JP2004041036A

JP2004041036A - Method for preparing recombinant plasmid

Info

Publication number: JP2004041036A
Application number: JP2002200566A
Authority: JP
Inventors: Kentaro Miyazaki; 宮崎　健太郎
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-07-09
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2022-07-09
Also published as: JP4431778B2; AU2003241761A1; WO2004005508A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technique for eliminating self ligation of a vector or a clone in which a plurality of insertional fragments are inserted into the vector and affording a recombinant vector in which one genetic fragment is surely inserted into the one vector. <P>SOLUTION: The whole length of each complementary chain in the genetic fragment is used as a primer and a PCR is carried out by using a vector having a homologous sequence hybridizable with the gene as a template to afford the recombinant vector. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な組み換えプラスミドの作成方法、該方法により得られた組み換えプラスミド、該組み換えプラスミドの作成法を応用した変異遺伝子ライブラリの作成方法、並びに該方法を使用して得た変異遺伝子ライブラリ及び変異タンパク質ライブラリに関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限酵素とリガーゼの組み合わせによる遺伝子断片のベクターへのクローニングは確立された技術ではあるが、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンが出現することが問題となっていた。このことは、遺伝子一つ一つの機能をスクリーニングするための変異遺伝子ライブラリを作成する際に、とくに大きな問題となる。そのため、一つのベクターに対し一つの挿入断片を確実にクローニングするための方法が渇望されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンをなくし、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片が確実に挿入された組み換えベクターを得る技術を提供することにあり、さらに該技術を使用して有用な変異遺伝子ライブラリ、あるいは変異タンパク質ライブラリを提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、上記従来技術の制限酵素とリガーゼによる組み換えベクターの作成法を採用する以上上記従来技術の問題点の解消は困難であり、従来技術とは全く異なるアプローチによる組み換えベクターの作成方法を提供するため、鋭意研究の結果、遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するベクターを鋳型として、ＰＣＲを行い組み換えベクターを得る方法を創出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）に関するものである。
（１）遺伝子断片のクローニングまたは発現のために該遺伝子断片を含有する組み換えプラスミドを作成する方法であって、該遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行うことを特徴とする組み換えプラスミドの作成方法。
（２）上記（１）の方法において、ＰＣＲを行った後、鋳型として使用したプラスミドを制限酵素ＤｐｎＩで切断除去する工程をさらに含むことを特徴とする上記（１）に記載の組み換えプラスミドの作成方法。
（３）上記（１）の作成方法により得られる組み換えプラスミドであって、２本鎖ＤＮＡからなるとともに、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖が、上記遺伝子断片部分と、上記相同配列部分を除くプラスミド部分とからなる線状のＤＮＡからなることを特徴とする組み換えプラスミド。
（４）宿主細胞への導入により該細胞内で修復により環状化されるものである上記（３）に記載の組み換えプラスミド。
（５）複数の変異遺伝子断片を含有する試料を用いて、変異遺伝子断片を各々一つずつ含有する組み換えプラスミドを得る工程を含む変異遺伝子ライブラリを作成する方法であって、複数の変異遺伝子断片における相補鎖の全長をプライマーとするとともに、これら遺伝子断片にハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、変異遺伝子ライブラリの作成方法。
（６）上記（５）の方法により得られた変異遺伝子ライブラリ。
（７）上記（６）の変異遺伝子ライブラリを翻訳または発現したものである　変異タンパク質ライブラリ。
【０００６】
以下、本発明の組み換えベクターの作成法について図１を参照しながらさらに詳細に説明する。
（１）　遺伝子断片の調製；本発明において組み換えプラスミドにおいて含有させる対象遺伝子断片は、化学合成したもの、各種遺伝子源から制限酵素等のヌクレアーゼを用いて切り出したもの（ａ’）、あるいはアッパープライマー、ロウワープライマーを用い、遺伝子あるいは該遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、ＰＣＲにより複製増幅したもの（ａ）等が挙げられるが、これらに限らずいかなるものであってもよい。
【０００７】
また、上記ＰＣＲ法として変異ＰＣＲ法を使用する場合、得られるものは種々の変異遺伝子の集合体であり、これを用いて、本発明の組み換えプラスミドの作成方法を実施すれば、後記することから明らかなように、変異遺伝子ライブラリを作成できる。
【０００８】
（２）　ＰＣＲによる組換えプラスミド合成；本発明においては、上記各種方法により得た遺伝子断片の全長をＰＣＲのプライマーとする。すなわち、該遺伝子断片の各相補鎖全体をプライマーとし、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行う。
上記ＰＣＲにおいては、鋳型プラスミドを加熱してその相補鎖を解離させ、次いで、プライマーとなる該遺伝子断片の各相補鎖を反応系に加え、冷却して上記分離された鋳型プラスミドの各相補鎖にそれぞれ該遺伝子断片の各相補鎖をハイブリダイズさせる。この後ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオチドを加え、各プライマーの下流側に、鋳型プラスミドを鋳型にしたＤＮＡ鎖を伸長させる。この操作を複数サイクル行い、上記各プライマーの下流側に鋳型プラスミドの上記相同配列部分を除いたプラスミドの配列が付加された線状ＤＮＡを複製増幅する。
【０００９】
（３）　鋳型プラスミド切断除去；この後、ＤｐｎＩ等により環状プラスミドである鋳型プラスミドを消化する。
これにより得られるものは、２本鎖ＤＮＡからなるとともに、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖が、上記遺伝子断片部分と、上記相同配列部分を除くプラスミド部分とからなるニックの入った線状の組み換えプラスミドである。
【００１０】
なお、上記ＤｐｎＩはメチル化されたＤＮＡのみを特異的に切断するため、ｄａｍ^＋の遺伝子型をもつエシェリシア　コリー内などで増幅されたプラスミドが基質となり、メチル化されていないヌクレオチドを用いて合成されたＰＣＲ産物などは切断を受けない。
このことにより、新たに合成されたニックの入ったプラスミドが形質転換能を有し、ＤｐｎＩで切断された鋳型プラスミドは形質転換能を有さなくなる。
（４）　形質転換；上記（３）の工程により得られた、線状の２本鎖ＤＮＡからなる組み換えプラスミドを宿主細胞に導入して該細胞の形質転換を行う。上記線状の組み換えプラスミドは、各相補のＤＮＡ鎖を基にその欠陥部分が修復され、環状プラスミドとなり、宿主細胞において複製され、該遺伝子断片のクローニングあるいはその発現が可能となる。
【００１１】
以上説明したように、本発明においては、組み換えプラスミドの作成において、遺伝子断片をプラスミドに制限酵素及びリガーゼを用いて挿入する手法ではなく、いわば、該遺伝子断片をプライマーとして、プラスミド部分を合成するものであって、このような組み換えプラスミドの作成法によれば、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンが出現しないことは容易に理解されることである。
【００１２】
また、従来、環状プラスミドを鋳型とし、ＰＣＲ法により全プラスミド配列を合成する方法もあるが、この方法で使用するプライマーは、たかだか２５−４０塩基対程度の長さの化学合成オリゴヌクレオチドであり、通常数千塩基対程度からなるプラスミド全体のうちの、ごくわずかな塩基の部位特異的な置換を目的としたものである。これに対して、本発明は、組み換え対象遺伝子の各相補鎖の全長をプライマーとするものであって、例えば数百塩基対以上の長さの遺伝子断片をプライマーとするものである。そしてこのような全長遺伝子断片をプライマーとして用いて、これら全長遺伝子断片部分の配列を含むプラスミド全体を合成して組み換えプラスミドを作成しようとするものであり、このような試みは従来なされておらず、本発明は全く新しい着想に基づくものである。
さらに、本発明の組み換えプラスミドの作成法は変異遺伝子ライブラリの形成において極めて有効である。
【００１３】
本発明において変異遺伝子ライブラリを作成するには、上記したように、まず組み換え対象となる遺伝子断片を変異ＰＣＲ法により作成するが、この際得られるものは種々の変異遺伝子の集合体であり、これをそのままプライマーとして用いる。一方、鋳型プラスミドとしては、上記集合体の各変異遺伝子と相同性があり、上記各変異遺伝子とハイブリダイズ可能な遺伝子部分を有するプラスミドを使用してＰＣＲ法を行う。ＰＣＲにおいては、集合体の各変異遺伝子断片を構成する各相補鎖は、鋳型となる相同遺伝子部分の各相補鎖とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより、その下流側に鋳型プラスミドの相同遺伝子部分を除く配列に対応するＤＮＡ鎖を伸長し、ニックの入った線状の組み換えプラスミドが合成される。この操作を複数サイクル繰り返し、該線状の組み換えプラスミドを複製増幅する。このＰＣＲ法により複製増幅されて得られるものは、一つのプラスミドに対し変異遺伝子を一つのみ含み、プラスミド部分の配列を共通にする組み換えプラスミドの集合体である。
【００１４】
次いで、この組み換えプラスミドにより大腸菌等の宿主細胞を形質転換して、培地に培養し、生じたコロニー毎に釣菌し、各培地に分けて培養することにより各変異遺伝子をクローニングし、変異遺伝子ライブラリとする。
また、この遺伝子ライブラリの遺伝子を大腸菌等の宿主細胞内で翻訳あるいは発現させることにより、変異タンパク質ライブラリとすることもできる。
【００１５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、クローニングの対象となる挿入遺伝子断片として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子を用い（Ｓｃｈｏｌｚ　Ｏ，　Ｔｈｉｅｌ　Ａ，　Ｈｉｌｌｅｎ　Ｗ，　Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ　Ｍ．　２０００．　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６７（６）：１５６５−１５７０）、ＰＣＲの鋳型にはＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を含む）を用いた。
【実施例１】
（１）　鋳型プラスミドの調製
ＧＦＰ＋遺伝子以外のベクター部分は、Ｄａｔｅら（Ｄａｔｅ　Ｔ，　Ｔａｎｉｈａｒａ　Ｋ，　Ｎｕｍｕｒａ　Ｎ．　１９９０．　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃ−Ｍｙｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ａｔ　ａ　ｎｏｎ−ＡＵＧ　ｃｏｄｏｎ　ｉｎ　ｅｘｏｎ　１．　Ｇｅｎｅ　９０（１）：１４１−１４４）により作成されたｐＴＤ−ｔａｃをもとに、該プラスミドの有する唯一のＮｃｏＩ認識部位（ＣＣＡＴＧＧ）をＮｄｅＩ認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）に変換したプラスミドｐＴＤ−ｔａｃＮｄを作成した。次に、ＧＦＰ＋遺伝子の該ベクターへのクローニングは、以下のように行われた。即ち、２つのプライマー、５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴ−３’（配列表の配列番号１）及び５’−ＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧ−３’（同配列番号２）を用いて、クロンテック社製のＧＦＰｕｖをコードするプラスミドｐＧＦＰｕｖよりＧＦＰ遺伝子領域を定法に従いＰＣＲ法により増幅した。次に、増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、先に同様の制限酵素により切断しておいたｐＴＤ−ｔａｃＮｄとを定法に従いライゲーションにより連結した。こうして得られたＧＦＰｕｖを発現する組み換えプラスミドに対し、ストラタジーン社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットにより部位指定突然変異を行い、６４番目及び６５番目の位置のアミノ酸置換を行った。即ち、２つのプライマー、５’−ＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣ−３’（同配列番号３）及び
５’−ＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧ−３’（同配列番号４）を用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットのマニュアルに従い実験を行った。こうして得られたＧＦＰ＋遺伝子部分の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号５及び６に示す。本プラスミドは、イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドによる誘導により、蛍光をもった活性なＧＦＰ蛋白質を発現させる。
上記ＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドは、エシェリシア　コリーＪＭ１０９（ｄａｍ^＋）内で増幅し、キアゲン社製のプラスミド精製キットを用いて精製した。
このＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドは以下の工程において本発明の鋳型プラスミドとして用いられる。このプラスミドの塩基配列を配列表に配列番号７として示す。
【００１６】
（２）　クローニングする断片の調製
ＧＦＰ遺伝子を変異ＰＣＲ法により増幅し、プライマーとなるＤＮＡ断片を調製した。変異ＰＣＲは定法に従い行った。反応溶液（総量５０μｌ）は、１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　８．３）、５０ｍＭ　塩化カリウム、７ｍＭ　塩化マグネシウム、０．４ｍＭ　塩化マンガン、０．０１％ゲラチン、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＣＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ、各２５ｐｍｏｌ　プライマー、５０ｎｇの上記（１）で得た鋳型プラスミド、１．２５ユニット　Ｔａｑ２０００　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含む。用いたＰＣＲプライマー（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（同輩列番号８）及び５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣ−３’（同配列番号９）は、ベクターの配列の一部であり、ＧＦＰ遺伝子の全体を増幅するように設計されている。本溶液を９５℃　１分間の保温後、９４℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　３０秒の温度サイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。鋳型ＤＮＡは以下のＰＣＲによるプラスミド合成反応においても用いられるため、得られたＰＣＲ産物とともにキアゲン社製のＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ；登録商標）により同時に精製し、６０μｌの水で溶出した。
【００１７】
（３）　組換えプラスミドのＰＣＲ合成
上記（２）で得たＤＮＡをプライマーに、（１）で得た変異前の遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲを行うことにより、環状プラスミドのＰＣＲ合成を行った。反応溶液（総量５０μｌ）は、２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　８．８）、１０ｍＭ　塩化カリウム、１０ｍＭ　硫酸アンモニウム、２ｍＭ　硫酸マグネシウム、各０．２ｍＭ　デオキシリボヌクレオチド混合物、０．１％　トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ　牛血清アルブミン、（１）で得られたＰＣＲ産物及び鋳型プラスミド　４０μｌ、１．２５ユニット　ＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含む。本溶液を６８℃にて５分間の保温後、９５℃にて５分間保温し、さらに９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、６８℃　６分の温度サイクルを１８回繰り返した。最初の６８℃にて５分間の保温は、（２）で得られたＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ増幅断片の３’末端にアデニンが付加されているため、３’→５’ヌクレアーゼ活性をもったＰｆｕポリメラーゼによりこれを除去するためである。
【００１８】
（４）　合成プラスミド溶液のＤｐｎＩ処理
上記（３）で合成されたプラスミドに対し、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＢ社製）を２０ユニット加え、３７℃で１時間保温し、鋳型として用いたプラスミドＤＮＡの切断除去を行った。
【００１９】
【実施例２】
（１）　ライブラリの調製
【実施例１】（４）で調製された合成プラスミドを含む溶液を、エシェリシアコリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡社製）に導入し、形質転換体を寒天プレート上にコロニーを形成させた。形質転換体を爪楊枝で１１５２個突き、１００μｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む１ｍｌのＬＢ培地の入った９６穴深型マイクロプレートに植菌した。
【００２０】
（２）　ライブラリの蛍光スクリーニング
マイクロプレートを３７℃で１６時間振とう培養した。一部（１００μｌ）の培養液を分取し、ＧＦＰの発する蛍光（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５０９ｎｍ）を指標にスクリーニングを行った。結果を図２に示す（蛍光強度の強いものから順に並べてある）。
（３）　ライブラリの制限酵素チェック
（２）で得られたライブラリスクリーニングの結果より、蛍光を発しないクローンを２４個無作為に拾い、制限酵素チェックを行った。その結果、いずれのクローンにおいてもベクターに一つずつのＧＦＰ遺伝子が挿入されており、クローニング操作自体は正しく行われていることが確認された。
【００２１】
（４）　変異体ＧＦＰの変異部位の決定
上記（２）におけるスクリーニングにより蛍光強度の強かったクローンのうち１つを単離し、ＧＦＰコード部位の塩基配列を決定した。その結果、４９６番目の塩基がＡからＣに変わり、これに応じ前者においては１６６番目のアミノ酸がリジンからグルタミンへ変わっていた。
【００２２】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、自己環状化されたベクターや複数の断片が一つのベクターに組み込まれるといった、従来法にみられる制限酵素とライゲーションの組み合わせにより起こるクローニング・エラーを生じることがなく、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片のみ含む組み換えベクターを得ることができ、これにより遺伝子を確実、正確にクローニングすることが可能となる。こうしてクローニング・エラーを排除することは、変異遺伝子ライブラリあるいはこれを翻訳ないしは発現させた変異タンパク質ライブラリを作成する際にとりわけ有益である。
【００２３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組み換えプラスミドの作成工程の概要を示す図である。
【図２】ＧＦＰ蛋白質の変異ライブラリの蛍光スクリーニングの結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides a method for preparing a novel recombinant plasmid, a recombinant plasmid obtained by the method, a method for preparing a mutant gene library by applying the method for preparing the recombinant plasmid, a mutant gene library obtained by using the method, and It relates to a mutant protein library.
[0002]
[Prior art]
Cloning of a gene fragment into a vector using a combination of a restriction enzyme and a ligase is an established technique, but the problem is that the vector is self-cyclized or a clone in which multiple inserts are inserted into one vector. It was. This is a particularly serious problem when preparing a mutant gene library for screening the function of each gene. Therefore, a method for reliably cloning one insert into one vector has been desired.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above-mentioned problems of the prior art, the object of the present invention is to eliminate the clone in which a plurality of insert fragments are inserted into one vector and self-cyclization of a vector, and to ensure that one gene fragment per one vector. And a technique for obtaining a useful mutant gene library or mutant protein library using the technique.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the inventor of the present invention has difficulty in solving the above-described problems of the prior art by employing the above-described method for preparing a recombinant vector using restriction enzymes and ligases of the prior art, and thus, preparing a recombinant vector by an entirely different approach from the prior art. In order to provide a method, as a result of intensive studies, a method of obtaining a recombinant vector by performing PCR using a vector having a homologous sequence hybridizing with the gene as a template while using the full length of each complementary strand in a gene fragment as a primer And completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention relates to the following (1) to (5).
(1) A method for preparing a recombinant plasmid containing the gene fragment for cloning or expression of the gene fragment, wherein the full length of each complementary strand in the gene fragment is used as a primer and hybridizes with the gene. A method for producing a recombinant plasmid, comprising performing PCR using a plasmid having a homologous sequence as a template.
(2) The method of (1) above, further comprising a step of performing PCR and then cutting and removing the plasmid used as a template with a restriction enzyme DpnI after performing PCR. Method.
(3) A recombinant plasmid obtained by the preparation method of (1) above, which comprises double-stranded DNA, and wherein each DNA strand of the double-stranded DNA has the above-mentioned gene fragment portion and the above-mentioned homologous sequence portion removed. A recombinant plasmid comprising a linear DNA consisting of:
(4) The recombinant plasmid according to (3), which is circularized by repair in the cell upon introduction into the host cell.
(5) A method for preparing a mutated gene library including a step of obtaining a recombinant plasmid containing each mutated gene fragment by using a sample containing a plurality of mutated gene fragments. A method for preparing a mutant gene library, wherein PCR is carried out using a full-length complementary strand as a primer and a plasmid having a homologous sequence that hybridizes to these gene fragments as a template.
(6) A mutant gene library obtained by the method of (5).
(7) A mutant protein library obtained by translating or expressing the mutant gene library of (6).
[0006]
Hereinafter, the method for preparing the recombinant vector of the present invention will be described in more detail with reference to FIG.
(1) Preparation of gene fragment; The target gene fragment to be contained in the recombinant plasmid in the present invention is chemically synthesized, cut out from various gene sources using a nuclease such as a restriction enzyme (a ′), or an upper primer, Examples thereof include those (a) replicated and amplified by PCR using a lower primer and a gene or a plasmid containing the gene as a template, but not limited thereto.
[0007]
In addition, when the mutant PCR method is used as the PCR method, what is obtained is an aggregate of various mutant genes, and if the method for producing the recombinant plasmid of the present invention is carried out using this, it will be described later. Clearly, a mutant gene library can be created.
[0008]
(2) Recombinant plasmid synthesis by PCR; In the present invention, the full length of the gene fragment obtained by the above various methods is used as a primer for PCR. That is, PCR is performed using the entire complementary strand of the gene fragment as a primer and a plasmid having a homologous sequence that hybridizes with the gene as a template.
In the PCR, the template plasmid is heated to dissociate its complementary strand, and then each complementary strand of the gene fragment serving as a primer is added to the reaction system, and cooled, and the complementary strand of each of the separated template plasmids is added. Each complementary strand of the gene fragment is hybridized. Thereafter, a DNA polymerase and nucleotides are added, and a DNA strand using the template plasmid as a template is extended downstream of each primer. This operation is performed for a plurality of cycles to replicate and amplify the linear DNA to which the sequence of the plasmid excluding the homologous sequence portion of the template plasmid is added downstream of each of the primers.
[0009]
(3) Cleavage and removal of the template plasmid; Thereafter, the template plasmid which is a circular plasmid is digested with DpnI or the like.
The resulting product is composed of double-stranded DNA, and each DNA strand of the double-stranded DNA has a nicked linear recombination composed of the gene fragment portion and the plasmid portion excluding the homologous sequence portion. It is a plasmid.
[0010]
Since DpnI specifically cuts only methylated DNA, the plasmid amplified in Escherichia coli having a dam ⁺ genotype serves as a substrate, and is synthesized using unmethylated nucleotides. PCR products are not cleaved.
As a result, the newly synthesized nicked plasmid has a transforming ability, and the template plasmid cut with DpnI has no transforming ability.
(4) Transformation: The recombinant plasmid comprising the linear double-stranded DNA obtained in the above step (3) is introduced into a host cell to transform the cell. The linear recombinant plasmid has its defective portion repaired on the basis of each complementary DNA strand, becomes a circular plasmid, is replicated in a host cell, and the gene fragment can be cloned or expressed.
[0011]
As described above, in the present invention, in the production of a recombinant plasmid, rather than inserting a gene fragment into a plasmid using restriction enzymes and ligases, a method of synthesizing a plasmid portion using the gene fragment as a primer However, according to such a method for preparing a recombinant plasmid, it can be easily understood that self-cyclization of a vector and a clone in which a plurality of inserts are inserted into one vector do not appear. .
[0012]
Conventionally, there is also a method of synthesizing the entire plasmid sequence by PCR using a circular plasmid as a template, but the primers used in this method are chemically synthesized oligonucleotides having a length of at most about 25 to 40 base pairs, It is intended for site-specific substitution of a very small number of bases in the entire plasmid, which usually comprises about several thousand base pairs. In contrast, the present invention uses the full length of each complementary strand of the gene to be recombined as a primer, for example, a gene fragment having a length of several hundred base pairs or more. Then, using such a full-length gene fragment as a primer, the entire plasmid containing the sequence of these full-length gene fragments is synthesized to prepare a recombinant plasmid, and such an attempt has not been made before. The invention is based on a completely new idea.
Further, the method for preparing a recombinant plasmid of the present invention is extremely effective in forming a mutant gene library.
[0013]
In the present invention, in order to create a mutant gene library, as described above, first, a gene fragment to be recombined is created by a mutation PCR method, and what is obtained at this time is an aggregate of various mutant genes, Is used as a primer as it is. On the other hand, as a template plasmid, a PCR method is performed using a plasmid which has homology with each mutant gene of the above-mentioned assembly and has a gene portion capable of hybridizing with each mutant gene. In PCR, each complementary strand constituting each mutant gene fragment of the assembly hybridizes with each complementary strand of the homologous gene portion serving as a template, and the DNA polymerase removes the homologous gene portion of the template plasmid downstream thereof by DNA polymerase. The DNA strand corresponding to the sequence is extended, and a nicked linear recombinant plasmid is synthesized. This operation is repeated for a plurality of cycles, and the linear recombinant plasmid is replicated and amplified. The product obtained by replication and amplification by this PCR method is an assembly of recombinant plasmids containing only one mutant gene per plasmid and having a common plasmid sequence.
[0014]
Next, host cells such as Escherichia coli are transformed with the recombinant plasmid, cultured in a medium, each colony produced is culled, and cultivated separately in each medium to clone each mutant gene, thereby obtaining a mutant gene library. And
Further, a mutant protein library can be obtained by translating or expressing the genes of this gene library in a host cell such as Escherichia coli.
[0015]
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these Examples.
In the following examples, a gene for green fluorescent protein (GFP) was used as an inserted gene fragment to be cloned (Scholz O, Thiel A, Hillen W, Niederweis M. 2000. Quantitative analysis of gene expression). A plasmid (including an ampicillin resistance gene) into which a GFP gene was inserted was used as a template for PCR, an animated green fluorescen protein, European Journal of Biochemistry 267 (6): 1565-1570.
Embodiment 1
(1) Preparation of Template Plasmid The vector portion other than the GFP + gene was prepared according to Date et al. (Date T, Tanihara K., Numura N. 1990. Construction of Escherichia licensing factors for presentation and presentation. a non-AUG codon in exon 1. Based on pTD-tac created by Gene 90 (1): 141-144), the unique NcoI recognition site (CCATGG) of the plasmid was replaced with an NdeI recognition site (CATATG). The plasmid pTD-tacNd converted into was prepared. Next, cloning of the GFP + gene into the vector was performed as follows. That is, using two primers, 5′-GGCATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing) and 5′-GGTAATGGTAGCGACCGGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 2), a plasmid pGFPuv encoding GFPuv from Clontech. The GFP gene region was amplified by PCR according to a standard method. Next, the amplified fragment was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and ligated to pTD-tacNd, which had been digested with the same restriction enzymes, by a conventional method. The thus obtained recombinant GFPuv-expressing plasmid was subjected to site-directed mutation using the QuikChange kit manufactured by Stratagene, and amino acid substitution at the 64th and 65th positions was performed. That is, using two primers, 5′-CCAACACTTGTCACTACTTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-GGAAAAAGCATTTGAACACCATAAGTTTAAAGTAGTGGACAAGGTTGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4), and using a manual of QuigC in the experiment kit. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the GFP + gene portion thus obtained are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 in the sequence listing, respectively. This plasmid expresses a fluorescent and active GFP protein by induction with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside.
The plasmid having the GFP gene inserted therein was amplified in Escherichia coli JM109 (dam ⁺ ) and purified using a plasmid purification kit manufactured by Qiagen.
The plasmid into which the GFP gene has been inserted is used as a template plasmid of the present invention in the following steps. The nucleotide sequence of this plasmid is shown as SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
[0016]
(2) Preparation of a fragment to be cloned The GFP gene was amplified by the mutant PCR method, and a DNA fragment to be used as a primer was prepared. Mutation PCR was performed according to a standard method. The reaction solution (50 μl in total volume) contains 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 7 mM magnesium chloride, 0.4 mM manganese chloride, 0.01% gelatin, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 mM It contains dCTP, 1 mM dTTP, 25 pmol of each primer, 50 ng of the template plasmid obtained in the above (1), and 1.25 units of Taq2000 DNA polymerase (manufactured by Stratagene). The PCR primers used (5'-AGCGGATACAAATTTCACACAGG-3 '(equals col. No. 8) and 5'-GTAAAACGACGGCCAGTGCC-3' (seq. No. 9) are part of the sequence of the vector and amplify the entire GFP gene. After keeping the solution at 95 ° C. for 1 minute, a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 25 times, and finally, the solution was kept at 72 ° C. for 5 minutes. Since the template DNA was also used in the following plasmid synthesis reaction by PCR, it was simultaneously purified with the obtained PCR product using a Qiagen DNA purification kit (QIAquick; registered trademark) and eluted with 60 μl of water.
[0017]
(3) PCR synthesis of recombinant plasmid PCR is performed using the DNA obtained in (2) above as a primer and the plasmid containing the gene before mutation obtained in (1) as a template to perform PCR synthesis of the circular plasmid. went. The reaction solution (50 μl in total volume) was made up of 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium sulfate, a mixture of 0.2 mM deoxyribonucleotide, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg / Ml bovine serum albumin, containing the PCR product obtained in (1) and 40 μl of the template plasmid, 1.25 units of PfuTurbo DNA polymerase (manufactured by Stratagene). This solution was kept at 68 ° C. for 5 minutes, then kept at 95 ° C. for 5 minutes, and a temperature cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 6 minutes was repeated 18 times. The first incubation at 68 ° C. for 5 minutes was carried out by adding adenine to the 3 ′ end of the PCR-amplified fragment obtained by the Taq polymerase obtained in (2), since Pfu polymerase having 3 ′ → 5 ′ nuclease activity was added. This is to remove this.
[0018]
(4) DpnI Treatment of Synthetic Plasmid Solution To the plasmid synthesized in the above (3), 20 units of restriction enzyme DpnI (manufactured by NEB) was added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour to cleave the plasmid DNA used as a template. Removal was performed.
[0019]
Embodiment 2
(1) Preparation of library [Example 1] The solution containing the synthetic plasmid prepared in (4) was introduced into competent cells of Escherichia coli JM109 (manufactured by Toyobo), and the transformant was placed on an agar plate. Were allowed to form colonies. 1152 transformants were pierced with a toothpick and inoculated into a 96-well deep microplate containing 1 ml of LB medium containing 100 μg / l ampicillin and 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. .
[0020]
(2) The fluorescence screening microplate of the library was cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. A portion (100 μl) of the culture solution was collected and screened using the fluorescence emitted by GFP (excitation wavelength 488 nm, fluorescence wavelength 509 nm) as an index. The results are shown in FIG. 2 (ordered in descending order of fluorescence intensity).
(3) Restriction enzyme check of library From the results of library screening obtained in (2), 24 clones that did not emit fluorescence were randomly picked and checked for restriction enzymes. As a result, in each of the clones, one GFP gene was inserted into the vector, and it was confirmed that the cloning operation itself was correctly performed.
[0021]
(4) Determination of Mutant Site of Mutant GFP One of the clones having high fluorescence intensity by the screening in the above (2) was isolated, and the nucleotide sequence of the GFP coding site was determined. As a result, the 496th base changed from A to C, and accordingly, in the former, the 166th amino acid changed from lysine to glutamine.
[0022]
【The invention's effect】
As is apparent from the above description, according to the present invention, a cloning error caused by a combination of a restriction enzyme and ligation found in a conventional method, such as a self-cyclized vector or a plurality of fragments being integrated into one vector, is obtained. , And a recombinant vector containing only one gene fragment for one vector can be obtained, whereby the gene can be reliably and accurately cloned. Eliminating cloning errors in this way is particularly useful when creating a mutant gene library or a mutant protein library obtained by translating or expressing the same.
[0023]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an outline of a step of preparing a recombinant plasmid of the present invention.
FIG. 2 shows the results of fluorescence screening of a GFP protein mutant library.

Claims

A method for preparing a recombinant plasmid containing the gene fragment for cloning or expression of the gene fragment, comprising using the full length of each complementary strand in the gene fragment as a primer, and a homologous sequence hybridizing with the gene. A method for producing a recombinant plasmid, comprising performing PCR using a plasmid having the following as a template.

The method according to claim 1, further comprising a step of, after performing PCR, cleaving and removing a plasmid used as a template with a restriction enzyme DpnI.

A recombinant plasmid obtained by the method according to claim 2, wherein the recombinant plasmid is composed of double-stranded DNA, and each DNA strand of the double-stranded DNA is composed of the gene fragment portion and the plasmid portion excluding the homologous sequence portion. A recombinant plasmid comprising linear DNA.

4. The recombinant plasmid according to claim 3, which is circularized by repair in the cell upon introduction into the host cell.

Using a sample containing a plurality of mutant gene fragments, a method for creating a mutant gene library comprising a step of obtaining a recombinant plasmid each containing one mutant gene fragment, comprising: A method for preparing a mutant gene library, wherein PCR is performed using a plasmid having a homologous sequence that hybridizes to these gene fragments as a template, using the full length as a primer.

A mutant gene library obtained by the method of claim 5.

A mutant protein library obtained by translating or expressing the mutant gene library according to claim 6.