欠損したBMAL1(以下BMAL1ΔC) cDNAは、全長BMAL1 cDNAを鋳型として以下のプライマーを用いてPCR法により調製した。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、QIAquick Extraction Kitを用いてアガロースゲルより抽出した。得られた精製DNAをEcoRIおよびXbaIで消化した。次いで同様にEcoRIとXbaIで
消化したp3XFLAG-CMVTM -14発現ベクター中にBMAL1ΔC cDNAをサブクローニングした。また、作成したBMAL1ΔC発現ベクターのドミナントネガティブ効果をReporter Gene Assayにより確認した。
BMAL1ΔC発現ベクターあるいはp3XFLAG-CMVTM -14発現ベクターをFugene6 Transfection Reagentを用いてリポソーム法により3T3-L1細胞に導入した。その後BMAL1ΔC過剰発現細胞(BΔC細胞)ならびにベクター遺伝子過剰発現細胞(V細胞)をクローニングした。
クローニングしたBΔC細胞、V細胞ならびに3T3-L1細胞野生株(WT)を脂肪細胞へと分化誘導した。脂肪細胞への分化の程度はOil Red O染色により確認した。また脂肪細胞関連遺伝子の発現を検討した。その際に新たに使用したプライマーを以下に示す。
転写活性領域を欠いたBMAL1ΔC(図8)がドミナントネガティブ効果を示すか否かをReporter Gene Assayにより検討した。全長BMAL1、BMAL1ΔC、ならびにCLOCKの発現ベクターをBMAL1の結合部位であるE-boxを含んだリポーター遺伝子(MLP-Luc)とともにHEK293細胞に一過性に導入した。その結果、加えたBMAL1ΔCの用量に依存してルシフェラーゼ活性は抑制された (図9)。
BMAL1ΔC発現ベクターならびに空の発現ベクターを3T3-L1細胞に導入し、これらの遺伝子を恒常的に発現する細胞クローン(BΔC細胞およびV細胞)を確立した。得られた BΔC細胞ならびにV細胞におけるBMAL1ΔCタンパク質の発現をWestern Blot法により検討した。その結果、BMAL1ΔCタンパク質の発現はBΔC細胞においてのみ確認された(図10A)。次いで、BΔC細胞およびV細胞を常法に従い脂肪細胞へと分化誘導した。その結果、V細胞は成熟脂肪細胞へと分化したものの、BΔC細胞の脂肪細胞への分化の程度は著しく低いものであった(図10B)。
BΔC細胞、V細胞ならびに3T3-L1細胞野生株(WT)を常法に従い、脂肪細胞へと分化誘導した。分化誘導前(0日目)のBΔC細胞において、脂肪細胞マーカー遺伝子であるaP2の発現低下ならびにコレステロール合成の制御を司る転写因子であるSREBP1の発現増加が認められた。分化誘導5日目においてBMAL1ΔCの発現に伴う上記の変化は観察されなかった。その一方で脂肪細胞分化の制御に関与する転写因子であるC/EBPδがBΔC細胞に
おいて顕著な発現増加を示し、また脂質代謝の調節に関与する転写因子であるPPARγ1の
発現は、コントロール(VおよびWT)細胞に比較して明らかに低いものであった。これらに対して脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPARγ2、脂肪滴の構成タンパク質
であるADRPおよびperilipin、ならびに脂肪細胞特異的糖輸送担体であるGlut4の発現に関しては、分化誘導前後のいずれにおいてもBΔC細胞ならびにコントロール(VおよびWT)細胞の間で、明らかな差異は認められなかった。
BΔC細胞、V細胞ならびに3T3-L1細胞野生株(WT)を常法に従い分化誘導し、Oil Red Oを用いた脂肪滴の染色により分化の程度を検討した。その結果、BΔC細胞の分化の程度は先に示したように著しく低いものであった (図12上段)。さらに、BMAL1ΔC細胞の分化能はPPARγ2のリガンドであるpioglitazone存在下において分化誘導を行っても、
コントロール(VおよびWT)細胞と比較して分化能の回復は認められなかった(図12下段)。
aP2あるいはGlut4はいずれもBΔC細胞において発現されており、その程度はV細胞におけるそれと顕著な違いは見られなかった(図11)。このことからBMAL1はこれらの脂肪細胞関連因子の発現においては影響を与えることなく、細胞内の脂肪の蓄積に関与することが示唆された。細胞内における脂肪の蓄積を考える上でBΔC細胞におけるPPARγ1
の発現量の低下は興味深い(図11)。PPARγ1シグナル下流には多くの脂肪合成酵素遺
伝子があることが報告されている31)。さらにはBΔC細胞の形態的な分化能の低下はPPARγのリガンドであるpioglitazone処理によっても回復しなかったことより(図12)、脂肪細胞分化過程におけるBMAL1の主な作用はPPARより下流の脂肪酸合成ならびに蓄積
に至る経路であることが推察される。アデノウイルスベクターを用いてBMAL1を3T3-L1前駆脂肪細胞に過剰発現させたところ、多くの脂質代謝酵素遺伝子の発現量が増加することを明らかにした16)。一方、脂肪滴の構成タンパク質であるADRPならびにperilipinはBMAL1ΔCの影響を受けていないことより(図11)、BMAL1は脂肪滴の構成に対しても影響を与えないことが示唆された。以上の結果より、脂肪細胞分化においてBMAL1は脂質代謝酵素群の発現調節ならびにその結果におこる脂肪の蓄積に関与することが示唆された。
生後10週齢のC57BL/6マウスにロシグリタゾン(10mg/kg体重)を経口より20日間投与した。その後、脂肪組織を摘出し、RNAを抽出した。BMAL1 mRNAの発現をRT-PCRにより確認した。結果を図13に示す。
BMAL1 Brain and Muscle Arnt-Like Protein 1
PPARγ Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ
C/EBP CCAAT/Enhancer Binding Protein
aP2 Adipocyte fatty acid binding Protein 2
DBP Albumin gene D-site Binding Protein
Glut Glucose Transporter
IR Insulin Receptor
IRS Insulin Receptor Substrate
RORα Retinoid-like Orphan Receptor α
GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
ADRP Adipose Differentiation-Related Protein
SREBP1 Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1
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〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Forward Primer Sequence
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〈210〉 22
〈211〉 22
〈212〉 DNA
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〈220〉
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〈220〉
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〈220〉
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〈400〉 24
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〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
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- チアゾリジン系化合物を非ヒト動物に投与してBMAL1を阻害する方法。
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