JP4442983B2

JP4442983B2 - Triglyceride measuring reagent

Info

Publication number: JP4442983B2
Application number: JP2000069193A
Authority: JP
Inventors: 和昭山下; 泰史白波瀬
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2000-03-13
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2020-03-13
Also published as: JP2001252096A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床化学、薬物化学、生化学及び食品化学において、酵素又は基質濃度を酵素反応を利用して測定するための改良法及び改良された試料測定用組成物に関するものである。更に詳しくは、本発明は生体試料中のトリグリセリド含量を測定するための測定試薬における改良及び改良された測定試薬を用いる測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査に用いられる多くの試薬は、液状あるいは凍結乾燥した状態で供給されている。凍結乾燥試薬は使用に際し、一定の溶解液で溶解する必要がある。そして測定後の残余試薬は冷所に保存され、次の測定に使用される。従ってこの保存期間中の試薬の安定性、液状製品の安定性、及び液状製品の使用時の安定性は十分確保されなくてはならないが、現状では必ずしも十分なものではなかった。保存期間の長さに伴って経時的に、測定値や感度の低下、試薬ブランクの上昇、及び／又は酵素、補酵素、基質等の試薬組成分の失活、分解、変性等がしばしば起こり、その結果測定試薬として最も重要な正確性や精密性などが経時的に低下することが問題となっている。
【０００３】
これらの問題に対しては、製品及びその溶解後の使用期限の短縮や安定化物質の添加等により対応しているのが現状であるが、十分とは言い難い。それ故、測定に用いる試薬の、製品での安定性、及び開封後又は溶解後における効果的な安定化方法、が望まれていた。
【０００４】
生体試料中のトリグリセリド（ＴＧ）は、グリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合したものである。血中ＴＧは外因性と内因性とがあり、前者はカイロミクロン中に、後者は超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、又は高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、中に組み込まれて血中を運搬される。血中のＴＧは、食後は主としてカイロミクロン中に、空腹時は主としてＶＬＤＬ中に、含まれている。肝は脂肪組織から放出された遊離脂肪酸を摂取し、また糖質から脂肪酸合成を行い、これらの脂肪酸を素材としてＴＧを合成し、ＶＬＤＬに組み込んで血中に分泌している。血中カイロミクロン、ＶＬＤＬ中のＴＧは、末梢組織のリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）によって加水分解されて脂肪酸を遊離し、その脂肪酸は組織内に取り込まれて代謝される。従って、血中ＴＧ濃度は主として肝におけるＴＧ及びＶＬＤＬ合成とその分泌、並びに末梢におけるＶＬＤＬ分解とのバランスによって左右される。すなわち、血中ＴＧ濃度の上昇は、脂肪組織からの脂肪酸放出の増大、肝における合成拮抗、末梢組織のＬＰＬ活性低下などによって起こり、その測定はコレステロールやリポタンパク質の測定とともに脂質代謝異常の解明に重要である。
【０００５】
生体試料中のＴＧの測定は、酵素を用いた方法が臨床化学の分野で広く用いられている。その方法は、生体試料中のＴＧをＬＰＬの作用によりグリセロールに加水分解し、生じたグリセロールにグリセロールキナーゼ（ＧＫ）、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼを作用させてＨ_２Ｏ_２を生成させ、この生成されたＨ_２Ｏ_２をＰＯＤを用いて測定するものである。この方法では、生体試料中にもともと含まれている遊離グリセロール、グリセロール−３−リン酸が測定系に影響を及ぼすので、これらを予め消去する必要がある。更にこの方法は、生体試料中の還元性物質の影響を受ける、発色が安定しない、などの欠点を有していた。
【０００６】
また、ＡＤＰ−ＨＫ（ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ）を利用した測定法が特開平１０−２６２６９７号公報に開示されている。この方法において、生体試料中のＴＧは、ＬＰＬによりグリセロールに分解され、更にＡＴＰの存在下でグリセロールキナーゼ（ＧＫ）により、グリセロール−３−リン酸になる。このとき、ＡＴＰはＡＤＰへと変換される。この変換されて生じたＡＤＰ存在下で、グルコースにＡＤＰ−ＨＫを作用させ、グルコース−６−リン酸を生成させる。更にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を作用させることによりＮＡＤＰＨが生成する。この生成したＮＡＤＰＨ量より生体試料中のＴＧ量を測定する。
【０００７】
この公開公報に開示されている方法は、従前の方法が有する問題点のうち還元物質の影響を受けるといった問題点を解決した。しかし、該公開公報に開示されている試薬の組成によれば、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、及びβ−ＮＡＤＰが同一試薬中に保存されている。この試薬の保存ｐＨは７．０であり、このｐＨではこれらいずれの試薬成分も不安定である。また、反応最終ｐＨも７．０なので、生成した反応指示物質であるＮＡＤＰＨも不安定であり、退色が起こる。また、グルコース、ＡＴＰ及びグリセロールキナーゼを同一試薬中に保存しているので、後述するように試薬の保存中に反応が進行してＰＥＰが消費されてしまい、正確なＴＧの測定には望ましくない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、測定試薬の製品での安定性、開封後あるいは溶解後における効果的な安定化方法を提供することである。更に詳しくは、生体試料中のトリグリセリド含量を測定するための測定試薬の、安定性、開封後又は溶解後における効果的な安定化方法、及び安定化された測定試薬を用いた正確なＴＧ測定方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは精度の高い測定に必要である安定な試薬を得るべく検討し、「共存できない試薬成分の組合せ」と「共存できる試薬成分の組合せ」及びその保存ｐＨ、シグナルを発生させる反応生成物と反応ｐＨの適合性、更には、試薬成分の一である酵素と他の試薬成分との組合せ、測定妨害物質の消去、も考慮に入れた試薬組成を構築した。
【００１０】
本発明において測定試薬とは、１つ以上の試薬よりなり、生体試料中の特定の物質の存在又はその含量を測定するために使用されるものである。また、本発明において試薬とは１つ又は複数の試薬成分よりなる。更に、本発明において試薬成分とは、試薬を構成する成分である物質を意味する。
【００１１】
安定な試薬を得るためには、ｐＨ安定域が異なる試薬成分が同一試薬中に含まれているか否かを、更に共役酵素に含まれている又は酵素自身が持っている及び／又は混在している夾雑酵素様活性を、考慮する必要がある。
【００１２】
すなわち、共役酵素に含まれている夾雑酵素様活性、又はその酵素がもっている基質特異性に由来して、試薬保存中に試薬成分と酵素反応が生じ、試薬ブランクを上昇させたり、試薬成分を消費したりすることがある。
【００１３】
また、例えば、酸性域で安定な試薬成分とアルカリ性域で安定な試薬成分が同一試薬中に含まれることにより、どちらか一方の試薬成分が不安定となる、又は選択するｐＨによっては両試薬成分がともに不安定となる、ことがある。
【００１４】
更に、一般に基質濃度若しくは酵素活性量の測定は、反応により生じた生成物である反応指示物質のシグナルを検出することにより行われるが、この場合、酵素活性の反応至適ｐＨのみならず反応生成物の安定性も考慮する必要がある。つまり、特に生体試料の測定は、生体試料に一種又は二種以上の試薬を添加することにより行われるが、これら試薬を添加した後のｐＨがシグナルを発生する反応生成物の安定域から外れているとその反応生成物の分解又は変性が起こり、正確なシグナルの検出が行われず、ひいては正確な測定結果が得られない。
【００１５】
そこで試薬の安定化及びシグナルを発生する反応生成物の安定化の研究を重ねた結果、同じｐＨ安定域を持つ試薬成分を同一の試薬として調製し、異なるｐＨ安定域を持つ試薬成分を別の試薬をして調製し、更に、測定対象物とこれら試薬とを混合した後のｐＨを、シグナルを発生させる反応生成物のｐＨ安定域に調整することにより、試薬が安定に保持できかつ正確なシグナルの検出が可能となる。
【００１６】
更に、正確な測定のためには、上記各試薬成分及び反応生成物特に反応指示物質のｐＨ安定性や夾雑酵素様活性の他に、測定妨害物質の消去等の方法も考慮して試薬を構築する必要がある。
【００１７】
以下、生体試料中のトリグリセリドの測定法を例にとり、本発明を詳細に説明する。
ＡＤＰ−ＨＫを用いたＴＧ測定法は、例えば図１に示した反応原理に基づく。生体試料中のＴＧは、ＬＰＬによりグリセロールに分解され、その後ＧＫ、ＡＤＰ−ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨを作用させることによりβ−ＮＡＤＰＨを生成する。この生成されるβ−ＮＡＤＰＨを検出することにより、ＴＧの測定を行うことができる。このとき、β−ＮＡＤＨにより検出を行ってもよい。
【００１８】
本発明者らは、上記反応原理に基づく反応系に係る酵素であるＧＫが、ＡＴＰａｓｅ（アデノシントリホスファターゼ；ＡＴＰをＡＤＰに変換させる酵素）様活性とヘキソキナーゼ様活性を有することを発見した。つまり、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、ＡＴＰ、及びグルコースを一体として同一液状状態で保存すると、保存中に酵素反応が開始し、ＰＥＰの減少がおきて正確な測定を達成できないことを見出した。この発見に基づき、本発明の一である、１）グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、２）ＡＴＰ、３）グルコースを、ＴＧ測定試薬において、そのうち１つを測定に影響しない段階まで他の２つとは反応が開始しない状況に保持することを特徴とする測定試薬を得ることを達成した。
【００１９】
ここで、測定に影響しない段階とは、測定対象物との接触までを一般的には意味する。しかし、測定対象物との接触が生じたとしても、更に何らかの手段、例えば阻害剤等の添加により測定に影響する反応を制御し、目的とする反応時に当該阻害剤による制御をはずす手段等をとっていればよく、ここで測定に影響しない段階を具体的に限定することは適当でない。
【００２０】
また、上記１）〜３）等の試薬成分を反応が開始しない状況におくには、分別して保存あるいは保持することが最も簡便な手段であり、好ましい態様であるが、分別でなくとも乾燥状態、凍結状態、阻害剤による制御下におく等の手段によっても、本発明の目的を達成することができる。
【００２１】
更に、生体試料中にもともと含まれておりＴＧの測定誤差の原因の１つとなる遊離グリセロール等の消去を行えば、ＴＧのより正確な測定を達成することができる。グリセロール等の消去は、図１の反応原理に示すように、生成したＡＤＰをＰＫの作用によりＡＴＰに戻すことにより行われる。このとき、目的とする本反応では、ＰＫの反応を止める必要がある。ＰＫの反応を止める物質は、ＰＫの反応を止めるものであれば特に限定されないが、塩化カルシウム、シュウ酸が例示される。
【００２２】
また、上記反応原理に基づく反応系において、アルカリ性域で安定な物質としては、ＡＴＰ、ＰＥＰなどを例示することができる。本発明のＴＧを測定するための測定試薬において、これらは、アルカリ性域であるｐＨ７．５〜１０．０、好ましくはｐＨ８．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ８．０〜９．０に単独で又は組合せて調整される。その他、アルカリ性域で安定な物質としてＡＤＰ、β−ＮＡＤＨ、β−ＮＡＤＰＨを示すことができる。また、酸性域において安定な物質としては、β−ＮＡＤＰを例示することができる。その他、酸性域で安定な物質としてβ−ＮＡＤを示すことができる。そのため本発明において、これらは、酸性域であるｐＨ５．０〜７．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整される。
【００２３】
更にＴＧの測定系において、シグナルを発生する反応生成物として検出に用いられているβ−ＮＡＤＨやβ−ＮＡＤＰＨはｐＨ７．３以上で安定である。そこで酸性域で安定な物質を同一試薬として、アルカリ性域で安定な物質を別の同一試薬として調製し、測定対象物とこれら試薬とを混合したときのｐＨは、例えばβ−ＮＡＤＰＨを用いてシグナルを検出する場合、ｐＨ７．０〜１０．０、好ましくはｐＨ７．３〜９．０とするのが望ましい。
【００２４】
試薬を酸性域又はアルカリ性域に保つには適宜緩衝液を用いるのが好ましく、酸性域に用いられる緩衝液としてはグリシン−塩酸、酢酸、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ等、アルカリ性域に用いられる緩衝液としてはＴｒｉｓ−塩酸、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ等を例示することができる。これら緩衝液の種類、ｐＨ、及び濃度は、成分の安定性及び反応最終ｐＨにより適宜選択することができる。更に目的に応じ、本発明では、例えば酸性域、中性域、アルカリ性域等に試薬を分けることも可能である。
【００２５】
また、上記反応原理に基づく反応系に係る酵素であるＧ６ＰＤＨには、グルコース脱水素酵素活性が夾雑している。そのため、Ｇ６ＰＤＨをβ−ＮＡＤＰ、グルコースとともに同一の試薬中で保存すると、酵素反応が開始し試薬ブランクが上昇する。従って、Ｇ６ＰＤＨに夾雑するグルコース脱水素酵素の作用によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成を制御することを目的とし、Ｇ６ＰＤＨ、β−ＮＡＤＰ、グルコースから選ばれる少なくとも１つを、その保存時において反応が開始しない状況に調製することも本発明の別の態様である。
【００２６】
以上のような要件分析によって、本発明の別の一である、トリグリセリドを測定するための測定試薬において、１）グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、２）ＡＴＰ、３）グルコース、のうち１つを測定に影響しない段階まで他の２つとは反応が開始しない状況に保持し、更に次の４）〜９）の処理から選ばれる少なくとも１つの処理を施すことを特徴とする、トリグリセリドを測定するための測定試薬を完成した。
４）ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の活性を制御する。
５）少なくとも一の試薬がｐＨ７．５〜１０．０、他の一の試薬がｐＨ５．０〜７．０になるように調製する。
６）反応時の反応液ｐＨが７．３以上になるように試薬を調製する。
７）ＡＴＰ及び／又はＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）の保存時のｐＨをアルカリ性になるように試薬を調製する。
８）β−ＮＡＤＰの保存時のｐＨを酸性になるように試薬を調製する。
９）Ｇ６ＰＤＨ（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）、β−ＮＡＤＰ、グルコースから選ばれる少なくとも１つを、その保存時において反応が開始しない状況の試薬として調製する。
【００２７】
また、本発明の別の一は、生体試料中のトリグリセリド含量を測定するための測定試薬において、上記４）〜９）の処理から選ばれる少なくとも２つの処理を施すことを特徴とするトリグリセリドを測定するための測定試薬である。
【００２８】
反応が開始しない状況の試薬に調製するには、分別して調製することが最も簡便な手段であり、好ましい態様である。分別調製の例として、上記のように各試薬成分のｐＨによる安定性及び反応の至適ｐＨを考慮して、各試薬成分を、安定でかつ反応が生じないｐＨで、個別にあるいは組合せて調製することがあげられる。なお、分別調製する試薬は溶液であってもよいし、用時溶解して用いる乾燥あるいは凍結製剤として調製してもよい。また、分別でなくとも乾燥状態、凍結状態、阻害剤による制御下におく等の手段によっても、本発明の目的は達成することができる。
【００２９】
本発明の測定試薬の実施の態様としては、第一試薬にＡＴＰ、ＰＥＰ等を含有させ、アルカリ性域のｐＨ７．５〜１０．０より好ましくは、ｐＨ８．０〜９．０に調整し、第二試薬にβ−ＮＡＤＰ等を含有させ弱酸性のｐＨ５．０〜７．０より好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整し、生体試料、第一試薬、第二試薬を混合したときのｐＨは、ｐＨ７．０〜１０．０より好ましくは、ｐＨ７．３〜９．０となるのが好ましい。
【００３０】
これら第一試薬、第二試薬の緩衝液の種類、濃度は試薬成分の安定性、反応最終ｐＨにより適宜選択することができるが、より好ましくは、第一試薬の緩衝液はＢｉｃｉｎｅを用いるのが好ましい。また、濃度は０．０１〜２Ｍ、より好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度が好ましい。また、第二試薬の緩衝液はＭＥＳを用いるのが好ましい。また、濃度は０．０１〜２Ｍ、より好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度が好ましい。
【００３１】
更に本発明は、上記本発明の測定試薬を利用して行うトリグリセリド測定方法をも含有する。本発明のトリグリセリド測定方法で測定する対象となる生体試料としては、血清、血漿、尿、髄液等が例示される。また、本発明のトリグリセリド測定方法において、測定手法は特に限定されずエンドポイントアッセイ法、レートアッセイ法等の手法を適宜用いることができる。
【００３２】
なお本発明は、生体試料中の物質を、特にＴＧを、測定する系の試薬並びに測定方法に関する発明であり、最も好ましくは本発明で開示した改良の手段を全て組合せて利用することが好適である。しかし、各改良手段を完全に組合せなくとも、従前の技術に比して格段の効果を達成するものであれば、当業者が所望により適宜組合せて、その要求する効果の程度に合わせ試薬のキット化や調製、及び測定方法に利用すればよい。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
本発明の測定試薬を調製した。
（１）第一試薬の組成
Ｂｉｃｉｎｅ５０ｍＭ
塩化カリウム１００ｍＭ
塩化マグネシウム１０ｍＭ
ノニオンＡ−１０Ｒ０．５％
トリトンＸ−１０００．２％
アジ化ナトリウム０．１％
ＰＥＰ４．０ｍＭ
ＡＴＰ３．０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ４．５Ｕ／ｍＬ
ＰＫ３．０Ｕ／ｍＬ
ＧＫ３．０Ｕ／ｍＬ
ｐＨ８．５
【００３５】
（２）第二試薬の組成
ＭＥＳ５０ｍＭ
シュウ酸１００ｍＭ
グルコース８０ｍＭ
トリトンＸ−１０００．２５％
β−ＮＡＤＰ６．０ｍＭ
アジ化ナトリウム０．１％
ＡＤＰ−ＨＫ１０．０Ｕ／ｍＬ
リパーゼ１５００Ｕ／ｍＬ
ｐＨ６．５
【００３６】
比較例１
特開平１０−２６２６９７号公報に開示された測定試薬を、本発明の測定試薬との比較検討のために調製した。
（１）第一試薬の組成
ＰＩＰＥＳ５０ｍＭ
塩化マグネシウム５ｍＭ
アデカノールＢ−７９５０．３％
トリトンＸ−１０００．３％
ＰＥＰ０．５ｍＭ
ＡＴＰ２ｍＭ
ＰＫ５Ｕ／ｍＬ
ＧＫ５Ｕ／ｍＬ
グルコース２０ｍＭ
ＮＡＤＰ１ｍＭ
ｐＨ７．０
【００３７】
（２）第二試薬の組成
ＰＩＰＥＳ５０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ２０Ｕ／ｍＬ
ＡＤＰ−ＨＫ２０Ｕ／ｍＬ
リパーゼ２０００Ｕ／ｍＬ
ＭＧＬＰ（モノグリセリドリパーゼ）５Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ５０Ｕ／ｍＬ
アデカノールＢ−７９５０．１％
ｐＨ７．０
【００３８】
実験例１
実施例１で調製した試薬を用いて、試薬の製造後１ヶ月保存後の試薬ブランクの変動を表１に示した。比較例として、特開平１０−２６２６９７号公報の実施例に開示された組成の試薬（比較例１）、すなわち塩化マグネシウム、ＡＴＰ、ＰＥＰ、グルコース、ＧＫ及びＰＫを第一試薬組成に配置した試薬を用いて同様に製造後１ヶ月保存後の試薬ブランクの変動を調べた。表１に示すとおり、特開平１０−２６２６９７号公報の実施例に開示された組成の試薬を用いると、経時的並びに温度依存的に試薬ブランクが上昇してしまうが、本発明の試薬では試薬ブランクの上昇が抑えられることが判明した。
【００３９】
【表１】

【００４０】
【実験例２】
実施例１及び比較例１で調製した試薬を用いて、各試薬の製造後１ヶ月保存した後のＡＴＰ、ＰＥＰの残存率、並びにグルコース−６−リン酸の生成量について比較検討した。表２〜４に示すように、本発明により、ＡＴＰの安定化が図られ、グルコース−６−リン酸の生成も抑制されていることが示された。実験例１で示された比較例の試薬ブランクの変動は、ＡＴＰ加水分解によるＡＤＰの生成とグルコース−６−リン酸の生成が原因であると考えられる。また、特開平１０−２６２６９７号公報に開示された試薬組成は、ＰＫとＰＥＰとによるＡＴＰ再生反応により保存中並びにグリセロール消去反応により生成するＡＤＰの消去を目的としているが、試薬組成の組合せによる問題のために、ＰＥＰの枯渇が生じている。すなわち、既報の試薬組成では長期間の保存により試薬ブランクの変動のみならず、十分なグリセロール消去を行うことができなくなる。
【００４１】
【表２】

【００４２】
【表３】

【００４３】
【表４】

【００４４】
【発明の効果】
本発明は、トリグリセリド（ＴＧ）を測定するための測定試薬であって、混在する酵素、基質、触媒等に影響されない、極めて安定性に優れた測定試薬を提供する。更に本発明は、該測定試薬を用いたＴＧ測定方法をも提供する。本発明により、測定試薬の保存期間を延長することができ、更にＴＧの測定をより正確に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＤＰ−ＨＫ（ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ）を用いたトリグリセリド（ＴＧ）測定法の反応原理を示した図である。図中、ＬＰＬはリポタンパク質リパーゼ、ＧＫはグリセロールキナーゼ、ＰＫはピルビン酸キナーゼ、Ｇ６ＰＤＨはグルコース−６−リン酸脱水素酵素を意味する。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an improved method for measuring an enzyme or substrate concentration using an enzyme reaction and an improved composition for measuring a sample in clinical chemistry, drug chemistry, biochemistry and food chemistry. More specifically, the present invention relates to an improvement in a measurement reagent for measuring the triglyceride content in a biological sample and a measurement method using the improved measurement reagent.
[0002]
[Prior art]
Many reagents used in clinical tests are supplied in a liquid or lyophilized state. The lyophilized reagent needs to be dissolved in a fixed solution when used. The residual reagent after the measurement is stored in a cold place and used for the next measurement. Therefore, the stability of the reagent during the storage period, the stability of the liquid product, and the stability at the time of use of the liquid product must be sufficiently ensured, but are not necessarily sufficient at present. Over time, the measurement value and sensitivity decrease, the reagent blank increases, and / or the inactivation, decomposition, denaturation, etc. of the reagent composition such as enzyme, coenzyme, substrate, etc. often occur over time, As a result, there is a problem that the accuracy and precision most important as a measurement reagent are deteriorated with time.
[0003]
These problems are currently addressed by shortening the expiration date of use of the product and its dissolution, adding a stabilizing substance, and the like, but it is not sufficient. Therefore, there has been a demand for the stability of the reagent used for measurement in the product and an effective stabilization method after opening or dissolution.
[0004]
Triglyceride (TG) in a biological sample is obtained by esterifying three molecules of fatty acid to glycerol. Blood TG is extrinsic and endogenous, the former is in chylomicron, the latter is in very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL), or high density lipoprotein (HDL), It is incorporated and transported in the blood. Blood TG is contained mainly in chylomicron after meals and mainly in VLDL when fasting. The liver ingests free fatty acids released from adipose tissue, synthesizes fatty acids from carbohydrates, synthesizes TGs using these fatty acids as materials, incorporates them into VLDL, and secretes them into the blood. TG in blood chylomicron and VLDL is hydrolyzed by peripheral tissue lipoprotein lipase (LPL) to release fatty acids, which are taken up into tissues and metabolized. Therefore, blood TG concentration depends mainly on the balance between TG and VLDL synthesis and secretion in the liver, and VLDL degradation in the periphery. That is, the increase in blood TG concentration is caused by increased fatty acid release from adipose tissue, synthetic antagonism in the liver, decreased LPL activity in peripheral tissue, etc. is important.
[0005]
For the measurement of TG in a biological sample, a method using an enzyme is widely used in the field of clinical chemistry. In this method, TG in a biological sample is hydrolyzed to glycerol by the action of LPL, and glycerol kinase (GK) and glycero-3-phosphate oxidase are allowed to act on the resulting glycerol to produce H ₂ O _2. The generated H ₂ O ₂ is measured using POD. In this method, since the free glycerol and glycerol-3-phosphate originally contained in the biological sample affect the measurement system, it is necessary to erase them in advance. Furthermore, this method has drawbacks such as being affected by a reducing substance in a biological sample and unstable color development.
[0006]
A measuring method using ADP-HK (ADP-dependent hexokinase) is disclosed in JP-A-10-262697. In this method, TG in a biological sample is decomposed into glycerol by LPL, and further converted into glycerol-3-phosphate by glycerol kinase (GK) in the presence of ATP. At this time, ATP is converted into ADP. In the presence of this converted ADP, ADP-HK is allowed to act on glucose to produce glucose-6-phosphate. Furthermore, NADPH is produced by the action of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The amount of TG in the biological sample is measured from the generated NADPH amount.
[0007]
The method disclosed in this publication has solved the problem that the conventional method is affected by the reducing substance. However, according to the reagent composition disclosed in the publication, ATP, phosphoenolpyruvate (PEP), and β-NADP are stored in the same reagent. The storage pH of this reagent is 7.0, and any of these reagent components are unstable at this pH. In addition, since the final pH of the reaction is 7.0, the generated reaction indicator NADPH is also unstable and fading occurs. In addition, since glucose, ATP, and glycerol kinase are stored in the same reagent, as described later, the reaction proceeds during storage of the reagent and PEP is consumed, which is not desirable for accurate TG measurement.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a stability of a measurement reagent in a product and an effective stabilization method after opening or dissolution. More specifically, the stability of the measurement reagent for measuring the triglyceride content in a biological sample, an effective stabilization method after opening or dissolution, and an accurate TG measurement method using the stabilized measurement reagent Is to provide.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied to obtain a stable reagent necessary for high-precision measurement, and "reaction component generation that generates a" combination of reagent components that cannot coexist "and" combination of reagent components that can coexist "and its storage pH. The reagent composition was constructed taking into consideration the compatibility of the product with the reaction pH, the combination of an enzyme, which is one of the reagent components, and other reagent components, and the elimination of measurement interfering substances.
[0010]
In the present invention, the measurement reagent is composed of one or more reagents and is used for measuring the presence or content of a specific substance in a biological sample. In the present invention, the reagent is composed of one or more reagent components. Furthermore, the reagent component in the present invention means a substance that is a component constituting the reagent.
[0011]
In order to obtain a stable reagent, whether or not reagent components having different pH stability ranges are contained in the same reagent is further included in the conjugated enzyme, or the enzyme itself has and / or mixed. It is necessary to consider the contaminating enzyme-like activity.
[0012]
That is, due to the contaminating enzyme-like activity contained in the conjugated enzyme, or the substrate specificity of the enzyme, an enzyme reaction occurs with the reagent component during storage of the reagent, raising the reagent blank, It may be consumed.
[0013]
In addition, for example, when a reagent component that is stable in the acidic range and a reagent component that is stable in the alkaline range are included in the same reagent, either one of the reagent components becomes unstable, or both reagent components depend on the selected pH. May become unstable.
[0014]
Furthermore, in general, the substrate concentration or the amount of enzyme activity is measured by detecting the signal of the reaction indicator, which is a product generated by the reaction. In this case, not only the optimum pH of the enzyme activity but also the reaction production. It is also necessary to consider the stability of things. That is, in particular, measurement of a biological sample is performed by adding one or more reagents to the biological sample, but the pH after adding these reagents deviates from the stable range of the reaction product that generates a signal. If this occurs, decomposition or denaturation of the reaction product occurs, so that an accurate signal cannot be detected, and an accurate measurement result cannot be obtained.
[0015]
Therefore, as a result of repeated studies on the stabilization of reagents and the stabilization of reaction products that generate signals, reagent components with the same pH stability range are prepared as the same reagent, and reagent components with different pH stability ranges are By preparing the reagent and adjusting the pH after mixing the measurement target and these reagents to the stable pH range of the reaction product that generates a signal, the reagent can be held stably and accurately. The signal can be detected.
[0016]
Furthermore, for accurate measurement, in addition to the pH stability and contaminating enzyme-like activity of each of the above reagent components and reaction products, particularly reaction indicator substances, a reagent is constructed in consideration of methods such as elimination of measurement interfering substances. There is a need to.
[0017]
Hereinafter, the present invention will be described in detail by taking a method for measuring triglycerides in a biological sample as an example.
The TG measurement method using ADP-HK is based on, for example, the reaction principle shown in FIG. TG in the biological sample is decomposed into glycerol by LPL, and then β-NADPH is generated by allowing GK, ADP-HK, and G6PDH to act. TG can be measured by detecting this generated β-NADPH. At this time, detection may be performed by β-NADH.
[0018]
The present inventors have found that GK, which is an enzyme related to the reaction system based on the above reaction principle, has ATPase (adenosine triphosphatase; enzyme that converts ATP to ADP) -like activity and hexokinase-like activity. That is, when glycerol kinase (GK), ATP, and glucose were stored together in the same liquid state, the enzyme reaction started during storage, and PEP decreased, and it was found that accurate measurement could not be achieved. Based on this discovery, 1) glycerol kinase (GK), 2) ATP, and 3) glucose, which is one of the present invention, are reacted with the other two in the TG measurement reagent until one of them does not affect the measurement. It was achieved to obtain a measuring reagent characterized in that it was held in a situation where the start did not start.
[0019]
Here, the stage that does not affect the measurement generally means until the contact with the measurement object. However, even when contact with the measurement object occurs, some means, such as controlling the reaction that affects the measurement by adding an inhibitor, etc., and removing the control by the inhibitor during the intended reaction are taken. However, it is not appropriate to specifically limit the steps that do not affect the measurement.
[0020]
Further, in order to put the reagent components such as 1) to 3) above in a state where the reaction does not start, it is the simplest means to separate and store or hold the reagent component, which is a preferred embodiment, but it is in a dry state even if it is not fractionated. The object of the present invention can also be achieved by means such as being in a frozen state or under the control of an inhibitor.
[0021]
Furthermore, more accurate measurement of TG can be achieved by eliminating free glycerol or the like that is originally contained in a biological sample and is one of the causes of TG measurement errors. Elimination of glycerol and the like is performed by returning the generated ADP to ATP by the action of PK, as shown in the reaction principle of FIG. At this time, it is necessary to stop the PK reaction in the intended main reaction. The substance that stops the PK reaction is not particularly limited as long as it stops the PK reaction, and examples thereof include calcium chloride and oxalic acid.
[0022]
In the reaction system based on the above reaction principle, examples of substances that are stable in the alkaline region include ATP and PEP. In the measuring reagent for measuring TG of the present invention, these are used alone in the alkaline range of pH 7.5 to 10.0, preferably pH 8.0 to 10.0, more preferably pH 8.0 to 9.0. Or adjusted in combination. In addition, ADP, β-NADH, and β-NADPH can be shown as substances that are stable in the alkaline region. An example of a substance that is stable in the acidic region is β-NADP. In addition, β-NAD can be shown as a substance that is stable in the acidic region. Therefore, in the present invention, these are adjusted to an acidic range of pH 5.0 to 7.0, preferably pH 6.0 to 7.0.
[0023]
Furthermore, in the TG measurement system, β-NADH and β-NADPH used for detection as reaction products that generate signals are stable at pH 7.3 or higher. Therefore, when a substance stable in the acidic region is prepared as the same reagent and a substance stable in the alkaline region is prepared as another same reagent, and the measurement object and these reagents are mixed, the pH is, for example, a signal using β-NADPH. When detecting the pH, it is desirable to adjust the pH to 7.0 to 10.0, preferably pH 7.3 to 9.0.
[0024]
In order to keep the reagent in the acidic range or the alkaline range, it is preferable to use a buffer as appropriate. As the buffer used in the acidic range, buffers used in the alkaline range such as glycine-hydrochloric acid, acetic acid, MES, Bis-Tris, ADA, etc. Examples of the liquid include Tris-hydrochloric acid, Bicine, glycylglycine, TAPS, CHAPS, and the like. The type, pH, and concentration of these buffers can be appropriately selected depending on the stability of the components and the final reaction pH. Furthermore, according to the purpose, in the present invention, it is possible to divide reagents into, for example, an acidic region, a neutral region, an alkaline region, or the like.
[0025]
In addition, glucose dehydrogenase activity is contaminated in G6PDH, which is an enzyme related to the reaction system based on the above reaction principle. Therefore, when G6PDH is stored in the same reagent together with β-NADP and glucose, the enzyme reaction starts and the reagent blank rises. Therefore, the purpose is to control the production of NADH or NADPH by the action of glucose dehydrogenase contaminating G6PDH, and at least one selected from G6PDH, β-NADP, and glucose does not start the reaction at the time of storage It is also another aspect of the present invention to prepare.
[0026]
By the requirement analysis as described above, one of the present invention is a measurement reagent for measuring triglyceride, in which one of 1) glycerol kinase (GK), 2) ATP, and 3) glucose is measured. Measurement for measuring triglyceride, characterized in that the reaction is not started with the other two until a stage where there is no influence, and at least one treatment selected from the following treatments 4) to 9) is further applied. Completed reagent.
4) Control the activity of pyruvate kinase (PK).
5) Prepare so that at least one reagent has a pH of 7.5 to 10.0 and the other reagent has a pH of 5.0 to 7.0.
6) Prepare the reagent so that the pH of the reaction solution during the reaction is 7.3 or higher.
7) A reagent is prepared so that the pH during storage of ATP and / or PEP (phosphoenolpyruvate) becomes alkaline.
8) Prepare the reagent so that the pH during storage of β-NADP is acidic.
9) At least one selected from G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase), β-NADP, and glucose is prepared as a reagent that does not start the reaction during storage.
[0027]
Another aspect of the present invention is to measure triglyceride, characterized in that in a measurement reagent for measuring triglyceride content in a biological sample, at least two treatments selected from the treatments 4) to 9) are performed. It is a measuring reagent for doing this.
[0028]
In order to prepare a reagent in a situation where the reaction does not start, fractionated preparation is the simplest means and is a preferred embodiment. As an example of fractional preparation, each reagent component is prepared individually or in combination at a stable and non-reactive pH in consideration of the stability of each reagent component depending on the pH and the optimum pH of the reaction as described above. To do. The reagent to be separately prepared may be a solution, or may be prepared as a dry or frozen preparation used by dissolving at the time of use. Further, the object of the present invention can also be achieved by means such as being in a dry state, a frozen state, or under the control of an inhibitor without being fractionated.
[0029]
As an embodiment of the measuring reagent of the present invention, the first reagent contains ATP, PEP, etc., and is adjusted to pH 7.5 to 10.0 in the alkaline region, more preferably pH 8.0 to 9.0, Β-NADP and the like are contained in the two reagents and adjusted to pH 6.0 to 7.0, more preferably pH 6.0 to 7.0, and pH when the biological sample, the first reagent, and the second reagent are mixed. The pH is more preferably 7.0 to 10.0, and more preferably 7.3 to 9.0.
[0030]
The types and concentrations of the first reagent and the second reagent buffer can be appropriately selected depending on the stability of the reagent components and the final reaction pH. More preferably, the first reagent buffer is Bicine. preferable. The concentration is preferably 0.01 to 2M, more preferably 20 to 100 mM. The second reagent buffer is preferably MES. The concentration is preferably 0.01 to 2M, more preferably 20 to 100 mM.
[0031]
Furthermore, this invention also contains the triglyceride measuring method performed using the measuring reagent of the said invention. Examples of biological samples to be measured by the triglyceride measurement method of the present invention include serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid. In the triglyceride measurement method of the present invention, the measurement method is not particularly limited, and methods such as an endpoint assay method and a rate assay method can be appropriately used.
[0032]
The present invention relates to a reagent and measurement method for measuring a substance in a biological sample, particularly TG, and most preferably, it is preferable to use all the improved means disclosed in the present invention in combination. is there. However, a reagent kit can be appropriately combined as needed by those skilled in the art as long as it achieves a remarkable effect as compared with the conventional technique without completely combining each improvement means. What is necessary is just to utilize for conversion, preparation, and a measuring method.
[0033]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be further described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0034]
Example 1
The measurement reagent of the present invention was prepared.
(1) Composition of the first reagent Bicine 50 mM
Potassium chloride 100 mM
Magnesium chloride 10 mM
Nonion A-10R 0.5%
Triton X-100 0.2%
Sodium azide 0.1%
PEP 4.0 mM
ATP 3.0 mM
G6PDH 4.5U / mL
PK 3.0U / mL
GK 3.0U / mL
pH 8.5
[0035]
(2) Composition of second reagent MES 50 mM
Oxalic acid 100 mM
Glucose 80 mM
Triton X-100 0.25%
β-NADP 6.0 mM
Sodium azide 0.1%
ADP-HK 10.0U / mL
Lipase 1500U / mL
pH 6.5
[0036]
Comparative Example 1
A measuring reagent disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 10-262697 was prepared for comparison with the measuring reagent of the present invention.
(1) Composition of first reagent PIPES 50 mM
Magnesium chloride 5 mM
Adecanol B-795 0.3%
Triton X-100 0.3%
PEP 0.5 mM
ATP 2 mM
PK 5U / mL
GK 5U / mL
Glucose 20 mM
NADP 1 mM
pH 7.0
[0037]
(2) Composition of second reagent PIPES 50 mM
G6PDH 20U / mL
ADP-HK 20U / mL
Lipase 2000U / mL
MGLP (monoglyceride lipase) 5U / mL
Cholesterol esterase 50U / mL
Adecanol B-795 0.1%
pH 7.0
[0038]
Experimental example 1
Table 1 shows the fluctuation of the reagent blank after storage for one month after the reagent was prepared using the reagent prepared in Example 1. As a comparative example, a reagent (comparative example 1) having the composition disclosed in the examples of JP-A-10-262697, that is, a reagent in which magnesium chloride, ATP, PEP, glucose, GK and PK are arranged in the first reagent composition is used. Similarly, the variation of the reagent blank after storage for 1 month after production was examined. As shown in Table 1, when the reagent having the composition disclosed in the example of JP-A-10-262697 is used, the reagent blank increases with time and temperature dependence. However, with the reagent of the present invention, the reagent blank is increased. It was found that the rise in
[0039]
[Table 1]

[0040]
[Experimental example 2]
Using the reagents prepared in Example 1 and Comparative Example 1, the remaining ratio of ATP and PEP and the amount of glucose-6-phosphate produced after storage for 1 month after the production of each reagent were compared. As shown in Tables 2 to 4, it was shown that ATP was stabilized and production of glucose-6-phosphate was also suppressed by the present invention. It is considered that the fluctuation of the reagent blank of the comparative example shown in Experimental Example 1 is caused by the production of ADP by ATP hydrolysis and the production of glucose-6-phosphate. The reagent composition disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-262697 is intended to eliminate ADP generated during storage and glycerol elimination reaction by ATP regeneration reaction with PK and PEP. As a result, PEP depletion has occurred. That is, with the previously reported reagent composition, not only fluctuation of the reagent blank but also sufficient glycerol elimination cannot be performed due to long-term storage.
[0041]
[Table 2]

[0042]
[Table 3]

[0043]
[Table 4]

[0044]
【The invention's effect】
The present invention provides a measurement reagent for measuring triglyceride (TG), which is not affected by a mixed enzyme, substrate, catalyst, etc. and has extremely excellent stability. Furthermore, the present invention also provides a TG measurement method using the measurement reagent. According to the present invention, the storage period of the measurement reagent can be extended, and the TG can be measured more accurately.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the reaction principle of a triglyceride (TG) measurement method using ADP-HK (ADP-dependent hexokinase). In the figure, LPL means lipoprotein lipase, GK means glycerol kinase, PK means pyruvate kinase, and G6PDH means glucose-6-phosphate dehydrogenase.

Claims

A measurement reagent for measuring the triglyceride content in a biological sample ,
Containing lipoprotein lipase, glycerol kinase, adenosine 5′-triphosphate, glucose, pyruvate kinase and phosphoenolpyruvate,
And wherein the holding glycerol kinase, one of the adenosine 5'-triphosphate and glucose as a separate reagent,
Measuring reagent for triglyceride measurement.

A first reagent containing glycerol kinase , adenosine 5′-triphosphate , pyruvate kinase, and phosphoenolpyruvate ;
A second reagent containing glucose and lipoprotein lipase ;
The measurement reagent according to claim 1, comprising:

The measuring reagent according to claim 2, wherein the pH of the first reagent is pH 7.5 to 10.0.

The measurement reagent according to claim 2 or 3, wherein the second reagent has a pH of 5.0 to 7.0.

The second reagent further contains a substance that suppresses the activity of pyruvate kinase ;
Measuring reagent according to any one of claims 2-4.

Substance inhibiting the activity of pyruvate kinase, calcium chloride and / or oxalic acid, assay reagent of claim 5.

The second reagent is
β-NADP and / or β-NAD ;
ADP-dependent hexokinase,
The measurement reagent according to any one of claims 2 to 6 , further comprising:

The measurement reagent according to any one of claims 2 to 7 , wherein the first reagent further contains glucose-6-phosphate dehydrogenase.

The measurement reagent according to any one of claims 2 to 8 , wherein the pH when the biological sample, the first reagent, and the second reagent are mixed is pH 7.3 or more.

Using the measurement reagent according to any one of claims 1 to 9 triglyceride measurement method.