JP4469772B2

JP4469772B2 - コエンザイムｑ１０高負荷細胞の作製方法、コエンザイムｑ１０高負荷細胞増殖添加剤及びコエンザイムｑ１０高負荷培地

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Publication number: JP4469772B2
Application number: JP2005268005A
Authority: JP
Inventors: 恵子高田; 尚友寺田
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2025-09-15
Also published as: WO2007032138A1; JP2007075024A

Description

本発明は、抗酸化剤であるコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法、コエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤、コエンザイムＱ１０高負荷培地及びコエンザイムＱ１０高負荷細胞に関する。

活性酸素は、水や酸素から生成され、不安定な不対電子を有する反応性に富んだ分子であり、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、そして一重項酸素が一般的である。活性酸素は、細胞の酸素呼吸過程にて発生する。また、生体への放射線若しくは紫外線照射又は発ガン物質の代謝過程等においても発生する。過剰な活性酸素は、核酸、タンパク質、脂質等の生体成分の酸化障害を誘引し、その結果、発ガン、動脈硬化、糖尿病等の発症や細胞老化の原因となる。

このように生体に対し傷害を与える原因となる活性酸素だが、人間においては活性酸素による生体内組織や器官の損傷を防ぐ機構が存在する。すなわち、有害な活性酸素を消去する働きをする抗酸化剤を体内に備えている。抗酸化剤としては、コエンザイムＱ１０、ビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオン、α−リポ酸又はカタラーゼ若しくはスーパーオキシドディスムターゼ等の酵素などが知られている。

抗酸化剤の効能を研究するために細胞培養系を用いることができるが、このためには抗酸化剤を細胞へ取り込ませることが必要である。α−リポ酸などの水溶性の抗酸化剤は水溶液として比較的容易に細胞へ取り込ませることができる。また、脂溶性の抗酸化剤であるビタミンＥでも、細胞培養系において添加する溶媒として一般的であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することにより、細胞へ取り込ませることができる（非特許文献１）。

近年、抗酸化剤としてコエンザイムＱ１０が注目されている。コエンザイムＱ１０の生体に対する作用に関する研究成果は目覚しく、コエンザイムＱ１０の抗酸化作用に由来する心筋保護作用、発ガン予防、老化防止作用、血中ＬＤＬ酸化抑制などが報告されている。これらはコエンザイムＱ１０の生体に対する効果に基づく研究成果であるが、細胞培養系による研究はまだ確立されていない。現在のところ、様々な外的ストレスから内部を守る皮膚に対するコエンザイムＱ１０の効果に関する知見は少ない。コエンザイムＱ１０は、前述のビタミンＥと異なり、細胞培養系において添加する溶媒として一般的であるＤＭＳＯに溶解しないため、コエンザイムＱ１０を細胞へ取り込ませることが困難であった。このため、細胞培養系による研究を進展させることができず、皮膚に対するコエンザイムＱ１０の効果に関する知見が少ないことの一因となっていた。
特開２００４−１９８４０９高橋希之、高田恵子、二木鋭雄、ビタミンＥ研究の進歩VIII、ビタミンＥ研究会編、共立出版株式会社ｐ.１２８−１３２（１９９８） Organic solvents : physical properties and methods of purification 3rd ed. By John A. Riddick and William B. Bunger. New York : Wiley-Interscience, c1970.

上述したように、細胞培養系でのコエンザイムＱ１０の抗酸化効果に関する研究を進め、外的ストレスから内部を守る皮膚に対するコエンザイムＱ１０の効果に関する知見を得るためには、コエンザイムＱ１０を細胞へ効率良く取り込ませることが必要である。そこで本発明は、コエンザイムＱ１０を細胞へ取り込ませる方法を提供することを目的とする。

上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、細胞培養系において添加する溶媒として一般的であるＤＭＳＯではなく、特定の特性を有する溶媒を用いることにより、細胞毒性をおこさずにコエンザイムＱ１０を高濃度で細胞へ取り込ませることができることを見出した。このことより、コエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法、コエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤、コエンザイムＱ１０高負荷培地及びコエンザイムＱ１０高負荷細胞からなる本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、以下の通りである。

本発明の請求項１は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させる吸着工程と、前記吸着工程でコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含む培地中で細胞を培養する培養工程とを備えたことを特徴とするコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法である。

本発明の請求項２は、前記溶媒が１，４−ジオキサン又はエタノールのいずれか１であることを特徴とする請求項１記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法である。

本発明の請求項３は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させたことを特徴とするコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤である。

本発明の請求項４は、前記溶媒が１，４−ジオキサン又はエタノールのいずれか１であることを特徴とする請求項３記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤である。

本発明の請求項５は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含むことを特徴とするコエンザイムＱ１０高負荷培地である。

本発明の請求項６は、前記溶媒が１，４−ジオキサン又はエタノールのいずれか１であることを特徴とする請求項５記載のコエンザイムＱ１０高負荷培地である。

本発明の請求項１記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法によれば、コエンザイムＱ１０を細胞へ高濃度で取り込ませることができる。

本発明の請求項２記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法によれば、本発明の請求項１記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法において、コエンザイムＱ１０を細胞へより高濃度で取り込ませることができる。

本発明の請求項３記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤によれば、コエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤へ高割合で吸着できる。

本発明の請求項４記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤によれば、本発明の請求項３記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤において、コエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤へより高割合で吸着できる。

本発明の請求項５記載のコエンザイムＱ１０高負荷培地によれば、コエンザイムＱ１０を細胞へ高濃度で取り込ませるための培地を提供することができる。

本発明の請求項６記載のコエンザイムＱ１０高負荷培地によれば、本発明の請求項５記載のコエンザイムＱ１０高負荷培地において、コエンザイムＱ１０を細胞へより高濃度で取り込ませるための培地を提供することができる。

コエンザイムＱ１０は、ベンゾキノン誘導体であり、広く生物界に存在する。コエンザイムＱ１０は、ミトコンドリアの電子伝達系の必須因子として、また、抗酸化剤として、生体内で重要な物質である。コエンザイムＱ１０には酸化型と還元型が存在する。還元型のコエンザイムＱ１０は酸化を受けやすい性質を有するため、活性酸素に水素を与え、無害な水などに変換する働きがある。そのため、細胞内では還元型コエンザイムＱ１０が抗酸化剤としての効果がある。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

本発明はコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法に関する。本発明のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤は、コエンザイムＱ１０が高割合で吸着した細胞増殖添加剤である。本発明のコエンザイムＱ１０高負荷培地は、コエンザイムＱ１０が高濃度で溶解した培地である。また、本発明のコエンザイムＱ１０高負荷細胞は、コエンザイムＱ１０が高濃度で細胞内へ取り込まれた細胞である。

本発明者は、コエンザイムＱ１０を溶解させる溶媒について検討を進めた結果、特定の特性を有する溶媒を用いることにより、コエンザイムＱ１０を溶媒に溶解させて、細胞毒性をおこさずにコエンザイムＱ１０を高濃度で細胞へ取り込ませることができることを見出した。

本発明のコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させる吸着工程と、前記吸着工程でコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含む培地中で細胞を培養する培養工程とを備えたことを特徴とする。

細胞は、コエンザイムＱ１０を取り込ませることができる細胞であれば特に限定はされない。具体的な細胞の例として、表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、メラノサイト、小腸上皮細胞、肺線維芽細胞などの接着依存性細胞、リンパ球細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、及びある細胞と他の細胞との細胞融合によって得られたハイブリドーマ等の動物細胞である。

細胞を取り込ませるために、まずコエンザイムＱ１０を溶媒に溶解させる。溶媒としては、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒を用いる。

本発明者は、コエンザイムＱ１０は比誘電率が高い溶媒には溶けにくく、低い溶媒ほど溶けやすいことが見出した。そのため、コエンザイムＱ１０を溶解させる溶媒の比誘電率は３０以下、のぞましくは２０以下、さらにのぞましくは１０以下が良い。コエンザイムＱ１０が高濃度に溶解する溶媒のうち、比誘電率２０〜３０の溶媒の例としては、アセトン、エタノール、比誘電率１０〜２０の溶媒の例としては、２−プロパノールが挙げられる。コエンザイムＱ１０が溶けやすい、比誘電率が０より大きくて１０以下の溶媒として、１，４−ジオキサン、１,２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、イソペンタン、ヘキサン、ジエチルエーテルなどが挙げられる。ＤＭＳＯ、エチレングリコール、アセトニトリル、プロピレングリコールなど比誘電率が３０以上のものにはコエンザイムＱ１０は溶けにくく、コエンザイムＱ１０高濃度溶液を細胞増殖添加剤に溶かす本発明には適当でない。

本発明の「水溶性」は、水に溶けて水溶液をつくる性質を有することをいう。例えば、水と有機溶媒とが目的の割合で混和するとき、その有機溶媒は「水溶性」である。発明で用いる溶媒は、コエンザイムＱ１０高濃度溶液の水への溶解性が高い必要がある。つまり、発明で用いる溶媒は、水溶性である必要がある。これは、コエンザイムＱ１０を高濃度で溶解させた溶液を細胞増殖添加剤又は培養液に溶解させる必要があるからである。上記コエンザイムＱ１０が高濃度に溶解する溶媒のうち、イソペンタン、ヘキサン、ジエチルエーテル以外の溶媒は水への溶解性が高いため、本発明に適している。

本発明の「揮発性」は、室温付近（例えば、約１０〜３０℃程度）で当該溶媒が揮発（気化）するかどうかを示す性質である。本発明の「揮発性が低い（又は低揮発性）」とは、室温付近で当該溶媒が揮発しない溶媒を指す。本発明の「揮発性が高い（又は高揮発性）」は、室温付近で当該溶媒が揮発する溶媒を指す。揮発性が高い溶媒は、溶媒が揮発するために実験における正確な定量及び細胞増殖添加剤への添加が困難となる。そのため、本発明では揮発性が低い溶媒が適している。上記コエンザイムＱ１０が高濃度に溶解する溶媒のうち、例えば、１，４−ジオキサン又はエタノールは揮発性が低いため、実験において正確にハンドリングできる。

１，４−ジオキサンは、コエンザイムＱ１０の溶解性が高い、コエンザイムＱ１０高濃度溶液の水への溶解性が高い、揮発性が低い及び細胞毒性を生じないという理由から特に好ましく、後述する本発明の実施例で溶媒として用いられている。

吸着工程で、溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させる。コエンザイムＱ１０は細胞増殖添加剤と混和し攪拌することにより、吸着させることができる。細胞増殖添加剤は、細胞の増殖を促す物質をいう。細胞増殖剤として、血清、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）等が挙げられる。血清は、細胞培養に使用される血清であれば制限なく使用でき、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ胎児血清、ヒト胎児血清等が例示される。後述する本発明の実施例では、ＦＢＳを用いた。

次の培養工程で、前記吸着工程で得られた細胞増殖添加剤を含む培地中で細胞を培養する。コエンザイムＱ１０が吸着された細胞増殖添加剤を培地へ添加して、その培地中で細胞を培養した。細胞の培養方法は、前記培地を用いて、細胞を培養することからなる。その他の培養条件としては、特に制限されず、従来の培養条件を適用できる。本発明における細胞増殖添加剤の培地への添加量は、対象細胞種により適宜調整すればよい。

培地は、培養する細胞に適したものであれば特に限定されず、市販の基本培地であっても、また、これらを適宜改変したものであってもよい。具体的な基本培地の例として、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍＦ１２等が挙げられる。後述する本発明の実施例では、ＤＭＥＭ培地を用いた。

上記培養工程を経ることにより、コエンザイムＱ１０を細胞へ取り込ませることができる。

本発明のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させたことを特徴とする。上記のようにして、溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させることができる。

本発明のコエンザイムＱ１０高負荷培地は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含むことを特徴とする。上記のようにして、溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させた後、その細胞増殖添加剤を培地に添加することにより、本発明のコエンザイムＱ１０高負荷培地を作製できる。

本発明のコエンザイムＱ１０高負荷細胞は、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含む培地中で培養することにより得られたことを特徴とする。上記のようにして、溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させた後、その細胞増殖添加剤を培地に添加し、その培地中で細胞を培養することにより、コエンザイムＱ１０高負荷細胞を作製できる。

以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

［実験１コエンザイムＱ１０を溶解させる溶媒の検討］
コエンザイムＱ１０をイソペンタン、ヘキサン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２−プロパノール、アセトン、エタノール、プロピレングリコール、アセトニトリル、エチレングリコール、ＤＭＳＯに各々添加して、その溶解性を比較した。また、各々の溶媒の水への溶解性及び溶媒の揮発性を比較した。下記の表１にその結果を示す。表１では、（非特許文献２）に記載されている各々の溶媒の比誘電率も併せて示す。

［実験１の結果］
表１より、比誘電率が低い溶媒（比誘電率が３０以下の溶媒）は、コエンザイムＱ１０の溶解性が高いことが示された。イソペンタン、ヘキサン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２−プロパノール、アセトン、エタノールはコエンザイムＱ１０の溶解性が高かった。前記比誘電率が低い溶媒の中で、イソペンタン、ヘキサン、ジエチルエーテル以外の溶媒の水への溶解性は高かったため、本発明のコエンザイムＱ１０を細胞へ取り込ませる方法における溶媒として適していると考えられた。また、前記比誘電率が低い溶媒の中でイソペンタン、ジエチルエーテル、アセトン以外は揮発性が低いため、正確な定量ができて、実験操作に不便がない。そのため、それらは、本発明のコエンザイムＱ１０を細胞へ取り込ませる方法における溶媒として適していると考えられた。このことより、比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒が本発明の溶媒として適していることが示された。コエンザイムＱ１０の溶解性が高く、溶媒の水への溶解性が高く、揮発性が低い溶媒として、１，４−ジオキサンが特に好ましいと考えられた。

［実験２コエンザイムＱ１０の細胞への取り込み］
所定の濃度のコエンザイムＱ１０を１，４−ジオキサンに溶解させた。この１，４−ジオキサン溶液をＦＢＳに添加して、３７℃にて一晩中転倒混和させ、コエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤を得た。このコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤をＤＭＥＭに１０％添加し、培地中でのコエンザイムＱ１０濃度が２５μＭとなるコエンザイムＱ１０高負荷培地（以下、ＣｏＱ１０（＋）培地と称する）を作製した。ＣｏＱ１０（＋）培地を用いてヒト表皮（ＨａＣａＴ）細胞を培養して、コエンザイムＱ１０高負荷細胞を作製した（以下、この細胞をＣｏＱ１０（＋）細胞と称する）。

同時に、対照として、コエンザイムＱ１０を溶解させていない１，４−ジオキサンのみを、上記コエンザイムＱ１０溶液と同量、ＦＢＳに添加し、上記工程に従って、コントロール細胞（以下、この細胞をＣｏＱ１０（−）細胞と称する）を作製した。また、ＣｏＱ１０（−）細胞を培養した培地を以下ＣｏＱ１０（−）培地と称する。

［実験３ＣｏＱ１０（＋）細胞の抗酸化効果］
過酸化水素、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）という３種類の酸化ストレスについて、実験２で得たＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞の抗酸化効果を調べた。

（１）過酸化水素に対する抗酸化効果
ＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞を、１，４−ジオキサンやコエンザイムＱ１０を含まないＦＢＳ（以下、通常のＦＢＳと称する）を１０％含むＤＭＥＭにてそれぞれ８×１０⁴細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種した。細胞接着後、無血清培地に置換、一晩放置し細胞外の血清を完全に除去した。過酸化水素を所定量添加した培地に置換し２、４時間後、それぞれの細胞生存率を測定、比較した（図１）。

（２）ＡＡＰＨに対する抗酸化効果
ＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞を、通常のＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭにてそれぞれ１×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種した。細胞接着後、低血清培地に置換、一晩放置した。ＡＡＰＨを所定量添加した培地に置換し３時間後、それぞれの細胞生存率を測定、比較した（図２）。

また同時に、コエンザイムＱ１０をＣｏＱ１０（−）細胞に直接添加することによる抗酸化効果を調べた。ＣｏＱ１０（−）細胞を、通常のＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭにて１×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種した。細胞接着後、所定量のコエンザイムＱ１０を含有した低血清培地に置換し一晩放置した。翌日ＡＡＰＨを５０ｍＭ添加した無血清培地（又はコントロールとしてＡＡＰＨを添加していない無血清培地）に置換し３．５時間後、それぞれの細胞生存率を測定、比較した（図３）。

（３）ｔ−ＢｕＯＯＨに対する抗酸化効果
ＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞を、通常のＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭにてそれぞれ１×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種した。細胞接着後、低血清培地に置換、一晩放置した。ｔ−ＢｕＯＯＨを所定量添加した培地に置換し３時間後、それぞれの細胞生存率を測定、比較した（図４）。

（４）α−リポ酸との組合せによるＡＡＰＨに対する抗酸化効果
ＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞を、通常のＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭにてそれぞれ８×１０⁴細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種した。細胞接着後、低血清培地で洗浄・放置した。次にα−リポ酸を所定量添加した培地に置換し、６時間後ＡＡＰＨを２５ｍＭ添加した培地に置換した。１８時間後それぞれの細胞生存率を測定、比較した（図５）。

［実験３の結果］
図１より、酸化ストレスである過酸化水素で処理したところ、ＣｏＱ１０（−）細胞に比べて、ＣｏＱ１０（＋）細胞は生存率が有意に高かった。このことより、ＣｏＱ１０（＋）細胞は過酸化水素による傷害を抑制することが明らかとなった。また、この抗酸化効果は、過酸化水素を所定量添加した培地に置換した２時間後（図１（Ａ））、４時間後（図１（Ｂ））ともに見られた。

図２より、酸化ストレスであるＡＡＰＨで処理したところ、ＣｏＱ１０（−）細胞に比べて、ＣｏＱ１０（＋）細胞は生存率が有意に高かった（図２）。このことより、ＣｏＱ１０（＋）細胞はＡＡＰＨによる傷害を抑制することが明らかとなった。一方、図３より、培地にコエンザイムＱ１０を直接添加した細胞（ＡＡＰＨ５０ｍＭ、コエンザイムＱ１０２５μＭ）は、コントロール（ＡＡＰＨ５０ｍＭ、コエンザイムＱ１０無配合）群と生存率に大きな差はなく、図２の同条件（ＡＡＰＨ５０ｍＭ、コエンザイムＱ１０２５μＭ）のＣｏＱ１０（−）細胞がＣｏＱ１０（−）細胞より細胞死を有意に抑制したような結果は得られなかった。このことより、コエンザイムＱ１０は直接添加しただけでは細胞に取り込まれず、本発明の方法に従うことにより細胞に取り込まれ抗酸化効果を発揮することが示された。

図４より、酸化ストレスであるｔ−ＢｕＯＯＨで処理したところ、ＣｏＱ１０（−）細胞に比べて、ＣｏＱ１０（＋）細胞は生存率が有意に高かった。このことより、ＣｏＱ１０（＋）細胞はｔ−ＢｕＯＯＨによる傷害を抑制することが明らかとなった。

図５より、ＣｏＱ１０（＋）細胞は、他の抗酸化剤であるα―リポ酸を加えることにより、抗酸化効果に対して相加効果を示した。

これらの結果より、ＣｏＱ１０（＋）細胞は三種類の酸化ストレスに対して抗酸化効果を示すことが明らかとなった。

［実験４ＣｏＱ１０（＋）細胞内のコエンザイムＱ１０の定量］
実験２で得たＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞のそれぞれに対するコエンザイムＱ１０の細胞内への取り込み量を定量した。コエンザイムＱ１０の細胞内への取り込み量を定量するために、（特許文献１）で開示されたコエンザイムＱ１０の分析方法に従った。この方法によれば、細胞内の酸化型及び還元型コエンザイムＱ１０を正確に定量できる。図６に細胞内の還元型コエンザイムＱ１０の定量の結果を示す。

以下、実験手順を述べる。まず、通常のＦＢＳを１０％含有したＤＭＥＭ培地で培養したＨａＣａＴ細胞の培地へ１，４−ジオキサン又はコエンザイムＱ１０（終濃度：２５０μＭ）を添加し培養後、トリプシンで細胞を回収し、１．５×１０⁶細胞をイソプロパノールで懸濁し高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて還元型コエンザイムＱ１０量を測定した（それぞれの還元型コエンザイムＱ１０量を、図６のDMEM+10%FBS+ジオキサン、DMEM+10%FBS+CoQ10で表す）。

また、実験２に従って得たＣｏＱ１０（＋）細胞及びＣｏＱ１０（−）細胞を、それぞれ上記のように回収し、ＨＰＬＣにて定量した（それぞれの還元型コエンザイムＱ１０量を、図６のDMEM+10%FBS(CoQ10+)、DMEM+10%FBS(CoQ10-)で表す）。さらに、ＣｏＱ１０（＋）培地と同様の方法で、その半分の濃度のコエンザイムＱ１０を含有させた培地も作製し、同様に培養して細胞を回収した（還元型コエンザイムＱ１０量を、図６のDMEM+10%FBS(CoQ10 1/2+)で表す）。

［実験４の結果］
図６より、ＣｏＱ１０（−）細胞及び１，４−ジオキサンを添加しただけ培地で培養した対照細胞に比べて、ＣｏＱ１０（＋）細胞は多くの還元型コエンザイムＱ１０が存在した。また、半分の濃度のコエンザイムＱ１０を含有させた培地で培養した細胞は、ＣｏＱ１０（＋）細胞の約６０％程度の還元型コエンザイムＱ１０を有していた。このことより、還元型コエンザイムＱ１０が細胞内に取り込まれたことが確認できた。さらに、コエンザイムＱ１０を直接添加した培地で培養した細胞に比べて、ＣｏＱ１０（＋）細胞には約２．５倍の還元型コエンザイムＱ１０が存在した。これより、コエンザイムＱ１０は溶解してＦＢＳに吸着することにより、細胞に取り込まれることが確認できた。前述のように、還元型コエンザイムＱ１０は酸化を受けやすい性質を有するため、活性酸素に水素を与え、無害な水などに変換する働きがある。実験３のＣｏＱ１０（＋）細胞の抗酸化効果は、細胞内に取り込まれた還元型コエンザイムＱ１０の作用によるものであると考えられる。

過酸化水素に対するコエンザイムＱ１０の抗酸化効果を示した図である。（Ａ）は過酸化水素を所定量添加した培地に置換した２時間後、（Ｂ）は過酸化水素を所定量添加した培地に置換した４時間後のコエンザイムＱ１０の抗酸化効果を示した図である。ＡＡＰＨに対するコエンザイムＱ１０の抗酸化効果を示した図である。培地にコエンザイムＱ１０を直接添加したときのＡＡＰＨに対するコエンザイムＱ１０の抗酸化効果を示した図である。ｔ−ＢｕＯＯＨに対するコエンザイムＱ１０の抗酸化効果を示した図である。 α−リポ酸との組み合わせによるＣｏＱ１０（＋）細胞のＡＡＰＨに対する抗酸化効果を示した図である。細胞内のコエンザイムＱ１０の定量の結果を示した図である。

Claims

比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を細胞増殖添加剤に吸着させる吸着工程と、前記吸着工程でコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含む培地中で細胞を培養する培養工程とを備えたことを特徴とするコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法。
前記溶媒が１，４−ジオキサン又はエタノールのいずれか１であることを特徴とする請求項１記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞の作製方法。
比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させたことを特徴とするコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤。
前記溶媒が１，４−ジオキサン又はエタノールのいずれか１であることを特徴とする請求項３記載のコエンザイムＱ１０高負荷細胞増殖添加剤。
比誘電率３０以下の水溶性低揮発性溶媒に溶解したコエンザイムＱ１０を吸着させた細胞増殖添加剤を含むことを特徴とするコエンザイムＱ１０高負荷培地。
前記溶媒が１，４−ジオキサン又はエタノールのいずれか１であることを特徴とする請求項５記載のコエンザイムＱ１０高負荷培地。