JP4475373B2 - 毒性物質の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は毒性物質を生物学的方法を用いて検出する方法に関し、詳しくは披検物質の存在下に酵母の特定の遺伝子から転写されるｍＲＮＡを測定することにより毒性物質を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境庁により昭和４９年から平成１０年度までの２４年間にわたり毎年行われている化学物質環境追跡調査結果によりば、今まで調査した７７５種類の化学物質のうち、約４０％の物質が環境中に放出されている。一方、わが国において現在、工業的に生産されている化学物質は約５万種類とされ、その生産量、種類数は年々増加している。また、塩素による水処理、焼却処理により非意図的に生成された化学物質が環境を汚染することが知られている。これらの事実から、環境中に蓄積されている化学物質は多数あると予測されるが、これら全てを個々に調査することはきわめて困難である。
従来のバイオアッセイ（：生物材料を用いてその応答性から有害性を評価する手法）は主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としており、環境中の化学物質による毒性の評価はできるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因するかを判断することはできない。国内では亜硝酸生成細菌または硝酸精製細菌の活性により評価する方法（特開平06-123705号公報、特開2000-206087号公報）、鉄バクテリアの活性により評価する方法（特開平11-37969号公報）が提案されており、水質安全モニタ（富士電機）のような製品が販売されている。また、国外では、発光微生物の発光強度により評価する製品（MICROTOX、azur社、アメリカ；LUMIS、drlange社、ドイツ）が市販されている。しかし、これらはいずれも従来型のバイオアッセイ法の延長であり、毒性化学物質に関する詳細な情報は得られない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
わが国の化学物質のリスク管理は、新たな汚染が見出されるたびに化学物質の見直しが行われ、さらに規制と自主規制を組み合わせる体制の整備がすすめられている。しかし、トリハロメタンやダイオキシンに代表されるような有害化学物質の非意図的生成および環境放出など、複雑化、多様化する現状に即座に対応する体制は整っていない。また、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」における毒性評価法である動物実験はコストや時間がかかり国際的に受け入れ難くなっている。このように、管理体制についての問題は常に議論されるが、それを解決する具体的な手段が無いことから課題の解決には至っていない。従って、環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が要望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は毒性物質が存在するとの特定の酵母遺伝子のｍＲＮＡの発現が誘導されることを発見して本発明を完成させた。
即ち、本発明は被検物質の存在下に、以下の群から選択される酵母遺伝子、並びに該酵母遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子よりなる群から選択される遺伝子を含む細胞から発現される、該遺伝子に対応するｍＲＮＡを検出することを特徴とする毒性物質の検出方法に関する。
【０００５】
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OL156W、YOL161C、YOR002W、YOR009W、YOR010C、YOR085W、YOR108W、YOR128C、YOR129C、YOR142W、YOR161C、YOR176W、YOR230W、YOR298W、YPL004C、YPL036W、YPL048W、YPL057C、YPL059W、YPL061W、YPL135W、YPL179W、YPL218W、YPL220W、YPL246C、YPL272C、YPR063C、YPR080W、YPR181C、YBR290W、YCR010C、YCR091W、YDL107W、YDL129W、YDR066C、YDR529C、YFL026W、YGL018C、YGL059W、YNL144C、YOR003W、YAL037W、YAR023C、YBR003W、YBR020W、YBR044C、YBR091C、YBR185C、YBR282W、YCR015C、YCR038C、YCR043C、YDL119C、YDL146W、YDL220C、YDR057W、YDR123C、YDR125C、YDR222W、YDR225W、YDR277C、YDR286C、YDR347W、YDR408C、YDR438W、YDR479C、YDR483W、YEL039C、YEL057C、YEL073C、YER066W、YER076C、YER084W、YER121W、YER189W、YFL017C、YFL046W、YFR006W、YFR008W、YGL115W、YGL208W、YGL214W、YGL218W、YGR021W、YGR023W、YGR024C、YGR064W、YGR076C、YGR096W、YGR108W、YGR174C、YGR182C、YGR236C、YGR288W、YHL042W、YHR195W、YHR210C、YIL006W、YIL012W、YIL028W、YIL050W、YIL057C、YIL089W、YIL102C、YIL113W、YIL122W、YJL100W、YJL169W、YJL199C、YJR039W、YJR050W、YJR101W、YKL003C、YKL016C、YKL061W、YKL093W、YKL121W、YKL160W、YKL170W、YKL194C、YKR034W、YKR067W、YLR006C、YLR016C、YLR030W、YLR036C、YLR112W、YLR125W、YLR128W、YLR204W、YLR211C、YLR233C、YLR257W、YLR288C、YLR326W、YLR334C、YLR395C、YLR408C、YLR414C、YLR444C、YML050W、YML107C、YML120C、YMR031C、YMR053C、YMR073C、YMR162C、YMR204C、YMR206W、YMR284W、YNL010W、YNL025C、YNL127W、YNL139C、YNL217W、YOL116W、YOL118C、YOR053W、YOR100C、YOR103C、YOR122C、YOR150W、YOR187W、YOR251C、YOR312C、YOR327C、YOR348C、YOR352W、YOR388C、YOR394W、YPL001W、YPL033C、YPL066W、YPL148C、YPL230W、YPL275W、YPL276W、YPR005C、YPR014C、YPR192W、YPR194C、YBR005W、YER025W、YFL027C、YGL080W、YGL205W、YHL028W、YHR185C、YIL076W、YJL166W、YLR046C、YMR035W、YMR238W、YMR252C、YNL192W、YNL202W、YOL108C、YOR385W、YPR165W、YAR033W、YBL038W、YBR009C、YBR010W、YBR151W、YCL067C、YCR096C、YDL137W、YDL192W、YDR073W、YDR086C、YDR224C、YDR377W、YDR378C、YER015W、YGL187C、YHR162W、YJL167W、YJL216C、YKR009C、YLR165C、YMR197C、YNL157W、YOL002C、YOL109W、YOR180C、YPL010W、YPL233W、YBR036C、YDR297W、YGR149W、YGR224W、YNL043C、YPL067C、YPL170W、YCR046C、YDR387C、YFL050C、YGL051W、YHR132C、YIL112W、YJL141C、YKR098C、YLR052W、YLR206W、YML129C、YNL203C、YNR014W、YOL043C、YOL096C、YPR184W、YAL028W、YAL055W、YAR062W、YBL095W、YBL102W、YBR122C、YBR157C、YBR161W、YBR251W、YBR298C、YCR039C、YCR083W、YDL018C、YDL067C、YDL078C、YDL091C、YDL215C、YDL216C、YDR022C、YDR067C、YDR079W、YDR181C、YDR186C、YDR196C、YDR262W、YDR306C、YDR319C、YER188W、YGL004C、YGL035C、YGR036C、YGR062C、YGR120C、YGR131W、YGR141W、YGR167W、YGR287C、YHL024W、YHR080C、YHR097C、YIL077C、YJL046W、YJL070C、YJL096W、YJL113W、YJL146W、YJL180C、YJR019C、YJR049C、YKR058W、YLL005C、YLR078C、YLR151C、YLR271W、YLR295C、YLR351C、YLR375W、YMR023C、YMR025W、YMR135C、YMR210W、YMR267W、YMR278W、YMR293C、YNL073W、YNR037C、YNR040W、YNR072W、YOR028C、YOR316C、YOR328W、YOR363C、YPL039W、YPL040C、YPL099C、YPL107W、YPL134C、YPL138C、及びYPL140C。
【０００６】
これらの酵母遺伝子の塩基配列、及び対応するタンパク質のアミノ酸配列は公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されており、インターネットを介して知ることができる。
【０００７】
これらの酵母遺伝子ばかりでなく、これらの酵母遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子も使用できる。ここに「酵母遺伝子に相同性を有する遺伝子」とは酵母遺伝子の塩基配列に５０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子であって、該酵母遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を言う。
【０００８】
本発明で使用する細胞は上記遺伝子を含んでいるものであれば真核細胞、原核細胞のいずれの細胞も使用できる。好ましい細胞は酵母細胞である。
【０００９】
ｍＲＮＡを検出する方法は従来知られており、本発明においてそのいずれをも使用することができる。
【００１０】
本発明の一態様によればｍＲＮＡを検出を逆転写ＰＣＲ法で行なう。逆転写ＰＣＲ法は当業者に周知の技術である（例えば中別府雄作、他：細胞工学別冊 Tipsシリーズ 改定PCR Tips, 秀潤社、1999, pp25-43参照）。例えば、
（１）細胞に被験物質を添加して培養を行ない、
（２）細胞からｍＲＮＡを抽出し、
（３）標識したヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、
（４）該ｃＤＮＡをプローブとして用いて上記の酵母遺伝子とハイブリダイズさせること、
を含む。
【００１１】
細胞の培養条件は通常の培地、温度条件で良い。被験物質である化学物質を添加して更に数時間培養する。この時、被験物質の濃度は細胞が死滅に至らないような濃度を選択する。被験物質中の化学物質は１種または複数種類でも良い。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ｍＲＮＡの抽出は磁気ビーズやラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドと結合させトラップした後に、スピンカラムで洗浄および溶出を行う方法が良く用いられており、市販のキット（例えば、Oligotex-dT30<Super> ｍRNA Purification Kit, Takara）を用いれば簡単である。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase）を用いて逆転写する。逆転写の際に蛍光標識したヌクレオチドを取りこませて標識ｃＤＮＡを得る。逆転写酵素およびＣｙ３−ｄＵＴＰＣｙ５−ｄＵＴＰで蛍光標識したヌクレオチドも既に市販されている（例えばSuper Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014,GibcoBRL）。蛍光標識したｃＤＮＡの検出は、蛍光検出装置を用いることにより行う。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲは、まずＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いてｃＤＮＡに逆転社し、次にこのｃＤＮＡを出発材料として特定のプライマーセットと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、目的のＲＮＡの存在をそのｃＤＮＡの増幅という形で、検出定量化する方法である。
この場合、上記遺伝子を有するマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を準備しておき、ｃＤＮＡとハイブリダイズさせると効率的に検出を行なうことができ、この方法は本発明の好ましい態様である。
【００１３】
本発明の他の態様によればｍＲＮＡを検出をノーザンブロット法を用いて行なう。ノーザンブロット法は当業者に周知の技術である（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック 改定第２版、羊土社、2000, pp299-301）。例えば、
（１）細胞に被験物質を添加して培養を行ない、
（２）細胞からｍＲＮＡを抽出し、
（３）該ｍＲＮＡを上記の遺伝子とハイブリダイズさせること、
を含む。
【００１４】
ノーザンブロット法の手順はＲＮＡを電気泳動して、そのパターンをフィルターに移しとり、アイソト−プで標識した特異的な標識プローブとハイブリダイゼーションをさせることで、標本中のｍＲＮＡの存在と量、およびその長さを解析する。
この場合に、上記遺伝子を有するマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を準備しておき、ｍＲＮＡとハイブリダイズさせると効率的に毒性物質の検出を行なうことができる。
【００１５】
本発明の他の態様によればｍＲＮＡの生成の確認を上記酵母遺伝子によりコードされるポリペプチドの生成の確認によって行なう。該ポリペプチドの生成の確認は例えば該ポリペプチドの抗体を用いて行なうことができる。
【００１６】
本発明の方法により検出することのできる毒性物質には、変異原性物質であるヒ素、カドミウム、水銀、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２,４,５−トリクロロフェノール、γ−ヘキサクロロシクロへキサン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、２,４,５,６−テトラクロロ−１，３−ベンゼンジカルボニトリル、テトラメチルチウラムジスルフィド、エチレンビス（ジチオカルバメート）亜鉛、ジンジャオール、アクロレイン、ジメチルスルホオキシドを含む。
以下に本発明の方法を実施例により説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものでないことは勿論である。
【００１７】
【実施例】
実施例１
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C(α SUC2mal mel gap2 CUP1)）を２５℃で培養した。対数増殖期に以下の細胞に対して毒性を有する化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。化学物質の濃度は酵母の生育を阻害するが死滅には至らないような濃度を選択した。
【００１８】
【００１９】
培養終了後遠心して集菌した。これに酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit,Takara）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014,GibcoBRL）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを取りこませて標識ｃＤＮＡを得た。
この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（10mM Tris・HCl/1mM EDTA, pH8.0）に溶解し、酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ研究所製）に滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。このＤＮＡチップの蛍光強度をスキャナーで読み取り、化学物質を添加しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量として表１〜９に示した。
【００２０】
【表１】
機能未知の酵母遺伝子
【００２１】
【表２】
ミトコンドリアタンパク質遺伝子
【００２２】
【表３】
遺伝子修復系タンパク質遺伝子
【００２３】
【表４】
エネルギー系タンパク質遺伝子
【００２４】
【表５】
トランスポート促進タンパク質遺伝子
【００２５】
【表６】
ストレスタンパク質遺伝子
【００２６】
【表７】
代謝系タンパク質遺伝子
【００２７】
【表８】
脱毒性タンパク質遺伝子
【００２８】
【表９】
その他のカテゴリーに属する遺伝子
【００２９】
機能未知の酵母遺伝子２４００のうち約７００が重金属、農薬、界面活性剤等の毒性を有する化学物質いずれかによりｍＲＮＡの発現が誘導され（表１）、ミトコンドリア局在タンパク質遺伝子１６７（表２）、遺伝子修復系タンパク質遺伝子５２（表３）、エネルギー系タンパク質遺伝子１６１（表４）、トランスポート促進タンパク質遺伝子１４２（表５）、ストレスタンパク質遺伝子９０（表６）、代謝系たんぱく質遺伝子１４２（表７）、脱毒性蛋白質遺伝子６０（表８）、その他のカテゴリーに属する遺伝子５０７（表９）のｍＲＮＡの発現が毒性を有する化学物質のいずれかにより誘導されることが示される。ここで、化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量が２倍以上のものを有意とした。
【配列表フリーテキスト】
配列番号：１は酵母（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子YBL075Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：２は酵母遺伝子YBR008Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：３は酵母遺伝子YCR107Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：４は酵母遺伝子YDL218Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：５は酵母遺伝子YDL243Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：６は酵母遺伝子YFL056Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：７は酵母遺伝子YFL057Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：８は酵母遺伝子YHR139Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：９は酵母遺伝子YKL071Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は酵母遺伝子YLL056Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：１１は酵母遺伝子YLL057Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は酵母遺伝子YMR004Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：１３は酵母遺伝子YNL277Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：１４は酵母遺伝子YPL171Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：１５は酵母遺伝子YPR167Cのヌクレオチド配列である。
【発明の属する技術分野】
本発明は毒性物質を生物学的方法を用いて検出する方法に関し、詳しくは披検物質の存在下に酵母の特定の遺伝子から転写されるｍＲＮＡを測定することにより毒性物質を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境庁により昭和４９年から平成１０年度までの２４年間にわたり毎年行われている化学物質環境追跡調査結果によりば、今まで調査した７７５種類の化学物質のうち、約４０％の物質が環境中に放出されている。一方、わが国において現在、工業的に生産されている化学物質は約５万種類とされ、その生産量、種類数は年々増加している。また、塩素による水処理、焼却処理により非意図的に生成された化学物質が環境を汚染することが知られている。これらの事実から、環境中に蓄積されている化学物質は多数あると予測されるが、これら全てを個々に調査することはきわめて困難である。
従来のバイオアッセイ（：生物材料を用いてその応答性から有害性を評価する手法）は主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としており、環境中の化学物質による毒性の評価はできるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因するかを判断することはできない。国内では亜硝酸生成細菌または硝酸精製細菌の活性により評価する方法（特開平06-123705号公報、特開2000-206087号公報）、鉄バクテリアの活性により評価する方法（特開平11-37969号公報）が提案されており、水質安全モニタ（富士電機）のような製品が販売されている。また、国外では、発光微生物の発光強度により評価する製品（MICROTOX、azur社、アメリカ；LUMIS、drlange社、ドイツ）が市販されている。しかし、これらはいずれも従来型のバイオアッセイ法の延長であり、毒性化学物質に関する詳細な情報は得られない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
わが国の化学物質のリスク管理は、新たな汚染が見出されるたびに化学物質の見直しが行われ、さらに規制と自主規制を組み合わせる体制の整備がすすめられている。しかし、トリハロメタンやダイオキシンに代表されるような有害化学物質の非意図的生成および環境放出など、複雑化、多様化する現状に即座に対応する体制は整っていない。また、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」における毒性評価法である動物実験はコストや時間がかかり国際的に受け入れ難くなっている。このように、管理体制についての問題は常に議論されるが、それを解決する具体的な手段が無いことから課題の解決には至っていない。従って、環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が要望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は毒性物質が存在するとの特定の酵母遺伝子のｍＲＮＡの発現が誘導されることを発見して本発明を完成させた。
即ち、本発明は被検物質の存在下に、以下の群から選択される酵母遺伝子、並びに該酵母遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子よりなる群から選択される遺伝子を含む細胞から発現される、該遺伝子に対応するｍＲＮＡを検出することを特徴とする毒性物質の検出方法に関する。
【０００５】
YBR072W、YCR102C、YCR107W（配列番号：３）、YDL218W（配列番号４）、YDL243C（配列番号：５）、YDR453C、YDR533C、YFL014W、YFL056C（配列番号：６）、YFL057C（配列番号：７）、YGR110W、YJR155W、YKL071W（配列番号：９）、YKR076W、YLL060C、YLR460C、YMR090W、YNL331C、YNL332W、YNL335W、YOL150C、YOL165C、YPL171C（配列番号：１４）、YPR167C（配列番号：１５）、YBL048W、YBL064C、YBL107C、YBR008C（配列番号：２）、YBR173C、YBR256C、YBR296C、YDL021W、YFL022C、YFL024C、YFL061W、YGL121C、YGL158W、YGR043C、YHR029C、YHR112C、YHR139C（配列番号：８）、YHR179W、YHR209W、YIR030C、YJR010W、YJR048W、YKL001C、YKL107W、YKR075C、YKR097W、YLL056C（配列番号：１０）、YLR297W、YLR303W、YML087C、YMR096W、YNL274C、YOL151W、YOR226C、YOR338W、YOR391C、YPL280W、YDR406W、YJL153C、YLR346C、YOR049C、YOR153W、YPL088W、YAL034C、YDL124W、YDL174C、YDR476C、YGL156W、YGR035C、YGR157W、YGR213C、YGR281W、YGR284C、YHL047C、YHR043C、YHR044C、YHR054C、YJR073C、YKL165C、YLR008C、YMR315W、YNL211C、YOL031C、YOL101C、YOR303W、YAL005C、YAR031W、YBL005W-A、YBL022C、YBL041W、YBL049W、YBL075C（配列番号：１）、YBL078C、YBR062C、YBR169C、YBR294W、YCL020W、YCL035C、YCL043C、YCL050C、YCL057W、YCR012W、YCR013C、YCR060W、YDL007W、YDL027C、YDL097C、YDL110C、YDL126C、YDL169C、YDR070C、YDR155C、YDR158W、YDR204W、YDR210W、YDR214W、YDR258C、YDR313C、YDR368W、YDR435C、YER012W、YER037W、YER091C、YER103W、YFL044C、YFR003C、YFR010W、YFR020W、YFR024C、YFR044C、YFR053C、YGL006W、YGL048C、YGL062W、YGL141W、YGL157W、YGL163C、YGL180W、YGL184C、YGR010W、YGR028W、YGR032W、YGR048W、YGR124W、YGR135W、YGR142W、YGR161C、YGR192C、YGR197C、YGR201C、YGR212W、YGR231C、YGR244C、YGR254W、YGR268C、YHL030W、YHR016C、YHR018C、YHR055C、YHR087W、YHR166C、YIL160C、YIR017C、YJL034W、YJL048C、YJL052W、YJL144W、YJL163C、YJR009C、YJR069C、YJR074W、YJR130C、YJR149W、YKL065C、YKL073W、YKL103C、YKL142W、YKL210W、YKL218C、YKR011C、YKR018C、YKR046C、YKR049C、YLL024C、YLL026W、YLR027C、YLR080W、YLR107W、YLR121C、YLR132C、YLR133W、YLR155C、YLR158C、YLR161W、YLR195C、YLR217W、YLR328W、YLR336C、YLR345W、YLR370C、YLR423C、YML004C、YML092C、YML128C、YML130C、YML131W、YMR040W、YMR118C、YMR214W、YMR251W、YMR297W、YMR322C、YNL036W、YNL055C、YNL071W、YNL094W、YNL134C、YNL155W、YNL160W、YNL239W、YNL241C、YOL005C、YOR020C、YOR027W、YOR037W、YOR059C、YOR120W、YOR134W、YOR152C、YOR173W、YOR289W、YOR362C、YPL240C、YPR030W、YAL008W、YAL023C、YAL060W、YAL062W、YAR009C、YBL101C、YBR006W、YBR046C、YBR052C、YBR053C、YBR056W、YBR099C、YBR137W、YBR139W、YBR149W、YBR170C、YBR177C、YBR203W、YBR207W、YBR212W、YBR239C、YBR284W、YBR293W、YCL018W、YCL033C、YCL040W、YCL049C、YCR062W、YCR067C、YCR082W、YDL010W、YDL020C、YDL024C、YDL054C、YDL095W、YDL100C、YDL115C、YDL144C、YDL198C、YDL223C、YDL245C、YDL246C、YDR001C、YDR032C、YDR058C、YDR072C、YDR127W、YDR168W、YDR169C、YDR188W、YDR231C、YDR261C、YDR264C、YDR272W、YDR293C、YDR304C、YDR330W、YDR403W、YDR411C、YDR427W、YDR436W、YDR497C、YDR511W、YDR516C、YDR519W、YDR545W、YEL012W、YEL030W、YER004W、YER009W、YER021W、YER035W、YER053C、YER079W、YER094C、YER096W、YER125W、YER158C、YER163C、YER175C、YER177W、YER178W、YER185W、YFL006W、YFL010C、YFL016C、YFL029C、YFL030W、YFL031W、YFL032W、YFL038C、YFL041W、YFR004W、YFR047C、YFR050C、YFR052W、YGL011C、YGL013C、YGL037C、YGL047W、YGL053W、YGL091C、YGL094C、YGL127C、YGL150C、YGL199C、YGL207W、YGL248W、YGR008C、YGR037C、YGR055W、YGR101W、YGR130C、YGR154C、YGR194C、YGR221C、YGR232W、YGR248W、YGR253C、YGR256W、YHL008C、YHR027C、YHR053C、YHR057C、YHR111W、YHR138C、YHR161C、YHR164C、YHR169W、YHR174W、YHR176W、YHR199C、YIL010W、YIL034C、YIL041W、YIL045W、YIL087C、YIL107C、YIL142W、YIL155C、YIR034C、YIR036C、YIR037W、YIR038C、YIR039C、YJL001W、YJL031C、YJL035C、YJL053W、YJL057C、YJL066C、YJL068C、YJL082W、YJL099W、YJL102W、YJL151C、YJL152W、YJL161W、YJL164C、YJL171C、YJL172W、YJL210W、YJL219W、YJR008W、YJR045C、YJR046W、YJR106W、YJR117W、YJR137C、YKL007W、YKL026C、YKL035W、YKL091C、YKL104C、YKL117W、YKL145W、YKL146W、YKL151C、YKL152C、YKL153W、YKL193C、YKL195W、YKL213C、YKL215C、YLL028W、YLL039C、YLL058W、YLR054C、YLR103C、YLR120C、YLR136C、YLR149C、YLR152C、YLR178C、YLR259C、YLR299W、YLR324W、YLR327C、YLR348C、YLR350W、YLR356W、YLR362W、YLR387C、YLR429W、YML054C、YML070W、YML100W、YML117W、YML125C、YMR004W（配列番号：１２）、YMR008C、YMR009W、YMR020W、YMR067C、YMR089C、YMR097C、YMR102C、YMR105C、YMR107W、YMR152W、YMR180C、YMR184W、YMR191W、YMR219W、YMR271C、YMR275C、YMR295C、YMR314W、YMR316W、YNL006W、YNL007C、YNL012W、YNL044W、YNL045W、YNL074C、YNL092W、YNL093W、YNL104C、YNL115C、YNL156C、YNL231C、YNL234W、YNL237W、YNL281W、YNL305C、YNL333W、YNR010W、YNR019W、YNR033W、YNR059W、YNR068C、YNR069C、YOL032W、YOL036W、YOL047C、YOL071W、YOL082W、YOL083W、YOL117W、YOL119C、YOL126C、YOL131W、YOL153C、YOL162W、YOL163W、YOL164W、YOR019W、YOR035C、YOR036W、YOR099W、YOR117W、YOR124C、YOR130C、YOR132W、YOR157C、YOR185C、YOR197W、YOR259C、YOR261C、YOR273C、YOR288C、YOR332W、YOR336W、YOR347C、YPL017C、YPL087W、YPL106C、YPL109C、YPL149W、YPL154C、YPL196W、YPL206C、YPL222W、YPR023C、YPR024W、YPR026W、YPR067W、YPR103W、YPR108W、YPR151C、YAL012W、YBR029C、YBR222C、YCL009C、YCL027W、YCL064C、YCR098C、YDL222C、YDR055W、YDR077W、YDR502C、YEL001C、YEL042W、YER026C、YER106W、YGR136W、YGR138C、YHR137W、YHR142W、YIL023C、YIL153W、YJL073W、YJR004C、YJR054W、YKL039W、YKL086W、YKL163W、YKR091W、YLR109W、YLR194C、YLR250W、YMR095C、YMR189W、YNL106C、YNL169C、YNL322C、YOR181W、YOR198C、YOR208W、YOR247W、YPL089C、YAL038W、YAL053W、YBR023C、YBR214W、YBR295W、YCR048W、YDL072C、YDL204W、YDR085C、YDR098C、YDR259C、YDR380W、YDR388W、YDR391C、YDR432W、YDR481C、YDR510W、YER069W、YGL022W、YGL126W、YGL209W、YGL255W、YGR189C、YGR282C、YHL035C、YHR030C、YIL022W、YIL024C、YIL117C、YIL123W、YIL140W、YIL154C、YJL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OL156W、YOL161C、YOR002W、YOR009W、YOR010C、YOR085W、YOR108W、YOR128C、YOR129C、YOR142W、YOR161C、YOR176W、YOR230W、YOR298W、YPL004C、YPL036W、YPL048W、YPL057C、YPL059W、YPL061W、YPL135W、YPL179W、YPL218W、YPL220W、YPL246C、YPL272C、YPR063C、YPR080W、YPR181C、YBR290W、YCR010C、YCR091W、YDL107W、YDL129W、YDR066C、YDR529C、YFL026W、YGL018C、YGL059W、YNL144C、YOR003W、YAL037W、YAR023C、YBR003W、YBR020W、YBR044C、YBR091C、YBR185C、YBR282W、YCR015C、YCR038C、YCR043C、YDL119C、YDL146W、YDL220C、YDR057W、YDR123C、YDR125C、YDR222W、YDR225W、YDR277C、YDR286C、YDR347W、YDR408C、YDR438W、YDR479C、YDR483W、YEL039C、YEL057C、YEL073C、YER066W、YER076C、YER084W、YER121W、YER189W、YFL017C、YFL046W、YFR006W、YFR008W、YGL115W、YGL208W、YGL214W、YGL218W、YGR021W、YGR023W、YGR024C、YGR064W、YGR076C、YGR096W、YGR108W、YGR174C、YGR182C、YGR236C、YGR288W、YHL042W、YHR195W、YHR210C、YIL006W、YIL012W、YIL028W、YIL050W、YIL057C、YIL089W、YIL102C、YIL113W、YIL122W、YJL100W、YJL169W、YJL199C、YJR039W、YJR050W、YJR101W、YKL003C、YKL016C、YKL061W、YKL093W、YKL121W、YKL160W、YKL170W、YKL194C、YKR034W、YKR067W、YLR006C、YLR016C、YLR030W、YLR036C、YLR112W、YLR125W、YLR128W、YLR204W、YLR211C、YLR233C、YLR257W、YLR288C、YLR326W、YLR334C、YLR395C、YLR408C、YLR414C、YLR444C、YML050W、YML107C、YML120C、YMR031C、YMR053C、YMR073C、YMR162C、YMR204C、YMR206W、YMR284W、YNL010W、YNL025C、YNL127W、YNL139C、YNL217W、YOL116W、YOL118C、YOR053W、YOR100C、YOR103C、YOR122C、YOR150W、YOR187W、YOR251C、YOR312C、YOR327C、YOR348C、YOR352W、YOR388C、YOR394W、YPL001W、YPL033C、YPL066W、YPL148C、YPL230W、YPL275W、YPL276W、YPR005C、YPR014C、YPR192W、YPR194C、YBR005W、YER025W、YFL027C、YGL080W、YGL205W、YHL028W、YHR185C、YIL076W、YJL166W、YLR046C、YMR035W、YMR238W、YMR252C、YNL192W、YNL202W、YOL108C、YOR385W、YPR165W、YAR033W、YBL038W、YBR009C、YBR010W、YBR151W、YCL067C、YCR096C、YDL137W、YDL192W、YDR073W、YDR086C、YDR224C、YDR377W、YDR378C、YER015W、YGL187C、YHR162W、YJL167W、YJL216C、YKR009C、YLR165C、YMR197C、YNL157W、YOL002C、YOL109W、YOR180C、YPL010W、YPL233W、YBR036C、YDR297W、YGR149W、YGR224W、YNL043C、YPL067C、YPL170W、YCR046C、YDR387C、YFL050C、YGL051W、YHR132C、YIL112W、YJL141C、YKR098C、YLR052W、YLR206W、YML129C、YNL203C、YNR014W、YOL043C、YOL096C、YPR184W、YAL028W、YAL055W、YAR062W、YBL095W、YBL102W、YBR122C、YBR157C、YBR161W、YBR251W、YBR298C、YCR039C、YCR083W、YDL018C、YDL067C、YDL078C、YDL091C、YDL215C、YDL216C、YDR022C、YDR067C、YDR079W、YDR181C、YDR186C、YDR196C、YDR262W、YDR306C、YDR319C、YER188W、YGL004C、YGL035C、YGR036C、YGR062C、YGR120C、YGR131W、YGR141W、YGR167W、YGR287C、YHL024W、YHR080C、YHR097C、YIL077C、YJL046W、YJL070C、YJL096W、YJL113W、YJL146W、YJL180C、YJR019C、YJR049C、YKR058W、YLL005C、YLR078C、YLR151C、YLR271W、YLR295C、YLR351C、YLR375W、YMR023C、YMR025W、YMR135C、YMR210W、YMR267W、YMR278W、YMR293C、YNL073W、YNR037C、YNR040W、YNR072W、YOR028C、YOR316C、YOR328W、YOR363C、YPL039W、YPL040C、YPL099C、YPL107W、YPL134C、YPL138C、及びYPL140C。
【０００６】
これらの酵母遺伝子の塩基配列、及び対応するタンパク質のアミノ酸配列は公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されており、インターネットを介して知ることができる。
【０００７】
これらの酵母遺伝子ばかりでなく、これらの酵母遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子も使用できる。ここに「酵母遺伝子に相同性を有する遺伝子」とは酵母遺伝子の塩基配列に５０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子であって、該酵母遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を言う。
【０００８】
本発明で使用する細胞は上記遺伝子を含んでいるものであれば真核細胞、原核細胞のいずれの細胞も使用できる。好ましい細胞は酵母細胞である。
【０００９】
ｍＲＮＡを検出する方法は従来知られており、本発明においてそのいずれをも使用することができる。
【００１０】
本発明の一態様によればｍＲＮＡを検出を逆転写ＰＣＲ法で行なう。逆転写ＰＣＲ法は当業者に周知の技術である（例えば中別府雄作、他：細胞工学別冊 Tipsシリーズ 改定PCR Tips, 秀潤社、1999, pp25-43参照）。例えば、
（１）細胞に被験物質を添加して培養を行ない、
（２）細胞からｍＲＮＡを抽出し、
（３）標識したヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、
（４）該ｃＤＮＡをプローブとして用いて上記の酵母遺伝子とハイブリダイズさせること、
を含む。
【００１１】
細胞の培養条件は通常の培地、温度条件で良い。被験物質である化学物質を添加して更に数時間培養する。この時、被験物質の濃度は細胞が死滅に至らないような濃度を選択する。被験物質中の化学物質は１種または複数種類でも良い。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ｍＲＮＡの抽出は磁気ビーズやラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドと結合させトラップした後に、スピンカラムで洗浄および溶出を行う方法が良く用いられており、市販のキット（例えば、Oligotex-dT30<Super> ｍRNA Purification Kit, Takara）を用いれば簡単である。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase）を用いて逆転写する。逆転写の際に蛍光標識したヌクレオチドを取りこませて標識ｃＤＮＡを得る。逆転写酵素およびＣｙ３−ｄＵＴＰＣｙ５−ｄＵＴＰで蛍光標識したヌクレオチドも既に市販されている（例えばSuper Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014,GibcoBRL）。蛍光標識したｃＤＮＡの検出は、蛍光検出装置を用いることにより行う。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲは、まずＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いてｃＤＮＡに逆転社し、次にこのｃＤＮＡを出発材料として特定のプライマーセットと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、目的のＲＮＡの存在をそのｃＤＮＡの増幅という形で、検出定量化する方法である。
この場合、上記遺伝子を有するマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を準備しておき、ｃＤＮＡとハイブリダイズさせると効率的に検出を行なうことができ、この方法は本発明の好ましい態様である。
【００１３】
本発明の他の態様によればｍＲＮＡを検出をノーザンブロット法を用いて行なう。ノーザンブロット法は当業者に周知の技術である（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック 改定第２版、羊土社、2000, pp299-301）。例えば、
（１）細胞に被験物質を添加して培養を行ない、
（２）細胞からｍＲＮＡを抽出し、
（３）該ｍＲＮＡを上記の遺伝子とハイブリダイズさせること、
を含む。
【００１４】
ノーザンブロット法の手順はＲＮＡを電気泳動して、そのパターンをフィルターに移しとり、アイソト−プで標識した特異的な標識プローブとハイブリダイゼーションをさせることで、標本中のｍＲＮＡの存在と量、およびその長さを解析する。
この場合に、上記遺伝子を有するマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を準備しておき、ｍＲＮＡとハイブリダイズさせると効率的に毒性物質の検出を行なうことができる。
【００１５】
本発明の他の態様によればｍＲＮＡの生成の確認を上記酵母遺伝子によりコードされるポリペプチドの生成の確認によって行なう。該ポリペプチドの生成の確認は例えば該ポリペプチドの抗体を用いて行なうことができる。
【００１６】
本発明の方法により検出することのできる毒性物質には、変異原性物質であるヒ素、カドミウム、水銀、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２,４,５−トリクロロフェノール、γ−ヘキサクロロシクロへキサン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、２,４,５,６−テトラクロロ−１，３−ベンゼンジカルボニトリル、テトラメチルチウラムジスルフィド、エチレンビス（ジチオカルバメート）亜鉛、ジンジャオール、アクロレイン、ジメチルスルホオキシドを含む。
以下に本発明の方法を実施例により説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものでないことは勿論である。
【００１７】
【実施例】
実施例１
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C(α SUC2mal mel gap2 CUP1)）を２５℃で培養した。対数増殖期に以下の細胞に対して毒性を有する化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。化学物質の濃度は酵母の生育を阻害するが死滅には至らないような濃度を選択した。
【００１８】
培養終了後遠心して集菌した。これに酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit,Takara）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014,GibcoBRL）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを取りこませて標識ｃＤＮＡを得た。
この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（10mM Tris・HCl/1mM EDTA, pH8.0）に溶解し、酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ研究所製）に滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。このＤＮＡチップの蛍光強度をスキャナーで読み取り、化学物質を添加しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量として表１〜９に示した。
【００２０】
【表１】
機能未知の酵母遺伝子
【表２】
ミトコンドリアタンパク質遺伝子
【表３】
遺伝子修復系タンパク質遺伝子
【表４】
エネルギー系タンパク質遺伝子
【表５】
トランスポート促進タンパク質遺伝子
【表６】
ストレスタンパク質遺伝子
【表７】
代謝系タンパク質遺伝子
【表８】
脱毒性タンパク質遺伝子
【表９】
その他のカテゴリーに属する遺伝子
機能未知の酵母遺伝子２４００のうち約７００が重金属、農薬、界面活性剤等の毒性を有する化学物質いずれかによりｍＲＮＡの発現が誘導され（表１）、ミトコンドリア局在タンパク質遺伝子１６７（表２）、遺伝子修復系タンパク質遺伝子５２（表３）、エネルギー系タンパク質遺伝子１６１（表４）、トランスポート促進タンパク質遺伝子１４２（表５）、ストレスタンパク質遺伝子９０（表６）、代謝系たんぱく質遺伝子１４２（表７）、脱毒性蛋白質遺伝子６０（表８）、その他のカテゴリーに属する遺伝子５０７（表９）のｍＲＮＡの発現が毒性を有する化学物質のいずれかにより誘導されることが示される。ここで、化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量が２倍以上のものを有意とした。
【配列表フリーテキスト】
配列番号：１は酵母（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子YBL075Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：２は酵母遺伝子YBR008Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：３は酵母遺伝子YCR107Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：４は酵母遺伝子YDL218Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：５は酵母遺伝子YDL243Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：６は酵母遺伝子YFL056Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：７は酵母遺伝子YFL057Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：８は酵母遺伝子YHR139Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：９は酵母遺伝子YKL071Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は酵母遺伝子YLL056Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：１１は酵母遺伝子YLL057Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は酵母遺伝子YMR004Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：１３は酵母遺伝子YNL277Wのヌクレオチド配列である。
配列番号：１４は酵母遺伝子YPL171Cのヌクレオチド配列である。
配列番号：１５は酵母遺伝子YPR167Cのヌクレオチド配列である。
Claims (8)
- 被験物質の存在下に、YBL075C（配列番号：１）、YBR008C（配列番号：２）、YCR107W（配列番号：３）、YDL218W（配列番号：４）、YDL243C（配列番号：５）、YFL056C（配列番号：６）、YFL057C（配列番号：７）、YHR139C（配列番号：８）、YKL071W（配列番号：９）、YLL056C（配列番号：１０）、YLL057C（配列番号：１１）、YMR004W（配列番号：１２）、YNL277W（配列番号：１３）、YPL171C（配列番号：１４）及びYPR167C（配列番号：１５）の酵母遺伝子を含む酵母から発現される該遺伝子に対応するｍＲＮＡを検出することを特徴とする、被験物質中の2,4,5,6-テトラクロロ-1,3-ベンゼンジカルボニトリルの検出方法。
- ｍＲＮＡの検出を逆転写ＰＣＲ法によって増幅させて行なう請求項１に記載の方法。
- （１）酵母に被験物質を添加して培養を行ない、
（２）酵母からｍＲＮＡを抽出し、
（３）標識したヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、
（４）該ｃＤＮＡをプローブとして用いて請求項１に記載の遺伝子とハイブリダイズさせること、
を含む請求項２に記載の方法。 - 請求項１に記載の遺伝子を固定したマイクロアレイを用いて請求項３の（４）の工程を行なう請求項３に記載の方法。
- ｍＲＮＡの検出をノーザンブロット法を用いて行なう請求項１に記載の方法。
- （１）酵母に被験物質を添加して培養を行ない、
（２）酵母からｍＲＮＡを抽出し、
（３）該ｍＲＮＡを請求項１に記載の遺伝子とハイブリダイズさせること、
を含む請求項１に記載の方法。 - 請求項１に記載の遺伝子を固定したマイクロアレイを用いて請求項６の（３）の工程を行なう請求項６に記載の方法。
- ｍＲＮＡの検出を請求項１に記載の遺伝子によりコードされるポリペプチドの生成の確認によって行なう請求項１に記載の方法。
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