JP4432783B2 - 電気泳動装置 - Google Patents

Description

本発明は、微量のタンパク質や核酸などを分析する電気泳動装置に関し、更に詳しくは、電気泳動部材として透明板状部材の内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えたマイクロチップを用いるマイクロチップ電気泳動装置、及び電気泳動部材としてキャピラリーを用いるキャピラリー電気泳動装置を含む電気泳動装置に関するものである。

微量のタンパク質や核酸などを分析するための電気泳動装置として、キャピラリ電気泳動装置が主として用いられてきた。近年になって、キャピラリに代わってマイクロチップを用いるマイクロチップ電気泳動装置が使用されるようになってきた。マイクロチップ電気泳動装置では、２枚の透明基板を接合して形成されたマイクロチップと称されるキャピラリー電気泳動チップが使用される。そのマイクロチップの例を図１に示す。マイクロチップ５は、一対の透明基板（ガラス板）５１，５２からなり、一方の基板５２の表面に互いに交差する泳動用キャピラリー溝５４，５５を形成し、他方の基板５１にはその溝５４，５５の端に対応する位置にリザーバ５３を貫通穴として設けたものである。

このマイクロチップ５を使用するときは、両基板５１，５２を（Ｃ）に示すように重ね、いずれかのリザーバ５３から泳動液を溝５４，５５中に注入する。その後、短い方の溝５４の一方の端のリザーバ５３に試料を注入しその溝５４の両端のリザーバ５３，５３間に電極を差し込んで所定時間だけ高電圧を印加する。これにより、試料は溝５４中に移動する。次に、長い方の溝５５の両端のリザーバ５３，５３に電極を差し込み、泳動電圧を印加する。これにより、両溝５４，５５の交差部分５６に存在する試料が溝５５内を電気泳動する。

キャピラリ電気泳動装置では、キャピラリの一端に試料を注入し、そのキャピラリの両端間に泳動電圧を印加することにより試料がキャピラリ内を電気泳動する。このような電気泳動装置で分離成分の検出を行なうには、分離流路の適当な位置に紫外可視分光光度計、蛍光光度計、電気化学検出器等の検出器を配置しておくのが一般的である。他の検出方法としては、分離流路の所定の範囲にわたって光を照射し、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段により分離流路内で分離された試料成分による光の吸収又は発光の強度を分離流路に沿った所定の範囲にわたって同時に検出するものも提案されている（特許文献１参照。）

電気泳動装置で分離された泳動パターンは、分離された試料成分の吸光度又は発光強度を分離流路に沿って表わしたエレクトロフェログラムとして表示されるのが一般的であるが、分離された試料成分を分離流路に沿って帯状のパターンで表わしたゲルイメージとして表示されることもある。

しかし、エレクトロフェログラムにしろ、ゲルイメージにしろ、分離流路に沿った所定の範囲にわたって表示されるときは、いずれも試料の電気泳動分離が完了した後の状態で表示されている。電気泳動の目的がタンパク質や核酸などの定量分析にあることを考えれば、電気泳動分離が完了した状態の電気泳動パターンのみを表示するだけで十分である。特に、検出器を分離流路の適当な位置に配置してそこを通過する試料成分を検出する方法では、検出器を通過した試料成分を時間軸に対して表示するのであるから、リアルタイムでの表示といっても時々刻々と変化する泳動パターンを分離流路に沿って表示することはできない。また、エレクトロフェログラムとゲルイメージがともに表示されることがあっても、表示されるのは電気泳動分離完了後であるだけでなく、互いに座標軸を共通にして表示されることはない。定量分析のみを考えればそのような表示の必要性はない。
特開平１０−１３２７８３号公報

電気泳動分離を実行していて、電気泳動分離完了後の泳動パターンのみでなく、電気泳動途中の泳動パターンもわかる方が好都合な場合のあることがわかった。例えば、電気泳動開始から完了までの間に泳動異常が発生したかったことをオペレータが確認したいというような場合である。それも、泳動途中の泳動パターンをエレクトロフェログラムとして表示するよりはゲルイメージとして表示する方が泳動パターンの把握が容易であると考えられる。しかし、泳動途中の泳動パターンをゲルイメージとして表示することは行われてはいない。そこで、本発明は電気泳動装置において、泳動途中の泳動パターンをゲルイメージとして表示できるようにすることを目的とするものである。

本発明の電気泳動装置は、透明部材にて形成され、その内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えた電気泳動部材と、その分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、その分離流路の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、その分離流路内で分離された試料成分による照射光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段と、表示装置と、電気泳動の開始から終了までの途中の段階で、光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分を分離流路に沿って、一定値以下の吸光度又は発光強度については背景と同じ扱いとして表示しないように補正してゲルイメージを表示する帯状のパターンで表わしたゲルイメージとして表示装置に表示させるデータ処理・制御部とを備えている。

また、本発明の電気泳動装置は、透明部材にて形成され、その内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えた電気泳動部材と、その分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、その分離流路の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、その分離流路内で分離された試料成分による照射光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段と、表示装置と、電気泳動の開始から終了までの途中の段階で、光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分を分離流路に沿って、吸光度又は発光強度のベースラインのうねりを補正してゲルイメージを表示する帯状のパターンで表わしたゲルイメージとして表示装置に表示させるデータ処理・制御部とを備えている。

また、本発明の電気泳動装置は、透明部材にて形成され、その内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えた電気泳動部材と、その分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、その分離流路の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、その分離流路内で分離された試料成分による照射光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段と、表示装置と、電気泳動の開始から終了までの途中の段階で、光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分を分離流路に沿って、一定幅以下の吸光度又は発光強度のバンドを表示しないように補正してゲルイメージを表示する帯状のパターンで表わしたゲルイメージとして表示装置に表示させるデータ処理・制御部とを備えている。

これらにより、泳動途中の泳動パターンがゲルイメージとして表示され、しかも見やすく表示されるので、泳動異常などを容易に判断できるようになる。

データ処理・制御部は、光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分の吸光度又は発光強度を分離流路に沿って表わしたエレクトロフェログラムもゲルイメージと分離流路の位置を共通にして表示装置に表示させるものであることが好ましい。エレクトロフェログラムとゲルイメージを対応させて表示することにより、泳動異常などの判断をより容易に把握できるようになる。本発明は、マイクロチップ電気泳動装置又はキャピラリー電気泳動装置に適用するのに相応しいが、他の電気泳動装置にも適用できるものである。

本発明では泳動開始から終了に至る段階での泳動途中の分離流路に沿った所定の範囲の泳動パターンをゲルイメージとして、しかも見やすく補正して、リアルタイムで表示するようにしたので、分離条件の検討や分離過程の異常などを把握するのが容易になる。またゲルイメージの表示と対応させて位置の座標を共通にしてエレクトロフェログラムも表示するようにすれば、直感的な把握がより容易になる。

装置の一実施例を図２に示す。マイクロチップ５は図１に示されたものである。その分離流路５５の一定範囲を光照射するために、分離流路５５に沿って線状に延びた光源１からの光がシリンドリカルレンズ２で平行光にされてバンドパスフィルター３に入射し、バンドパスフィルター３を透過して所定の波長にされた光がシリンドリカルレンズ４によりマイクロチップ５の分離流路に集光されて入射する。マイクロチップ５の反対側には分離流路を透過した光を集光するためにシリンドリカルレンズ６が設けられ、シリンドリカルレンズ６で集光された光が光検出器のリニアイメージセンサであるフォトセルアレイ７に入射して検出される。シリンドリカルレンズ２，４，６、バンドパスフィルター３及びフォトセルアレイ７は分離流路よりは短かいが、分離流路とほぼ同じ長さを有している。フォトセルアレイ７は、検出素子として分離流路の長さ方向の一直線上に配列された、例えば５１２個のフォトダイオードを備えている。バンドパスフィルター３の位置は、マイクロチップ５からフォトセルアレイ７側であってもよい。また、バンドパスフィルター３の代わりに、プリズム、回折格子などの分光素子による分光器を使用することもできる。

この実施例で、光源１からの光は、シリンドリカルレンズ２により平行光となり、バンドパスフィルタ３を通って特定波長のみの光となり、シリンドリカルレンズ４によってマイクロチップ５上の分離流路へ集光される。分離流路を通過した光はシリンドリカルレンズ６により再び平行光になり、フォトセルアレイ７へ照射される。

フォトセルアレイ７は図３のような回路構成を有している。そのフォトセルアレイ７は、一直線上で互い違いに並べられた奇数フォトダイオード１１と偶数フォトダイオード１２を有しており、両フォトダイオード１１，１２をあわせれば５１２個となる。さらに、測定に用いられるフォトダイオード１１，１２と同一特性を持つダミーフォトダイオード１３が５１２個設けられている。各フォトダイオード１１，１２，１３には、ＭＯＳ−ＦＥＴからなるスイッチング素子１４が接続されている。各スイッチング素子１４には奇数シフトレジスタ１５又は偶数シフトレジスタ１６が接続されており、シフトレジスタ１５，１６からの信号によって各スイッチング素子１４のオン、オフの切換えが行なわれるようになっている。

１７は奇数シフトレジスタ１５の動作信号入力端子、１８は偶数シフトレジスタ１５の動作信号入力端子、１９は奇数側リセット信号入力端子、２０は偶数側リセット信号入力端子、２１は奇数フォトダイオード１１からの出力用の出力端子、２２は偶数フォトダイオード１２からの出力用の出力端子、２３及び２４はダミーフォトダイオードからの出力用の出力端子、Ｃｖはコンデンサーである。

さらに、この電気泳動装置は図４に示す制御部４０を備えており、その制御部４０によってこの電気泳動装置が制御される。制御部４０はＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭなどを含むマイクロコンピュータから構成されている。制御部４０にはフォトセルアレイ７の入力端子１７〜２０が接続されている。フォトセルアレイ７の出力端子２１〜２４は、アンプ４１及びＡ／Ｄ変換器４２を介して制御部４０に接続されている。制御部４０にはさらに操作者が指令を入力するためのキーボードを備えた操作盤４３と、泳動途中の泳動パターンをゲルイメージとして表示したり、さらにはエレクトロフェログラムとともに表示したり、泳動完了後のエレクトロフェログラムを表示したり、分析条件や分析結果を表示したりするためのＣＲＴ（陰極線管）や液晶表示板などのディスプー４５と、測定結果をチャート化するためのＸＹプリンター４４と、電源３４とが接続されている。

図４の制御部４０において、泳動途中の泳動パターンをゲルイメージとエレクトロフェログラムとしてディスプレー４５に表示するための機能を図５に示す。フォトセルアレイ７で検出される光量は、試料注入前をＩr(ｎ)、分離途中の光量を Ｉs(ｎ,ｔ) とする。ここで、ｎは検出位置、すなわちフォトセルアレイ７の受光素子の位置を表わし、ｔは泳動開始時点からの時刻を表わす。フォトセルアレイ７で検出され、アンプ４１からＡ／Ｄ変換器４２を経て制御部４０に取り込まれる検出信号により、制御部４０では時刻ｔ，位置ｎでの吸光度Ａb(n,t)として、Ａb(n,t) ＝ −logＩs(n,t)／Ｉr(n)で表される吸光度が求められる。ここで、ｌｏｇは常用対数である。求められた吸光度は、メモリ４０ｂに一時的に記憶される。規格化部４０ｃは、フォトセルアレイ７による全検出範囲での最小吸光度と最大吸光度を求め、求めた最小吸光度と最大吸光度を用いて全検出範囲の吸光度を規格化して、０〜１の間の値に変換するものである。

表示制御部４０ａは、横軸に検出位置をとり、それぞれの位置の規格化された吸光度をピークごとに着色を変えてバンドにしてゲルイメージとしてディスプレー４５のゲルイメージ表示部分４５ｂに表示する。ピークの色相、すなわち色の種類はピーク毎に指定され、色の濃度は最も濃度の高い色と背景色との間を吸光度規格値で補間を行い、吸光度の大小により階調をつけて表示する。また、表示制御部４０ａは、ゲルイメージの表示に用いた横軸を共通に用い、それぞれの位置に対応した吸光度そのものを用いてエレクトロフェログラムとしてエレクトロフェログラム表示部分４５ａに表示する。

この実施例の動作を図６に示す制御フローチャートにしたがって説明する。プログラムがスタートすると、電源３４をオフ状態としたり、プリンタ４４を初期位置にセットしたりするなどの初期設定が行なわれる（ステップＳ１）。操作盤４３を介してサンプル注入時間や電圧、泳動電圧などの分離パラメータの設定が操作者により行なわれる（ステップＳ２）。泳動終了時間（＝積算開始時間）や積算時間などの測定パラメータの設定が操作者により行なわれる（ステップＳ３）。そして、プログラムはスタート指令を待つ（ステップＳ４）。

操作者は通常のマイクロチップ電気泳動と同じように試料の注入を行ない、操作盤４３のスタートボタンを押す。これによりプログラムに従って試料の電気泳動分離が開始され、設定されたパラメータに基づいてマイクロチップ５の分離流路の両端間に泳動電圧が印加される。これにより、試料は分離流路内を移動しつつ分離されていく。

電気泳動分離が開始されると、後に図７により詳細に説明するように、泳動途中の分離の様子が、図８に示されるようにエレクトロフェログラムとゲルイメージが横軸を共通にして表示されていく（ステップＳ５）。このとき、フォトセルアレイ７のフォトダイオード１つ１つが流路の各位置に対応している。フォトセルアレイ７は、一例として、５１２個のフォトダイオードが２５μｍピッチで並んでおり、１２.８ｍｍの長さである。したがって、分離流路の１２.８ｍｍの長さの範囲の吸光度が２５μｍの分解能で得られ、それに基づいてエレクトロフェログラムとゲルイメージが表示されていく。

設定された泳動時間が終了すると（ステップＳ６）、目的成分が分離流路内で分離された状態となる。キャピラリー電気泳動（このマイクロチップ電気泳動も同じ）の特徴として、電気泳動用にかけられていた高電圧を除くと、キャピラリー中の成分は慣性力の影響もなく、その場に留まる。ステップＳ３での設定に従って測定を開始する（ステップＳ７）。制御部４０によりフォトセルアレイ７のスキャン（走査）が繰り返し行なわれ、積算されていくことにより、Ｓ／Ｎ比はどんどん大きくなっていく（ステップＳ７，Ｓ８，Ｓ９）。積算が終了すると、測定結果がプリンターに出力され（ステップＳ１０）、プログラムが終了する（ステップＳ１１）。泳動終了後のさらに詳しい動作は、特開平１０−１３２７８３号公報に記載されている通りである。

泳動途中の分離の様子をエレクトロフェログラムとゲルイメージが横軸を共通にして表示されていく図６中のステップＳ５の詳細な一例を図７を参照して説明する。フォトセルアレイ７で検出された光強度に基づいて、制御部４０には全検出範囲での吸光度が取り込まれる（ステップ２０）。取り込まれた吸光度は一時的にメモリ４０ｂに記憶される（ステップＳ２１）。そして最小吸光度と最大吸光度が求められ（ステップＳ２２）、全検出範囲の吸光度が０〜１に規格化される（ステップＳ２３）。その後、エレクトロフェログラムとゲルイメージが横軸を共通にしてディスプレー４５に表示される（ステップＳ２４）。吸光度の取り込みから表示までの動作は、泳動が終了するまで一定時間ごとに繰り返し行われる（ステップＳ６，Ｓ２５）。

図８はディスプレーに表示されたエレクトロフェログラムとゲルイメージの例を表わしたものである。（Ａ）から（Ｃ）は時間経過の順に３つの時刻でのディスプレー画面を例示している。横軸は分離流路の位置、すなわちフォトセルアレイ７の素子の位置を示しており、その位置を共通にして上側には吸光度を表わすエレクトロフェログラムが表示され、下側には分離された試料成分を帯状に示すゲルイメージが表示されている。このような表示が泳動開始からの時間経過とともにリアルタイムで表示されていく。

ゲルイメージの表示の仕方としては次のように種々に変更することができる。
１）一定以下の吸光度については背景と同じ扱いとして表示しないようにすることにより、ノイズ成分が表示されなくなり、より見やすくする。
２）ベースラインのうねりを補正してゲルイメージの表示をより正しくする。
３）階調を直線補間ではなく、非線形の関数を使用することにより、ゲルイメージを見やすくする。
４）一定幅以下の吸光度のバンドは表示しないようにする。
他にも、ゲルイメージの表示を見やすくするための種々の補正方法がありうる。実施例では、ゲルイメージとエレクトロフェログラムを横軸を共通にしてともに表示しているが、本発明は電気泳動途中ではゲルイメージのみを表示するようにしたものも含んでいる。

マイクロチップを示す図であり、（Ａ）と（Ｂ）はマイクロチップを構成する透明板状部材を示す平面図、（Ｃ）はマイクロチップの正面図である。 一実施例を示す概略斜視図である。 同実施例におけるフォトセルアレイを示す回路図である。 同実施例における制御系を示すブロック図である。 図４の制御系での制御部４０における表示に関する機能を示すブロック図である。 一実施例の全体の動作を示すフローチャート図である。 同実施例における表示に関する動作を示すフローチャート図である。 同実施例における表示画面の一例を時間経過の順に示す図である。

符号の説明

１ 光源
５ マイクロチップ
７ フォトセルアレイ
４０ 制御部
４０ａ 表示制御部
４０ｂ メモリ
４０ｃ 規格化部
４５ ディスプレー
４５ａ ディスプレーのエレクトロフェログラム表示部分
４５ｂ ディスプレーのゲルイメージ表示部分

Claims (4)

1. 透明部材にて形成され、その内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えた電気泳動部材と、
   前記分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、
   前記分離流路の所定の範囲にわたって光を集光して照射する照射手段と、前記分離流路内で分離された試料成分による前記光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段と、
   表示装置と、
   電気泳動の開始から終了までの途中の段階で、前記光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分を分離流路に沿って、一定値以下の吸光度又は発光強度については背景と同じ扱いとして表示しないように補正してゲルイメージを前記表示装置に表示するデータ処理・制御部と、
   を備えたことを特徴とする電気泳動装置。
2. 透明部材にて形成され、その内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えた電気泳動部材と、
   前記分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、
   前記分離流路の所定の範囲にわたって光を集光して照射する照射手段と、前記分離流路内で分離された試料成分による前記光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段と、
   表示装置と、
   電気泳動の開始から終了までの途中の段階で、前記光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分を分離流路に沿って、吸光度又は発光強度のベースラインのうねりを補正してゲルイメージを前記表示装置に表示するデータ処理・制御部と、
   を備えたことを特徴とする電気泳動装置。
3. 透明部材にて形成され、その内部に試料成分が電気泳動により分離される分離流路を備えた電気泳動部材と、
   前記分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、
   前記分離流路の所定の範囲にわたって光を集光して照射する照射手段と、前記分離流路内で分離された試料成分による前記光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って配列された複数個の受光素子を有する光検出手段と、
   表示装置と、
   電気泳動の開始から終了までの途中の段階で、前記光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分を分離流路に沿って、一定幅以下の吸光度又は発光強度のバンドを表示しないように補正してゲルイメージを前記表示装置に表示するデータ処理・制御部と、
   を備えたことを特徴とする電気泳動装置。
4. 前記データ処理・制御部は、前記光検出手段による検出信号に基づいて、分離された試料成分の吸光度又は発光強度を分離流路に沿って表わしたエレクトロフェログラムも前記ゲルイメージと分離流路の位置を共通にして前記表示装置に表示させるものである請求項１から３のいずれかに記載の電気泳動装置。

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