JP4467422B2 - 生体分子検出装置および生体分子検出法 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれる生体分子を１分子毎にカウントする方法に関する。

本明細書において、生体分子というのは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、核酸、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、単糖、２単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど生命現象にかかわる物質一般を指す。このように生化学物質は多種多様なものがあり、それらの性質も多種多様であるので、物質ごとに色々な検出法が考案され利用されてきた。

例えば、アミノ酸や糖の分離では、今でも、液体クロマトグラフィーが最も重要な分離手段であるが、そのバリエーションは、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーなどクロマトグラフィーを実行する上での形状のバリエーションに加え、分離単体の種類と分離溶媒のバリエーションが多様であるので、条件を最適化することで多くの生化学物質や化学物質を分離することが可能である。あるいはこれに類似の技術で、溶液の搬送を 電気浸透流で行う方法も利用されている。

タンパク質やポリヌクレオチド（ＤＮＡやＲＮＡ）などの、電荷を持った高分子の分離には一般的に電気泳動が用いられる。電気泳動においても、分離単体の選択と、溶媒の選択（多くの場合、ｐＨと静電力のコントロールを行う）により、高分離で、一般的には、サイズの２％くらいまでの違いを識別し分離できる。あるいはチャージの違いで分ける等電点電気泳動では０．０２ｐＨの違いに対応する等電点の違いでタンパク質を分離できる。ポリヌクレオチドの分野で、ＤＮＡシーケンサーに用いられている技術では、類似配列のＤＮＡに限れば、７００ｂｐと７０１ｂｐのＤＮＡを長さの差で分離することも可能である。

生化学研究の分野は、このような分離手段に支えられて発展してきた。生命の構成要素を成分ごとに分離し、それらの特性を明らかにすることで、生命現象全体が再構築できると考えられていたからである。近年のゲノム研究をはじめとするオーミクス研究では、生体の構成要因は遺伝子だけでも数万に及び、それ以外に、ゲノム情報によらずに関係し合う化学物質や物質間の相互作用は膨大な数にのぼることが明らかになりつつある。このため、生命現象は物質の複雑な相互作用の結果であるという古典的な解釈が再浮上している。

これらの方法のうち、クロマトグラフィーは担体と溶媒界面における媒質の分配に依存する。電気泳動では担体と媒質の相互作用の度合いにより分離を行う。このため、分離する媒質の分子数が少ないと、媒質が担体に吸着されてしまい、回収できないことが頻繁に起きる。クロマトグラフィーや電気泳動の担体体積と表面積を小さくすることである程度解決できるが、分離する試料体積も少なくする必要があり、限界がある。この限界に挑んでいるのがナノクロマトグラフィーやナノ電気泳動である。分子数が数分子まで少なくなると、吸着の問題以外にも、確率論的なエラーも増えるので確実に分子を分離することが更に難しくなる。特にクロマトグラフィーは統計的に十分な分子が統計的に十分な数の相互作用席とインタラクションすることを前提としており、分離すべき分子の数が少なくなったからといって担体の相互作用席すなわちカラム表面積を少なくしたのでは、分離すべき分子と担体の相互作用席の衝突確率が低下してしまい、分離が不正確になる。

電気泳動においても、分離すべき分子数が少なくなっても電気泳動路を短くすることはできない。ＤＮＡ一分子の電気泳動を行う報告も頻繁に出ているけれども、１分子を実際に電気泳動分離して利用した例は皆無に等しい。

生化学物質の場合、それを高純度に精製するのが必ずしも適切であるとは限らない。多くの場合、ある生化学物質は他の特定の物質と共同作業を行っており、それらを分離してしまうと本来の能力を発揮しないことがよくある。

本発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、単に生化学物質を分離するという観点だけではなく、細胞の機能を明らかにするため、細胞に対して活性のある極小数の分子を機能追跡が可能な形で分離する、新しい技術手段を提供することを課題としている。

本発明は、生体分子を単分子毎に確実に計数できる方法として、目的生体分子が、十分に狭い領域を必ず通過するようにしている。十分狭い領域とは、所定の波長の光のエバネッセンス波でその空間が覆われる領域である。すなわち、目的生体分子が移動するときは、所定の波長の光のエバネッセンス波でその空間が覆われる領域を必ず通過するようにすると、分子がその領域を横切ると、必ず光が散乱し、散乱したエバネッセンス波の光が、その空間から飛び出すことになる。この散乱光を検出すれば、生体分子を単分子毎に確実に計数できる。

所定の波長の光のエバネッセンス波でその空間が覆われる領域は、以下のようにして形成する。生体分子を通過させる細管の先端の開口を、検出に用いるエバネッセンス波の波長より小さい径とし、細管の先端部にアール（丸み）をつける。一方、細管には所定の波長のレーザ光を入射させる。細管に入射した光が細管の先端部からエバネッセンス波として染み出すとき、前記先端部のアールで全反射するような構造とする。これにより、その細管先端部に細管の外と内を完全にさえ切るようにエバネッセンス波領域が形成される。

したがって、移動する生体分子を細管の先端部の開口を通過させるようにすると細管の先端部の開口を通過するとき、光が散乱され、エバネッセンス波領域から飛び出す。これを検出することにすれば、生体分子を単分子毎に確実に計数できる。

本発明によれば、単に生化学物質を分離するという観点だけではなく、細胞の機能を明らかにするため、細胞に対して活性のある極小数の分子を機能追跡が可能な形で分離することができる。

(実施例１)
図１は本発明の共鳴プラズモンを利用した散乱光検出による分子計測装置の実施例を示す概念図である。１は細管であり、材質は光減衰の小さいフューズドシリカである。細管１は検出器である。細管先端部の開口の直径は２００〜３００ｎｍ前後に絞られ、また肉厚も薄いものとされている。また、細管先端部は、細管１に光が入射され、細管先端部の開口からエバネッセンス波が染み出すとき、プラズモン共鳴を起こすように、先端部の開口近傍の内外面が金属箔層２で覆われている。金属箔層２のうち最適なものは金である。細管１に入射される光の波長は、細管先端部の開口の直径よりはやや大きいものとされる。細管の先端部以外のところは太くてよく、その肉厚を前記光の波長に比べ十分大きくとることで、光の入射部位から細管先端部の開口まで、全反射で光を伝播できる。細管１の他端部の開口の直径は、細管１に入射される光の波長に比し十分に大きい。

細管１の先端部分を細くする方法は既存の方法で十分対応できる。たとえば、高周波加熱しながらフューズドシリカチューブを伸ばすことで先端部分を細くすると同時に先端部の肉厚を薄いものにできる。

緩衝液を入れた容器８に、被検出対象の生体分子４を含む試料溶液を入れ、細管１内にも緩衝液を入れて、細管１の先端部を容器８に入れる。細管１の肉厚部分から可視光域のレーザ光３を入射すると、肉厚部分から先端部に向かって、光が３−１の様に全反射で進行し、先端部のアール部分から所定の光がエバネッセンス波として染み出すし、染み出したエバネッセンス波領域３−２を形成する。エバネッセンス波領域３−２を生体分子４が横切ると、共鳴プラズモン現象が起き、フォトンレベルで光散乱が起き、エバネッセンス波領域の外にフォトン３−３が飛び出す。このフォトンをレンズ５で集光しフォトンカウンター６でカウントすることで細管１の先端部の開口を横切る生体分子を１分子単位で検出できる。レンズ５は水中で使用できる水浸レンズで散乱光の放出される細管１の先端部のエバネッセンス波領域３−２に極力接近させる。

生体物質の輸送には電気泳動を用いる。すなわち、上記光導波路となる細管１の内側と生体分子が分散している試料溶液中に、電極７−１、７−２を配し、電圧をかけることで、特定物質のみを細管内に引き込むことができる。ここで重要なのは、印加する電圧である。生体物質の量が多いとフォトンカウンター６が飽和し、フォトンパルスを正確にカウントできない。このような場合は適宜電圧を下げて、フォトンカウンティングが可能な移動の速度で、生体分子が細管先端のエバネッセンス波領域３−２を通過するようにする。

図２は、フォトンカウンター６に得られる結果の概念図を示す。横軸は時間、縦軸はフォトンカウンター６に入力される光の強さである。本発明では、基本的に光子検出になるので、背景光は極力除去することが必要である。電極７−１、７−２間に、電極７−１がプラス１５Ｖになる様に電界を掛けると、信号２２が得られる。これは、緩衝液に含まれる不純物由来の信号や電気的なノイズの信号由来のものであると考えられる。次に、時点２３に、細管１の外側にタンパク質の一種であるトランスフェリンを１ｆＭの濃度になるように添加する。数秒〜数十秒間の遅れをもって、信号２２より、明らかに強い信号２１−１と２１−２が検出される。すなわち、信号２２はノイズ、信号２１−１は細管先端のエバネッセンス波領域３−２をトランスフェリンが通過することにより発生する散乱光と考えられる。信号２１−２はトランスフェリン溶液に含まれる他のタンパク成分と考えられるが内容は明らかではない。強い信号２１−１と２１−２はトランスフェリンの添加量を増やすと信号の現れる頻度が増加し、添加量を少なくすると頻度が低下する。

トランスフェリンのＤＥＡＥセルロースカラムを用いるクロマト精製したものを試料として用いると、信号２１−１の頻度が信号２１−２の出現頻度に対して増えるので、強い信号２１−１がトランスフェリン由来の信号と考えられる。信号２１−２はトランスフェリン溶液に含まれる他の成分であろうが、物質が何であるかは不明であるが、信号２１−２は散乱光強度がトランスフェリン由来の信号２１−１より低いので、この不明物質はトランスフェリンよりサイズが小さいことが予想される。

(実施例２)
図３（Ａ）は、実施例１で説明した概念に基づく測定装置を、基板と、基板上に配置したチップ状の検出器とで形成した例を示す断面図、（Ｂ）は測定装置の基板と、基板上に配置したチップ状の検出器との関係の概要を示す平面図である。エバネッセンス波領域を形成する細孔をチップ上に形成した例である。

３１はチップ状の検出器であり、チップは幅３ｍｍ、長さ３ｍｍ、厚さ２００μｍである。中央部に直径２００〜３００ｎｍ前後の開口が形成され、細管の先端部３２が湾曲し、１００μｍせり出した構造をしており。この湾曲部分に金薄膜３３が蒸着されている。チップ状の検出器３１の一端の端面に光カップラー４０を固定する。光カップラー４０は光ファイバー４１に結合しており、光ファイバー４１の先端にはレーザ源４２が装着されている。レーザ源４２からチップ状の検出器３１に入射するレーザ光は、チップ状の検出器内を全反射し、湾曲した細管の先端部３２に到達する。細管の先端部３２からエバネッセンス波が染み出し、エバネッセンス波領域３４が形成される。チップ状の検出器３１の一端部には、チップの両面に電極３６−１と３６−２が形成されている。

チップ状の検出器３１は、基板３０の上に取り付けられている。検出器３１の細管の先端部３２に対応する基板３０の上面には緩衝液が入れられた容器３７が形成されている。基板３０は、例えば、厚さ０．４ｍｍとするが、容器３７の底面の厚さは０．１ｍｍとする。また、検出器３１を基板３０に取り付ける際、湾曲した細管の先端部３２が、容器３７の底面に出来るだけ近くなるようにする。容器３７には、緩衝液を入れる。

チップ状の検出器３１の開口部に試料液滴３５を上部から添加する。試料液滴３５内に１０ｎｍ程度の粒子がある場合、この粒子がエバネッセンス波領域を通過すると光子散乱を起こし、光子が集光レンズ４３を通し、ホトマルチプライヤー４４に到達し、実施例１で示した図２のような信号パターンを得る。検出器３１の電極３６−１は液滴３５に接し、検出器３１の電極３６−２は容器３７の緩衝液に接するので、チップ状の検出器３１の開口部を通過する粒子の方向を制御するために、電源５０５を用いて分子を電気泳動することができる。

図３（Ｂ）に基板と、基板上に配置したチップ状の検出器との関係の概要を示したように、基板３０には、チップ状の検出器３１に隣接して、穴４７が設けられる。穴４７と容器３７とは溝４８で連通されている。したがって、チップ状の検出器３１の開口部に試料液滴３５を上部から添加して、所定の測定を終えた後、穴４７から緩衝液を、例えば、スポイドで吸引して取り出すことにより、チップ状の検出器３１の開口部を通過して容器３７の緩衝液に移動した粒子を含む緩衝液を取り出すことが出来る。
（実施例３）
更に本発明では、実施例２で説明したチップ状の検出器３１の上部に生体分子を選択するトランスポーター４５を含む細胞膜を貼り付けたチップ４６を取り付け、特定の生体分子を選別して検出できるようにできる。すなわち、トランスポーターを通過する物質のみをエバネッセンス波領域３４で検出できる利点がある。ここで用いるトランスポーターは、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞（未成熟卵）に特定トランスポーターの遺伝子を強制発現させたもの、例えば、アフリカツメガエルの未成熟卵に特定の膜タンパク質のｍＲＮＡ配列を組み込み、前記特定の膜タンパク質を強制発現させた膜、からパッチクランプの要領で細胞膜を切り出して貼り付けたものを使用することができる。具体的には、例えば、本願の発明者らが提案した特願２００４−２６４８６６の図１を中心に説明されるトランスポーターが使用できる。

図４は、実施例２で説明した測定装置のチップ状の検出器の上に、トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けたチップを配置した実施例３の測定装置を示す断面図である。実施例３の場合の平面図は図３（Ｂ）と同様であるので省略する。

図４と図３とを対比して明らかなように、図４では、チップ状の検出器３１の上部に生体分子を選択するトランスポーター４５を含む細胞膜を貼り付けたチップ４６が設けられたこと、電極３６−１が細胞膜を貼り付けたチップ４６に設けられたことを除けば、同じである。したがって、チップ４６の上面に試料液滴３５を滴下して測定すると、トランスポーター４５を通過する生体分子のみがチップ状の検出器３１に導入され、通過が検出される。すなわち、細胞が複数存在する組織片を対象とする試料液滴３５のような場合、あるいは細胞をアレー状に構成的に並べた細胞チップにおいて特定の細胞から放出される信号伝達物質などを含む試料液滴３５のような場合に、生体分子を選択するトランスポーター４５を含む細胞膜を貼り付けたチップ４６で予め生体分子を選択して測定することができ、多細胞系における個別の細胞の状態を解析できる。
（実施例４）
実施例３では、液滴による計測とチップ化することによる生産性を考慮して、図４に示す構造としたが、試料を液滴化することが困難な場合には、必ずしも使い勝手が良いとは言えない。実施例４では、試料を液滴化することが困難な場合、例えば、細胞組織魁があり、そのうちの特定の細胞が固まった領域から放出される分子を検出しようと場合に好都合な測定装置を提案する。

図５は、実施例１で説明した測定装置のチップ状の検出器の外側に、トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けた細管を配置した測定装置を示す断面図である。

実施例４でも、トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けた細管は、本願の発明者らが提案した特願２００４−２６４８６６の図９を中心に説明されるトランスポーターが使用できる。５１は、実施例１で説明した測定装置の細管である。先端部分にエバネッセンス波領域５８が形成されている。５２はトランスポーターを含む細胞膜を貼り付けた細管である。細管５１の外側に、トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けた細管５２を被せる。５０は測定の対象となっている細胞塊である。細胞塊５０の測定対象の特定細胞５５が存在する。細胞塊５０は、容器５３の緩衝液の中に置かれている。容器５３の緩衝液には電極５４−１が、測定装置の細管５１の内側には電極５４−２が取り付けてある。細管５２の先端を細胞塊５０の特定細胞５５に接近させる。細胞５５から放出されている物質５６は電極５４−１と５４−２に電界を掛けることで細管５２の先端に取り付けてあるトランスポーター５７を介して細管５２の中に選択的に取り込まれる。トランスポーター５７を通過できないものは細管５２の中に入り込まない。細管５１の他端には光源はレーザ６０を取り付けてある。細管５１の先端部分は、実施例１で説明したように、バネッセンス領域８４を形成する。このため細管５２に取り込まれた物質は、電極５４−１と５４−２にかけた電界により１分子毎に細管５１のエバネッセンス波領域８４を通過し細管５１に取り込まれ、このとき、フォトンを発する。このフォトンを集光レンズ５９で捕捉し、フォトンカウンターでカウントする（図示せず）。

実施例４では、測定装置の先端がとがっているために立体的な細胞塊の特定領域にアクセスしやすくなる。

本発明の共鳴プラズモンを利用した散乱光検出による分子計測装置の実施例を示す概念図である。 フォトンカウンター６に得られる結果の概念図を示す。 （Ａ）は、実施例１で説明した概念に基づく測定装置を、基板と、基板上に配置したチップ状の検出器とで形成した例を示す断面図、（Ｂ）は測定装置の基板と、基板上に配置したチップ状の検出器との関係の概要を示す平面図である。 実施例２で説明した測定装置のチップ状の検出器の上に、トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けたチップを配置した実施例３の測定装置を示す断面図である。 実施例１で説明した測定装置のチップ状の検出器の外側に、トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けた細管を配置した測定装置を示す断面図である。

符号の説明

１，５１…細管、２…金属箔層、３…レーザ光、３−１…光、３−２，５８，８４…エバネッセンス波領域、３−３…フォトン、４…被検出対象の生体分子、５…レンズ、６…フォトンカウンター、７−１，７−２…電極、８，３７…容器、２１−１，２１−２，２２…信号、２３…試料注入、３０，５３…容器、３１…チップ状の検出器、３２…細管の先端部、３３…金薄膜、４０…光カップラー、３５…試料液滴、３６−１，３６−２１，５４−１，５４−２…電極、４１…光ファイバー、４２，６０…レーザ源、４４…ホトマルチプライヤー、４５…トランスポーター、４６…チップ、４７…穴、４８…溝、５０…細胞塊、５２…トランスポーターを含む細胞膜を貼り付けた細管、５５…特定細胞、５６…物質、５７…トランスポーター、５９…集光レンズ、５０５…電源。

Claims (13)

1. 一方の端部が所定の光の波長より狭い径の開口とされ、他方の端部の径が前記波長より十分広い細管であって、少なくとも前記細管の前記所定の波長より狭い径の開口近傍の内壁と外壁にプラズモン共鳴を起こすための金属が蒸着されており、前記細管の肉厚部分が光導波路を形成していることを特徴とする生体分子検出細管。
2. 先端部が所定の光の波長より狭い径の開口とされ、他方の端部の開口が前記波長より十分広い細管であって、少なくとも前記細管の前記所定の光の波長より狭い径の開口近傍の内壁と外壁に金属が蒸着されており、前記細管の肉厚部分が光導波路を形成している生体分子検出細管と、
   所定の電圧を印加するための二つの電極と、
   前記光導波路を形成している生体分子検出細管の前記十分広い開口の端部から前記所定の波長の光を入射するレーザ光源と、
   前記細管の先端部に配置され、光をカウントするフォトンカウンターと、
   を有し、前記レーザ光源の入射により前記細管の先端部開口近傍にエバネッセンス波領域が形成され、前記生体分子検出細管の先端部が生体分子を含む溶液中に置かれ、前記二つの電極による電界によって前記生体分子が前記エバネッセンス波領域を横切って細管の先端部開口を通過するとき、前記生体分子によって生起される散乱波を前記カウンターで検出することを特徴とする生体分子検出装置。
3. 中央部に所定の光の波長より狭い径の湾曲してせり出した開口が形成され、前記中央部の開口近傍の両面に金属が蒸着されており、その肉厚部分が光導波路を形成している生体分子検出チップと、
   所定の電圧を印加するための二つの電極と、
   前記光導波路を形成しているチップの一端面から前記所定の波長の光を入射するレーザ光源と、
   前記チップの開口が湾曲してせり出した面の側に配置される容器を有する基板と、
   前記基板の容器の底面の外側に配置され、光をカウントするフォトンカウンターと、
   を有し、前記レーザ光源の入射により前記チップの中央部開口近傍にエバネッセンス波領域が形成され、前記容器に緩衝液を入れ、前記生体分子検出チップの前記容器と反対側の面に生体分子を含む液滴を置いて、前記二つの電極による電界によって前記液滴内の生体分子が前記エバネッセンス波領域を横切ってチップの先端部開口を通過して前記容器の緩衝液に移動するとき、前記生体分子によって生起される散乱波を前記カウンターで検出する生体分子検出装置。
4. 前記生体分子検出細管の先端が包含されるとともに、先端の開口部に所定の物質を通過する膜を有する第２の細管を備える請求項２記載の生体分子検出装置。
5. 前記第２の細管の先端の開口部に配する所定の物質を通過する膜が特定物質を通過するトランスポーターを含む請求項４の生体分子検出装置。
6. 前記生体分子検出の上面に所定の物質を通過する膜を有する開口部を持つ第２のチップを備える請求項３記載の生体分子検出装置。
7. 前記第２のチップの開口部に配する所定の物質を通過する膜が特定物質を通過するトランスポーターを含む請求項６の生体分子検出装置。
8. 前記金属が金であることを特徴とする請求項２または３記載の生体分子検出装置。
9. 前記所定の物質を通過する膜がアフリカツメガエルの未成熟卵に特定の膜タンパク質のｍＲＮＡ配列を組み込み、前記特定の膜タンパク質を強制発現させた膜である請求項４記載の生体分子検出装置。
10. 前記所定の物質を通過する膜がアフリカツメガエルの未成熟卵に特定の膜タンパク質のｍＲＮＡ配列を組み込み、前記特定の膜タンパク質を強制発現させた膜である請求項６記載の生体分子検出装置。
11. 請求項２〜１０に記載の生体分子検出装置を用いて、
    所定の光の波長より狭い径の開口部にエバネッセンス波領域を形成すること、
    前記エバネッセンス波領域を検出対象である生体分子を通過させること、
    前記生体分子の通過により生起される散乱波を検出すること、
    を含む、生体分子検出方法。
12. 前記検出対象である生体分子が所定の物質の通過を許容する膜を通して供給される請求項１１記載の生体分子検出方法。
13. 前記所定の物質の通過を許容する膜がアフリカツメガエルの未成熟卵に特定の膜タンパク質のｍＲＮＡ配列を組み込み、前記特定の膜タンパク質を強制発現させた膜である請求項１２記載の生体分子検出方法。

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