JP3859947B2 - Mutagenesis method - Google Patents

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    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6827Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Description

【0001】 [0001]
【発明の属する技術分野】 BACKGROUND OF THE INVENTION
本発明は、例えば、塩基配列の所定の部位に所定の変異を導入する際、或いは、塩基配列の所定の部位にランダムな変異を導入する際に適用される、全く新規な突然変異導入方法に関する。 The present invention is, for example, when introducing a predetermined mutation at a predetermined site in the nucleotide sequence, or, about the applied method quite novel mutagenesis in introducing random mutations into a given site of the base sequence .
【0002】 [0002]
【従来の技術】 BACKGROUND OF THE INVENTION
部位特異的突然変異導入方法は、例えば、タンパク質の構造と機能における特定のアミノ酸残基の重要性を評価するための突然変異体を作製する上で、強力なツールとして使用されている。 Site-directed mutagenesis method, for example, in manufacturing the mutants to assess the importance of specific amino acid residues in the protein structure and function have been used as a powerful tool. この部位特異的突然変異導入方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を用いた様々なプロトコールが確立されている。 As the site-directed mutagenesis method, various protocols using polymerase chain reaction (PCR method) has been established.
【0003】 [0003]
PCR法に基づくプロトコールのうち、Quik Change TM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)(以下、Quik Change法と呼ぶ。)は広く用いられている。 Of the protocols based on PCR method, Quik Change TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ( hereinafter, referred to as a Quik Change method.) Is widely used. Quik Change法のプロトコールによれば、以下の3工程を経ることによって突然変異を有するDNAを得ることができる。 According to the protocol of the Quik Change method, it is possible to obtain a DNA having a mutation by passing through the following three steps.
1). 1). 所望の部位に突然変異を有するように設計された相補的な一対のプライマーを用いてPCR法を行う工程。 A step of performing PCR using a pair of complementary primers designed to have a mutation in the desired site.
2). 2). 反応液中の鋳型DNA(変異を有さない)のみを消化する工程。 A step of digesting only template DNA in the reaction solution (no mutation).
3). 3). 上記工程で消化されなかったDNA断片を用いて形質転換する工程。 Step of transforming with a DNA fragment that has not been digested by the process.
【0004】 [0004]
特に、Quik Change法では、PCR法を行う工程において、鋳型DNAとしてスーパーコイルの二本鎖(ds)DNAプラスミドを用い、また、酵素として高忠実性(high-fidelity)のPfu Turbo TM DNAポリメラーゼを用いる。 In particular, the Quik Change method, in the step of performing a PCR method, using the double-stranded (ds) DNA plasmids supercoiled as template DNA, also the Pfu Turbo TM DNA polymerase high fidelity (high-fidelity) as an enzyme used. PCR法を行う工程では、相補的な一対のプライマーをdsDNAにアニーリングさせた後に伸長反応を行い、変異を有するとともに伸長末端とプライマーの5'末端との間にニック(切れ目)が入ったDNA断片を増幅する。 In the step of performing PCR, a pair of complementary primers do extension reaction after annealing in dsDNA, DNA fragments nick (cut) has entered between the 5 'end of the extended end and a primer which has a mutation to amplify.
【0005】 [0005]
次いで、Quik Change法では、反応溶液にDpnIエンドヌクレアーゼを作用させることによって、完全メチル化またはヘミメチル化された5'-GATC-3'配列を特異的に切断する。 Then, the Quik Change method, by the action of DpnI endonuclease reaction solution, specifically cleaves fully methylated or hemi-methylated 5'-GATC-3 'sequence. 次に、所望の突然変異を含むin vitroで合成されニックを有するプラスミドDNAは、大腸菌(E.coli)中へ形質転換される。 Then, plasmid DNA having a nick is synthesized in vitro containing the desired mutation are transformed into E. coli (E. coli). これにより、ニックを有するプラスミドDNAは、大腸菌内で修復されて環状となる。 Thus, plasmid DNA having a nick is a cyclic been repaired in E. coli.
【0006】 [0006]
このように、Quik Change法によれば、所望の部位に突然変異を有するDNAを合成することができる。 Thus, according to the Quik Change method, it is possible to synthesize a DNA having a mutation in the desired site. しかしながら、Quik Change法は、以下の問題を有している。 However, Quik Change method has the following problems.
1). 1). 塩基配列における比較的離れた位置に、複数の変異を同時に導入することができない。 Relatively distant positions in the nucleotide sequence, it is impossible to introduce multiple mutations simultaneously. すなわち、この方法では、相補的な一対のプライマー内においてのみ複数の変異を導入することができるが、離れた位置に複数の変異を導入することは不可能である2). That is, in this method, it is possible to introduce multiple mutations only in a complementary pair in the primer, it is not possible to introduce multiple mutations into a position away 2). 突然変異を導入する際に、相補的な一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。 When introducing mutations, requiring complementary pair of synthetic oligonucleotide primers. すなわち、この方法では、1カ所の変異を導入するために2本のプライマーを要する。 That is, in this method, requires two primers to introduce mutations in one place.
3). 3). 相補的な一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを必要とするため、縮重プライマーを用いて所望の部位にランダムに突然変異を導入することができない。 Requires a complementary pair of synthetic oligonucleotide primers, it is not possible to introduce mutations randomly to a desired site using degenerate primers.
【0007】 [0007]
Quik Change法では、上記1)の問題があるため、複数の部位に突然変異を導入する際に上述した3工程を変異導入する数に相当する回数繰り返す必要がある。 The Quik Change method, because of the above 1) in question, it is necessary to repeat the number of times corresponding to the number of mutated three steps described above when introducing mutations at multiple sites. このため、Quik Change法によれば、複数の部位に突然変異を導入する場合に長時間を要し、効率が悪いといった不都合がある。 Therefore, according to the Quik Change method requires a long time in the case of introducing mutations at multiple sites, efficiency is disadvantage poor. また、Quik Change法では、上記2)の問題があるため、一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成或いは購入するためのコストがかかり、コスト高となってしまう。 Further, in the Quik Change method, because of the above 2) in question, costly to synthesize or purchase a pair of synthetic oligonucleotide primers, resulting in a high cost. さらに、Quik Change法では、上記3)の問題があるため、例えば、解析対象のタンパク質における所定のアミノ酸残基を様々な他のアミノ酸に変異させるような実験系にには使用することができず、適用可能な実験系が限られてしまう。 Furthermore, the Quik Change method, since it is above 3) in question, for example, can not be used in the experimental system as mutating certain amino acid residues in the protein to be analyzed in a variety of other amino acids , applicable experimental system is limited.
【0008】 [0008]
【発明が解決しようとする課題】 [Problems that the Invention is to Solve
そこで、本発明は、上述したような従来の問題に鑑み、簡易に、迅速に、低コストに且つ広範囲に亘って応用可能な、全く新規な突然変異導入方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the conventional problems as described above, simply, quickly, it can be applied over a and extensively low cost, totally and to provide a novel mutagenesis methods.
【0009】 [0009]
【課題を解決するための手段】 In order to solve the problems]
上述した目的を達成した本発明に係る突然変異導入方法は、少なくとも1以上の変異を有する塩基配列を含み、5'末端がリン酸化された1又は2以上のプライマーを鋳型DNAにアニーリングさせ、その後、耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、反応後、耐熱性DNAリガーゼを用いてリン酸化された5'末端と伸長末端とを連結することにより、上記プライマーを含む環状DNAを合成するDNA合成工程と、上記DNA合成工程を複数回繰り返して上記プライマーを含むDNAを増幅した後、少なくとも増幅された環状DNAを除くDNAを複数の断片に消化する消化工程と、上記消化工程で得られた複数の断片をメガプライマーとして、該メガプライマーを上記DNA合成工程で合成された上記環状DNAにアニー Mutagenesis method according to the present invention which achieves the above objects comprises a nucleotide sequence having at least one or more mutations, one or more primers 5 'ends were phosphorylated and annealed to the template DNA, then carried out an extension reaction using the thermostable high-fidelity DNA polymerase, after the reaction, by connecting the phosphorylated 5 'end and extended ends using thermostable DNA ligase, a circular DNA comprising said primers a DNA synthesis step of synthesizing, after amplifying the DNA containing the above primers is repeated a plurality of times the DNA synthesis step, the digestion step to digest DNA with the exception of at least the amplified circular DNA into a plurality of fragments in the digestion step a plurality of fragments obtained as megaprimers, Annie the mega primer to the circular DNA synthesized in the DNA synthesis step リングさせ、その後、上記耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う2本鎖DNA合成工程とを備える。 It is a ring, then, and a double-stranded DNA synthesis step of performing an extension reaction using the heat-resistant high-fidelity DNA polymerase.
【0010】 [0010]
【発明の実施の形態】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
以下、本発明に係る突然変異導入方法について、図面を参照して詳細に説明する。 Hereinafter, the mutagenesis method according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings. 以下の例では、エクオレア(Aequorea)属が産生する緑色蛍光タンパク質(GFP)を改変した増強緑色蛍光タンパク質(以下、EGFPと呼ぶ。)をコードする遺伝子に対して、所定の部位に突然変異を導入する方法について説明する。 In the following example, Aequorea (Aequorea) genus enhanced green fluorescent protein (hereinafter, referred to as EGFP.) Which was modified green fluorescent protein (GFP) produced to the gene encoding, introduce mutations at predetermined sites how to it will be described. なお、本発明に係る突然変異導入方法は、当該遺伝子に対して突然変異を導入する際に限定されず、いかなる遺伝子に対しても適用される方法である。 Incidentally, mutagenesis method according to the present invention is not limited to the time of introducing mutations with respect to the gene, a method applied to any gene.
【0011】 [0011]
ここで、このEGFPをコードする遺伝子(配列番号1)は、GFPをコードする遺伝子(配列番号3)と比較してコドン使用頻度を変更し、また、GFPにおける1番目のメチオニンと2番目のセリンとの間にバリンをコードするコドンを付加することによって宿主内での発現が増強されたものである。 Here, the gene encoding the EGFP (SEQ ID NO: 1) changes the codon usage compared to the gene (SEQ ID NO: 3) encoding GFP, also, the first methionine in the GFP and the second serine in which expression in the host is increased by adding a codon encoding valine between. また、EGFP(配列番号2にアミノ酸配列を示す。)は、GFP(配列番号4にアミノ酸配列を示す。)の64番目のフェニルアラニンがロイシン(EGFPにおける65番目)に、65番目のセリンがトレオニン(EGFPにおける66番目)に置換されたものである。 Moreover, EGFP (shown in SEQ ID NO: 2.) Is the GFP 64 th phenylalanine leucine (. Which are shown in SEQ ID NO: 4) (65 th in EGFP), 65 serine threonine ( those substituted in position 66) in EGFP. 本明細書において、アミノ酸の位置を表記する場合は、全てGFPのアミノ酸配列に基づいて数えられた数値とする。 In this specification, may be referred to the position of the amino acid is a numerical value counted based on the amino acid sequence of all GFP. したがって、例えば「EGFPの66番目のチロシン」と記載する場合には、配列番号2における67番目のアミノ酸を意味する。 Thus, for example, to be referred to as a "66th tyrosine of EGFP" is meant the 67 amino acids in SEQ ID NO: 2.
本方法では、図1に示すように、「突然変異鎖の合成」を行う第1の工程と、「DpnIによる消化」を行う第2の工程と、「メガプライマーを用いた相補鎖の合成」を行う第3の工程とを経てEGFPをコードする遺伝子に突然変異を導入する。 In this method, as shown in FIG. 1, a first step of performing a "synthetic mutant strand", a second step of performing a "digestion by DpnI", "synthesis of a complementary strand using the Mega primer" through a third step of performing introducing mutations into genes encoding EGFP.
【0012】 [0012]
(1)「突然変異鎖の合成」 (1) "Synthesis of mutant strand"
先ず、既知のEGFPをコードする遺伝子の塩基配列(配列番号1)における所定の部位に変異を導入するための突然変異導入用プライマーを準備する。 First, a mutagenesis primer for introduction of mutation into a predetermined site in the nucleotide sequence of the gene encoding a known EGFP (SEQ ID NO: 1). 本方法では、同時に複数の突然変異を導入することができるため、突然変異を導入する部位の数に相当する数の突然変異導入用プライマーを準備する。 In this way, at the same time it is possible to introduce multiple mutations, preparing a mutagenesis primer for the number corresponding to the number of sites for introducing mutations.
【0013】 [0013]
これら突然変異導入用プライマーは、配列番号1に基づいて設計されるとともに配列番号1における所定の塩基を置換したものとして設計される。 These mutagenesis primers are designed as obtained by substituting predetermined bases in SEQ ID NO: 1 with are designed based on SEQ ID NO: 1. なお、突然変異導入用プライマーにおいては、単一の塩基を置換したものに限定されず、複数の塩基を置換したものであってもよい。 In the mutagenesis primers are not limited to those obtained by substituting a single nucleotide, or may be obtained by substituting several bases. この場合、突然変異導入用プライマーは、EGFPをコードする遺伝子を有するプラスミドに対してアニーリングすることができるように設計される。 In this case, mutagenesis primers are designed to be able to anneal with respect plasmid with the gene coding for EGFP.
これら突然変異導入用プライマーの5'末端は、例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化しておく。 5 'ends of these mutagenesis primer, for example, previously phosphorylated using T4 polynucleotide kinase. なお、Pri-1及びPri-2の5'末端をリン酸化する酵素としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼに限定されず、プライマーの5'末端をリン酸化できる酵素をいずれも使用することができる。 Incidentally, 'as the enzyme that phosphorylates terminal is not limited to the T4 polynucleotide kinase, 5' primer 5 of Pri-1 and Pri-2 can be used both enzymes terminal can phosphorylate.
【0014】 [0014]
具体的に、突然変異導入用プライマーとしては、例えばEGFPアミノ酸配列における66番目のチロシン(Y)をトリプトファン(W)に突然変異させるためのPri-1(5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCAGGGTGGT-3':配列番号5)及びEGFPアミノ酸配列における203番目のトレオニン(T)をチロシン(Y)に突然変異させるためのPri-2(5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3':配列番号6)を例示できる。 Specifically, the mutagenesis primers, for example, Pri-1 for mutating 66th tyrosine in EGFP amino acid sequence (Y) tryptophan (W) (5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCAGGGTGGT-3 ': SEQ ID NO: 5 ) and EGFP Pri-2 for 203 th threonine (T) in the amino acid sequence is mutated to tyrosine (Y) (5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3 ': SEQ ID NO: 6) can be exemplified.
【0015】 [0015]
また、EGFPをコードする遺伝子を有するプラスミドを準備する。 Further, to prepare a plasmid having a gene coding for EGFP. このプラスミドとしては、例えば、T7発現系を有するpRSET B (インビトロジェン(Invitrogen)社製)を使用することができる。 As the plasmid, for example, it can be used pRSET B (Invitrogen (Invitrogen) Inc.) having a T7 expression system. このとき、従来公知の手法を用いることによって、EGFPをコードする遺伝子を有するpRSET B (pRSET B /EGFP)を構築することができる。 At this time, by using a conventionally known method can be constructed pRSET B a (pRSET B / EGFP) with a gene encoding EGFP. なお、通常、プラスミドはメチル化されており、ここで使用されるpRSET B /EGFPもメチル化されている。 Normally, the plasmid is also methylated pRSET B / EGFP are methylated, as used herein.
【0016】 [0016]
突然変異鎖を合成する際には、これら突然変異導入用プライマー(Pri-1及びPri-2)及び当該プラスミド(pRSET B /EGFP)を用いたPCR法を行う。 In the synthesis of mutant chains, PCR method performs using these mutagenesis primer (Pri-1 and Pri-2) and the plasmid (pRSET B / EGFP). このPCR法において、プラスミドを鋳型とした突然変異導入用プライマーからの伸長反応は、耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼを用いる。 In this PCR technique, elongation reaction plasmids from mutation-introducing primer was a template, using a heat-resistant and high-fidelity DNA polymerase. この耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼは、TaqDNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼと比較して約10倍の忠実性を有するものであり、伸長鎖の3'末端に1塩基程度を余分に付加する活性がほとんどないため、鋳型DNAに対する相補鎖をほぼ間違えることなく合成することができる。 The heat-resistant and high-fidelity DNA polymerase, which has about 10 times the fidelity compared to thermostable DNA polymerases such as TaqDNA polymerase activity adding an extra about 1 nucleotide to the 3 'end of the extended strand since but little, it can be synthesized without mistaking substantially complementary strand to the template DNA. 耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼとしては、Pfu DNAポリメラーゼ(ストラタジーン社製, La Jolla, CA)を使用することができる。 The heat-resistant high-fidelity DNA polymerase, may be used Pfu DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) and. なお、耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼとしては、Pfu DNAポリメラーゼに限定されず、高忠実度を有し、且つ伸長鎖の3'末端に1塩基程度を余分に付加する活性がほとんどないものであればいかなるものを使用しても良い。 Incidentally, if the heat-resistant high-fidelity DNA polymerase is not limited to Pfu DNA polymerase has a high fidelity, and those little activity adding an extra about 1 nucleotide to the 3 'end of the extended strand if may be used any of those.
【0017】 [0017]
このPCR法においては、耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼを用いた伸長反応の後、突然変異導入用プライマーの5'末端と伸長したDNA鎖の3'末端とを、耐熱性DNAリガーゼにより連結する。 In this PCR, after the extension reaction using the thermostable high-fidelity DNA polymerase, and a 3 'end of the extended-terminated DNA strand 5' mutagenesis primer, ligated with a thermostable DNA ligase. 耐熱性DNAリガーゼとしては、特に限定されないが、例えば、Taq DNAリガーゼ(New England BioLabs)を使用することができる。 The heat-resistant DNA ligase is not particularly limited, for example, can be used Taq DNA ligase (New England BioLabs). 本方法においては、突然変異導入用プライマーの5'末端をリン酸化しているため、上述したような連結反応を行うことができる。 In this method, the 5 'end of the mutagenesis primers because of the phosphorylation, it is possible to perform coupling reaction as described above.
【0018】 [0018]
PCR法におけるサーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。 Thermal cycler in the PCR method were as follows program. すなわち、先ず、65℃、5分のプレインキュベーションを行ってTaq DNAリガーゼによる鋳型DNAのニックを修復し、その後、95℃、2分の最初の変性を行う。 That is, first, 65 ° C., and for 5 minutes pre-incubation to repair nicks template DNA with Taq DNA ligase, then performing 95 ° C., the initial denaturation for 2 minutes. 続いて、95℃、30秒のDNA変性、55℃、30秒のアニーリング反応、及び65℃、7分の伸長・連結反応を1サイクルとして18サイクル行う。 Subsequently, 95 ° C., 30 seconds DNA denaturation, 55 ° C., 30 sec annealing reaction, and 65 ° C., performing 18 cycles of elongation-ligation of 7 minutes as one cycle. 最後に、75℃、7分のポストインキュベーションを行う。 Finally, the 75 ℃, 7 minutes of post-incubation. このプログラムにおいて、65℃の伸長・連結反応を長く設定することによって、特に、Taq DNAリガーゼによる連結反応を完全に行うことができる。 In this program, by setting a longer extension-ligation reaction 65 ° C., in particular, it can be carried out complete coupling reaction with Taq DNA ligase.
【0019】 [0019]
このようなプログラムによって、EGFPをコードする遺伝子に、突然変異導入プライマーが有する突然変異を導入してなる変異EGFP遺伝子を有する単鎖プラスミドDNAのみを増幅することができる。 Such programs, the gene coding for EGFP, can amplify only single-stranded plasmid DNA having a mutation EGFP gene made by introducing mutations with mutations introduced primer. 具体的に、突然変異導入用プライマーとしてPri-1及びPri-2を用いて合成された変異EGFP遺伝子の塩基配列を配列番号8に示す。 Specifically, shows the base sequence of the mutant EGFP gene was synthesized using the Pri-1 and Pri-2 as mutagenesis primers in SEQ ID NO: 8.
【0020】 [0020]
なお、このPCR法の最終反応液中には、変異EGFP遺伝子を有する1本鎖プラスミドDNAと、鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖DNAと、鋳型となった2本鎖プラスミドと、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドDNA及び鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖DNAがアニールしてなる2本鎖DNAとを含んでいる。 Note that the final reaction solution of the PCR method, a single-stranded plasmid DNA having a mutation EGFP gene, and single-stranded DNA from the plasmid as a template, and the double-stranded plasmid as a template, the mutant single-stranded DNA from the plasmid became single-stranded plasmid DNA and templates with EGFP gene and a double-stranded DNA formed by annealing.
【0021】 [0021]
(2)「DpnIによる消化」 (2) "digestion with DpnI"
ここでは、上述したように得られた反応液中に、少なくとも、変異EGFP遺伝子を有する1本鎖DNA以外のDNAを消化する酵素を添加し、所定のDNAのみを消化して除去する。 Here, the reaction solution obtained as described above, at least, an enzyme that digests DNA other than single-stranded DNA having a mutation EGFP gene was added, removed by digestion with only a predetermined DNA. 例えば、使用可能な酵素としては、所定の塩基配列(5'-G m6 ATC-3')を認識して切断するDpnIを挙げることができる。 For example, usable enzymes include a DpnI that recognizes and cleaves a predetermined nucleotide sequence (5'-G m6 ATC-3 ').
反応溶液中にDpnIを添加した場合、反応溶液中に残存するメチル化したプラスミド(pRSET B /EGFP)と、反応溶液中に残存する変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドDNA及び鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖DNAがアニールしてなるヘミメチル化した2本鎖DNAとが選択的に切断されることとなる。 If the addition of DpnI to the reaction solution, and methylated plasmid remaining in the reaction solution (pRSET B / EGFP), was a single-stranded plasmid DNA and the template having a mutation EGFP gene remaining in the reaction solution plasmid and double-stranded DNA single stranded DNA from the you hemimethylated formed by annealing the is to be selectively cleaved. これにより、反応溶液中には、変異EGFP遺伝子を有する1本鎖DNAと、微量ながらも存在する鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖DNAのみが環状のDNAとして存在する。 Thus, the reaction solution, single-stranded and DNA having a mutation EGFP gene, only single-stranded DNA from the plasmid used as a template to present while trace amounts are present as a circular DNA.
【0022】 [0022]
(3)「メガプライマーを用いた相補鎖の合成」 (3) "synthesis of a complementary strand using the Mega-primer"
ここでは、上記(2)で切断されたDNA断片をメガプライマーとし、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドDNAを鋳型として、2本鎖DNAを合成する。 Here, the digested DNA fragments in the above (2) and mega primer, a single-stranded plasmid DNA having a mutation EGFP gene as a template to synthesize a double-stranded DNA. すなわち、この反応においては、DpnIにより切断されたDNA断片を変性して1本鎖DNA断片とし、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドDNAに該1本鎖DNA断片をアニーリングさせ、該1本鎖DNA断片をメガプライマーとして伸長反応を行う。 That is, in this reaction, by modifying the cleaved DNA fragments and single-stranded DNA fragments by DpnI, was annealed to the single-stranded DNA fragments to single-stranded plasmid DNA having a mutation EGFP gene, the single-stranded performing elongation reaction of DNA fragment as megaprimers. これにより、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドDNAに相補的な塩基配列が合成され、所定の位置に突然変異が導入されたEGFP遺伝子を有する2本鎖プラスミドDNAを構築することができる。 This makes it possible to construct a nucleotide sequence complementary to the single-stranded plasmid DNA having a mutation EGFP gene was synthesized, double-stranded plasmid DNA with EGFP gene mutation is introduced into a predetermined position.
具体的に、95℃、30秒の熱変性によりメガプライマーを1本鎖とし、次いで、95℃、30秒の熱変性、55℃、1分のアニーリング及び70℃、7分の伸長反応を1サイクルとして2サイクル行うことによって、2本鎖DNAを合成することができる。 Specifically, 95 ° C., and single-stranded mega primer by heat denaturation for 30 seconds, then, 95 ° C., 30 sec denaturation, 55 ° C., 1 minute annealing and 70 ° C., of 7 minute extension reaction 1 by performing two cycles as cycles, it is possible to synthesize a double-stranded DNA.
【0023】 [0023]
ここで、鋳型DNAをDpnI処理して得られるDNA断片のなかには、変異を導入する前の野生型の塩基を有するものが含まれる。 Here, some of the DNA fragments obtained by DpnI treatment the template DNA, include those having a wild-type base before introducing the mutation. 変異を導入する箇所が野生型の塩基配列であるDNA断片をメガプライマーとして使用すると、合成した相補鎖に変異が導入されていないこととなってしまう。 When portions of introducing mutation using DNA fragments are nucleotide sequences of the wild-type as megaprimers, mutations in the synthesized complementary strand becomes possible not introduced. したがって、この工程では、補助的プライマーを大量に加え、当該DNA断片のアニーリングを防止した状態で2本鎖DNAを合成することが好ましい。 Thus, in this process, large amounts added supplementary primer, it is preferable to synthesize the double-stranded DNA while preventing the annealing of the DNA fragments.
【0024】 [0024]
補助的プライマーとしては、EGFP遺伝子のクローニング部位近傍に存在する配列と相補的なT7プライマーを使用することができる。 The supplementary primer, can be used complementary to T7 primer sequence present in the cloning site near the EGFP gene. T7プライマーを反応溶液中に添加することによって、T7プライマーが優先的にアニールすることとなり、変異を導入する箇所が野生型の塩基配列であるDNA断片のアニールを防止することができる。 By adding T7 primer in the reaction solution, it becomes possible to T7 primer preferentially anneals, places to introduce mutations can be prevented annealing of the DNA fragments are nucleotide sequences of the wild-type.
【0025】 [0025]
また、この反応では、上記(1)におけるPCRから引き継がれたPfuDNAポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼ、dNTPs及びNADも利用することができる。 Further, in this reaction, Pfu DNA polymerase was carried over from the PCR in the above (1), Taq DNA ligase, also dNTPs and NAD may be utilized. すなわち、本方法では、上記(1)及び(2)の各反応に引き続いて同一の反応溶液中で反応を行うことができるため、DNA断片の精製等の煩雑な工程を経ることなく、所望の2本鎖プラスミドDNAを合成することができる。 That is, in this way, it is possible to carry out the reaction in the above (1) and (2) the same reaction solution subsequent to the reaction, without a complicated step such as purification of DNA fragments, the desired it can be synthesized double-stranded plasmid DNA.
【0026】 [0026]
以上のように、上述した(1)、(2)及び(3)の工程を経ることによって、EGFP遺伝子の所定の部位に突然変異を導入してなる変異EGFP遺伝子を有する2本鎖プラスミドを構築することができる。 As described above, the above-described (1), constructing a double-stranded plasmid bearing the mutated EGFP gene obtained by introducing a mutation Through the process, a predetermined portion of the EGFP gene (2) and (3) can do. そして、当該2本鎖プラスミドを有する反応液を用いて所定の細胞を形質転換することによって、変異EGFP遺伝子を有するプラスミドを備える形質転換細胞を得ることができる。 Then, by transforming a given cell using a reaction solution having the double-stranded plasmid, it is possible to obtain a transformed cell comprising a plasmid having a mutation EGFP gene.
【0027】 [0027]
ここで使用可能な細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞等、いずれを使用しても良く、変異を導入する遺伝子の由来や使用するプラスミド等に応じて適宜選択される。 Here, as the available cells, bacteria such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, yeast cells, animal cells, insect cells and plant cells, etc., may be used any plasmid like derived from or using a gene introducing mutations It is appropriately selected depending on. また、形質転換には、一般的に行われている手法、例えば、コンピテントセル使用する方法、電気的パルスを引加する手法等を適用することができる。 Moreover, the transformation technique which is generally performed, for example, can be applied a method of using competent cells, a technique like that 引加 electrical pulses.
【0028】 [0028]
突然変異を導入した遺伝子は、得られた形質転換細胞を培養することにより発現することができる。 Gene introduced mutations can be expressed by culturing the transformed cells obtained. 例えば、pRSET B /EGFPを鋳型DNAとして用いた場合には、大腸菌JM109(DE3)を形質転換し、イソプロピルβ-D-チオガラクシド(IPTG)を培地中に添加することによって、突然変異を導入したEGFPの発現を誘導することができる。 For example, in the case of using the pRSET B / EGFP as template DNA, E. coli JM109 (DE3) was transformed by the addition of isopropyl beta-D-thiogalactoside to (IPTG) in the culture medium, mutations were introduced EGFP it can induce the expression.
形質転換細胞中に発現した変異タンパク質は、一般的に行われているタンパク質精製工程を経ることによって精製することができる。 Mutant protein expressed in transformed cells may be purified by passing through a protein purification process which is generally performed. 変異タンパク質の精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィやゲル濾過等の手法を使用することができる。 The purification of mutein, for example, can be used a technique of affinity chromatography and gel filtration or the like.
【0029】 [0029]
ところで、本発明に係る突然変異導入方法は、上記(1)「突然変異鎖の合成」において、複数の突然変異導入用プライマーを用いるものに限定されず、縮重プライマーを用いて、所定の塩基配列にランダムな突然変異を導入するようなものであってもよい。 Incidentally, mutagenesis method according to the present invention, in the above-mentioned (1) "Synthesis of the mutant strand" is not limited to one using a plurality of mutagenesis primers, using degenerate primers, predetermined base it may be such as to introduce random mutations in sequences. 以下の例では、縮重プライマーを用いてECFP(エクオレア(Aequorea)属が産生するシアン蛍光タンパク質を改変した増強シアン蛍光タンパク質)における所定の部位のアミノ酸をランダムに変異させる方法を説明する。 The following example, ECFP illustrating a method for randomly mutating amino acids of a given site in (Aequorea (Aequorea) genus enhanced cyan fluorescent protein obtained by modifying a cyan fluorescent protein produced) using degenerate primers.
【0030】 [0030]
この場合、例えば、縮重プライマーとしては、ECFPアミノ酸配列における203番目のトレオニン(T)をランダムに突然変異させるための縮重プライマーPri-3(5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-3':配列番号7)を合成する。 In this case, for example, the degenerate primers, degenerate primers Pri-3 for mutating 203 threonine in ECFP amino acid sequence (T) at random (5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-3 ': SEQ ID NO: 7) synthesized. なお、Pri-3の塩基配列(配列番号7)における「N」は、A、G、C又はTを意味し、例えば、等モル濃度のA、G、C及びTを有するヌクレオシドホスホロアミダイドを用いることによって合成することができる。 Note that "N" in the Pri-3 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7), A, G, means C or T, for example, nucleoside phosphoramidite with equimolar concentrations of A, G, C and T it can be synthesized by using.
上記(1)「突然変異鎖の合成」においてPri-3を用いることによって、ECFPにおける203番目のトレオニンをランダムに変異させた様々な変異ECFP遺伝子を構築することができる。 By using the Pri-3 in the above (1), "Synthesis of the mutant strand", it is possible to construct various mutations ECFP gene mutated 203 threonine in ECFP randomly.
【0031】 [0031]
【実施例】 【Example】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, a more detailed explanation of the present invention with reference to Examples, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[実施例1] [Example 1]
1)突然変異導入用プライマー及び鋳型プラスミドDNAの準備本実施例では、GFPアミノ酸配列における66番目のチロシン(Y)をトリプトファン(W)に、203番目のトレオニン(T)をチロシン(Y)に突然変異させる。 1) Preparing the embodiment of mutagenesis primers and template plasmid DNA, 66 th tyrosine in GFP amino acid sequence (Y) tryptophan (W), a sudden 203 th threonine (T) to tyrosine (Y) mutate. 突然変異導入用プライマーとして、66番目のチロシン(Y)をトリプトファン(W)に突然変異させるためのPri-1(5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCAGGGTGGT-3':配列番号5)及び203番目のトレオニン(T)をチロシン(Y)に突然変異させるためのPri-2(5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3':配列番号6)を設計して合成した。 As the mutation-introducing primer, Pri-1 for mutating 66th tyrosine (Y) to tryptophan (W) (5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCAGGGTGGT-3 ': SEQ ID NO: 5) and 203 th threonine (T) tyrosine (Y) Pri-2 for mutating to: and (5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3 'SEQ ID NO: 6) were designed synthesis. これらPri-1及びPri-2の5'末端を、それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。 The 5 'end of these Pri-1 and Pri-2, was phosphorylated by T4 polynucleotide kinase, respectively.
鋳型プラスミドDNAとして、EGFP遺伝子をプラスミドベクターpRSET B (インビトロジェン社製(Invitrogen)にクローニングした。以下、鋳型プラスミドDNAを「pRSET B /EGFP」とする。 As a template plasmid DNA, the EGFP gene was cloned into a plasmid vector pRSET B (Invitrogen (Invitrogen). Hereinafter, the template plasmid DNA and "pRSET B / EGFP."
【0032】 [0032]
2)突然変異鎖の合成以下の組成の反応溶液50μlを準備しPCRを行った。 2) Prepare the reaction solution 50μl of synthesis following composition of mutant strand was subjected to PCR.
pRSET B /EGFP 50ng pRSET B / EGFP 50ng
Pri-1 14pmol Pri-1 14pmol
Pri-2 14pmol Pri-2 14pmol
dNTPs 10nmol dNTPs 10nmol
Pfu DNAポリメラーゼ 2.5U Pfu DNA polymerase 2.5U
Taq DNAリガーゼ 20U Taq DNA ligase 20U
なお、Pfu DNAポリメラーゼは、ストラタジーン社製であり、0.5×Pfuポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものである。 Incidentally, Pfu DNA polymerase is manufactured by Stratagene, it is obtained by dissolving in 0.5 × Pfu polymerase reaction buffer. また、Taq DNAリガーゼは、New England BioLabs社製であり、50nmolのNADを含む0.5×Taq DNAリガーゼバッファー中に溶解したものである。 Further, Taq DNA ligase is made New England BioLabs, Inc., is obtained by dissolving in 0.5 × Taq DNA ligase in a buffer containing NAD of 50 nmol.
【0033】 [0033]
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。 Thermal cycler was as follows program. すなわち、先ず、65℃、5分のプレインキュベーションを行ってTaq DNAリガーゼによる鋳型DNAのニックを修復し、その後、95℃、2分の最初の変性を行った。 That is, first, 65 ° C., and preincubation of 5 min to repair the nicks template DNA with Taq DNA ligase, then, 95 ° C., were initial denaturation for 2 minutes. 続いて、95℃、30秒のDNA変性、55℃、30秒のアニーリング反応及び65℃、7分の伸長・連結反応を1サイクルとして18サイクル行った。 Subsequently, 95 ° C., 30 seconds DNA denaturation, 55 ° C., annealing reaction and 65 ° C. for 30 seconds, was performed 18 cycle extension-ligation of 7 minutes as one cycle. 最後に、75℃、7分のポストインキュベーションを行った。 Finally, 75 ℃, was subjected to post-incubation of 7 minutes.
【0034】 [0034]
3)DpnIによる消化以下の条件に従ってDpnIを用いて、メチル化又はヘミメチル化したプラスミドDNAを選択的に消化した。 3) using DpnI following conditions digestion with DpnI, was selectively digest the methylated or hemi-methylated plasmid DNA. すなわち、上記PCR後の反応溶液50μlに、1μl(20U)のDpnI(New England BioLabs社製)を加え、37℃で1時間インキュベートした。 That is, the reaction solution 50μl after the PCR, adding 1 [mu] l DpnI of (20 U) (manufactured by New England BioLabs Inc.) and incubated for 1 hour at 37 ° C.. DpnIは、(5'-G m6 ATC-3')を認識して2本鎖DNAを切断するエンドヌクレアーゼである。 DpnI is an endonuclease which cleaves double-stranded DNA recognizes (5'-G m6 ATC-3 '). DpnIによれば、3672bpのプラスミドpRSET B /EGFPを完全切断すると、6、8、11、12、17、18、24、31、36、38、46、47、75、78、105、133、148、160、258、341、506、740、789塩基対の23のDNA断片を生じる。 According to DpnI, when completely cutting the plasmid pRSET B / EGFP of 3672bp, 6,8,11,12,17,18,24,31,36,38,46,47,75,78,105,133,148 produces a DNA fragment of 160,258,341,506,740,789 bp 23.
【0035】 [0035]
4)メガプライマーを用いた相補鎖の合成 4) synthesis of a complementary strand using the mega-primer
DpnIによる消化後の反応溶液51μlを用い、2)で合成した突然変異鎖の相補鎖を以下の条件により合成した。 Using a reaction solution 51μl after digestion with DpnI, 2 complementary strands of the synthesized mutant strand with) was synthesized by the following conditions. すなわち、該反応溶液51μlについて、95℃、30秒の変性、次いで95℃で30秒、55℃で1分、70℃で7分を2サイクル行った。 That is, for the reaction solution 51μl, 95 ℃, 30 seconds denaturation, followed by 30 seconds at 95 ° C., 1 min at 55 ° C., was carried out for 2 cycles 7 minutes at 70 ° C.. このとき、3)で得られたDNA断片23のうちいくつかがメガプライマーとして作用する。 At this time, some of the DNA fragment 23 obtained in 3) acts as a mega-primer.
【0036】 [0036]
5)形質転換及び変異EGFPの発現4)の反応後のサンプルの2μlを用いて、Ca 2+共沈法により大腸菌(E.coli)コンピテントセル(JM109(DE3))を形質転換した。 5) using 2μl of the sample after the reaction of transformation and expression of the mutated EGFP 4), E. (E. coli) competent cells (JM109 (DE3)) were transformed by Ca 2+ coprecipitation. そして、形質転換した大腸菌細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB固体培地で37℃にて培養し、生育した単一コロニーをピックアップして100μg/mlのアンピシリンを含むLB培養液2ml中へ移し、37℃で一晩培養して増殖させた。 Then, E. coli cells transformed and cultured at 37 ° C. in LB solid medium containing 100 [mu] g / ml of ampicillin, was transferred to pick up single colonies grown into LB broth 2ml medium containing 100 [mu] g / ml of ampicillin , grown in culture overnight at 37 ° C..
【0037】 [0037]
変異を導入したEGFPは、T7発現系(pRSET B /JM109(DE3))を用いて発現させた。 EGFP was introduced mutation was expressed using T7 expression system (pRSET B / JM109 (DE3) ). すなわち、培養液の100倍希釈物を作製し、該培養物を濃度がおよそOD 600 =0.5に達するまで室温で増殖させ、次いで最終濃度0.2mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)によって変異EGFPの発現を誘導し、その後、更に18時間培養した。 That is, to produce a 100-fold dilution of the culture broth, grown at room temperature the culture to a concentration reached approximately OD 600 = 0.5, then mutated by the final concentration 0.2mM isopropyl beta-D-thiogalactoside (IPTG) induced EGFP expression, then cultured another 18 hours. 得られた細胞をフレンチプレスにより破砕し、得られた上清液から、ニッケルキレートカラム(Qiagen社製)を用いてポリヒスチジン標識化タンパク質を精製した。 The resulting cells were disrupted by French press, from the resulting supernatant was purified polyhistidine labeled proteins using nickel chelate columns (Qiagen, Inc.). さらに、この溶出液(100mMイミダゾール、50mM Tris/Cl pH7.5、300mM NaCl)中のタンパク質サンプルをCentricon 10(Amicon)によって濃縮し、ゲル濾過によりさらに精製した。 Furthermore, the eluate (100 mM imidazole, 50mM Tris / Cl pH7.5,300mM NaCl) protein samples in concentrated by Centricon 10 (Amicon), was further purified by gel filtration.
【0038】 [0038]
6)結果1. 6) Results 1. 得られたタンパク質が所望の突然変異を2カ所同時に導入したものであることを、該タンパク質の励起波長及び発光波長を測定するとともに既存のタンパク質(野生型EGFP等)の励起波長及び発光波長と比較することにより確認した。 The resulting protein is obtained by introducing the desired mutation simultaneously two places, the excitation and emission wavelengths of the existing protein (wild-type EGFP, etc.) as well as measuring the excitation and emission wavelengths of the protein compared It was confirmed by. 得られたタンパク質の励起波長を測定し、規格化したものを図2(A)中曲線Aで示す。 The excitation wavelength of the resulting protein was measured, indicating those standardized by FIG 2 (A) middle curve A. また、得られたタンパク質の発光波長を測定し、規格化したものを図2(B)中曲線Aで示す。 Further, the emission wavelength of the resulting protein was measured, indicating those standardized by the middle curve A Fig 2 (B). なお、図2(A)及び(B)には、比較のために、野生型EGFP、野生型EGFPの66番目のチロシンをトリプトファンに変異させてなるEGFP-Y66W及び野生型EGFPの203番目のトレオニンをチロシンに変異させてなるEGFP-T203Yについて励起波長及び発光波長を併せて示す。 Note that FIG. 2 (A) and (B), for comparison, wild-type EGFP, 203 th threonine EGFP-Y66W and wild-type EGFP to the 66th tyrosine wild-type EGFP comprising mutated to tryptophan are also shown the excitation and emission wavelengths for EGFP-T203Y comprising mutated to tyrosine. 図2(A)及び(B)において、野生型EGFPは曲線Bで示し、EGFP-Y66Wは曲線Cで示し、EGFP-T203Yは曲線Dで示す。 In FIG. 2 (A) and (B), wild-type EGFP is shown on the curve B, EGFP-Y66W is shown on the curve C, EGFP-T203Y is indicated by a curve D.
【0039】 [0039]
図2(A)及び(B)に示すように、上述した方法で変異を導入したタンパク質は、励起波長のピークが458nmであり、発光波長のピークが504nmであることがわかる。 As shown in FIG. 2 (A) and (B), proteins mutated in the manner described above, the excitation wavelength peak at 458 nm, it can be seen that the peak emission wavelength is 504 nm. これに対して、野生型EGFPは、励起波長のピークが488nmであり、発光波長のピークが509nmである。 In contrast, wild-type EGFP is the peak of the excitation wavelength 488 nm, the peak emission wavelength is 509 nm. EGFP-Y66Wは、66番目のチロシンをトリプトファンに置換することによってインドールを有する新たな発色団を生じるため、励起波長のピークが450nmであり、発光波長のピークが494nmである。 EGFP-Y66W is to produce a new chromophore having an indole by replacing the 66th tyrosine to tryptophan, excitation wavelength peak at 450 nm, the peak emission wavelength is 494 nm. EGFP-T203Yは、203番目のトレオニンをチロシンに置換することによって66番目のチロシンとの間でπ−π相互作用を生じるため、励起波長のピークが514nmであり、発光波長のピークが524nmである。 EGFP-T203Y is to produce a [pi-[pi interaction between the 66th tyrosine by replacing 203 threonine to tyrosine, excitation wavelength peak at 514 nm, the peak emission wavelength is at 524nm .
得られたタンパク質は、66番目のチロシンをトリプトファンに変異させるとともに203番目のトレオニンをチロシンに変異させてなる(EGFP-Y66W/T203Y)ため、上述したインドールを有する発色団とπ−π相互作用とを生じるため、シアン色−緑色蛍光を示している。 The resulting protein is the 66th tyrosine mutate 203 threonine with mutated into tryptophan tyrosine comprising (EGFP-Y66W / T203Y) for a chromophore having an indole as described above [pi-[pi interaction with to produce a cyan color - shows green fluorescence.
【0040】 [0040]
2. 2. 一方、アンピシリン添加LB固体培地上に生育したコロニーの蛍光を測定することによって、突然変異導入率を算出した。 On the other hand, by measuring the fluorescence of the colonies grown on ampicillin LB solid medium, it was calculated mutagenesis rate. 当該コロニーのスペクトル特性を、Bairdらの報告(Baird,GS, Zacharias,DA and Tsien,RY (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11241-11246)に基づいて改変した蛍光イメージ解析システムを用いて測定した。 The spectral characteristics of the colonies, Baird et al report (Baird, GS, Zacharias, DA and Tsien, RY (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11241-11246) fluorescence image analysis was modified on the basis of It was measured by using the system. 蛍光イメージ解析システムでは、LBプレート(直径9cm)上に生育したコロニーを、150Wのキセノンランプ光によって励起する。 The fluorescence image analysis system, the colonies grown on LB plates (diameter 9cm), excited by the xenon lamp light of 150 W. 励起波長は回折格子モノクロメーター(CT-10, JASCO社製)によって選択することができる。 The excitation wavelength can be selected by the diffraction grating monochromator (CT-10, JASCO Corporation). 具体的には、回折格子モノクロメーターによる励起波長を450nm及び490nmとする(図2(A)中、直線a及びbで示す。)。 Specifically, the excitation wavelength by the diffraction grating monochromator and 450nm and 490 nm (in FIG. 2 (A), the indicated by the straight line a and b.).
【0041】 [0041]
また、このシステムでは、LBプレート全体を均一に照らすために、一対の光ファイバー(1m)を用いた。 Further, in this system, in order to illuminate the entire LB plate evenly, using a pair of optical fibers (1 m). コロニーからの蛍光イメージは、干渉バンド透過フィルター(Omega社製, 535DF25 直径1インチ)を介して、レンズ(Nikon社製, AF NIKKOR)で集光した。 Fluorescence images from colonies interference bandpass filter (Omega Co., 535DF25 1 inch diameter) through the lens (Nikon Corp., AF NIKKOR) was condensed with. そのイメージはSenSys冷却CCDカメラ(Photometrics社製)によって取り込まれ、MetaMorph 3.0ソフトウェア(Universal Imaging社製, West Chester, PA)を用いて解析した。 The image is taken up by SenSys cooled CCD camera (Photometrics Inc.) and analyzed using MetaMorph 3.0 software (Universal Imaging Corp., West Chester, PA) and. 具体的に、比率イメージとしては、490nmイメージを450nmイメージで除することによって得られた。 Specifically, as the ratio image, obtained by dividing the 490nm image at 450nm image. 図2(A)に示した励起スペクトルから予測されるように、該比率値は、EGFP-T203Y > 野生型EGFP > EGFP-Y66W/T203Y > EGFP-Y66Wであった。 In as expected from the excitation spectrum shown FIG. 2 (A), the the ratio values ​​were EGFP-T203Y> wild-type EGFP> EGFP-Y66W / T203Y> EGFP-Y66W.
【0042】 [0042]
このとき、干渉バンド透過フィルターを用いて比較する場合、回折格子モノクロメーターを使用すると、励起波長を非常に狭い幅で変化させ、選択することができた。 In this case, when comparing with an interference bandpass filter, using a diffraction grating monochromator, by changing the excitation wavelength in a very narrow width could be selected. したがって、このシステムでは当該モノクロメーターを使用した励起によって、近接した励起スペクトルを示す野生型EGFP、EGFP-T203Y、EGFP-Y66W及びEGFP-Y66W/T203Yをそれぞれ確実に区別することができた。 Accordingly, the excitation using the monochromator in this system, the wild-type EGFP showing the excitation spectra that are close, EGFP-T203Y, was able to EGFP-Y66W and EGFP-Y66W / T203Y reliably distinguished from each other.
【0043】 [0043]
その結果、アンピシリン添加LBプレート上に生育した42個のコロニーのうち、32個はシアン-グリーン蛍光を示し(EGFP-Y66W/T203Y)、2部位同時の突然変異誘発率は76%と算出された。 As a result, among the 42 colonies grown on ampicillin LB plates, is 32 Cyan - shows green fluorescence (EGFP-Y66W / T203Y), the mutagenesis rate of 2 sites simultaneously was calculated to 76% . 残りのコロニーのうち、4個がイエロー蛍光を示し(EGFP-T203Y)、4個がシアン蛍光を示し(EGFP-Y66W)2個がグリーン蛍光を示した(野生型EGFP)。 Of the remaining colonies, four showed yellow fluorescence (EGFP-T203Y), 4 Two shows the cyan fluorescent (EGFP-Y66W) showed green fluorescence (wild-type EGFP). なお、非蛍光のコロニーは存在しなかった。 It should be noted that the colony of non-fluorescent did not exist.
【0044】 [0044]
さらに、上述した実験を4回繰り返し、シアン-グリーン蛍光を示すコロニーの割合、すなわち、2部位同時の突然変異誘発率を算出した。 Furthermore, repeated four times experiments described above, cyan - percentage of colonies showing green fluorescence, namely, to calculate the mutagenesis rate of 2 sites simultaneously. その結果、(シアン-グリーン蛍光を示すコロニー数)/(全コロニー数)がそれぞれ、21/30、42/50、50/72及び32/40であり、2部位同時の突然変異誘発効率が75.8%±4.2%(n=5)であった。 As a result, (cyan - number of colonies showing a green fluorescence) / (total number of colonies) respectively, is 21/30, 42 / 50,50 / 72 and 32/40, mutagenesis efficiency of two-site simultaneous 75.8 % was ± 4.2% (n = 5).
さらにまた、シアン-グリーン蛍光を示すコロニーから精製したプラスミドのDNA配列決定により、Pri-1及びPri-2以外の部位で突然変異は導入されていないことが明らかになった。 Furthermore, cyan - DNA sequencing of the plasmid purified from colonies showing green fluorescence, mutations at sites other than Pri-1 and Pri-2 was found to be not introduced.
【0045】 [0045]
さらにまた、4)でメガプライマーとして作用する23個のDNA断片のうち506塩基対及び148塩基対のセンス鎖には、それぞれ66番目のアミノ酸残基及び203番目のアミノ酸残基をコードする領域を含んでいる。 Furthermore, the 506 to the sense strand of base pairs and 148 base pairs, the region encoding the 66 amino acid residues and 203 amino acid residues, respectively of the 23 pieces of DNA fragments which act as mega primer 4) which comprise. このため、これら506塩基対及び148塩基対のDNA断片は、メガプライマーとしてはたらかないようにすることが好ましい。 Thus, DNA fragments of these 506 bp and 148 bp, it is preferable not to work as a mega-primer. 本例において、クローニング部位の外側にアニールするコモンセンスプライマー(T7プライマー14pmol)をDpnI消化後に加えると、これら506塩基対及び148塩基対のDNA断片のアニーリングを防止することができるため、突然変異誘発効率を90%を超えるまでに増大させることができる。 In this example, the addition of common sense primers that anneal to the outer side of the cloning site (T7 primer 14Pmol) after DpnI digestion, it is possible to prevent the annealing of DNA fragments of these 506 bp and 148 bp, mutagenesis efficiency can be increased to over 90%. 具体的には、200個のコロニーのうち、196個がシアン-グリーン蛍光を示した。 Specifically, of the 200 colonies, 196 cyan - showed green fluorescence.
【0046】 [0046]
[実施例2] [Example 2]
本実施例では、縮重プライマーを用いてECFPアミノ酸配列における203番目のトレオニン(T)をランダムに突然変異させる。 In this embodiment, mutate randomly 203 threonine in ECFP amino acid sequence (T) using degenerate primers. 突然変異導入用プライマーとして、203番目のトレオニン(T)をランダムに突然変異させるための縮重プライマーPri-3(5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-3':配列番号7)を合成する。 As mutagenesis primer, a degenerate primer Pri-3 for mutate randomly 203 threonine (T) (5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-3 ': SEQ ID NO: 7) to synthesize. なお、Pri-3の塩基配列(配列番号7)における「N」は、A、G、C又はTを意味する。 Note that "N" in the Pri-3 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7), means A, G, C or T. そして、これらPri-3の5'末端を、それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。 Then, the 5 'ends of these Pri-3, was phosphorylated by T4 polynucleotide kinase, respectively.
【0047】 [0047]
鋳型プラスミドDNAとして、ECFP遺伝子をプラスミドベクターpRSET B (インビトロジェン社製(Invitrogen)にクローニングした。以下、鋳型プラスミドDNAを「pRSET B /ECFP」とする。なお、このECFP遺伝子は、実施例1で使用したEGFP遺伝子と比較して、タンパク質の折り畳みおよび成熟を助けるための更なる置換(N146I、M153T、V163A及びN164H)を有し、且つ、66番目のチロシンがトリプトファンに置換(Y66W)されている。 As a template plasmid DNA, the ECFP gene was cloned into a plasmid vector pRSET B (Invitrogen (Invitrogen). Hereinafter, the template plasmid DNA and "pRSET B / ECFP." Note that this ECFP gene, used in Example 1 compared to the EGFP gene, further substituents to assist in folding and maturation of the protein (N146I, M153T, V163A and N164H) has, and, 66th tyrosine is replaced with tryptophan (Y66W).
実施例2では、縮重プライマーとしてPri-3及び鋳型DNAとしてpRSET B /ECFPを使用した以外は実施例1と同様に実験を行った。 In Example 2, except for using pRSET B / ECFP as Pri-3 and the template DNA as a degenerate primers was performed in the same manner as in Experimental Example 1.
【0048】 [0048]
1)結果本例では、実施例1と同様に形質転換を行って形質転換大腸菌細胞をアンピシリン添加LBプレート上に生育させた。 1) The result this embodiment, and the transformed E. coli cells were grown on ampicillin LB plates was transformed in the same manner as in Example 1. 該LBプレート上に生育した62個のクローンをランダムにピックアップし、配列決定した。 62 clones grown on the LB plates were randomly picked and sequenced. その結果、28個のクローンは、Thr203をK、N、H、R、Lで置換した突然変異が導入されており、非蛍光タンパク質を産生した。 As a result, 28 clones, the Thr203 K, N, H, R, substituted mutations have been introduced in L, produced a non-fluorescent proteins. 一方、34個のクローンは、蛍光タンパク質を産生し、そのうち23個のクローンは、203番目のトレオニンをP、V、I、W、F、S、C、Yで置換した突然変異体を含んでいた。 On the other hand, 34 clones, produce fluorescent proteins, of which 23 clones, the 203 threonine P, V, I, W, F, S, C, contains a mutant substituted with Y It had. 特に、203番目のトレオニンをチロシンに変異させたクローンでは、顕著なスペクトル変化を観察することができた。 In particular, the 203 th threonine in clones mutated to tyrosine, could be observed a significant spectral change. この突然変異は、その励起および発光のスペクトル全体がECFPとEGFPのものの中間であるため、ECGFP(強化シアングリーン蛍光タンパク質)と称する。 This mutation, because the entire spectrum of the excitation and emission are intermediate those of ECFP and EGFP, referred to as ECGFP (enhanced cyan green fluorescent protein). ECGFPのアミノ酸配列を配列番号9に示す。 This shows the amino acid sequence of ECGFP in SEQ ID NO: 9.
【0049】 [0049]
ECGFPの蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを、ECFP及びEGFPの蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを併せて図3に示す。 The fluorescence excitation and emission spectra of ECGFP, shown in FIG. 3 together fluorescence excitation and emission spectra of ECFP and EGFP. 図3において、ECGFPの蛍光励起スペクトルを曲線A(波線)で示し、ECGFPの発光スペクトルを曲線B(実線)で示す。 3 shows the fluorescence excitation spectrum of ECGFP by curve A (dashed line) shows an emission spectrum of ECGFP by curve B (solid line). また、図3において、EGFPの蛍光励起スペクトルを曲線C(波線)で示し、EGFPの発光スペクトルを曲線D(実線)で示し、ECFPの蛍光励起スペクトルを曲線E(波線)で示し、ECFPの発光スペクトルを曲線F(実線)で示す。 Further, in FIG. 3 shows the fluorescence excitation spectrum of EGFP in the curve C (broken line) shows the emission spectrum of EGFP by curve D (solid line) shows the fluorescence excitation spectrum of ECFP by curve E (wavy line), the emission of ECFP It shows a spectrum with a curve F (solid line).
【0050】 [0050]
この図3から判るように、ECGFPの励起ピーク(455nm)及び発光ピーク(506nm)はECFPにおける長波長成分の励起ピーク(452nm)及び発光ピーク(505nm)とかなり近接していた。 As seen from FIG. 3, the excitation peaks of ECGFP (455nm) and emission peaks (506 nm) was fairly close to the excitation peak of the long wavelength components in ECFP (452 ​​nm) and emission peaks (505 nm). 変異によって、π-π相互作用はより長波長が優位を占める量子状態を促進することが示唆される。 Mutated by, the [pi-[pi interactions are suggested to promote quantum state longer wavelength predominates. また、図3に示すように、ECGFP及びEGFPは同程度の発光ピークを有する(ECGFPは506nm、EGFPは511nm)が、ECGFPではより大きなストークスシフト(励起ピーク及び発光ピークの間隔)を示している。 Further, as shown in FIG. 3, ECGFP and EGFP has an emission peak comparable (ECGFP is 506 nm, EGFP is 511 nm) have shown a larger Stokes shift in ECGFP (spacing excitation peak and emission peak) . ECGFPにおいては、ECFP及びEGFPと比較してストークスシフトが大きいため、落射蛍光観察において、蛍光シグナルと励起光とを容易に分離することができる。 In ECGFP, since a large Stokes shift compared to ECFP and EGFP, in epifluorescence observation, it is possible to easily separate the fluorescence signal and the excitation light.
【0051】 [0051]
一方、ECGFP、EGFP及びECFPについて、pH抵抗性を検討した。 On the other hand, ECGFP, for EGFP and ECFP, was studied pH resistance.
ここでは、先ず、50mM酢酸塩(pH3.8〜5.6)、Na 2 HPO 4 -Na 2 H 2 PO 4 (pH5.5〜7.0)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホネート(pH5.5〜6.0)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホネート(pH6.5〜7.0)、ヘペス(pH7.0〜7.9)、グリシン(pH9.0〜10.0)及びリン酸塩(pH11)のいずれかを用いて、pH値3.8〜11の範囲となるような一連のpHバッファーを調製した。 Here, first, 50 mM acetate (pH3.8~5.6), Na 2 HPO 4 -Na 2 H 2 PO 4 (pH5.5~7.0), 2- (N- morpholino) ethane sulfonate (PH5.5~6.0 ), 3- (N-morpholino) propane sulfonate (pH6.5~7.0), Hepes (pH7.0~7.9), using either glycine (PH9.0~10.0) and phosphate (pH 11), a series of pH buffer such as the range of pH values ​​from 3.8 to 11 were prepared. pH抵抗性を検討する溶液は、先ず、タンパク質を弱緩衝溶液中に濃縮し、当該弱緩衝溶液を、所定のpHバッファー溶液と等量混合して調製した。 The solution to study the pH resistance, first, the protein was concentrated in a weak buffer solution, the weak buffer solution was prepared by mixing equal amounts and predetermined pH buffer solution.
【0052】 [0052]
得られた溶液を用いて吸収波長スペクトル及び発光波長スペクトルを測定した結果を図4及び図5に示す。 The results obtained solution was measured absorption wavelength spectrum and an emission wavelength spectrum with reference to FIG. 4 and FIG. 5. なお、図4において、(A)はEGFPの吸収スペクトルを示し、(B)はEGFPの発光スペクトルを示し、(C)はECFPの吸収スペクトルを示し、(D)はECFPの発光スペクトルを示し、(E)はECGFPの吸収スペクトルを示し、(F)はECGFPの発光スペクトルを示す。 Incidentally, In FIG. 4, (A) shows the absorption spectrum of EGFP, (B) shows the emission spectrum of EGFP, (C) represents the absorption spectrum of ECFP, (D) shows the emission spectrum of ECFP, (E) represents the absorption spectrum of ECGFP, (F) shows the emission spectrum of ECGFP. また、図5において、(A)は図4(A)、(C)及び(E)のスペクトルをプロットし直したものであり、(B)は図4(B)、(D)及び(F)のスペクトルをプロットし直したものである。 Further, in FIG. 5, (A) is FIG. 4 (A), the are those that re-plotted spectra (C) and (E), (B) FIG. 4 (B), (D) and (F ) in which the re-plot the spectrum of.
【0053】 [0053]
また、EGFP、ECFP及びECGFPに関して、量子収率(Φ)及びモル吸光係数(ε)を測定した。 Moreover, EGFP, with respect ECFP and ECGFP, were measured quantum yield ([Phi) and molar extinction coefficient (epsilon). 量子収率(Φ)及びモル吸光係数(ε)の値は、50mMのヘペス(pH7.5)中で測定した。 The value of quantum yield ([Phi) and molar extinction coefficient (epsilon) was determined in 50mM HEPES (pH 7.5). ECGFPの量子収率(Φ)は、標準(フルオレセイン(Φ=0.91)およびECFP(Φ=0.40))との比較により決定した。 ECGFP quantum yield of ([Phi) was determined by comparison with a standard (fluorescein ([Phi = 0.91) and ECFP (Φ = 0.40)). モル吸光係数を算出するためのタンパク質濃度の測定には、標準物質としてBSA(ウシ血清アルブミン)を用いたBradfordアッセイキット(Bio Rad)を使用した。 To measure the protein concentration to calculate the molar extinction coefficient was used BSA as a standard Bradford assay kit using (bovine serum albumin) (Bio Rad). 結果を表1に示す。 The results are shown in Table 1.
【0054】 [0054]
【表1】 [Table 1]
【0055】 [0055]
なお、この表1において、λabsはナノメーター単位での吸光度スペクトルのピークを表している。 Incidentally, in the table 1, Ramudaabs represents the peak of the absorbance spectrum at nanometers. (ε)は10 3 M -1 cm -1単位でのモル吸光係数である。 (Epsilon) is the molar extinction coefficient at 10 3 M -1 cm -1 units. λemはナノメーター単位での発光スペクトルのピークを表している。 λem represents the peak of the emission spectrum in nanometers. (Φ)は量子収率である。 ([Phi) is a quantum yield. また、Kaは酸解離定数であり、pKa=-log 10 Kaで求められる。 Further, Ka is the acid dissociation constant, determined by pKa = -log 10 Ka. pKaは図5(B)から算出した。 pKa was calculated from FIG. 5 (B).
絶対輝度はε及びΦの積で算出され、ECGFPは中性pH付近で、EGFP及びECFPよりも光が弱いことが表1より判る。 Absolute luminance is calculated by the product of ε and Φ, ECGFP at around neutral pH, it light weaker than EGFP and ECFP is apparent from Table 1. なお、GFP突然変異体のほとんどすべては酸性pHによりいくらか光が弱まることが知られている。 Incidentally, almost all of the GFP mutants are known to some light is weakened by an acidic pH.
【0056】 [0056]
一方、図4(A)及び(B)から判るように、EGFPは、488nmにおける吸光度ピークが酸性化に依存した低下を示すとともに398nmにおける吸光度ピークは増大した。 On the other hand, as can be seen from FIG. 4 (A) and 4 (B), EGFP is absorbance peak at 398nm with exhibit a reduced absorbance peak was dependent on acidification in 488nm was increased. EGFPにおいては、発光(511nmピーク)および励起(488nmピーク)スペクトルはpHが低下するにつれて低下したが、蛍光励起スペクトルは398nmでの補償的増加を示さなかった。 In EGFP, emission (511 nm peak) and excitation (488 nm peak) spectra was reduced as the pH is lowered, the fluorescence excitation spectra showed no compensatory increase in 398 nm. このことから、398nmでの吸光種は非蛍光性であることがわかる。 This indicates that the absorption species in 398nm is nonfluorescent. また、EGFPは、図4(A)及び(B)に示すように、その吸光スペクトル及び発光スペクトルの両方についてpKa6.0を示し、図5(A)及び(B)に示すように、その吸光度はpH感受性であるが量子収率はpH感受性でない。 Moreover, EGFP, as shown in FIG. 4 (A) and (B), both as to its absorption spectrum and an emission spectrum shows a PKa6.0, as shown in FIG. 5 (A) and (B), its absorbance it is a pH-sensitive non-quantum yield pH sensitive.
【0057】 [0057]
また、ECFPは、図4(C)及び(D)に示すように、EGFPと比較してpHの影響が小である。 Further, ECFP, as shown in FIG. 4 (C) and (D), the effect of pH is smaller as compared to EGFP. pHの低下した条件下においても、その吸光度スペクトル(図4C)にほとんど影響を与えず、発光スペクトルのみが弱めたられた。 Even in reduced conditions in pH, little effect on the absorbance spectrum (Fig. 4C), only the emission spectrum was Once weakened. このことは、ECFPにおいては、図5(A)及び(B)に示すように、量子収率が酸性により低下させられる。 This means that in the ECFP, as shown in FIG. 5 (A) and (B), quantum yield is lowered by an acid.
【0058】 [0058]
一方、ECGFPに関しては、図4(E)及び(F)に示すように、広いpH範囲(pH4〜12)において安定であった。 On the other hand, with respect to ECGFP, as shown in FIG. 4 (E) and (F), it was stable over a wide pH range (pH4~12). 言い換えると、このECGFPは、図5(A)及び(B)に示すように、いかなるpH条件下においても、変わらない蛍光特性を有していることが判った。 In other words, this ECGFP, as shown in FIG. 5 (A) and (B), at any pH conditions, it was found to have fluorescence properties unchanged.
ECGFPの蛍光を使用することによって、例えば、分泌およびエンドサイトーシスオルガネラといった、酸性オルガネラの細胞内膜挙動の解析に際して、画像化した分子種を正確に報告することが可能となる。 By using fluorescence ECGFP, for example, such as secretion and endocytosis organelles, upon analysis of intracellular membrane behavior of acidic organelles, imaging molecular species and it is possible to accurately report.
【0059】 [0059]
【発明の効果】 【Effect of the invention】
以上詳細に説明したように、本発明に係る突然変異導入方法では、複数の部位に同時に突然変異を導入することができる。 As described above in detail, in the mutagenesis method according to the present invention, it can be introduced at the same time mutation at multiple sites. このため、本発明の突然変異導入方法によれば、迅速に、簡易に且つ低コストで、所望の塩基配列を合成することができる。 Therefore, according to the mutagenesis methods of the present invention, it is possible to quickly, at low cost easily, to synthesize the desired base sequence. したがって、本発明によって、広範囲に亘って応用可能な遺伝子工学の新手法を提供することができる。 Accordingly, the present invention can provide a new approach which can be applied genetic engineering over a wide range.
【配列表】 [Sequence Listing]
【0060】 [0060]
【配列表フリーテキスト】 Sequence Listing Free Text
配列番号5〜配列番号7は、合成プライマーである。 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7 is a synthetic primers.
配列番号7,第9塩基、第10塩基及び第11塩基のnは、a、t、c又はgである。 SEQ ID NO: 7, 9 bases, n of the first 10 bases and 11 bases is a, t, c or g.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】本発明に係る突然変異導入方法のプロトコールを説明するための概略図である。 1 is a schematic diagram for explaining the protocol of mutagenesis method according to the present invention.
【図2】 EGFP、ECFP、EYFP及びEGFP-Y66W/T203Yの蛍光励起スペクトル(A)及び発光(B)スペクトルを示す特性図である。 [Figure 2] EGFP, it is a characteristic diagram showing ECFP, fluorescence excitation spectrum of EYFP and EGFP-Y66W / T203Y (A) and emission (B) a spectrum.
【図3】 ECFP、ECGFP、EGFPの励起スペクトル(波線)及び発光スペクトル(実線)を示す特性図である。 [3] ECFP, is a characteristic diagram showing ECGFP, the excitation spectrum of EGFP (wavy) and emission spectrum (solid line).
【図4】 EGFP、ECFP及びECGFPそれぞれの吸光スペクトル及び発光スペクトルのpH依存性を示す特性図であり、(A)がEGFPの吸光スペクトルであり、(B)がEGFPの発光スペクトルであり、(C)がECFPの吸光スペクトルであり、(D)がECFPの発光スペクトルであり、(E)がECGFPの吸光スペクトルであり、(F)がECGFPの発光スペクトルである。 [4] EGFP, a characteristic diagram showing the ECFP and ECGFP pH dependence of the respective absorption and emission spectra, (A) is a light absorption spectrum of EGFP, (B) is an emission spectrum of EGFP, ( C) is the absorption spectrum of ECFP, (D) is an emission spectrum of ECFP, (E) is the absorption spectrum of ECGFP, (F) is the emission spectrum of ECGFP.
【図5】 EGFP、ECFP及びECGFPそれぞれの吸光ピーク及び発光ピークのpH依存性を示す特性図であり、(A)が吸収ピークとpHとの関係を示し、(B)が蛍光ピークとpHとの関係を示している。 [5] EGFP, a characteristic diagram showing the ECFP and ECGFP pH dependence of the respective absorption peaks and emission peaks, (A) indicates the relationship between the absorption peak and pH, (B) and the fluorescence peak and the pH It shows the relationship.

Claims (8)

  1. 少なくとも1以上の変異を有する塩基配列を含み、5'末端がリン酸化された1又は2以上のプライマーを環状鋳型DNAにアニーリングさせ、その後、耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、反応後、耐熱性DNAリガーゼを用いてリン酸化された5'末端と伸長末端とを連結することにより、上記プライマーを含む環状DNAを合成するDNA合成工程と、 Includes a nucleotide sequence having at least one or more mutations, one or more primers 5 'ends were phosphorylated and annealed to the circular template DNA, Thereafter, an extension reaction using the thermostable high-fidelity DNA polymerase after the reaction, by connecting the extension distal the 5 'end phosphorylated using thermostable DNA ligase, and DNA synthesis step of synthesizing a circular DNA comprising said primers,
    上記DNA合成工程を複数回繰り返して上記プライマーを含むDNAを増幅した後、 メチル化及びヘミメチル化された塩基配列を選択的に切断する制限酵素を用いて少なくとも増幅された環状DNAを除くDNAを複数の断片に消化する消化工程と、 After amplifying the DNA containing the above primers is repeated a plurality of times the DNA synthesis process, a plurality of DNA with the exception of at least the amplified circular DNA with a restriction enzyme that selectively cleaves the nucleotide sequence is methylated and hemimethylated and the digestion process to digest the fragment of,
    上記消化工程で得られた複数の断片をメガプライマーとして、該メガプライマーを上記DNA合成工程で合成された上記環状DNAにアニーリングさせ、その後、上記耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う2本鎖DNA合成工程とを備える突然変異導入方法。 A plurality of fragments obtained by the above digestion step as megaprimers, said megaprimers are annealed to said circular DNA synthesized in the DNA synthesis step, then the extension reaction using the heat-resistant high-fidelity DNA polymerase mutagenesis method and a double-stranded DNA synthesis step of performing.
  2. 上記DNA合成工程では、上記プライマーを複数用いることによって、複数の部位に同時に突然変異を導入する請求項1記載の突然変異導入方法。 In the DNA synthesis step, by using a plurality of the primers, according to claim 1 mutagenesis method according to introduce simultaneously mutations at multiple sites.
  3. 上記DNA合成工程では、上記プライマーを縮重プライマーとすることによって、塩基配列の所定の部位にランダムな突然変異を導入する請求項1又は2記載の突然変異導入方法。 Above the DNA synthesis step, by the above primers and degenerate primer claim 1 or 2 mutation introduction method according to introduce random mutations at predetermined sites in the nucleotide sequence.
  4. 上記2本鎖DNA合成工程の際に、変異を導入した塩基配列に近接した領域に相補的な塩基配列を有する補助的プライマーを加えることを特徴とする請求項1乃至3いずれか1項に記載の突然変異導入方法。 During the double-stranded DNA synthesis process, according to claims 1 to 3 any one characterized by adding a supplementary primer having a base sequence complementary to the region close to the base sequence mutated mutagenesis methods.
  5. 上記補助的プライマーがT7プライマーであることを特徴とする請求項4記載の突然変異導入方法。 Mutagenesis method according to claim 4, wherein said auxiliary primer is T7 primer.
  6. 上記消化工程では、DpnIを用いることを特徴とする請求項1記載の突然変異導入方法。 Above the digestion step, mutagenesis method according to claim 1, wherein the use of DpnI.
  7. 上記DNA合成工程で使用した耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼ及び/又は耐熱性DNAリガーゼを、上記2本鎖DNA合成工程で使用することを特徴とする請求項1記載の突然変異導入方法。 Mutagenesis method of claim 1, wherein the heat-resistant high-fidelity DNA polymerase and / or thermostable DNA ligase used in the DNA synthesis process, for use in the double-stranded DNA synthesis process.
  8. 上記DNA合成工程では、少なくとも、上記プライマー、上記環状鋳型DNA、上記耐熱性高忠実度DNAポリメラーゼ及び耐熱性DNAリガーゼを含む反応溶液中で全工程を完了することを特徴とする請求項1記載の突然変異導入方法。 In the DNA synthesis step, at least, the primer, the circular template DNA, according to claim 1, wherein the completion of all steps in the reaction solution containing the above-mentioned heat-resistant and high-fidelity DNA polymerase and thermostable DNA ligase mutagenesis method.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2823219B1 (en) * 2001-04-10 2003-07-04 Pasteur Institut Mutants of deoxycytidine kinase possessing enzymatic activity enlarged
WO2003025118A2 (en) 2001-07-26 2003-03-27 Stratagene Multi-site mutagenesis
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SI1844144T1 (en) * 2005-01-10 2010-07-30 Medimmune Ltd Method of mutagenesis
US20100267147A1 (en) * 2007-04-25 2010-10-21 GM Biosciences, Inc. Site-directed mutagenesis in circular methylated dna
EP3031919B1 (en) 2007-07-31 2018-09-19 BASF Enzymes LLC Tailored multi-site combinational assembly
ITTO20070687A1 (en) * 2007-10-01 2009-04-02 Consiglio Nazionale Ricerche New mutant gfp sensitive to pH and the concentration of anions, chimeric protein comprising such a mutant and combined procedure for the determination of the pH and the concentration of anions
CN101210240B (en) 2007-12-25 2011-11-16 天津大学 Pointing mutation method for large primer PCR
US9476079B2 (en) 2012-01-20 2016-10-25 Kennesaw State University Research And Services Foundation, Inc. Methods to mutate circular deoxyribonucleotides
US9458453B2 (en) 2012-06-12 2016-10-04 The Johns Hopkins University Methods for efficient, expansive, user-defined DNA mutagenesis
EP3322679A1 (en) 2015-07-13 2018-05-23 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving plant traits

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69233035D1 (en) * 1991-12-24 2003-06-05 Harvard College Targeted point-mutagenesis of dna
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5939250A (en) * 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US5789166A (en) * 1995-12-08 1998-08-04 Stratagene Circular site-directed mutagenesis

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