JP4468592B2 - 3,3'-diketotrehalose - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規トレハロース誘導体、その製造方法、ならびに本発明のトレハロース誘導体を含むトレハラーゼ阻害剤および凍結乾燥安定剤に関する。
背景技術
トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル α−Ｄ−グルコピラノシド）は２分子のＤ−グルコースが１，１結合した形の非還元性二糖類である。３種の異性体が存在するが、天然にはα，α体のみが存在し多くの有機体に広く分布する。昆虫では血リンパ中に存在しており、主要血糖として存在するだけでなく、不凍剤として耐寒性を保持する作用を有する。
トレハラーゼはトレハロースに特異的な酵素であり、トレハロースを２分子のグルコースに加水分解する。トレハラーゼはバクテリア、酵母、菌類、昆虫、哺乳類を含む動物界と植物界に広く分布する。
哺乳類における小腸のトレハラーゼは、小腸の上皮細胞に局在し、摂取されたトレハロースの加水分解を行う機能をもつ。しかし血液中にはトレハロースが存在しないため、腎臓のトレハラーゼの生理学的機能はまだ解明されていない。
これまで、豚の腎臓由来トレハラーゼに関して、種々のトレハロース誘導体に対する親和性が報告されている（図１、２）。α，α−トレハロースはトレハラーゼの基質となるが、その異性体であるβ，β−トレハロース、α，β−トレハロースは親和性を全く持たない。また、α，Ｄ−マンノピラノシルα，Ｄ−マンノピラノシドとα，Ｄ−グルコピラノシルα，Ｄ−マンノピラノシドのように、基質の水酸基のわずかの変化のみでその親和性は大きく変化する。トレハラーゼの種々の特性については、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０，６９２−６９８，１９９６：Ｂｉｏｃｈｉｍｉ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２４４，２９１−２９４，１９９５：Ｂｉｏｃｈｉｍｉ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７９１，４５−４９，１９８４を参照されたい。
多くの昆虫ではトレハロースは血リンパに存在し主要血糖である。また、酵母、菌類では主要な貯蔵糖である。昆虫、酵母、菌類に存在するトレハラーゼは、グルコースをそれぞれの器官に供給する作用を有する調節酵素であると考えられる。したがって、トレハラーゼ阻害剤は殺菌剤または殺虫剤として有用であることが期待される。
これまでに報告されているトレハラーゼ阻害剤としては、例えば、Ｓ−ＧＩ（ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、トレハロスタチン（ｔｒｅｈａｌｏｓｔａｔｉｎ）、バリダマイシンＡ（ｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎ Ａ）、バリドキシルアミンＡ（ｖａｌｉｄｏｘｙｌａｍｉｎｅ Ａ）、ＭＤＬ２５６３７、カスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、トレハゾリン（ｔｒｅｈａｚｏｌｉｎ）、スーダトレスチン（ｓｕｉｄａｔｒｅｓｔｉｎ）が挙げられる（図３）。これらのうち、バリドキシルアミンＡ、トレハゾリン、スーダトレスチンは、阻害定数Ｋｉ値がそれぞれ２．４×１０−９Ｍ、１．９×１０−８Ｍ、５．０×１０−８Ｍであり、強いトレハラーゼ阻害剤であることが報告されている。また、トレハゾリンとスーダトレスチンは、トレハラーゼ以外の他のグルコシダーゼに対しては阻害を示さないため、トレハラーゼに特異的な阻害剤である。実際、バリダマイシンＡは既に植物病原菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉによるイネの葉鞘の害に対して殺菌剤として用いられている。また、バリドキシルアミンＡはタバコの害虫に対し、殺虫効果を持つと考えられている。
種々のトレハラーゼ阻害剤については、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ１２０，６３９−６４６，１９９８：Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１６（２），８２１−８２６，１９９５：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（３），８９５−８９７，１９９１：Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４４（１０），１１６５−１１６８，１９９１：Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４０（４），５６３−５６５，１９８７：Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６１Ｂ，１１１−１１４，１９７８を参照されたい。
トレハロースはまた、蛋白質を凍結乾燥する際、蛋白質を保護する能力を持つことが知られており、酵素、膜、ワクチン、動物や植物の細胞や器官など生体分子の低温保護剤として用いられている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，２：２９３−３１４，１９９６）。例えば、トレハロースを凍結乾燥保護剤として用いたとき、グルコース脱水素酵素の凍結乾燥時の安定性が大幅に高まることが見いだされている。しかし、トレハロースは血液中に存在するトレハラーゼにより加水分解されてグルコースを生じること、およびＧ３ＤＨの基質となるため、グルコースアッセイ用酵素および１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール分析用酵素の凍結乾燥安定剤として用いることはできなかった。
したがって、本発明は、トレハラーゼ阻害剤および蛋白質凍結乾燥安定剤として有用な新規トレハロース誘導体を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、次式：
発明を実施するための最良の形態
本発明の３，３’−ジケトトレハロースは、グルコース３−脱水素酵素を用いてトレハロースを酸化することにより容易に合成することができる。化学的に合成することも可能であるが、糖類は多数の水酸基を有しているため、特定部位を修飾するためには多段階の反応を必要とする。
グルコース３−脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ３−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ３ＤＨ）は糖類のＣ−３位の水酸基を特異的に脱水素化し、３−ケト糖を生成する酵素である。Ｇ３ＤＨはこれまでに４種類（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｍ由来Ｇ３ＤＨ）が報告されている。
Ｇ３ＤＨは、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２６９−２７４，１９９８に記載の方法を用いて調製することができる。簡単には、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株（Ｄｅｌｅｙａ ｓｐ．α−１５株）を常法にしたがって培養し、回収した菌体を破壊して水溶性画分を得る。これを透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の方法により精製する。
本発明の３，３’−ジケトトレハロースは、Ｇ３ＤＨ酵素電極法を用いてトレハロースを酸化することにより製造することができる。酵素電極法の原理を図４に示す。電極用のセルを遮光し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にトレハロース、Ｇ３ＤＨ、および電子メディエーターを加える。電子メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。対極白金、作用極白金メッシュ、参照極Ａｇ／ＡｇＣｌを用いて３７０ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの定電位電解を行う。薄層クロマトグラフィーにより反応をモニターし、トレハロースのスポットの経時変化を観察する。反応終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて、反応生成物を精製することができる。
あるいは、例えばフェリシアン化カリウムを１００ｍＭ以上の濃度で用いることにより、電極を使わずに酵素反応を進行させることもできる。
本発明はまた、本発明の３，３’−ジケトトレハロースを含むトレハラーゼ阻害剤を特徴とする。本発明の３，３’−ジケトトレハロースは、阻害定数Ｋｉ＝２．４２×１０−６Ｍという、高いトレハラーゼ阻害活性を有することが見いだされた。したがって、本発明のトレハラーゼ阻害剤は、トレハロースおよびトレハラーゼの作用を解明する研究用試薬として、および殺菌剤または殺虫剤として有用である。
さらに本発明は、３，３’−ジケトトレハロースを含む蛋白質凍結乾燥安定化剤を特徴とする。特に、酵素を凍結乾燥する際に本発明のトレハロース誘導体を添加することにより、酵素解凍後に高い残存酵素活性を得ることができる。さらに、本発明のトレハロース誘導体は血中に存在するトレハラーゼにより分解されてグルコースを生成しないため、グルコースアッセイ用のＧＯＤ、ＧＤＨ等の酵素の凍結乾燥安定化剤として非常に有用である。
なお、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願平成１１−０７３５６８号の明細書に記載の全内容を、本明細書の一部としてここに引用する。
以下に実施例により本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
Ｇ３ＤＨの調製
Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．α−１５株を、１リットルあたり１０ｇポリペプトン、１ｇ酵母抽出物、３０ｇＮａＣｌ、２ｇＫ２ＨＰＯ４、１０ｇα−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する培地（ｐＨ７．０）中で、３０℃にて２４時間好気培養した。回収した菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に懸濁して、フレンチプレスで菌体を破砕した。超遠心分離により上清を分離し（４００００ｒｐｍ、１．５ｈ）、氷冷しながら硫酸アンモニウムを２４３ｇ／ｌの割合で加えて塩析した。遠心分離により上清を分離し（１００００ｇ、２０分）、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で一晩透析して、粗精製Ｇ３ＤＨを得た。この粗精製Ｇ３ＤＨに対し、高速液体クロマトグラフィー（８０２０シリーズ：東ソー（株））で疎水クロマトグラフィーを行うことによりＧ３ＤＨを精製した。
酵素活性の測定は常法に従い、１分間に１μｍｏｌのグルコースが酸化される酵素量を１単位（Ｕ）とした。
実施例２
酵素電極法を用いたトレハロースの酸化
電極用のセルを遮光し、トレハロース（林原（株）；０．１０３ｇ：終濃度２０ｍＭ）、実施例１で得たα−１５由来Ｇ３ＤＨ（１０Ｕ）および電子メディエーターとしてフェリシアン化カリウム（終濃度１００ｍＭ）を入れ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で全量を１５ｍｌとした。ウォーターバスを使用して反応温度を２６℃に保ち、対極白金、作用極白金メッシュ、参照極Ａｇ／ＡｇＣｌを用いて３７０ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの定電位電解を行った。経時変化を観察するため、２時間毎に２００μｌずつサンプリングし、そのサンプルをそれぞれ乾燥、メタノールに溶解し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，５分）により不溶性物質を除去した。同様にもう一度メタノール抽出を行い、残存蛋白質を完全に除去した。得られたサンプルを乾燥してメタノールを除去し、蒸留水に再溶解し、得られたサンプルを薄層クロマトグラフィーにより観察した。展開溶媒としてアセトニトリル：水＝７：３の割合の混合液を用いた。
薄層クロマトグラフィーの結果、トレハロースのスポット（Ｒｆ＝０．４５）は時間とともに薄くなってゆき、Ｒｆ＝０．５７の位置にスポットが現れた。電極反応によって約１２時間でトレハロース誘導体が合成できた。
実施例３
反応生成物の精製
電極反応後の反応溶液をナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮、乾燥後メタノールに溶解した。不溶解物を吸引濾過し、得られたろ液を再度濃縮、乾燥後蒸留水に溶解、シリカゲルをつめたオープンカラムで未反応トレハロースと生成物を分離した。溶離液にはアセトニトリル：水＝７：３を用いた。こうして分離した溶液を濃縮、乾燥後蒸留水に溶解、アンバーライト（陽イオン交換樹脂）をつめたオープンカラムにより反応溶液中に存在する陽イオンを吸着除去した。溶離液としては水を用いた。溶出した水溶液をさらに濃縮、乾燥後蒸留水に溶解し、アンバーライト（陰イオン交換樹脂）をつめたカラムにより反応溶液中に含まれる陰イオンを吸着除去した。溶離液としては水を用いた。溶出した水溶液を濃縮、乾燥し、反応生成物を回収した。
実施例４
１３Ｃ ＮＭＲによる反応生成物の解析
実施例３で得た反応生成物を重水（Ｄ２Ｏ）に溶解し、１３Ｃ ＮＭＲにより構造解析した。比較としてトレハロースも同様に行った。
精製後のサンプルを１３Ｃ ＮＭＲで構造解析した結果、図５に示される結果が得られた。これをトレハロースおよび３−ケトトレハロースと比較した（図６）。反応生成物のピークをトレハロースのピークの位置と比較すると、生成物のピークのうちＣ−３のピークが低磁場シフトしていた。このシフトは３−ケトトレハロースのＣ−３と同じである。このことから、この反応生成物は２分子のグルコース残基の両方の３位にケト基が入った、３，３’−ジケトトレハロースであることが明らかとなった。
実施例５
酸加水分解による反応生成物の解析
精製した反応生成物を水２００μｌに溶解し、４Ｎ硫酸２００μｌ（終濃度２Ｎ）を加え、９９℃で５時間熱処理を行い、加水分解した。得られた溶液のｐＨをｐＨ試験紙で確認しながら、中性になるまで１０Ｎ ＮａＯＨを少量ずつ加えた。こうして得られたサンプルを薄層クロマトグラフィーで確認した。展開溶媒としてアセトニトリル：水＝６：４を用いた。比較としてトレハロースも同様に加水分解し確認した。
薄層クロマトグラフィーの結果を図７に示す。加水分解によりトレハロースからは２分子のグルコースが生成する。これに対し、反応生成物からはグルコースが生成しなかった。もし、反応生成物がトレハロースの２分子のグルコース残基のうちの１つのＣ−３位にケト基が入た３−ケトトレハロースであるなら、加水分解後グルコースと同じ位置にもスポットが現れるはずである。したがって、反応生成物はトレハロースの２分子のグルコース残基の両方のＣ−３位にケト基が入った、３，３’−ジケトトレハロースであることが明らかとなった。
実施例６
３，３’−ジケトトレハロースに対するトレハラーゼの作用
トレハロース、３，３’−ジケトトレハロースをそれぞれ１７ｍｇ（終濃度５０ｍＭ）量り取り、豚の腎臓由来トレハラーゼ（ＳＩＧＭＡ）３００μｌ（０．０８Ｕ）、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）７００μｌを加えて全量を１ｍｌとし、室温で攪拌しながら反応を開始した。反応開始から０，５，１０，２３，３３時間で２００μｌずつサンプリングし、加水分解の経時変化を観察した。これらのサンプルをそれぞれ真空下で濃縮し、メタノール２００μｌに溶解し、遠心分離で蛋白質を沈殿させることによりメタノール抽出を行った。この上清を濃縮、さらにもう一度メタノール抽出を行うことにより残存する蛋白質を完全に除去した。こうして得られたサンプルを真空下で一晩乾燥させることによりメタノールを完全に除去した。残渣を水２００μｌに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＣＣＰＳ、ＣＯ−８０２０、ＲＩ−８０２０、Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：東ソー（株））により観察した。カラムは糖分析用カラム、流速０．６５ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液は水で測定した。
ＨＰＬＣの結果を図８のグラフに示す。グラフより、時間の経過と共に、トレハロースはグルコースに変換されている様子が観察された。これに対し、３，３’−ジケトトレハロースはトレハロースと同じ分解条件でも減少が見られなかったので、トレハラーゼによる加水分解は起こっていないことがわかる。したがって、トレハラーゼは３，３’−ジケトトレハロースを基質としないことが示された。
実施例７
トレハラーゼ阻害活性
３，３’−ジケトトレハロース溶液１００μｌ（トレハラーゼ反応系の全量２００μｌ中の終濃度がそれぞれ０，０．１，０．５，１．０，５．０，１０．０μＭになるように調製）と豚の腎臓由来トレハラーゼ２６μｌ（０．００７Ｕ）を、３７℃で５分間攪拌した。次に、トレハロース（終濃度０，５，１０，２０ｍＭ）を加え、全量を２００μｌとした。緩衝液は５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。この溶液を３７℃で３０分間攪拌することによりトレハラーゼ反応を進行させ、９５℃で５分間熱処理することによって失活させて反応を停止した。反応溶液中のグルコース濃度を測定し、グルコースの生成量からトレハラーゼ活性を算出した。トレハラーゼ活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのトレハロースから２μｍｏｌのグルコースを生成する量とした。
トレハロース濃度とトレハラーゼ活性の関係より、トレハラーゼのトレハロースに対するミカエリス定数Ｋｍは６．６ｍＭと求められた。また、３，３’−ジケトトレハロース濃度が高くなるほど反応速度が減少していることから、トレハラーゼは３，３’−ジケトトレハロースによって阻害されていることがわかる。図９にはディクソンプロットを示す。ディクソンプロットでは、阻害剤濃度 ｖｓ １／反応速度のグラフ上において、２つの異なる基質濃度を同一グラフ上に描いたとき交差する点における阻害剤濃度から阻害物質定数が求まる。これにより、３，３’−ジケトトレハロースのトレハラーゼに対する阻害定数Ｋｉは２．４２×１０−６Ｍと求められた。
以上の結果より、３，３’−ジケトトレハロースはトレハラーゼに対し、阻害作用を有することが分かる。
実施例８
蛋白質凍結乾燥安定化
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を用いて、本発明の化合物の蛋白質凍結乾燥安定化作用を調べた。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ 由来ＰＱＱＧＤＨを、Ｍｏｌ，Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６に記載の遺伝子配列に基づいて、組換え大腸菌で生産した。菌体を破壊して得た水溶性画分を陽イオンクロマトグラフィーにより精製することにより調製した。この酵素を、終濃度５μＭ ＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ２の存在下で室温で１時間インキュベートすることによりホロ化した。次に、本発明の化合物を終濃度５０ｍＭとなるように加え、試料を６０μＬずつ分注し、−８０℃で凍結した。対照としては本発明の化合物を添加せずに酵素を凍結した。次に、凍結酵素をデシケータ中で、１０Ｐａ、０℃で１２時間乾燥した。この凍結乾燥酵素を４，２８，４５または７０℃で１時間熱処理した後、酵素の残存活性を測定した。酵素活性の測定は、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中においてＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
測定したいずれの温度においても、本発明の化合物を添加したものは、対照と比較して酵素の残存活性が高かった。すなわち、本発明の化合物は、酵素の凍結乾燥安定化作用を有することがわかった。
産業上の利用性
本発明のトレハロース誘導体は、トレハラーゼ阻害剤および蛋白質凍結乾燥安定剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、種々のトレハロース誘導体を示す。
図２は、種々のトレハロース誘導体を示す。
図３は、種々のトレハラーゼ阻害剤を示す。
図４は、酵素電極法の原理を示す。
図５は、本発明の化合物の１３Ｃ ＮＭＲ構造解析を示す。
図６は、本発明の化合物および比較化合物の１３Ｃ ＮＭＲ構造解析を示す。
図７は、本発明の化合物の加水分解生成物を示す。
図８は、本発明の化合物を加水分解したときの経時変化を示す。
図９は、本発明の化合物のトレハラーゼ阻害作用についてのディクソンプロットを示す。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel trehalose derivative, a method for producing the same, and a trehalase inhibitor and a freeze-dried stabilizer containing the trehalose derivative of the present invention.
BACKGROUND ART Trehalose (α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside) is a non-reducing disaccharide in which two molecules of D-glucose are linked in a 1,1 manner. There are three types of isomers, but only α and α isomers exist in nature and are widely distributed in many organisms. Insects are present in hemolymph and are not only present as major blood sugar but also have an effect of maintaining cold resistance as an antifreeze.
Trehalase is an enzyme specific for trehalose and hydrolyzes trehalose into two molecules of glucose. Trehalase is widely distributed in the animal and plant kingdoms, including bacteria, yeast, fungi, insects and mammals.
Intestinal trehalase in mammals is localized in epithelial cells of the small intestine and has a function of hydrolyzing ingested trehalose. However, due to the absence of trehalose in the blood, the physiological function of renal trehalase has not yet been elucidated.
So far, affinity for various trehalose derivatives has been reported for porcine kidney-derived trehalase (FIGS. 1 and 2). Although α, α-trehalose is a substrate for trehalase, its isomers β, β-trehalose and α, β-trehalose have no affinity at all. In addition, as in α, D-mannopyranosyl α, D-mannopyranoside and α, D-glucopyranosyl α, D-mannopyranoside, the affinity changes greatly only by a slight change in the hydroxyl group of the substrate. For various properties of trehalase, see Eur. J. et al. Biochem. 240, 692-698, 1996: Biochimi. Biophys. Acta 1244, 291-294, 1995: Biochimi. Biophys. See Acta 791, 45-49, 1984.
In many insects, trehalose is present in the hemolymph and is a major blood sugar. It is the main storage sugar in yeast and fungi. Trehalase present in insects, yeasts and fungi is considered to be a regulatory enzyme having an action of supplying glucose to each organ. Accordingly, trehalase inhibitors are expected to be useful as fungicides or insecticides.
Examples of trehalase inhibitors that have been reported so far include, for example, S-GI (deoxynojirimycin), trehalostatin, validamycin A, validoxylamine A, MDL25637, castanospermine. (Castanospermine), trehazolin, and suidarestin (FIG. 3). Among these, validoxylamine A, trehazoline, and sudatrestine have strong inhibition constant Ki values of 2.4 × 10 −9 M, 1.9 × 10 −8 M, and 5.0 × 10 −8 M, respectively. It is reported to be a trehalase inhibitor. Trehazoline and Sudatrestin are inhibitors specific to trehalase because they do not inhibit other glucosidases other than trehalase. In fact, validamycin A has already been used as a fungicide against rice leaf sheath damage by the plant pathogen Rhizotonia solani. In addition, validoxylamine A is considered to have an insecticidal effect against tobacco pests.
For various trehalase inhibitors, see Comp. Biochem. Physiol. B120, 639-646, 1998: Arch. Biochem. Biophys. , 316 (2), 821-826, 1995: Agric. Biol. Chem. , 55 (3), 895-897, 1991: J. Am. Antibiotics 44 (10), 1165-1168, 1991: J. Am. Antibiotics 40 (4), 563-565, 1987: Comp. Biochem. Physiol. 61B, 111-114, 1978.
Trehalose is also known to have the ability to protect proteins when lyophilized, and is used as a cryoprotectant for biomolecules such as enzymes, membranes, vaccines, and cells and organs of animals and plants. (Biotechnol. Annu. Rev., 2: 293-314, 1996). For example, when trehalose is used as a freeze-drying protective agent, it has been found that the stability of glucose dehydrogenase during freeze-drying is greatly increased. However, since trehalose is hydrolyzed by trehalase present in blood to produce glucose, and becomes a substrate for G3DH, lyophilized stabilizer for glucose assay enzyme and enzyme for 1,5-anhydro-D-glucitol analysis It could not be used as.
Therefore, an object of the present invention is to provide a novel trehalose derivative useful as a trehalase inhibitor and a protein lyophilization stabilizer.
DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has the following formula:
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The 3,3′-diketotrehalose of the present invention can be easily synthesized by oxidizing trehalose using glucose 3-dehydrogenase. Although it is possible to synthesize chemically, since saccharides have a large number of hydroxyl groups, a multi-step reaction is required to modify a specific site.
Glucose 3-dehydrogenase (G3DH) is an enzyme that specifically dehydrogenates the hydroxyl group at the C-3 position of a saccharide to produce 3-ketosaccharide. Four types of G3DH have been reported so far (Halomonas sp., Cytophaga marinoflava, Agrobacterium tumefaciens, G3DH from Flavobacterium saccharophilum).
G3DH is, for example, Enzyme Microb. Technol. 22: 269-274, 1998. Briefly, Halomonas sp. The α-15 strain (Deleya sp. α-15 strain) is cultured according to a conventional method, and the collected cells are destroyed to obtain a water-soluble fraction. This is purified by a method such as dialysis, gel filtration, or ion exchange chromatography.
The 3,3′-diketotrehalose of the present invention can be produced by oxidizing trehalose using the G3DH enzyme electrode method. The principle of the enzyme electrode method is shown in FIG. The electrode cell is shielded from light, and trehalose, G3DH, and an electron mediator are added to 100 mM phosphate buffer (pH 7.5). As the electron mediator, potassium ferricyanide, ferrocene, an osmium derivative, phenazine methosulfate, or the like can be used. Constant potential electrolysis of 370 mV vs Ag / AgCl is performed using counter electrode platinum, working electrode platinum mesh, and reference electrode Ag / AgCl. The reaction is monitored by thin layer chromatography and the time course of the trehalose spot is observed. After completion of the reaction, the reaction product can be purified using silica gel column chromatography, ion exchange chromatography or the like.
Alternatively, for example, by using potassium ferricyanide at a concentration of 100 mM or more, the enzyme reaction can be allowed to proceed without using an electrode.
The invention also features a trehalase inhibitor comprising the 3,3′-diketotrehalose of the invention. The 3,3′-diketotrehalose of the present invention was found to have a high trehalase inhibitory activity with an inhibition constant Ki = 2.42 × 10 −6 M. Therefore, the trehalase inhibitor of the present invention is useful as a research reagent for elucidating the action of trehalose and trehalase, and as a fungicide or insecticide.
The invention further features a protein lyophilization stabilizer comprising 3,3′-diketotrehalose. In particular, by adding the trehalose derivative of the present invention when freeze-drying the enzyme, a high residual enzyme activity can be obtained after enzyme thawing. Furthermore, since the trehalose derivative of the present invention is not decomposed by trehalase present in the blood to produce glucose, it is very useful as a freeze-drying stabilizer for enzymes such as GOD and GDH for glucose assays.
In addition, all the content as described in the specification of Japanese patent application No. 11-073568 which is an application used as the basis of the priority claim which this application has is quoted here as a part of this specification.
Examples The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, these examples do not limit the scope of the present invention.
Example 1
Preparation of G3DH Halomonas sp. The α-15 strain was successfully cultured in a medium (pH 7.0) containing 10 g polypeptone, 1 g yeast extract, 30 g NaCl, 2 g K 2 HPO 4 , 10 g α-methyl-D-glucoside per liter at 30 ° C. for 24 hours. Air-cultured. The collected cells were suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the cells were crushed with a French press. The supernatant was separated by ultracentrifugation (40000 rpm, 1.5 h), and salted out by adding ammonium sulfate at a rate of 243 g / l while cooling with ice. The supernatant was separated by centrifugation (10000 g, 20 minutes) and dialyzed overnight in 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) to obtain crude purified G3DH. G3DH was purified by subjecting this crudely purified G3DH to hydrophobic chromatography using high performance liquid chromatography (8020 series: Tosoh Corporation).
The enzyme activity was measured according to a conventional method, and the amount of enzyme that oxidizes 1 μmol of glucose per minute was defined as 1 unit (U).
Example 2
The cell for the oxidation electrode of trehalose using the enzyme electrode method was shielded from light, trehalose (Hayashibara Co., Ltd .; 0.103 g:
As a result of thin layer chromatography, the trehalose spot (Rf = 0.45) became thinner with time, and a spot appeared at the position of Rf = 0.57. A trehalose derivative was synthesized in about 12 hours by the electrode reaction.
Example 3
The reaction solution after the purified electrode reaction of the reaction product was placed in an eggplant flask, concentrated using a rotary evaporator, dried, and then dissolved in methanol. Undissolved material was filtered with suction, and the resulting filtrate was concentrated again, dried, dissolved in distilled water, and unreacted trehalose and product were separated using an open column filled with silica gel. As the eluent, acetonitrile: water = 7: 3 was used. The solution thus separated was concentrated, dried, dissolved in distilled water, and the cations present in the reaction solution were removed by adsorption using an open column filled with amberlite (cation exchange resin). Water was used as the eluent. The eluted aqueous solution was further concentrated, dried, dissolved in distilled water, and the anion contained in the reaction solution was removed by adsorption using a column filled with amberlite (anion exchange resin). Water was used as the eluent. The eluted aqueous solution was concentrated and dried, and the reaction product was recovered.
Example 4
Analysis of reaction product by 13 C NMR The reaction product obtained in Example 3 was dissolved in heavy water (D 2 O), and the structure was analyzed by 13 C NMR. For comparison, trehalose was also performed in the same manner.
As a result of structural analysis of the purified sample by 13 C NMR, the result shown in FIG. 5 was obtained. This was compared with trehalose and 3-ketotrehalose (FIG. 6). When the peak of the reaction product was compared with the position of the trehalose peak, the C-3 peak among the product peaks was shifted in a low magnetic field. This shift is the same as C-3 of 3-ketotrehalose. This revealed that the reaction product was 3,3′-diketotrehalose containing a keto group at the 3-position of both of the two glucose residues.
Example 5
Analysis of reaction product by acid hydrolysis The purified reaction product was dissolved in 200 μl of water, 200 μl of 4N sulfuric acid (final concentration 2N) was added, and heat treatment was performed at 99 ° C. for 5 hours for hydrolysis. While confirming the pH of the obtained solution with a pH test paper, 10N NaOH was added little by little until neutrality. The sample thus obtained was confirmed by thin layer chromatography. Acetonitrile: water = 6: 4 was used as a developing solvent. For comparison, trehalose was also hydrolyzed and confirmed.
The results of thin layer chromatography are shown in FIG. Two molecules of glucose are produced from trehalose by hydrolysis. On the other hand, glucose was not produced from the reaction product. If the reaction product is 3-ketotrehalose with a keto group in the C-3 position of one of the two glucose residues of trehalose, a spot should appear at the same position as glucose after hydrolysis. It is. Therefore, it was revealed that the reaction product was 3,3′-diketotrehalose containing a keto group at the C-3 position of both glucose residues of trehalose.
Example 6
Action of trehalase on 3,3′-diketotrehalose Trehalose and 3,3′-diketotrehalose were each weighed 17 mg (
The result of HPLC is shown in the graph of FIG. From the graph, it was observed that trehalose was converted to glucose over time. In contrast, 3,3′-diketotrehalose did not show a decrease even under the same degradation conditions as trehalose, indicating that hydrolysis by trehalase did not occur. Therefore, it was shown that trehalase does not use 3,3′-diketotrehalose as a substrate.
Example 7
Trehalase
From the relationship between trehalose concentration and trehalase activity, the Michaelis constant Km of trehalase for trehalose was determined to be 6.6 mM. Moreover, since the reaction rate decreases as the 3,3′-diketotrehalose concentration increases, it can be seen that trehalase is inhibited by 3,3′-diketotrehalose. FIG. 9 shows a Dixon plot. In the Dixon plot, the inhibitor constant is determined from the inhibitor concentration at the point where two different substrate concentrations are drawn on the same graph on the graph of inhibitor concentration vs. 1 / kinetics. Thereby, the inhibition constant Ki for trehalase of 3,3′-diketotrehalose was determined to be 2.42 × 10 −6 M.
From the above results, it can be seen that 3,3′-diketotrehalose has an inhibitory action on trehalase.
Example 8
Protein freeze-drying stabilization Using the glucose dehydrogenase (GDH) with pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a coenzyme, the protein freeze-drying stabilizing action of the compound of the present invention was investigated. Acinetobacter calcoaceticus-derived PQQGDH was prepared according to Mol, Gen. Genet. (1989), 217: 430-436, and was produced in recombinant E. coli. It was prepared by purifying the water-soluble fraction obtained by destroying the cells by cation chromatography. The enzyme was hololated by incubating for 1 hour at room temperature in the presence of a final concentration of 5 μM PQQ, 1 mM CaCl 2 . Next, the compound of the present invention was added to a final concentration of 50 mM, and 60 μL of the sample was dispensed and frozen at −80 ° C. As a control, the enzyme was frozen without adding the compound of the present invention. Next, the frozen enzyme was dried in a desiccator at 10 Pa and 0 ° C. for 12 hours. The freeze-dried enzyme was heat-treated at 4, 28, 45 or 70 ° C. for 1 hour, and then the residual activity of the enzyme was measured. The enzyme activity was measured using PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol) in 10 mM phosphate buffer pH 7.0, and the absorbance change of DCIP at 600 nm was measured using a spectrophotometer. The rate of decrease in absorbance was taken as the enzyme reaction rate. At this time, the enzyme activity that reduces 1 μmol of DCIP per minute was defined as 1 unit. The molar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM- 1 .
At any measured temperature, the enzyme-added activity of the compound to which the compound of the present invention was added was higher than that of the control. That is, it was found that the compound of the present invention has an enzyme lyophilization stabilizing effect.
Industrial Applicability The trehalose derivative of the present invention is useful as a trehalase inhibitor and a protein lyophilization stabilizer.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows various trehalose derivatives.
FIG. 2 shows various trehalose derivatives.
FIG. 3 shows various trehalase inhibitors.
FIG. 4 shows the principle of the enzyme electrode method.
FIG. 5 shows the 13 C NMR structural analysis of the compounds of the present invention.
FIG. 6 shows 13 C NMR structural analysis of the compounds of the present invention and comparative compounds.
FIG. 7 shows the hydrolysis products of the compounds of the present invention.
FIG. 8 shows a change with time when the compound of the present invention is hydrolyzed.
FIG. 9 shows a Dixon plot for trehalase inhibitory action of the compounds of the present invention.
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