JP4454571B2 - 蛋白非添加製剤 - Google Patents

Description

本発明は顆粒球コロニー刺激因子含有製剤に関し、特に容器壁上への吸着又は会合、重合、酸化等による活性成分の損失、不活性化を防止し、安定化させた顆粒球コロニー刺激因子含有製剤に関する。

顆粒球コロニー刺激因子（以下において、Ｇ−ＣＳＦということもある）は、好中球の前駆細胞に作用し、その増殖ならびに分化成熟を促進する分子量約２万の糖タンパク質である。

本出願人によって、口腔底癌患者の腫瘍細胞から採取した細胞株を培養することにより高純度のヒトＧ−ＣＳＦが精製されて以来、これを契機に、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子のクローニングに成功し、現在では遺伝子工学的方法によって動物細胞で組換えヒトＧ−ＣＳＦを大量に生産することが可能になった。また、本願出願人はこの精製したＧ−ＣＳＦの製剤化に成功し、これを感染防御剤として市場に製品を供給している（特許第２１１６５１５号）。

Ｇ−ＣＳＦは極めて微量で使用され、通常成人一人当たり、０．１〜１０００μｇ（好ましくは５〜５００μｇ）のＧ−ＣＳＦを含有する製剤を１〜７回／週の割合で投与する。しかしながら、このＧ−ＣＳＦは例えば注射用アンプル、注射器等の器壁に対し吸着性を示す。また、Ｇ−ＣＳＦは不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重合あるいは酸化等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招く。

そこで安定なＧ−ＣＳＦ製剤を市場に供給するために種々の処方設計がなされている。例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸及びその塩又はアルギニン及びその塩から選ばれる緩衝剤を含む製剤（特表平８−５０５６１０号）等が提案されている。また、安定化剤としてＧ−ＣＳＦ１重量部に対して１重量部〜１０，０００重量部の界面活性剤を含むＧ−ＣＳＦ製剤がある（特開昭６３−１４６８２６号）。この公開公報には、Ｇ−ＣＳＦ含有溶液製剤において、Ｇ−ＣＳＦの損失を防止し、安定化を達成するためには界面活性剤の添加量、特にその下限が臨界的であることが記載されている。

本発明の目的は、製造工程の煩雑さを少なくし、かつ長期の保存にもより安定なＧ−ＣＳＦの製剤を提供することである。

上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤として極めて少量の界面活性剤を添加した場合であっても、安定なＧ−ＣＳＦ溶液製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。

すなわち、本発明は、顆粒球コロニー刺激因子と、顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対して０．０００１〜１重量部の少なくとも１種の製薬上許容される界面活性剤を含み、ｐＨ７以下である、安定な顆粒球コロニー刺激因子含有製剤を提供する。

本明細書中で安定化とは、Ｇ−ＣＳＦ含有溶液製剤を２５℃の保存条件下で６ヶ月保存した後のＧ−ＣＳＦ残存率が９５％以上、あるいは４０℃の保存条件下で２週間保存した後のＧ−ＣＳＦ残存率が７５％以上保たれることを意味する。

本発明の溶液製剤に使用するＧ−ＣＳＦは高純度に精製されたヒトＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。具体的には、哺乳動物、特にヒトのＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法によって得られたものを含む。遺伝子組換え法によって得られるＧ−ＣＳＦには天然のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１または複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。

本発明の安定なＧ−ＣＳＦ含有製剤を得るのに使用する界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の溶液製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。

好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び８０である。

本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般にはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．０００１〜１重量部であり、好ましくはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．０１〜１重量部であり、さらに好ましくはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．２〜１重量部であり、さらに好ましくはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．２〜０．８重量部であり、最も好ましいのは、Ｇ−ＣＳＦ１重量部に対して０．４重量部〜０．８重量部である。特に、製剤量１ｍＬ当たりのＧ−ＣＳＦ含有量が１２５μｇあるいは２５０μｇの場合、界面活性剤の添加量は１００μｇが好ましい。従って、Ｇ−ＣＳＦ１重量部当たり、０．４重量部又は０．８重量部の界面活性剤の添加量が特に好ましい。アルブミン等のタンパク質を安定化剤として添加しない場合には、界面活性剤の添加量がＧ−ＣＳＦ１重量部に対して１重量部を越えると、長期保存後のＧ−ＣＳＦ残存率が低下する傾向が見られた。また、界面活性剤の添加量がＧ−ＣＳＦ１重量部に対して１重量部以下の場合であっても、Ｇ−ＣＳＦの容器への吸着を十分に抑制することができる。

本発明の好ましいＧ−ＣＳＦ含有製剤には安定化剤として実質的にタンパク質を含まない。現在市場に供給されている製品には、Ｇ−ＣＳＦの化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しかしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウイルスのコンタミを除去するために非常に煩雑な工程を必要とすることになるなどの問題がある。

本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤のｐＨは７以下であり、好ましくはｐＨが５〜７であり、さらに好ましくはｐＨが６〜６．８であり、最も好ましくはｐＨが６．２〜６．８である。後述するように、４０℃−２週間加速試験を行った後のＧ−ＣＳＦ残存率はｐＨが７以下で安定である。この観点からはｐＨが約７．０以下であることが好ましい。また、４０℃−２週間加速試験後にＧ−ＣＳＦの糖鎖分解体の生成比を測定したところ、ｐＨが４以下になると糖鎖分解体の含量が急速に増加することが観察された。従って、この観点からはｐＨが約５以上であることが好ましい。さらに、注射剤として投与するには人体への刺激が少ない中性に近い方が好ましく、これらを総合すると、ｐＨを６．２〜６．８とすることが最も好ましい。

本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤には、希釈剤、溶解補助剤、等張化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。例えば、等張化剤としては、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノースなどの糖類を用いることができる。含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。賦形剤としてグリシン、システイン、スレオニン、シスチン、トリプトファン、メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン等のアミノ酸を添加してもよい。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの溶液製剤に通常添加される成分を含んでいてよい。

本発明の溶液製剤中に含まれるＧ−ＣＳＦの量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜８００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０〜５００μｇ／ｍＬである。

本発明の溶液製剤はこれらの成分をリン酸及び／又はクエン酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって調製できる。リン酸緩衝液は、リン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系が好ましく、クエン酸緩衝液としてはクエン酸ナトリウムの緩衝液が好ましい。

本発明の安定化されたＧ−ＣＳＦ含有製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注又は筋注）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。

本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはディスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することもできる。好ましくは、バイアル、注射器用アンプル又はプレフィルドシリンジに充填された形態のＧ−ＣＳＦ含有製剤として供給する。

本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤は後述の実施例に示すように、４０℃−２週間の加速試験あるいは２５℃−６ヶ月間の保存を行った後にも、極めて良好なＧ−ＣＳＦ残存率を示す。また、Ｇ−ＣＳＦは糖鎖末端に１ないし２個のシアル酸をもつが、長期保存中にシアル酸が分解された分解体を生じることがある。本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤は、４０℃−２週間の加速試験を行った後にも、分解体の生成比を低く保つことが示された。さらに、本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤は容器への吸着を十分に抑制することができ、またバイアル充填製剤、シリンジ充填製剤等の容器の形状にかかわらず、４０℃−２週間の加速試験後、及び２５℃−６ヶ月の保存後に極めて良好なＧ−ＣＳＦ残存率を示す。

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。

試験方法
２５０ｍｇのＧ−ＣＳＦ、０．１ｇのポリソルベート２０、３０ｇのＤ−マンニトールを秤量し、リン酸ナトリウム緩衝液にて、下記の第１表に示す各種ｐＨとなるように調整した後、全量を１Ｌとした。

各調剤液は無菌的に調製を行い、濾過を行った後、無菌的にバイアルに１ｍＬずつ充填、密封し、Ｇ−ＣＳＦ溶液製剤を製造した。
このようにして無菌的に調製したＧ−ＣＳＦ２５０μｇ／ｍＬ含有製剤を、４０℃の恒温槽内に２週間静置した。

バイアル中のＧ−ＣＳＦ含有量を下記の方法１に基づき測定した。また、バイアル中のＧ−ＣＳＦ糖鎖分解体含量を下記の方法２に基づき測定した。
方法１
Ｃ４逆相カラム（４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、３００オングストローム）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた。逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりＧ−ＣＳＦ含量を測定した。Ｇ−ＣＳＦとして５μｇ相当量を注入し、アセトニトリルのグラジエントによりＧ−ＣＳＦを溶出させ、２１５ｎｍの波長で分光学的に検出した。

本方法で測定したＧ−ＣＳＦ含量を用い、下記の式に基づき、４０℃−２週間加速後の残存率（％）を算出した。

方法２
陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー法により、Ｇ−ＣＳＦ糖鎖分解体（糖鎖末端に存在するシアル酸が全て分解されたもの）、及びＧ−ＣＳＦ（未変化体）を検出した。即ち、陰イオン交換カラム（TSKgel DEAE）を用い、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を移動相とし、ＮａＣｌグラジエント（０−５００ｍＭ）により溶出させ、２１５ｎｍの波長で分光学的に検出した。

本方法で測定したＧ−ＣＳＦ糖鎖分解体とＧ−ＣＳＦ未変化体の測定値を用い、下記の式に基づき、４０℃−２週間加速後のＧ−ＣＳＦ糖鎖分解体生成比（％）を算出した。

実施例１：各種ｐＨのＧ−ＣＳＦ残存率に及ぼす効果
第１表に記載の各種ｐＨで調製した溶液製剤を、４０℃−２週間加速試験を行った後のＧ−ＣＳＦ残存率を方法１に記載の式により算出した。得られた結果を図１に示す。

ｐＨが７以下においてＧ−ＣＳＦ残存率は７５％以上であった。

実施例２：各種ｐＨのＧ−ＣＳＦ糖鎖分解体生成に及ぼす効果
第１表に記載の各種ｐＨで調製した溶液製剤を、４０℃−２週間加速試験を行った後のＧ−ＣＳＦ糖鎖分解体生成比をを方法２に記載の式により算出した。得られた結果を図２に示す。

ｐＨが約５〜７の範囲では、Ｇ−ＣＳＦ糖鎖分解体の生成比がきわめて低かった。

実施例３：界面活性剤濃度の容器へのＧ−ＣＳＦ吸着に及ぼす効果
250mgのG-CSF，5.844gの塩化ナトリウムを添加した後，さらに下記の表２に示す各ポリソルベート20濃度となるように添加し，リン酸ナトリウム緩衝液にてpHを6.5に調整し，全量を1L とした。

無菌的に調整・濾過を行い製造した、表２記載のG-CSF各調剤液は，バイアル（村瀬硝子株式会社製無処理白色ガラスバイアル（5mL））に対して1mLずつ充填し，充填直後，および，充填後24時間経過後に方法1記載の逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりG-CSF含量を測定した。

本方法で測定したG-CSF含量を用い、下記の式に基づき，充填後２４時間経過後の吸着抑制率（%）を算出した。

得られた結果を表３及び図３に示す。

G-CSF １重量部に対するポリソルベート濃度が１重量部以下の場合にも吸着抑制率は十分であった。

実施例４：バイアル又はシリンジ充填製剤の安定性
２５０ｍｇのＧ−ＣＳＦ、０．１ｇのポリソルベート２０、７ｇの塩化ナトリウムを秤量し、リン酸ナトリウム緩衝液にてｐＨを６．５に調整した全量１Ｌの調剤液を無菌的に調製し、濾過を行った後、無菌的にバイアル（同上）又はシリンジ（日本ベクトン・ディッキンソン社製ハイパックＳＦＣ、１ｍＬロング）に１ｍＬずつ充填、密封し、表４に示すＧ−ＣＳＦ溶液製剤を製造した。

このようにして無菌的に調製したＧ−ＣＳＦ２５０μｇ／ｍＬ含有製剤を、４０℃の恒温槽内に２週間静置、又は２５℃の恒温槽内に６ヶ月静置した。
バイアル中、又はシリンジ中のＧ−ＣＳＦ含有量を方法１に基づき測定し、４０℃−２週間加速後のＧ−ＣＳＦ残存率、及び２５℃−６ヶ月保存後のＧ−ＣＳＦ残存率を方法１記載の式により算出した。

得られた結果を表５に示す。

本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は、バイアル充填製剤、シリンジ充填製剤のいずれにおいても、４０℃−２週加速後の残存率は７５％以上であり、２５℃−６ヶ月保存後の残存率は９５％以上であり、優れた安定性を示した。

本発明のＧ−ＳＣＦ含有製剤は、Ｇ−ＣＳＦ１重量部に対して１重量部以下という極めて少量の界面活性剤を含むことにより、製剤中に微量で存在するＧ−ＣＳＦの温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子に基づく会合、重合、あるいは酸化もしくは容器壁への吸着の結果として生じる、有効成分の損失、活性の低下等に関する問題点を効果的に解決することができる。従って、本発明は製造工程における煩雑さ、コストを少なくし、また長期保存にも安定な溶液製剤を提供するものである。

図１は、４０℃−２週間加速試験を行った後の、ｐＨとＧ−ＣＳＦ残存率の関係を示すグラフである。 図２は、４０℃−２週間加速試験を行った後の、ｐＨとＧ−ＣＳＦ糖鎖分解体生成比との関係を示すグラフである。 図３は、充填後２４時間経過後の、G-CSF １重量部に対するポリソルベート２０の重量部と吸着抑制率との関係を示すグラフである。

Claims (14)

1. 糖鎖を有する顆粒球コロニー刺激因子と、顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対して１重量部以下の少なくとも１種の製薬上許容される非イオン界面活性剤を含み、ｐＨ５〜７である、安定な顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
2. 界面活性剤を顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対して０．２〜１重量部の範囲内の量で含む請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
3. 界面活性剤を顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対して０．２〜０．８重量部の範囲内の量で含む請求項２記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
4. 界面活性剤を顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対して０．４〜０．８重量部の範囲内の量で含む請求項２記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
5. 界面活性剤を顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対して０．４又は０．８重量部含む請求項２記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
6. 安定化剤として他のタンパク質を含まない請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
7. 非イオン界面活性剤がソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンミツロウ誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪酸アミドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
8. ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルがポリソルベート２０又はポリソルベート８０である請求項７記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
9. ｐＨが６〜６．８である請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
10. ｐＨが６．２〜６．８である請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
11. バイアル、注射器用アンプル又はプレフィルドシリンジに充填された請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
12. 長期保存後におけるＧ−ＣＳＦの残存率が高く、かつ糖鎖分解体の生成が少ない、請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
13. Ｇ−ＣＳＦ含有溶液製剤を２５℃の保存条件下で６ヶ月保存した後のＧ−ＣＳＦ残存率が９５％以上、あるいは４０℃の保存条件下で２週間保存した後のＧ−ＣＳＦ残存率が７５％以上保たれる、請求項１２記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
14. 糖鎖を有する顆粒球コロニー刺激因子が、ＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されるものである、請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。

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