JP4431778B2

JP4431778B2 - How to make a recombinant plasmid

Info

Publication number: JP4431778B2
Application number: JP2002200566A
Authority: JP
Inventors: 健太郎宮崎
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-07-09
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2022-07-09
Also published as: JP2004041036A; WO2004005508A1; AU2003241761A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な組み換えプラスミドの作成方法、該方法により得られた組み換えプラスミド、該組み換えプラスミドの作成法を応用した変異遺伝子ライブラリの作成方法、並びに該方法を使用して得た変異遺伝子ライブラリ及び変異タンパク質ライブラリに関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限酵素とリガーゼの組み合わせによる遺伝子断片のベクターへのクローニングは確立された技術ではあるが、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンが出現することが問題となっていた。このことは、遺伝子一つ一つの機能をスクリーニングするための変異遺伝子ライブラリを作成する際に、とくに大きな問題となる。そのため、一つのベクターに対し一つの挿入断片を確実にクローニングするための方法が渇望されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンをなくし、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片が確実に挿入された組み換えベクターを得る技術を提供することにあり、さらに該技術を使用して有用な変異遺伝子ライブラリ、あるいは変異タンパク質ライブラリを提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、上記従来技術の制限酵素とリガーゼによる組み換えベクターの作成法を採用する以上上記従来技術の問題点の解消は困難であり、従来技術とは全く異なるアプローチによる組み換えベクターの作成方法を提供するため、鋭意研究の結果、遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するベクターを鋳型として、ＰＣＲを行い組み換えベクターを得る方法を創出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３）に関するものである。
（１）変異遺伝子断片のクローニングまたは発現のために該変異遺伝子断片を含有する組み換えプラスミドを作成する方法であって、該変異遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該変異遺伝子断片とハイブリダイズする相同な配列を有する変異前の遺伝子断片を含むプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行うことを特徴とする組み換えプラスミドの作成方法。
（２）上記（１）の方法において、ＰＣＲを行った後、鋳型として使用したプラスミドを制限酵素ＤｐｎＩで切断除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換えプラスミドの作成方法。
（３）複数の変異遺伝子断片を含有する試料を用いて、変異遺伝子断片を各々一つずつ含有する組み換えプラスミドを得る工程を含む変異遺伝子ライブラリを作成する方法であって、上記複数の変異遺伝子断片における各相補鎖の全長をプライマーとするとともに、これら変異遺伝子断片にハイブリダイズする相同な配列を有する変異前の遺伝子断片を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、変異遺伝子ライブラリの作成方法。
【０００６】
以下、本発明の組み換えベクターの作成法について図１を参照しながらさらに詳細に説明する。
（１）遺伝子断片の調製；本発明において組み換えプラスミドにおいて含有させる対象遺伝子断片は、化学合成したもの、各種遺伝子源から制限酵素等のヌクレアーゼを用いて切り出したもの（ａ’）、あるいはアッパープライマー、ロウワープライマーを用い、遺伝子あるいは該遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、ＰＣＲにより複製増幅したもの（ａ）等が挙げられるが、これらに限らずいかなるものであってもよい。
【０００７】
また、上記ＰＣＲ法として変異ＰＣＲ法を使用する場合、得られるものは種々の変異遺伝子の集合体であり、これを用いて、本発明の組み換えプラスミドの作成方法を実施すれば、後記することから明らかなように、変異遺伝子ライブラリを作成できる。
【０００８】
（２）ＰＣＲによる組換えプラスミド合成；本発明においては、上記各種方法により得た遺伝子断片の全長をＰＣＲのプライマーとする。すなわち、該遺伝子断片の各相補鎖全体をプライマーとし、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行う。
上記ＰＣＲにおいては、鋳型プラスミドを加熱してその相補鎖を解離させ、次いで、プライマーとなる該遺伝子断片の各相補鎖を反応系に加え、冷却して上記分離された鋳型プラスミドの各相補鎖にそれぞれ該遺伝子断片の各相補鎖をハイブリダイズさせる。この後ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオチドを加え、各プライマーの下流側に、鋳型プラスミドを鋳型にしたＤＮＡ鎖を伸長させる。この操作を複数サイクル行い、上記各プライマーの下流側に鋳型プラスミドの上記相同配列部分を除いたプラスミドの配列が付加された線状ＤＮＡを複製増幅する。
【０００９】
（３）鋳型プラスミド切断除去；この後、ＤｐｎＩ等により環状プラスミドである鋳型プラスミドを消化する。
これにより得られるものは、２本鎖ＤＮＡからなるとともに、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖が、上記遺伝子断片部分と、上記相同配列部分を除くプラスミド部分とからなるニックの入った線状の組み換えプラスミドである。
【００１０】
なお、上記ＤｐｎＩはメチル化されたＤＮＡのみを特異的に切断するため、ｄａｍ^＋の遺伝子型をもつエシェリシアコリー内などで増幅されたプラスミドが基質となり、メチル化されていないヌクレオチドを用いて合成されたＰＣＲ産物などは切断を受けない。
このことにより、新たに合成されたニックの入ったプラスミドが形質転換能を有し、ＤｐｎＩで切断された鋳型プラスミドは形質転換能を有さなくなる。
（４）形質転換；上記（３）の工程により得られた、線状の２本鎖ＤＮＡからなる組み換えプラスミドを宿主細胞に導入して該細胞の形質転換を行う。上記線状の組み換えプラスミドは、各相補のＤＮＡ鎖を基にその欠陥部分が修復され、環状プラスミドとなり、宿主細胞において複製され、該遺伝子断片のクローニングあるいはその発現が可能となる。
【００１１】
以上説明したように、本発明においては、組み換えプラスミドの作成において、遺伝子断片をプラスミドに制限酵素及びリガーゼを用いて挿入する手法ではなく、いわば、該遺伝子断片をプライマーとして、プラスミド部分を合成するものであって、このような組み換えプラスミドの作成法によれば、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンが出現しないことは容易に理解されることである。
【００１２】
また、従来、環状プラスミドを鋳型とし、ＰＣＲ法により全プラスミド配列を合成する方法もあるが、この方法で使用するプライマーは、たかだか２５−４０塩基対程度の長さの化学合成オリゴヌクレオチドであり、通常数千塩基対程度からなるプラスミド全体のうちの、ごくわずかな塩基の部位特異的な置換を目的としたものである。これに対して、本発明は、組み換え対象遺伝子の各相補鎖の全長をプライマーとするものであって、例えば数百塩基対以上の長さの遺伝子断片をプライマーとするものである。そしてこのような全長遺伝子断片をプライマーとして用いて、これら全長遺伝子断片部分の配列を含むプラスミド全体を合成して組み換えプラスミドを作成しようとするものであり、このような試みは従来なされておらず、本発明は全く新しい着想に基づくものである。
さらに、本発明の組み換えプラスミドの作成法は変異遺伝子ライブラリの形成において極めて有効である。
【００１３】
本発明において変異遺伝子ライブラリを作成するには、上記したように、まず組み換え対象となる遺伝子断片を変異ＰＣＲ法により作成するが、この際得られるものは種々の変異遺伝子の集合体であり、これをそのままプライマーとして用いる。一方、鋳型プラスミドとしては、上記集合体の各変異遺伝子と相同性があり、上記各変異遺伝子とハイブリダイズ可能な遺伝子部分を有するプラスミドを使用してＰＣＲ法を行う。ＰＣＲにおいては、集合体の各変異遺伝子断片を構成する各相補鎖は、鋳型となる相同遺伝子部分の各相補鎖とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより、その下流側に鋳型プラスミドの相同遺伝子部分を除く配列に対応するＤＮＡ鎖を伸長し、ニックの入った線状の組み換えプラスミドが合成される。この操作を複数サイクル繰り返し、該線状の組み換えプラスミドを複製増幅する。このＰＣＲ法により複製増幅されて得られるものは、一つのプラスミドに対し変異遺伝子を一つのみ含み、プラスミド部分の配列を共通にする組み換えプラスミドの集合体である。
【００１４】
次いで、この組み換えプラスミドにより大腸菌等の宿主細胞を形質転換して、培地に培養し、生じたコロニー毎に釣菌し、各培地に分けて培養することにより各変異遺伝子をクローニングし、変異遺伝子ライブラリとする。
また、この遺伝子ライブラリの遺伝子を大腸菌等の宿主細胞内で翻訳あるいは発現させることにより、変異タンパク質ライブラリとすることもできる。
【００１５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、クローニングの対象となる挿入遺伝子断片として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子を用い（Scholz O, Thiel A, Hillen W, Niederweis M. 2000. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry 267(6):1565-1570）、ＰＣＲの鋳型にはＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を含む）を用いた。
【実施例１】
（１）鋳型プラスミドの調製
GFP+遺伝子以外のベクター部分は、Dateら（Date T, Tanihara K, Numura N. 1990. Construction of Escherichia coli vectors for expression and mutagenesis: synthesis of human c-Myc protein that is initiated at a non-AUG codon in exon 1. Gene 90(1):141-144）により作成されたpTD-tacをもとに、該プラスミドの有する唯一のNcoI認識部位（CCATGG）をNdeI認識部位（CATATG）に変換したプラスミドpTD-tacNdを作成した。次に、GFP+遺伝子の該ベクターへのクローニングは、以下のように行われた。即ち、２つのプライマー、5’-GGCATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3’（配列表の配列番号１）及び5’-GGTAATGGTAGCGACCGGCG-3’（同配列番号２）を用いて、クロンテック社製のGFPuvをコードするプラスミドpGFPuvよりGFP遺伝子領域を定法に従いPCR法により増幅した。次に、増幅断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで切断し、先に同様の制限酵素により切断しておいたpTD-tacNdとを定法に従いライゲーションにより連結した。こうして得られたGFPuvを発現する組み換えプラスミドに対し、ストラタジーン社製QuikChangeキットにより部位指定突然変異を行い、６４番目及び６５番目の位置のアミノ酸置換を行った。即ち、２つのプライマー、5’-CCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCC-3’（同配列番号３）及び
5’-GGAAAAGCATTGAACACCATAAGTTAAAGTAGTGACAAGTGTTGG-3’（同配列番号４）を用い、QuikChangeキットのマニュアルに従い実験を行った。こうして得られたGFP+遺伝子部分の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号５及び６に示す。本プラスミドは、イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドによる誘導により、蛍光をもった活性なＧＦＰ蛋白質を発現させる。
上記ＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドは、エシェリシアコリーJM109（dam^＋）内で増幅し、キアゲン社製のプラスミド精製キットを用いて精製した。
このＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドは以下の工程において本発明の鋳型プラスミドとして用いられる。このプラスミドの塩基配列を配列表に配列番号７として示す。
【００１６】
（２）クローニングする断片の調製
ＧＦＰ遺伝子を変異ＰＣＲ法により増幅し、プライマーとなるＤＮＡ断片を調製した。変異ＰＣＲは定法に従い行った。反応溶液（総量５０μｌ）は、１０ｍＭトリス−塩酸（pH 8.3）、５０ｍＭ塩化カリウム、７ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｍＭ塩化マンガン、０．０１％ゲラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、各２５ｐｍｏｌプライマー、５０ｎｇの上記（１）で得た鋳型プラスミド、１．２５ユニットＴａｑ2000 ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含む。用いたＰＣＲプライマー（5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’（同輩列番号８）及び5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCC-3’（同配列番号９）は、ベクターの配列の一部であり、ＧＦＰ遺伝子の全体を増幅するように設計されている。本溶液を９５℃ 1分間の保温後、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の温度サイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。鋳型ＤＮＡは以下のＰＣＲによるプラスミド合成反応においても用いられるため、得られたＰＣＲ産物とともにキアゲン社製のＤＮＡ精製キット（QIAquick；登録商標）により同時に精製し、６０μｌの水で溶出した。
【００１７】
（３）組換えプラスミドのＰＣＲ合成
上記（２）で得たＤＮＡをプライマーに、（１）で得た変異前の遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲを行うことにより、環状プラスミドのＰＣＲ合成を行った。反応溶液（総量５０μｌ）は、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、各０．２ｍＭデオキシリボヌクレオチド混合物、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、（１）で得られたＰＣＲ産物及び鋳型プラスミド４０μｌ、１．２５ユニットＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含む。本溶液を６８℃にて5分間の保温後、９５℃にて5分間保温し、さらに９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ６分の温度サイクルを１８回繰り返した。最初の６８℃にて５分間の保温は、（２）で得られたＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ増幅断片の３’末端にアデニンが付加されているため、３’→５’ヌクレアーゼ活性をもったＰｆｕポリメラーゼによりこれを除去するためである。
【００１８】
（４）合成プラスミド溶液のＤｐｎＩ処理
上記（３）で合成されたプラスミドに対し、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＢ社製）を２０ユニット加え、３７℃で１時間保温し、鋳型として用いたプラスミドＤＮＡの切断除去を行った。
【００１９】
【実施例２】
（１）ライブラリの調製
【実施例１】
（４）で調製された合成プラスミドを含む溶液を、エシェリシアコリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡社製）に導入し、形質転換体を寒天プレート上にコロニーを形成させた。形質転換体を爪楊枝で１１５２個突き、１００μｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを含む１ｍｌのＬＢ培地の入った９６穴深型マイクロプレートに植菌した。
【００２０】
（２）ライブラリの蛍光スクリーニング
マイクロプレートを３７℃で１６時間振とう培養した。一部（１００μｌ）の培養液を分取し、ＧＦＰの発する蛍光（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５０９ｎｍ）を指標にスクリーニングを行った。結果を図２に示す（蛍光強度の強いものから順に並べてある）。
（３）ライブラリの制限酵素チェック
（２）で得られたライブラリスクリーニングの結果より、蛍光を発しないクローンを２４個無作為に拾い、制限酵素チェックを行った。その結果、いずれのクローンにおいてもベクターに一つずつのＧＦＰ遺伝子が挿入されており、クローニング操作自体は正しく行われていることが確認された。
【００２１】
（４）変異体ＧＦＰの変異部位の決定
上記（２）におけるスクリーニングにより蛍光強度の強かったクローンのうち１つを単離し、ＧＦＰコード部位の塩基配列を決定した。その結果、４９６番目の塩基がＡからＣに変わり、これに応じ前者においては１６６番目のアミノ酸がリジンからグルタミンへ変わっていた。
【００２２】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、自己環状化されたベクターや複数の断片が一つのベクターに組み込まれるといった、従来法にみられる制限酵素とライゲーションの組み合わせにより起こるクローニング・エラーを生じることがなく、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片のみ含む組み換えベクターを得ることができ、これにより遺伝子を確実、正確にクローニングすることが可能となる。こうしてクローニング・エラーを排除することは、変異遺伝子ライブラリあるいはこれを翻訳ないしは発現させた変異タンパク質ライブラリを作成する際にとりわけ有益である。
【００２３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組み換えプラスミドの作成工程の概要を示す図である。
【図２】ＧＦＰ蛋白質の変異ライブラリの蛍光スクリーニングの結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel recombinant plasmid production method, a recombinant plasmid obtained by the method, a mutant gene library production method applying the recombinant plasmid production method, a mutant gene library obtained using the method, and It relates to a mutant protein library.
[0002]
[Prior art]
Cloning of gene fragments into a vector using a combination of restriction enzyme and ligase is an established technique, but there are problems with the self-circularization of vectors and the appearance of clones with multiple inserts inserted into one vector. It was. This is a major problem when creating a mutant gene library for screening the function of each gene. Therefore, there has been a strong demand for a method for reliably cloning one insert into one vector.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above-mentioned problems of the prior art, the object of the present invention is to eliminate vector self-circulation and clones in which a plurality of inserted fragments are inserted into one vector, and to ensure one gene fragment per one vector. It is an object of the present invention to provide a technique for obtaining a recombinant vector inserted into the gene, and to provide a useful mutant gene library or mutant protein library using the technique.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Accordingly, the present inventor has difficulty in solving the problems of the above-mentioned prior art as long as the above-described conventional method for producing a recombinant vector using restriction enzymes and ligases is employed, and the preparation of a recombinant vector by a completely different approach from the prior art. In order to provide a method, a method for obtaining a recombinant vector by performing PCR using a vector having a homologous sequence hybridizing to the gene as a template, and using a full length of each complementary strand in the gene fragment as a primer, as a result of intensive research And the present invention has been completed.
[0005]
That is, the present invention relates to the following (1) to (3).
(1) A method of making a recombinant plasmid containing the mutant gene fragment for cloning the mutant gene fragment or expression, as well as the respective primers the full length of each complementary strand of the mutant gene fragment, the mutant gene A method for producing a recombinant plasmid, comprising performing PCR using a plasmid containing a pre-mutation gene fragment having a homologous sequence that hybridizes with a fragment as a template.
(2) The method of (1) above, further comprising the step of cleaving and removing the plasmid used as a template with the restriction enzyme DpnI after performing PCR. .
(3) A method for preparing a mutant gene library comprising a step of obtaining a recombinant plasmid each containing one mutant gene fragment using a sample containing a plurality of mutant gene fragments, the plurality of mutant gene fragments A mutant gene library, characterized in that PCR is carried out using as a template a plasmid containing a pre-mutation gene fragment having a homologous sequence that hybridizes to these mutant gene fragments , using as a primer the full length of each complementary strand in Method.
[0006]
Hereinafter, the method for producing the recombinant vector of the present invention will be described in more detail with reference to FIG.
(1) Preparation of gene fragment: The target gene fragment to be contained in the recombinant plasmid in the present invention is a chemically synthesized product, a product excised from various gene sources using a nuclease such as a restriction enzyme (a ′), an upper primer, Examples include (a) which is obtained by replication amplification by PCR using a lower primer and a gene or a plasmid containing the gene as a template, but is not limited thereto.
[0007]
In addition, when the mutant PCR method is used as the PCR method, what is obtained is an aggregate of various mutant genes, and if this is used to carry out the method for producing the recombinant plasmid of the present invention, it will be described later. As will be apparent, a mutant gene library can be created.
[0008]
(2) Recombinant plasmid synthesis by PCR: In the present invention, the full length of the gene fragment obtained by the various methods described above is used as a PCR primer. That is, PCR is performed using the entire complementary strand of the gene fragment as a primer and a plasmid having a homologous sequence that hybridizes with the gene as a template.
In the PCR, the template plasmid is heated to dissociate its complementary strand, and then each complementary strand of the gene fragment that serves as a primer is added to the reaction system and cooled to each complementary strand of the separated template plasmid. Each complementary strand of the gene fragment is hybridized. Thereafter, DNA polymerase and nucleotides are added, and a DNA strand using the template plasmid as a template is extended downstream of each primer. This operation is performed for a plurality of cycles, and linear DNA in which the plasmid sequence excluding the homologous sequence portion of the template plasmid is added to the downstream side of each primer is replicated and amplified.
[0009]
(3) Template plasmid cleavage removal; Thereafter, the template plasmid, which is a circular plasmid, is digested with DpnI or the like.
What is obtained thereby consists of double-stranded DNA, and each DNA strand of the double-stranded DNA is a linear recombination containing a nick consisting of the gene fragment part and the plasmid part excluding the homologous sequence part. It is a plasmid.
[0010]
Since DpnI specifically cleaves only methylated DNA, a plasmid amplified in an Escherichia coli having a dam ⁺ genotype serves as a substrate, and is synthesized using unmethylated nucleotides. PCR products etc. are not subject to cleavage.
As a result, the newly synthesized nicked plasmid has transformation ability, and the template plasmid cleaved with DpnI has no transformation ability.
(4) Transformation: A recombinant plasmid composed of linear double-stranded DNA obtained by the step (3) is introduced into a host cell to transform the cell. The linear recombinant plasmid has its defective portion repaired based on each complementary DNA strand, becomes a circular plasmid, replicates in the host cell, and allows cloning or expression of the gene fragment.
[0011]
As described above, in the present invention, in the construction of a recombinant plasmid, not a method of inserting a gene fragment into a plasmid using a restriction enzyme and ligase, but a method of synthesizing a plasmid portion using the gene fragment as a primer. However, according to such a method for producing a recombinant plasmid, it is easily understood that a vector is not self-circularized and a clone in which a plurality of inserted fragments are inserted into one vector does not appear. .
[0012]
Conventionally, there is also a method of synthesizing the entire plasmid sequence by PCR using a circular plasmid as a template, but the primer used in this method is a chemically synthesized oligonucleotide having a length of about 25-40 base pairs at most, It is intended for site-specific substitution of only a few bases in the whole plasmid, which usually consists of several thousand base pairs. On the other hand, the present invention uses the full length of each complementary strand of the recombination target gene as a primer, for example, a gene fragment having a length of several hundred base pairs or more as a primer. And using such a full-length gene fragment as a primer, an attempt is made to synthesize an entire plasmid containing the sequence of these full-length gene fragment portions to create a recombinant plasmid, and such an attempt has not been made in the past, The present invention is based on a completely new idea.
Furthermore, the method for producing a recombinant plasmid of the present invention is extremely effective in forming a mutant gene library.
[0013]
In order to create a mutant gene library in the present invention, as described above, a gene fragment to be recombined is first created by a mutant PCR method, and what is obtained at this time is an aggregate of various mutant genes. As a primer. On the other hand, as a template plasmid, PCR is carried out using a plasmid having a homology with each mutant gene of the above-mentioned assembly and having a gene part capable of hybridizing with each mutant gene. In PCR, each complementary strand constituting each mutant gene fragment of the assembly hybridizes with each complementary strand of the homologous gene portion to be a template, and the DNA polymerase removes the homologous gene portion of the template plasmid downstream thereof. The DNA strand corresponding to the sequence is extended, and a nicked linear recombinant plasmid is synthesized. This operation is repeated for a plurality of cycles to replicate and amplify the linear recombinant plasmid. What is obtained by replication amplification by this PCR method is an assembly of recombinant plasmids containing only one mutated gene per plasmid and sharing the sequence of the plasmid portion.
[0014]
Next, a host cell such as Escherichia coli is transformed with this recombinant plasmid, cultured in a medium, fished for each colony generated, and cultivated separately in each medium to clone each mutant gene, mutant gene library And
In addition, a mutant protein library can be obtained by translating or expressing the genes of this gene library in a host cell such as Escherichia coli.
[0015]
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
In the following examples, a green fluorescent protein (GFP) gene is used as an insertion gene fragment to be cloned (Scholz O, Thiel A, Hillen W, Niederweis M. 2000. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry 267 (6): 1565-1570), and a plasmid (including ampicillin resistance gene) into which a GFP gene was inserted was used as a PCR template.
[Example 1]
(1) Preparation of template plasmid
The vector portion other than the GFP + gene is described in Date et al. (Date T, Tanihara K, Numura N. 1990. Construction of Escherichia coli vectors for expression and mutagenesis: synthesis of human c-Myc protein that is initiated at a non-AUG codon in exon 1. Plasmid pTD-tacNd in which the unique NcoI recognition site (CCATGG) of the plasmid is converted to the NdeI recognition site (CATATG) based on pTD-tac prepared by Gene 90 (1): 141-144) It was created. Next, cloning of the GFP + gene into the vector was performed as follows. That is, from two plasmids, 5′-GGCATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and 5′-GGTAATGGTAGCGACCGGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 2), from the plasmid pGFPuv encoding GFPuv manufactured by Clontech The GFP gene region was amplified by PCR according to a conventional method. Next, the amplified fragment was cleaved with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and ligated with pTD-tacNd previously cleaved with the same restriction enzyme by ligation according to a conventional method. The thus obtained recombinant plasmid expressing GFPuv was subjected to site-directed mutagenesis using the QuikChange kit manufactured by Stratagene, and amino acid substitution at positions 64 and 65 was performed. That is, two primers, 5'-CCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCC-3 '(SEQ ID NO: 3) and
Experiments were performed using 5′-GGAAAAGCATTGAACACCATAAGTTAAAGTAGTGACAAGTGTTGG-3 ′ (same SEQ ID NO: 4) according to the QuikChange kit manual. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the GFP + gene portion thus obtained are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. This plasmid expresses an active GFP protein having fluorescence by induction with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside.
The plasmid with the GFP gene inserted was amplified in Escherichia coli JM109 (dam ⁺ ) and purified using a Qiagen plasmid purification kit.
This plasmid into which the GFP gene has been inserted is used as the template plasmid of the present invention in the following steps. The base sequence of this plasmid is shown as SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
[0016]
(2) Preparation of fragment to be cloned A GFP gene was amplified by a mutation PCR method to prepare a DNA fragment as a primer. Mutation PCR was performed according to a conventional method. The reaction solution (total volume 50 μl) was 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 7 mM magnesium chloride, 0.4 mM manganese chloride, 0.01% gelatin, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, each 25 pmol primer, 50 ng of the template plasmid obtained in (1) above, and 1.25 units Taq2000 DNA polymerase (Stratagene). The PCR primers used (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 '(equivalent sequence number 8) and 5'-GTAAAACGACGGCCAGTGCC-3' (same sequence number 9) are part of the vector sequence and amplify the entire GFP gene. This solution was incubated at 95 ° C. for 1 minute, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds was repeated 25 times, and finally, the solution was incubated at 72 ° C. for 5 minutes. Since the template DNA is also used in the following plasmid synthesis reaction by PCR, it was simultaneously purified with a Qiagen DNA purification kit (QIAquick; registered trademark) together with the obtained PCR product and eluted with 60 μl of water.
[0017]
(3) PCR synthesis of recombinant plasmid PCR is performed on the circular plasmid by performing PCR using the DNA obtained in (2) above as a primer and the plasmid containing the pre-mutation gene obtained in (1) as a template. went. The reaction solution (total volume 50 μl) was 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.8), 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium sulfate, each 0.2 mM deoxyribonucleotide mixture, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg. / Ml Bovine serum albumin, PCR product obtained in (1) and template plasmid 40 μl, 1.25 units PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene). This solution was kept at 68 ° C. for 5 minutes, then kept at 95 ° C. for 5 minutes, and a temperature cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 6 minutes was repeated 18 times. The first incubation at 68 ° C. for 5 minutes is that Pfu polymerase having 3 ′ → 5 ′ nuclease activity because adenine is added to the 3 ′ end of the PCR amplified fragment obtained by Taq polymerase obtained in (2). This is to remove this.
[0018]
(4) DpnI treatment of synthetic plasmid solution To the plasmid synthesized in (3) above, 20 units of restriction enzyme DpnI (manufactured by NEB) was added and incubated at 37 ° C for 1 hour to cleave plasmid DNA used as a template. Removal was performed.
[0019]
[Example 2]
(1) Library preparation [Example 1]
The solution containing the synthetic plasmid prepared in (4) was introduced into a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the transformant was allowed to form colonies on an agar plate. 1152 transformants were picked with a toothpick and inoculated into a 96-well deep microplate containing 1 ml of LB medium containing 100 μg / l ampicillin and 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. .
[0020]
(2) Library fluorescence screening The microplate was cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. A part (100 μl) of the culture solution was collected and screened using fluorescence emitted by GFP (excitation wavelength: 488 nm, fluorescence wavelength: 509 nm) as an index. The results are shown in FIG. 2 (arranged in descending order of fluorescence intensity).
(3) Library restriction enzyme check Based on the results of library screening obtained in (2), 24 clones that did not emit fluorescence were randomly picked and subjected to restriction enzyme check. As a result, in each clone, one GFP gene was inserted into the vector, and it was confirmed that the cloning operation itself was performed correctly.
[0021]
(4) Determination of mutation site of mutant GFP One of the clones having strong fluorescence intensity by the screening in (2) above was isolated, and the base sequence of the GFP coding site was determined. As a result, the 496th base changed from A to C, and in response to this, the 166th amino acid changed from lysine to glutamine.
[0022]
【The invention's effect】
As is apparent from the above description, according to the present invention, cloning errors caused by a combination of restriction enzymes and ligations found in conventional methods, such as a self-circularized vector and a plurality of fragments incorporated into one vector, are obtained. Thus, it is possible to obtain a recombinant vector containing only one gene fragment for one vector, thereby enabling reliable and accurate cloning of the gene. Eliminating cloning errors in this way is particularly useful when creating a mutant gene library or a mutant protein library obtained by translating or expressing the mutant gene library.
[0023]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an outline of a process for producing a recombinant plasmid of the present invention.
FIG. 2 shows the results of fluorescence screening of a GFP protein mutation library.

Claims

A method of making a recombinant plasmid containing the mutant gene fragment for cloning the mutant gene fragment or expression, as well as the respective primers the full length of each complementary strand of the mutant gene fragment hybridized with said mutated gene fragment A method for producing a recombinant plasmid, comprising performing PCR using a plasmid containing a pre-mutation gene fragment having a homologous sequence that is soybean as a template.

The method according to claim 1, further comprising the step of cleaving and removing a plasmid used as a template with a restriction enzyme DpnI after performing PCR.

A method for preparing a mutant gene library comprising a step of obtaining a recombinant plasmid containing each one of the mutant gene fragments using a sample containing a plurality of mutant gene fragments, each complement of the plurality of mutant gene fragments A method for preparing a mutant gene library, comprising performing PCR using a plasmid containing a pre-mutation gene fragment having a homologous sequence hybridizing to the mutant gene fragment as a template while using the full length of the strand as a primer.