JP4426528B2 - Nucleic acid analysis method, the cell for nucleic acid analysis, and nucleic acid analysis device - Google Patents

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Description

本発明は、DNA,mRNAなどの核酸(ポリヌクレオチド)の分析方法、核酸分析用セル、および核酸分析装置に関する。 The present invention, DNA, a method of analyzing nucleic acids such as mRNA (polynucleotide), nucleic acid analysis cell, and a nucleic acid analysis device.

サンプル中に存在するDNA或いはmRNAの種類を測定する技術として、DNAチップが知られている。 As a technique for measuring the type of DNA or mRNA present in the sample it is known DNA chips. DNAチップは、遺伝子などの関心のある核酸(標的核酸)をハイブリダイゼーション(相補鎖結合)により相補的に結合(捕捉),合成するために、種々の一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを、基板上に高密度に整列固定してなる。 DNA chip, complementary binding (capture) with a nucleic acid of interest, such as genes (target nucleic acid) hybridization (complementary strand binding), to synthesize an oligonucleotide probe of a variety of single-stranded, substrate formed by densely aligned fixed. 代表的なものとしては、アフィメトリックス社(米国)のDNAチップのように、フォトリソグラフィ技術を用いて半導体チップ上に標的核酸を捕捉するためにオリゴヌクレオチドプローブを高密度に整列固定するものが周知である。 It is known as the typical, such as the DNA chip Affymetrix (USA), followed by a oligonucleotide probe densely aligned secured to capture the target nucleic acid on a semiconductor chip by using a photolithography technique it is. また、関心のあるmRNAの発現量を定量計測する技術として、リアルタイムPCR法、及びTaqManプローブ法などが周知である。 Further, as a technique for quantifying measuring the expression level of mRNA of interest, real-time PCR, and TaqMan probe method and the like are well known.
さらに、従来の生化学反応装置では、特開平5−317030号公報に開示されるように、二次元平面上に配列された多数の孔(チャンバ)を持つ生化学反応装置(マイクロマルチチャンバ)において、各々のチャンバに温度調節機能を組み込んで、チャンバごとに温度を独立して制御可能にした技術が開示されている。 Furthermore, in the conventional biochemical reactors, as disclosed in JP-A-5-317030, in a biochemical reaction apparatus (micro multi-chamber) with a large number of holes arranged on a two-dimensional plane (chamber) by incorporating a temperature control function to each of the chambers, technology that enables controlled independently temperature is disclosed in each chamber.
また、同公報には、このようなマイクロマルチチャンバを用いてPCR(polymerase chain reaction:PCR法)による核酸増幅反応を行う技術が記載されている。 Further, the same publication, such micro multi PCR using chamber: a technique of performing (polymerase chain Reaction PCR method) by nucleic acid amplification reaction are described. この技術は、それぞれのチャンバに微少容量の種々のPCR用の反応液(生化学的試料)を与え、チャンバ毎に反応液に応じた温度サイクル制御を行うことにより、同時の多種,多数のPCRを可能にしている。 This technique gives a reaction solution for various PCR of small capacity (biochemical sample) to each of the chambers, by performing temperature cycle control according to the reaction liquid in each chamber, simultaneous wide, numerous PCR It is to allow. チャンバ母材は、例えばシリコンが用いられ、異方性エッチングによってチャンバとなる孔が掘られ、チャンバ内に温度調節手段として、半導体ペルティエ素子を形成している。 Chamber base material, for example silicon is used, holes serving as chamber by anisotropic etching is dug, as the temperature adjusting means in the chamber to form a semiconductor Peltier elements.
一方、特開2000−342264号公報、特開2001−235469号公報、特開2001−235474号公報においては、核酸検出用チップにおいて、一つの基板上に複数の独立した温度条件を設定することが可能な区域(区画)を設ける技術が開示されている。 On the other hand, JP 2000-342264, JP 2001-235469 discloses, in JP 2001-235474, in the nucleic acid detection chip, to set a plurality of independent temperature conditions on one substrate technique for providing the possible areas (partitions) have been disclosed. この従来技術は、DNA,mRNA等の核酸(ポリヌクレオチド)をハイブリダイゼーションにより検出(捕捉)することを目的としている。 This prior art is intended to DNA, nucleic acids such as mRNA (polynucleotide) detected by hybridization (capture). また、独立した温度制御が可能な複数の区画については、区画ごとに異なるオリゴヌクレオチドプローブ(核酸検出用プローブ)が固定されること、標的核酸を含む試料溶液の種類は各区画に共通の試料であり、その試料が基板上(チップ表面)に添加されること、各区画は各核酸検出用プローブのハイブリダイゼーションに適した温度に設定されることが述べられている。 Further, a plurality of partitions that can be independent temperature control, the different oligonucleotide probes for each partition (nucleic acid detection probe) is fixed, the type of sample solution containing target nucleic acid with a common sample each compartment There, the the sample is added onto the substrate (chip surface), it is stated that each partition is set to a temperature suitable for hybridization of the nucleic acid detection probe.
上記したように、従来の技術には、種々の一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを、基板上に高密度に整列固定するDNAチップや、多種,多数の試料を、一つの基板上の複数のチャンバで個別に温度制御して核酸増幅する技術や、一つの基板上で種別ごとの核酸検出用プローブ(オリゴヌクレオチドプローブ)を、独立して温度制御が可能な区画に固定する技術が開示されている。 As described above, in the prior art, the oligonucleotide probes of different single-stranded, DNA chips or a high density aligned immobilized on the substrate, a wide, a number of samples, one of the plurality of chambers on the substrate in technology and for nucleic acid amplification with individually temperature controlled, one of the nucleic acid probe for detecting each type on a substrate (oligonucleotide probes), a technique for fixing the temperature control is possible compartments independently is disclosed . これらの技術では、DNA,mRNAなどの関心のある核酸(標的核酸)を専ら増幅或いは検出するために用いるものとして開示されている。 In these techniques, DNA, a nucleic acid of interest, such as the mRNA (target nucleic acids) are disclosed as being used solely to amplify or detect. しかしながら、多種,多数の核酸を同時に増幅・検出可能にする技術については開示されていない。 However, a wide, it does not disclose a number of nucleic acids simultaneously allow amplification and detection techniques.
ところで、遺伝子発現が創薬分野などで重要となるに従い、10〜20ないし100種類の限定した関心のある遺伝子に関して、その発現量を定量評価することが求められている。 Meanwhile, according to the gene expression is important in such drug field, with respect to the gene of 100 kinds of limiting the interest to no 10-20, there is a need to quantify evaluate the expression level. 従来の技術では、発現の増減などは、DNAチップを用いることにより評価することが可能であったが、定量性に乏しく、また標的核酸の増幅手順を外部で行うため、煩雑である問題があった。 In the prior art, the increasing and decreasing of expression, it was possible to evaluate by using a DNA chip, poor quantitative accuracy, also for performing amplification procedure of the target nucleic acid at the outside, there is a troublesome problem It was. また、核酸の増幅においては、最適な温度制御に種類差が存在するため、一度に増幅が可能な種類数も限られていた。 Also, in the amplification of nucleic acids is due to the presence of the type difference optimum temperature control was limited also the number of types capable amplification at once.
一方、発現量の定量評価を行う技術であるリアルタイムPCRやTaqMan法は、増幅と同時に検出が行えるため、検出の精度が良く、簡便である。 On the other hand, real-time PCR and TaqMan method is a technique for quantitative evaluation of the expression level, since that allows the simultaneous detection and amplification, better accuracy of detection is convenient. しかし、1チューブで1種類の遺伝子しか検討できないため、関心のある遺伝子が複数ある場合は、その分リアクションが増加し、コストと煩雑さが激増する。 However, since one of the genes can only consider one tube, if the gene of interest there are multiple, correspondingly reaction increases, the cost and complexity are increased dramatically. さらに、測定サンプルを分注により小分けする必要があり、1リアクションあたりのサンプル量が減少してしまう。 Furthermore, it is necessary to subdivide the measurement sample dispensing, sample volume per reaction is reduced. 一般に、遺伝子発現で検討を行うサンプルは、微量であることがほとんどであり、小分けによる検出能の低下は、大きな問題である。 In general, a sample to examine gene expression is most often a small amount, lowering of the detectability by subdivision is a major problem.

本発明の目的は、関心のある遺伝子などの核酸(標的核酸)が10〜20ないし100種類程度存在する場合であっても、それらの標的核酸(DNA,mRNAなど)を同時に増幅し、一括で定量検定することが可能となる核酸分析方法の提供に関する。 An object of the present invention, even when a nucleic acid such as a gene of interest (target nucleic acid) is present about 100 kinds to not 10-20, amplifies their target nucleic acid (DNA, etc. mRNA) at the same time, in bulk It provides a nucleic acid analysis method it is possible to quantitatively assay.
本発明は、基本的には、次のように構成する。 The present invention is basically constructed as follows. 試料,試薬などの溶液を収容するためのスペース(反応層)を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための区画(核酸増幅用区画)と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための区画(核酸検出用区画)とを、互いに独立した温度制御が可能になるよう形成する。 Sample, on at least one surface forming a space for accommodating a solution such as a reagent (reaction layer), the nucleic acid compartment for generating the amplification (nucleic acid amplification compartment), hybridizing amplified nucleic acids generated after divergence and specifically compartments for capturing (for detecting nucleic acid compartments) by, formed so as to be capable of independent temperature control each other. そして、核酸増幅用区画では、核酸増幅のための温度サイクル制御を、核酸検出用区画では、特異的な捕捉に適した設定温度制御を行うことにより、単一の反応層にて核酸の増幅と検出を行う。 Then, a nucleic acid amplification compartment, a temperature cycle control for nucleic acid amplification, nucleic acid detection compartment By setting the temperature control suitable for specific capture, and amplification of nucleic acids in a single reaction layer to detect.
各区画は、温度センサーとヒーターのセットを個々に有し、それぞれ独立に制御することが可能である。 Each compartment has a set of temperature sensors and heaters individually, it is possible to control independently.
核酸増幅用区画は、核酸増幅用のプローブを備え、かつ少なくとも1以上形成される。 Nucleic acid amplification compartment is provided with a probe for nucleic acid amplification, and is formed at least one or more. 例えば、標的核酸がmRNAである場合には、核酸増幅用区画の表面には、mRNAの末端の特徴的配列であるポリA配列と相補的な、ポリT配列のプローブが固定されている。 For example, if the target nucleic acid is mRNA is the surface of the nucleic acid amplification compartment, complementary to the poly A sequence which is characteristic sequence at the end of the mRNA, a probe of poly-T sequence is fixed.
核酸検出用区画は、複数形成され、各核酸検出用区画には、2種以上の関心のある標的核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするために2種以上の検出用プローブ(オリゴヌクレオチドプローブ)が種別ごとに各核酸検出用区画に固定される。 For nucleic acid detection zone, formed in plural, the compartment for each nucleic acid detection, two or more detection probes to permit capture the target nucleic acid of two or more of interest by hybridization (oligonucleotide probes) It is fixed to the partition for each nucleic acid detection for each type.
それぞれの核酸検出用区画では、核酸検出用プローブとそれに相補的に結合するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの熱安定性を保証するために、核酸検出プローブの種別ごとにハイブリダイゼーション温度が設定される。 In each of the nucleic acid detection zone, in order to ensure hybridization of the thermal stability of the polynucleotide complementarily bind thereto and nucleic acid detection probes, the hybridization temperature is set for each type of nucleic acid detection probes. 核酸検出には標識化プライマーを用いた増幅物を利用する。 The nucleic acid detection utilizes an amplification product using a labeled primer.
さらに、核酸検出において、チップ上部の板に励起レーザーを入射し、その励起光の界面しみだし現象であるエバネッセント光を利用する装置も提案する。 Furthermore, the nucleic acid detection, incident excitation laser in a plate of the chip top device also proposes to utilize the evanescent light is's a surface stain of the excitation light phenomenon.
以下、上記およびその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。 Hereinafter, novel features and advantages of these and other of the present invention will be described with reference to the drawings. なお、図面はもっぱら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。 The drawings are provided for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of the invention.

第1図は、本発明の第1の実施例に用いる核酸増幅・検出セル(例えば遺伝子発現解析用検出セル)におけるチップ(基板)の上面図。 Top view of a chip (substrate) Figure 1 is in the first used in Example nucleic acid amplification and detection cell of the present invention (e.g., gene expression analysis for detecting cells). 第2図は、第1実施例のチップに配設される温度制御可能な区画の一つを取り出して示す詳細構造図。 Figure 2 is a detailed structural diagram showing taken out one temperature controllable sections to be arranged in the chip of the first embodiment. 第3図は、第2図の温度制御可能な区画を等価回路で示した図。 Figure 3 showed the temperature controllable sections of FIG. 2 in the equivalent circuit diagram. 第4図は、第2図に示す区画の温度制御系を示す基本回路図。 Figure 4 is a basic circuit diagram of a temperature control system of the partition shown in Figure 2. 第5図は、第2図の区画に設けられる温度検出用ダイオードの温度特性例を示す図。 FIG. 5 is a diagram showing a temperature characteristic example of the temperature detecting diode provided in the partition of FIG. 2. 第6図は、本発明の温度制御を行うシステムの全体構成図。 Figure 6 is a general block diagram of a system for temperature control of the present invention. 第7図は、本発明の第1の実施例に係る核酸増幅・検出セル(例えば遺伝子発現解析用検出セル)の断面図。 Figure 7 is a cross-sectional view of a first according to the example nucleic acid amplification and detection cell of the present invention (e.g., gene expression analysis for detecting cells). 第8図は、本発明の第1の実施例に用いる核酸増幅・検出セルと検出システムの概略図。 Figure 8 is a schematic diagram of the nucleic acid amplification and detection cells and detection systems used in the first embodiment of the present invention. 第9図は、本発明の第1の実施例における検出手順のフローを示す図。 Figure 9 is a view showing a flow of a detection procedure in the first embodiment of the present invention. 第10図は、本発明の第1の実施例における検出手順の温度条件を示す図。 Figure 10 is a diagram showing a temperature condition of the detection procedure in the first embodiment of the present invention. 第11図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、初期状態を示している。 Figure 11 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention shows an initial state. 第12図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、増幅用のポリTプローブに、mRNAがハイブリダイズ状態を示している。 FIG. 12 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention, the poly-T probe for amplification, mRNA indicates the hybridized state. 第13図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、逆転写反応(RT反応)によりmRNAの相補鎖伸張物が合成されている状態を示している。 FIG. 13 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention, the complementary strand extension of the mRNA indicates the state of being synthesized by reverse transcription reaction (RT reaction). 第14図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、mRNAの相補鎖伸張物の1本鎖の状態を示している。 Figure 14 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention, showing a state of single-stranded complementary strands elongation of mRNA. 第15図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、mRNAの相補鎖伸張物の1本鎖に増幅用プライマーがハイブリダイズしている状態を示している。 Figure 15 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention, showing a state in which the amplification primer to one strand of the complementary strand extension of the mRNA is hybridized there. 第16図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、増幅用プライマーの伸張により、蛍光標識化した検出用増幅物が合成されている状態を示している。 FIG. 16 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention, the extension of the amplification primers, shows a state in which the detecting amplified product was fluorescently labeled is synthesized there. 第17図は、本発明の第1の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、蛍光標識化した検出用増幅物が、検出区画のプローブに特異的にハイブリダイズしている状態を示している。 FIG. 17 is a diagram for explaining a first embodiment definitive nucleic acid amplification and detection method of the present invention, the condition detecting amplified product was fluorescent labeling, and specifically hybridize to a probe of the detection zone the shows. 第18図は、本発明の第2の実施例に用いる核酸増幅・検出セル(例えば遺伝子発現解析用検出セル)の模式図(断面図)。 Figure 18 is a schematic diagram of the nucleic acid amplification and detection cell used in the second embodiment of the present invention (e.g., gene expression analysis for detection cell) (sectional view). 第19図は、本発明の第2の実施例のセルに、エバネッセント光による励起を利用する例を示す模式図。 Figure 19 is a cell of a second embodiment of the present invention, schematic diagram showing an example of utilizing the excitation by evanescent light. 第20図は、本発明の第3の実施例に用いる核酸増幅・検出用チップの初期状態において、核酸増幅用区画には、標的核酸(目的遺伝子)に特異的なリバースプライマーが固定されている例を示す鳥瞰図。 FIG. 20, in the third initial state of nucleic acid amplification and detection chip used in an embodiment of the present invention, the nucleic acid amplification compartment, reverse primer specific to the target nucleic acid (target gene) is fixed bird's-eye view showing an example. 第21図は、本発明の第3の実施例において、核酸増幅用プライマー(リバースプライマー)にmRNAがハイブリダイズし、相補鎖伸張合成が行われる例を示す鳥瞰図。 FIG. 21, in the third embodiment of the present invention, bird's-eye view showing an example of mRNA in a nucleic acid amplification primer (reverse primer) hybridizes the complementary strand extension synthesis is performed. 第22図は、本発明の第3の実施例において、リバースプライマーの伸張した部分に、蛍光標識付フォワードプライマーがハイブリダイズしている例を示す鳥瞰図。 FIG. 22, in the third embodiment of the present invention, bird's-eye view showing the extended portion of the reverse primer, an example of a forward primer with the fluorescent label is hybridized. 第23図は、本発明の第3の実施例において、蛍光標識付フォワードプライマーが伸張されて、蛍光標識化した検出用増幅物となる例を示す図。 FIG. 23, in the third embodiment of the present invention, shows an example in which a forward primer with the fluorescent label is stretched, the detection amplification product was fluorescently labeled. 第24図は、本発明の第5実施例に係るに用いる核酸増幅・検出セル(例えば遺伝子発現解析用検出セル)におけるチップ(基板)の上面図。 Figure 24 is a top view of a chip (substrate) in the nucleic acid amplification and detection cell used in the fifth embodiment of the present invention (e.g., gene expression analysis for detecting cells).

(第1の実施例) (First Embodiment)
本発明の第1の実施例として、遺伝子発現解析を実施した例を以下に示す。 As a first embodiment of the present invention, the following examples embodying the gene expression analysis.
図1は、本実施例に用いる核酸増幅・検出セル(例えば遺伝子発現解析用検出セル)におけるチップ(基板)の上面図である。 Figure 1 is a top view of a chip (substrate) in the nucleic acid amplification and detection cell used in this embodiment (eg, gene expression analysis for detecting cells).
本実施例におけるチップ(基板)11は、例えば試料,試薬などの溶液を収容するスペース(以下、「反応層」と称する)12を有し、また、その溶液などの導入口13−1及び排出口13−2を有する。 Chip (substrate) 11 in this embodiment, for example the sample, a space for accommodating a solution such as a reagent (hereinafter, referred to as "reaction layer") has a 12, also inlets 13-1 and discharge such that the solution having an outlet 13-2.
チップ11における反応層12の一面には、複数の区画14および15−1〜15−8が形成されている。 On one surface of the reaction layer 12 in the chip 11, a plurality of compartments 14 and 15-1~15-8 are formed. それぞれの区画には、独立して作動する温度センサーとヒーターの組みが設けられている。 Each compartment, a set of temperature sensors and a heater that operates independently are provided. 温度センサーおよびヒーターの一例については、図2によって後述する。 An example of a temperature sensor and the heater will be described later by FIG.
複数の区画のうち、あるものは、核酸増幅用区画として機能し、あるものは核酸検出用として機能する。 Among a plurality of compartments, some functions as a nucleic acid amplification compartment and some function as nucleic acid detection. 図1では、チップ11において、区画14が核酸増幅用区画であり、区画15−1〜15−8が核酸検出用区画である。 In Figure 1, the chip 11, compartment 14 is the nucleic acid amplification compartment, compartment 15-1~15-8 a lane mark detection nucleic acid. 本実施例では、核酸増幅用区画14の両側或いは周囲に複数の核酸検出用区画15−1〜15−8を配設することによって、核酸検出用区画15−1〜15−8のすべてが、核酸増幅用区画14に対して等しい距離で配置されている。 In this embodiment, by disposing a plurality of nucleic acid detection zone 15-1~15-8 sides or around the nucleic acid amplification compartment 14, all of the nucleic acid detection zone 15-1~15-8 is, They are arranged at equal distance to the nucleic acid amplification compartment 14. なお、図1では、核酸増幅用区画14は、一つ、核酸検出用区画15は8つものを例示しているが、実際は、この数に限定されるものではなく、また、核酸検出用区画については、数十、数百のオーダとなる。 In FIG. 1, a nucleic acid amplification compartment 14, one, but the nucleic acid detection zone 15 illustrates the eight ones, in fact, not limited to this number, also, compartment for nucleic acid detection for, the tens, hundreds of the order.
図2は、図1で示した区画のうち、1つの区画の構造を説明する図である。 2, of the compartments shown in FIG. 1 is a diagram illustrating the structure of one compartment. 各区画は、全て同様の構造を有する。 Each partition has all similar structure. 各区画は、半導体製造技術を用いて作製される。 Each compartment is fabricated using a semiconductor manufacturing technology.
温度を検出する温度センサーは、P型拡散層21とN型拡散層22の接合で形成されたダイオードであり、その抵抗値の温度依存性を用いてセンサーとして利用する。 Temperature sensor for detecting the temperature is a diode formed by the junction of the P-type diffusion layer 21 and the N-type diffusion layer 22 is utilized as a sensor using the temperature dependence of the resistance value. また、このダイオードは、P型拡散層23を保護層として用い、ダイオード部分の電位を制御している。 Also, this diode uses a P-type diffusion layer 23 as a protective layer, thereby controlling the potential of the diode portion. 区画全体のチップ基板24はN型基板を用いており、その電位はN型拡散層25により決められる。 Chip substrate 24 of the whole partition has an N-type substrate, the potential is determined by N-type diffusion layer 25.
チップ24の電位即ちN型拡散層25の電位を、ダイオードのP型拡散層21の電位と等しくすることによって、保護層23とチップ基板24とがPN接合であっても、温度センサーから保護層23外部にセンサー電流が流出することを防ぐことが可能となる。 The potential of the potential i.e. N-type diffusion layer 25 of the chip 24, by equalizing the potential of the P-type diffusion layer 21 of the diode, also the protective layer 23 and the chip substrate 24 is a PN junction, a protective layer from a temperature sensor 23 external to the sensor current is possible to prevent the outflow. また、チップ基板24側からみれば、チップ基板24と保護層23は、NP接合となるので、保護層の外部から温度センサーにノイズ電流が流入することを防止できる。 Further, when viewed from the chip substrate 24 side, the chip substrate 24 and the protective layer 23, since the NP conjunction, it is possible to prevent the noise current flows into the temperature sensor from the outside of the protective layer.
本実施例では、ヒーターはN拡散層26で形成されている。 In this embodiment, the heater is formed of N diffusion layer 26. N型拡散層26は、P型拡散層の保護層27で囲まれている。 N-type diffusion layer 26 is surrounded by a protective layer 27 of P-type diffusion layer. 保護層27の電位は、P型拡散層28で決まる。 The potential of the protective layer 27 is determined by the P-type diffusion layer 28.
N型拡散層26の一端を保護層27と同電位(−)とし、他端を正極(+)とすると、N型拡散層26と保護層27はNP接合となるため、ヒーター電流が保護層へリークしない。 Same potential as the protective layer 27 to one end of the N-type diffusion layer 26 (-), and when the other end with the positive electrode (+), the protective layer 27 and the N-type diffusion layer 26 becomes NP junction, the heater current protective layer It does not leak to. そのため、N型拡散層26は、電熱線の構造と等価となる。 Therefore, N-type diffusion layer 26, a structure equivalent to the heating wire. このヒーター26に流れる電流を制御することにより、加熱を制御することができる。 By controlling the current flowing in the heater 26, it is possible to control the heating. センサーと回路の接続は、正極側をS(+)、負極側をS(−)と表す。 Connection of the sensor and circuit, the positive pole side S (+), a negative electrode side S - expressed as (). また、ヒーターと回路の接続は、正極側をR(+)、負極側をR(−)と表す。 The connection of the heater and circuits, the positive electrode side R (+), a negative electrode side R - represents a (). これらの構造を、等価回路で表すと、図3となる。 These structures, when represented by an equivalent circuit, the FIG. 温度センサーは、ダイオード31であり、ヒーターは32で表される。 Temperature sensor, a diode 31, the heater is represented by 32.
区画の温度を制御する基本回路の概略およびチップ上の区画との接続を図4に示す。 The connection between the schematic and the partition on the chip of the basic circuit for controlling the temperature of the compartments shown in FIG. これは、1つの区画について、温度を検出し、加熱を制御する回路の1例である。 This means that for one section detects the temperature, it is one example of a circuit for controlling the heating.
温度センサーのダイオード31には、定電流回路が接続する。 The diode 31 of the temperature sensor, a constant current circuit is connected. この回路は、抵抗41が、ダイオードの抵抗値が無視できる程大きい場合、抵抗41で決まるほぼ一定の電流が流れる定電流回路となる。 This circuit, the resistance 41, is larger as the resistance value of the diode can be ignored, it becomes substantially constant current circuit to flow a constant current determined by the resistor 41. ダイオード31における電圧降下は、電圧計42で測定し、その値は制御部43に送られる。 Voltage drop across the diode 31 is measured by the voltmeter 42, its value is sent to the control unit 43.
制御部43は、予め設定された電圧値(設定値Vs)と、電圧計42における測定値(Vx)を比較し、Vs<Vxの場合はゲート44をON、Vs>Vxの場合はゲート44をOFFとする制御を行う。 Control unit 43, preset voltage value (set value Vs), compared measurements at the voltmeter 42 (Vx), Vs <ON the gate 44 in the case of Vx, Vs> For Vx gate 44 the control is performed to the OFF. ヒーター側回路は、ゲートON時に両端に電圧45が印加され、OFF時には電圧印加が切れる。 Heater side circuit, the voltage 45 across at the gate ON is applied, OFF times voltage application expires. この基本回路を用いる制御について、以下に説明する。 The control using the basic circuit will be described below.
ダイオード31両端の電圧降下とチップの区画温度との関係(1例)を、図5に示した。 Diode 31 voltage drop across the chip relationship between compartment temperature of the (one), shown in FIG. 以下、この例を用いて説明する。 It will be described with reference to this example. 図5に示すとおり、チップの温度(T[摂氏度])と電圧降下(Vx[mV])は、直線性を示し、その傾きは、本例では約−2mV/度である。 As shown in FIG. 5, the chip of the temperature (T [degrees Celsius]) and the voltage drop (Vx [mV]) indicates a linear, its slope, in the present embodiment is approximately -2 mV / degree. そのため、以下の近似式(1)で示される。 Therefore, as shown by the following approximate expression (1).
Vx=−2T+560 …(1) Vx = -2T + 560 ... (1)
つまりチップの区画温度が1度上昇すると、電圧降下が約2mV減少する。 That the compartment temperature of the chip rises once the voltage drop is reduced to about 2 mV. 予め、この関係式を測定しておくことにより、電圧降下からチップ温度を計算することが可能となる。 Advance, by previously measuring the relationship, it is possible to calculate the chip temperature from a voltage drop. なお、傾きの値は、測定条件等により異なる。 Note that the slope value is different by measurement conditions and the like. また、本特許では説明しないが、ダイオードの抵抗値の温度依存性を、定電圧条件や、その他の条件を用いて関係式を求めることも可能であることは言うまでもない。 Although not described in this patent, the temperature dependence of the resistance value of the diode, it is needless to say constant voltage and it is also possible to determine the relationship with other conditions.
図5で示した通り、本例では、温度上昇は、電圧降下の低下で観測される。 As shown in FIG. 5, in this embodiment, the temperature rise is observed in the reduction in the voltage drop. そこで、チップ内における任意の区画の温度を、以下の通りに制御することが可能である。 Therefore, the temperature of any compartment in the chip, it is possible to control as follows.
例えば、ある区画を、T=摂氏50度で制御する場合を説明する。 For example, a case of controlling in a certain compartment, T = 50 degrees Celsius. 区画の温度が、所望の温度条件である摂氏50度より低い場合、センサーにおける電圧降下は、摂氏50度における電圧降下量460mVより大きい。 If the temperature of the compartment is lower than 50 degrees Celsius is the desired temperature condition, the voltage drop across the sensor is greater than the voltage drop 460mV at 50 degrees Celsius. 設定値Vsを、Vs=460とすると、Vx>Vsの条件が成り立つため、ゲート44がON制御となり、本回路はVx<Vsとなるまでヒーター回路に電流が流れ、区画は加熱される。 The set value Vs, when the Vs = 460, since Vx> Vs condition is satisfied, gate 44 becomes ON control, the circuit current flows through the heater circuit until Vx <Vs, compartment is heated. 加熱により区画の温度が上昇し、Vx<Vsが達成されると、ゲートがOFFとなり、加熱が停止するため、それ以上の温度上昇は発生しない。 The temperature of the compartment rises by heating, when Vx <Vs is achieved, because the gate is OFF, the heating is stopped, more temperature rise of not occur. 熱拡散により、区画の温度が下がり、再度Vx>Vsとなると、ゲートは再度ONとなり、加熱が再開する。 By thermal diffusion, down the temperature of the compartment and a back Vx> Vs, the gate again turned ON, the heating is resumed. この制御により、区画の温度は摂氏50度に維持される。 This control temperature of the compartment is maintained at 50 degrees Celsius.
本実施例では、この基本回路をチップの全ての区画に、それぞれ1回路ずつ接続し、その各設定値を独立に制御することにより、各区画の温度を独立に制御することが可能となる。 In this embodiment, the basic circuit in all compartments of the chip, connected one each circuit, by controlling independently the set values, it is possible to independently control the temperature of each compartment. すなわち、単一のチップ(基板)11に、核酸を増幅するための区画14と、増幅された核酸をハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための区画15−1〜15−8とが、互いに独立して温度制御が可能なヒーターを伴って形成される。 That is, a single chip (substrate) 11, a compartment 14 for amplifying nucleic acids, and compartment 15-1~15-8 to specifically capture the amplified nucleic acid by hybridization, independently of one another It is formed with a heater whose temperature can be controlled.
図6は、本実施例のシステム全体を示す図である。 Figure 6 is a diagram showing the overall system of this embodiment. 61および62−1〜62−8は、区画14および区画15−1〜15−8に接続する基本回路の制御部を示している。 61 and 62-1~62-8 shows the control unit of the basic circuits connected to the partition 14 and the partition 15-1~15-8. コンピューター63は、システム全体を制御し、予めプログラムされた温度制御を行い、インターフェース64は、コンピューター63と全部の制御部61、62−1〜62−8を接続する。 Computer 63 controls the entire system, performs preprogrammed temperature control, the interface 64 connects the whole of the control unit 61,62-1~62-8 the computer 63.
コンピューター63には、各区画の時刻ごとの設定温度或いは、それに対応する設定電圧値が、予めプログラムされている。 The computer 63, the set temperature for each time of each compartment or the set voltage value corresponding thereto, are pre-programmed. コンピューター63は、そのプログラムに則り、インターフェース64を介し、各基本回路の制御部61、62−1〜62−8へ、設定された温度或いはそれに対応する電圧値を、その時刻ごとの設定値Vsとして入力する。 Computer 63, in accordance with the program, via the interface 64, the control unit 61,62-1~62-8 of basic circuits, the set temperature or the voltage value corresponding thereto, the set value Vs per the time It is entered as. この結果、各区画はプログラムされた温度シーケンスを忠実に実現することができる。 As a result, each compartment can be faithfully realize the programmed temperature sequence. 以上が本発明のチップにおける、区画の構造、並びにその区画に接続する回路およびシステムの概要である。 Or in a chip of the present invention, the structure of the compartment, as well as an overview of the circuit and system for connecting to the partition.
つぎに、チップの構造について説明する。 Next, the structure of the chip. 図1において、核酸増幅用区画14には、その表面に、サンプル中の発現遺伝子(標的核酸例えばmRNA)を捕捉するポリTプローブが、配列末端5'側を区画表面側に向けて固定されている。 In Figure 1, the nucleic acid amplification compartment 14 has, on its surface, a poly T probe to capture expressed genes in a sample (target nucleic acid e.g. mRNA) is, the sequence 5 'end side is fixed toward the partition surface there. ポリTプローブは、配列番号1で示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、発現遺伝子が末端に有するポリA領域に、特異的にハイブリザイズする機能を有する。 Poly T probes are oligonucleotide probes having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the poly A region expressed gene has terminated, has the function of specifically hybridizing Zaizu. ここでは、配列長として20merのものを採用した。 Here, we adopted those 20mer as sequence length. しかし、ポリTプローブとしては、長さとして8〜200merの範囲のポリTオリゴヌクレオチドを利用できる。 However, the poly T probe, available poly-T oligonucleotides ranging 8~200mer as the length. 8merより短い物では、ハイブリダイズ時の安定性に欠ける。 The short ones than 8mer lack the stability at the time of hybridizing. また、200merより長い物の場合、機能としては充分であるが、製造のコストがかかる短所がある。 Also, in the case of longer ones than 200Mer, it is sufficient as a function, there is a disadvantage that the manufacturing cost of consuming. また、ポリTオリゴの5'末端側に、T以外も並ぶ領域を任意に付加する場合もある。 Also, the 5 'end of the poly-T oligos, sometimes arbitrarily adding a region also arranged other than T. これは、固相表面からの距離を大きくする効果があり、ハイブリダイゼーションの効率が高まる。 This has the effect of increasing the distance from the solid surface, increasing the efficiency of hybridization.
核酸検出用区画15−1〜15−8は、その表面に、目的の遺伝子に対応する増幅物に、特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブが固定されている。 Nucleic acid detection zone 15-1~15-8 has on its surface, the amplification product corresponding to the gene of interest, oligonucleotide probes capable of specifically binding are fixed. このプローブは、目的の遺伝子ごとに、最適な配列のものが選択される。 The probe for each gene of interest, is selected as the optimal sequence. 本実施例では、GAPDHとP53の2種類のmRNAについて、その発現量を測定することを試みた。 In this embodiment, two types of mRNA of GAPDH and P53, it was attempted to measure the expression level. GAPDH及びP53のmRNAを検出するプローブの配列は、それぞれ配列番号2及び配列番号3である。 Sequences of the probes to detect the GAPDH and P53 of mRNA is SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
これらの配列は、それぞれ、区画15−1及び区画15−5に固定されているとする。 These sequences, respectively, and are fixed to the partition 15-1 and partition 15-5. 固定化の方法は、アミノシラン化処理を行ったチップ表面に対し、リンカーとして、1,4−Phenylene Diisothiocyanateを用い、3'末端をアミノ修飾した上記オリゴプローブを固定する方法が、もっとも簡便である。 The method of immobilization, to the chip surface was subjected to aminosilane treatment, as a linker, using 1,4-Phenylene Diisothiocyanate, a method of fixing the oligo probe amino modifying the 3 'end, it is most convenient. ここで、特に、3'側をチップ表面に固定することが重要である。 Here, in particular, it is important to fix the 3 'side to the chip surface. これにより、このプローブにおいて、ポリメラーゼによる伸張反応が発生しない。 Accordingly, in this probe, the extension reaction by the polymerase does not occur. 同様の目的には、5'末端側を固定側とする場合において、プローブの3'側末端塩基を、伸張反応が発生しないように化学処理することも有効である。 The same purpose, 'in the case of the fixed-side end side, 3 of the probe' 5 side terminal base, it is effective to stretch the reaction is chemically treated so as not to occur.
これらの核酸検出用区画に、目的とする遺伝子に対応した増幅物がハイブリダイズするため、その量を検出することにより、目的遺伝子の量が決定できる。 These nucleic acid detection zone, since the amplification product corresponding to the gene of interest is hybridized, by detecting the amount, it determines the amount of target gene. その詳細は、後述する。 The details will be described later.
本発明で用いる核酸増幅・検出セルは、図7に示すように、既述した核酸増幅用区画14及び核酸検出用区画15−1〜15−8を有するチップ11と、そのチップ11の面上に、チップ面と対向するように配置された透明なシート(上部板)72とを有し、このチップ11と上部板72とにより挟まれる空間12にサンプル(試料,試薬などの溶液)72を保有する。 Nucleic acid amplification and detection cell used in the present invention, as shown in FIG. 7, a chip 11 having a nucleic acid amplification compartment 14 and the nucleic acid detection zone 15-1~15-8 already described, on the face of the chip 11 in, and a deployed transparent sheet (upper plate) 72 so as to face the chip surface, the space 12 sandwiched between the chip 11 and the upper plate 72 sample 72 (sample solution such as a reagent) Possess. ここでは、チップ11と、上部板72とを合わせたものを「セル」と称する。 Here, the chip 11, to the combined upper plate 72 referred to as "cells."
図1では、上部板72を外した状態でチップ11を見ているものであり、図7は、図1において、区画15−1と15−5を通る断面図である。 In Figure 1, which are seeing chip 11 when opening the upper plate 72, FIG. 7, FIG. 1 is a cross-sectional view through the partition 15-1 and 15-5.
チップ(基板)11及び上部板72との間の層状の空間が、サンプルを収容する反応層12となり、基板17をリソグラフィにより加工することにより形成される。 Space of the layered between the chip (substrate) 11 and the upper plate 72, the reaction layer 12 becomes to accommodate the sample, it is formed by processing by lithography substrate 17. なお、チップ11と上部72とをシートにより形成し、その間にスペーサを介在することで反応層12を形成することも可能である。 Incidentally, the chip 11 and the upper 72 is formed by a sheet, it is also possible to form the reaction layer 12 by interposing a spacer therebetween.
上部板72は、厚さは、0.01mm〜1mmが最適である。 Upper plate 72, the thickness is 0.01 mm to 1 mm is optimal. 材質は、ガラス、各種のプラスチックなどが利用できるが、その内部に蛍光物質をなるべく含まないことが重要である。 The material, glass, various plastics, etc. can be used for, it is important that it does not contain as much as possible a fluorescent substance therein. また、厚さ1mmを越える材料を用いることも可能であるが、上部板が熱伝達物質として働いてしまうため、本発明の目的である、チップ内の温度独立性を保つことが、難しくなる。 It is also possible to use a material that exceeds the thickness of 1 mm, since the upper plate will act as a heat transfer material, is an object of the present invention, to keep the temperature independence of the chip, becomes difficult. 一方、0.01mm以下では、強度に問題がある。 On the other hand, 0.01 mm in the following, there is a problem in strength. サンプルの層73は、0.05mm〜1mmが好適である。 Layer 73 of the samples, 0.05 mm to 1 mm is suitable. 1mmを越えると、チップ内のサンプル溶液において、熱による対流が発生するため、熱の独立性が劣化する。 It exceeds 1 mm, the sample solution in the chip, since the convection due to heat is generated, the thermal isolation is deteriorated.
核酸増幅用区画14と核酸検出用区画15−1〜15−8との間及び核酸検出用区画間は、熱の独立性を保つための薄膜状の構造が重要である。 Between and between nucleic acid detection zone with a nucleic acid amplification compartment 14 and a nucleic acid detection zone 15-1~15-8, it is important film-like structure for maintaining the thermal independence. これは、シリコン酸化膜を用いることが工業的に有効であるが、そのほか、プラスチックやポリイミドフィルムに代表される様な、他の有機材料フィルムを用いることも可能である。 This is the use of a silicon oxide film is industrially effective, other, such as typified by plastic or polyimide film, it is also possible to use other organic materials film. また、このチップは、平面的なため、上下方法への熱拡散効率が高い。 Also, the chip, because it planar, high thermal diffusion efficiency in a vertical way. そのため、検知温度が高い場合は、単にヒーターをoff条件とすることにより、冷却機能を設けずに、所定の温度まで下げることが可能である。 Therefore, if the detected temperature is high, simply by a heater and off condition, without providing the cooling function, it can be lowered to a predetermined temperature.
チップ表面上の核酸検出用区15−1〜15−8で捕捉した蛍光標識付き核酸増幅産物の量は、蛍光量として検出される(蛍光標識付き増幅産物の生成については後述する)。 The amount of the captured fluorescent labeled nucleic acid amplification products in a nucleic acid detection ku 15-1~15-8 on the chip surface (will be described later generation of fluorescent labeled amplified product) to the detected as fluorescence amount. 図8にその検出系を、セルに付加した状態を示す。 The detection system in FIG. 8 shows a state in which added to the cells.
本実施例では、蛍光検出系は、共焦点顕微鏡と同様な構成で行う。 In this embodiment, fluorescence detection system is performed in the same configuration as confocal microscopy. 他の検出方法に関しては、後述の実施例で説明する。 For other detection methods are described in the Examples below.
蛍光検出系は、レンズ81を用いるより、光検出器82と、励起レーザー83は、セル表面に対して共焦点関係84にあり、レーザー83で励起された反応層12中の各検出用区画における蛍光標識(蛍光量)が光検出器82により測定される。 Fluorescence detection system, from the use of lens 81, a photodetector 82, the excitation laser 83 is in confocal relation 84 to the cell surface, in each detection compartment in the reaction layer 12 excited by the laser 83 fluorescent labels (fluorescence amount) is measured by the photodetector 82.
検出器82、レーザー83、レンズ81はユニットとして一体に組み立てられており、それ全体で水平方向(図中矢印で表示)に移動して、セル表面のスキャニングを行う。 Detector 82, laser 83, the lens 81 is assembled together as a unit, to move the whole horizontal direction it (indicated by the arrow), it performs scanning of the cell surface.
次に、本実施例のチップを用いた核酸増幅の前処理、核酸増幅および検出の操作手順と、チップ上(セル内)で生成される生成物の変遷について、図9〜図17を用いて説明する。 Next, pretreatment of nucleic acid amplification using chips of this embodiment, the operation procedure of the nucleic acid amplification and detection, the transition of product produced on the chip (in a cell), with reference to FIGS. 9 to 17 explain.
サンプルは、一例として体細胞より抽出した全RNAである。 Sample is the total RNA extracted from somatic cells as an example. また、今回の標的核酸(ターゲット)は、GAPDHとP53の2種類のmRNAである。 Further, this target nucleic acid (target) is the two mRNA of GAPDH and P53.
図9は、本実施例の操作手順をまとめたものである。 Figure 9 summarizes the operating procedure of this embodiment. 図10は、それぞれの手順における、核酸増幅用区画、核酸検出用区画15−1の温度制御条件をまとめたものである。 Figure 10 is a in each procedure, the nucleic acid amplification compartment summarizes the temperature control conditions for nucleic acid detection zone 15-1.
図11は、チップ11の表面を模式的に説明する鳥瞰図である。 Figure 11 is a bird's-eye view for explaining the surface of the chip 11 schematically. 図11に示すように、チップ表面の初期状態では、核酸増幅用区画14の表面にポリTプローブ111(配列番号1)が、GAPDH用核酸検出用区画15−1にはGAPDH用プローブ112(配列番号2)が固定されている。 As shown in FIG. 11, in the initial state of the chip surface, surface poly T probe 111 (SEQ ID NO: 1) nucleic acid amplification compartment 14, GAPDH probe 112 (sequence for GAPDH for nucleic acid detection zone 15-1 No. 2) is fixed.
全RNAを含むサンプル溶液をチップ11の反応層12内に注入し、その後、図10に示す温度条件(1)に設定する。 The sample solution containing the total RNA was injected into the reaction layer 12 of the chip 11, then set the temperature condition (1) shown in FIG. 10. この温度条件は、増幅用区画14がハイブリダイズに適した35℃、核酸増幅用区画15−1〜15−8は、それよりもはるかに高温の75℃である。 The temperature condition is, 35 ° C. for amplifying section 14 is suitable for hybridizing nucleic acid amplification compartment 15-1~15-8 is much hotter in the 75 ° C. than that. その結果、サンプル中のmRNAは、核酸増幅用区画14のポリTプローブ111とハイブリダイズして固定される。 As a result, mRNA of the sample is fixed hybridized with poly T probe 111 of the nucleic acid amplification compartment 14.
図12は、mRNAが、核酸増幅用区画14にポリTプローブ111によって捕捉された様子を模式的に示す鳥瞰図である。 12, mRNA is a bird's-eye view schematically showing a state trapped in a nucleic acid amplification compartment 14 by poly T probe 111. ここでは、全てのmRNAが、種類を問わずに捕捉される。 Here, all the mRNA is captured regardless of the type. 例えば、GAPDHのmRNA121、p53のmRNA122及びそれ以外のmRNA123が捕捉される。 For example, the GAPDH mRNA121, p53 of mRNA122 and other mRNA123 is captured. 一方、核酸検出用区画15−1は、高温条件のため、ハイブリダイズは生じない。 On the other hand, for nucleic acid detection zone 15-1, for high temperature conditions, it hybridizes does not occur.
次に、不要物を洗浄し、逆転写用試薬(RT試薬)を導入して、図10に示す温度条件(2)とすると、核酸増幅用区画において、逆転写が生じる。 Then washed unnecessary substances, by introducing a reverse transcription reagents (RT reagent), if the temperature condition (2) shown in FIG. 10, in a nucleic acid amplification compartment, reverse transcription occurs. このときは、増幅用区画14の温度は、逆転写に適した温度42℃に設定される。 In this case, the temperature of the amplifying section 14 is set to a temperature 42 ° C. which is suitable for reverse transcription. 核酸検出用区画15−1は、引き続き75℃の高温条件に維持される。 For nucleic acid detection zone 15-1 is maintained subsequent to a high temperature condition of 75 ° C..
図13は、逆転写により、ポリTプローブ111が伸張された様子を示す図である。 13, by reverse transcription, is a diagram showing how the poly T probe 111 is stretched. ここで、伸張したプローブは、mRNAの存在量を忠実に再現していることが肝要である。 Here, stretched probe, it is important to faithfully reproduce the abundance of mRNA. つまり、ここでは、GAPDHのmRNAによる伸張物131と、P53のmRNAによる伸張物132、及びそれ以外のmRNAによる伸張物133が存在する。 That is, here, the extension product 131 according mRNA of GAPDH, stretching was 132 by mRNA in P53, and stretching was 133 exists by other mRNA.
つぎに、図10の温度条件(3)とし、チップ内を洗浄すると、mRNAは全て排出され、核酸増幅用区画14内には、図14の通り、伸張したプローブ(逆転写産物)131〜133の1本鎖のみとなる。 Then, the temperature condition of FIG. 10 (3), when washing the chip, mRNA are all discharged, the nucleic acid amplification compartment 14, as in FIG. 14, elongated probe (reverse transcript) 131-133 only to become one strand of.
以上の過程が標的核酸を増幅するためのリバースプローブを形成する前処理であり、この前処理では、既述のように核酸検出用区画に固定された標的核酸検出用のプローブが前処理中にハイブリダイゼーション動作を起こさない温度(例えば75℃の高温条件)に制御される。 The above process is a process before forming the reverse probes for amplifying a target nucleic acid, in this pre-treatment, during treatment before the probe for detecting a target nucleic acid that is fixed for nucleic acid detection zone as described above It is controlled to a temperature which does not cause the hybridization behavior (e.g. high temperature of 75 ° C.).
次に、反応層12に核酸増幅試薬を導入し、温度条件を図10の(4)の温度に設定する。 Next, the reaction layer 12 by introducing a nucleic acid amplification reagent, to set the temperature conditions to a temperature of (4) in FIG. 10. このときの温度条件は、増幅用区画14が60℃、検出用区画15−1が65度である。 Temperature conditions in this case, the amplifying section 14 is 60 ° C., detection compartment 15-1 is 65 degrees.
この温度条件の下では、図15に示す動作がなされる。 Under this temperature condition, the operation shown in FIG. 15 is performed. すなわち、核酸増幅試薬中には、5'末端に蛍光標識を有するGAPDH用のプライマー151とp53のプライマー152とがあるため、これらのプライマーが伸張した増幅用プローブの1本鎖の所定の配列にハイブリダイズすることができる。 That is, a nucleic acid amplification reagent, 5 'for the terminal to have the primer 151 and p53 primer 152 for GAPDH with a fluorescent label, a predetermined sequence of one strand of the amplification probes which these primers were stretched You can hybridize. ここでは、GAPDH用のプライマー151は、GAPDHのmRNAによる伸張物131にハイブリダイズし、P53用のプライマー152は、P53のmRNAによる伸張物132にハイブリダイズする。 Here, the primer 151 for GAPDH hybridizes to the extended product 131 according mRNA of GAPDH primers 152 for P53 hybridizes to the extended product 132 by mRNA in P53.
ここで、温度条件(5)として、増幅区画14ではサーマルサイクルとすると、増幅区画において、GAPDHとP53のそれぞれの伸張物から、リニア増幅により蛍光標識付き増幅物161、162が生成される。 Here, as a temperature condition (5), when the amplifying section 14 in the thermal cycle in the amplification section, from each of the extension product of GAPDH and P53, fluorescent labeled amplification product 161, 162 is produced by linear amplification.
図16は、それぞれの蛍光標識付き増幅物161、162が合成された様子を示している。 16, each of the fluorescent labeled amplification product 161, 162 indicates a state synthesized. 一方、核酸検出用区画15−1及び15−5は、それぞれのプローブがハイブリダイズするために最適な温度条件に設定されている。 On the other hand, for nucleic acid detection zone 15-1 and 15-5, each of the probes is set to the optimum temperature conditions to hybridize. そのため、リニア増幅された増幅物が各プローブに特異的にハイブリダイズする(図17)。 Therefore, amplification product was linear amplified specifically hybridizing to each probe (Figure 17). この量を、増幅と並行して、リアルタイムで検出すると、増幅サイクルN回に対し、本来のmRNA量の2N倍の信号が検出できる。 This amount, in parallel with the amplification and detection in real time, with respect to amplification cycle N times, 2N times the signal of the original amount of mRNA can be detected.
本実施例では、説明を簡単にするため、2種類のmRNAの検出について説明したが、本発明ではそれ以上の複数種類のmRNAを、核酸検出用区画の数だけ同時に測定することが可能である。 In this embodiment, for simplicity of explanation, has been described two types of detection of the mRNA, the more multiple types of mRNA in the present invention, it is possible to measure only at the same time the number of nucleic acid detection zone .
以上より、本実施例によれば、1つのチップ内において、増幅と検出を並行して行うことが可能であり、1サンプル中の複数種類のmRNA発現量を、同時に、迅速で簡便に測定することが可能である。 From the above, according to this embodiment, within one chip, a amplification and detection can be performed in parallel, a plurality of types of mRNA expression level in one sample, at the same time, rapid and simple measurement It is possible.
(第2の実施例) (Second embodiment)
第2の実施例として、第1の実施例の検出性能をさらに向上させた核酸増幅・検出用セルについて、図18及び図19を用いて説明する。 As a second example, the further nucleic acid amplification and detection cell with improved detection performance of the first embodiment will be described with reference to FIGS. 18 and 19.
図18は、チップ11とこれと対向する上部板182との間に反応層(サンプル層)73を介在させた模式図(断面図)である。 Figure 18 is a schematic diagram obtained by interposing a reaction layer (sample layer) 73 between the upper plate 182 facing the tip 11 and which (sectional view). チップ11には、第1の実施例と同様に核酸増幅用区画と核酸検出用区画とを配設しているが、ここでは、図の便宜上、核酸検出用区画の一つである15−1のみを誇張して表示している。 The chip 11, although disposed a first embodiment similarly partitioned compartment and the nucleic acid detection nucleic acid amplification, where is one of convenience, compartment for nucleic acid detection in Figure 15-1 It is displayed only in an exaggerated manner.
本実施例では、核酸検出用のプローブ181(第1実施例のプローブ112に相当するもの)は、核酸検出用区画のヒーター表面ではなく、それと向かい面、すなわち上部板部分(透明シート)182に固定されている。 In this embodiment, (corresponding to the probe 112 of the first embodiment) probe 181 for nucleic acid detection, rather than the heater surface for nucleic acid detection zone, at the same facing surface, i.e. the top plate portion (transparent sheet) 182 It has been fixed. 上部板182は、第1実施例の上部板72に相当するものである。 Upper plate 182 corresponds to the upper plate 72 of the first embodiment. 換言すれば、核酸検出用区画で標的核酸を捕捉する検出用プローブ181は、温度制御可能な区画151−1…151−nなどのヒーター面と対向する面に固定されている。 In other words, the detection probe 181 to capture a target nucleic acid in the nucleic acid detection compartment is fixed to the heater surface which faces such as temperature controllable sections 151-1 ... 151-n.
すなわち、本実施例における核酸検出用区画は、基板11とシート182間の対向する面に機能を分けて形成され、基板11側の対向面には核酸検出用区画の温度サイクル制御を区画ごとに行うヒーター機能が設けられ、シート182側の対向面には、核酸検出用プローブ181が固定されて核酸検出機能が与えられている。 Namely, compartment for detecting nucleic acid in the present embodiment is formed by dividing the functions in opposing surfaces between the substrate 11 and the sheet 182, the opposing surface of the substrate 11 side every compartment temperature cycle control compartment for detecting nucleic acid heater function is provided to perform, on the facing surface of the sheet 182 side, the nucleic acid detection probe 181 is fixed nucleic acid detection function is provided.
本実施例のセルにおいて、反応層73の厚さが1.0mm以下の条件では、区画(151−1…151−n)の温度とそれに対向する上部板182表面の温度は、ほぼ等しい。 In the cell of this embodiment, under the condition thickness 1.0mm following reaction layer 73, the temperature of the temperature and the upper plate 182 surface facing thereto of the partition (151-1 ... 151-n) are approximately equal.
そのため、本実施例の構造においても、プローブ固定領域の温度を、それぞれのハイブリダイゼーション条件に制御することが可能である。 Therefore, also in the structure of this embodiment, the temperature of the probe fixing region, it is possible to control each of the hybridization conditions. そのため、プローブ181にハイブリダイズした測定対象物は、上部板表面に固定される。 Therefore, the measurement object hybridized to the probe 181 is fixed to the upper plate surface.
核酸増幅と並行に検出用プローブ181に増幅産物(増幅用プローブから乖離した蛍光標識付き増幅産物)が捕捉されている過程において、図19に示すように、上部板182には、上部板182の側方に配置したレーザー光源191から横方向に励起レーザー192が入射される。 In the process of amplification products in a detection probe 181 in parallel with the nucleic acid amplification (fluorescence labeled amplification product deviates from the amplification probes) are captured, as shown in FIG. 19, the upper plate 182, the upper plate 182 excitation laser 192 laterally from the laser light source 191 which is arranged on the side is incident. 図19は、上部板182へ励起レーザー192を入射させた場合を模式的に表している。 Figure 19 shows a case obtained by inputting excitation laser 192 to the upper plate 182 schematically.
この励起レーザーは、上部板182内を全反射しながら進行し、上部板182の外部には射出されない角度に制御してある。 The excitation laser travels while being totally reflected within the upper plate 182, is outside the upper plate 182 are controlled to an angle that is not emitted. すると、上部板182の近傍にだけ、エバネッセント光として、励起レーザー192の漏れだしが発生する。 Then, only in the vicinity of the upper plate 182, as evanescent light leaks out of the excitation laser 192 is generated. その結果、上部板表面に存在する蛍光標識付き増幅産物193だけが励起され、サンプル層中程に浮遊する蛍光標識付き増幅産物194は、励起されない。 As a result, only the fluorescent labeled amplification product 193 that is present on the upper plate surface is excited, the fluorescent labeled amplification product 194 floating in the sample layer middle is not excited. したがって、本実施例によれば、第1の実施例の効果に加えて、反応溶液中に存在するプライマーは蛍光発光に寄与しないため、蛍光検出のバックグラウンドが著しく減少し、測定S/Nが向上する。 Therefore, according to this embodiment, in addition to the effects of the first embodiment, the primers present in the reaction solution because it does not contribute to the fluorescence background of fluorescence detection is significantly reduced, the measurement S / N improves.
(第3の実施例) (Third Embodiment)
次に本発明の第3実施例について、図20〜図23を用いて説明する。 Next, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 20 to 23. 本実施例と第1実施例との相違点は、核酸増幅用区画14に固定されるオリゴヌクレオチドプローブの配列構造である。 Difference between this embodiment and the first embodiment is the arrangement of oligonucleotide probes is fixed to a nucleic acid amplification compartment 14. 核酸検出用区画については変わらない。 It does not change for nucleic acid detection compartment.
本実施例では、核酸増幅用区画に固定するプローブとして、第1実施例のような前処理を施すことなく、目的のmRNAを相補的かつ特異的にとらえるリバースプライマーを用いる例を示す。 In this embodiment, as the probe to be immobilized on the nucleic acid amplification compartment, without pretreatment to be applied as in the first embodiment, an example of using the reverse primer to capture mRNA of interest complementary and specific. 先と実施例と同様に、標的核酸としては、GAPDHとP53の2種類のmRNAを例として説明する。 As in the previous Example, the target nucleic acid will be described two types of mRNA of GAPDH and P53 as an example. これらの2種類のmRNAに、それぞれ特異的なプライマーとして、配列4〜配列7を用意する。 These two types of mRNA, as each specific primer, providing a sequence 4 array 7.
ここで、配列4と配列5は、GAPDHに対するフォワード及びリバースであり、配列6と配列7は、P53に対するフォワード及びリバースである。 Here, sequences 4 and SEQ 5, a forward and reverse for GAPDH, sequence 6 and SEQ 7, a forward and reverse for P53. リバースプライマーは、核酸増幅用区画の表面に符号201,202に示すように固定されている。 Reverse primer is fixed, as shown by reference numeral 201 and 202 on the surface of the nucleic acid amplification compartment. 一方、フォワードプライマーは、5'末端部に蛍光標識を有する。 On the other hand, the forward primer has a fluorescent label at the 5 'end. これらを用いて、核酸増幅を行う。 Using these, performing nucleic acid amplification. 核酸増幅用区画における反応を、以下に説明する。 The reaction in the nucleic acid amplification compartment, will be described below.
図20は、チップ内部の鳥瞰図である。 Figure 20 is a perspective view of the chip. チップ11の反応層にサンプルとして、全RNAを注入すると、そのうち、固定されているリバースプライマー201及びプライマー202に特異的な物、即ちGAPDH及びP53のみ、対応するリバースプライマーにハイブリダイズする(図21)。 As a sample to the reaction layer of the chip 11, when injecting the total RNA, of which, those specific to the reverse primer 201 and primer 202 are fixed, i.e. GAPDH and P53 only hybridize to the corresponding reverse primers (FIG. 21 ). 伸張反応により、リバースプライマー211、212は伸張し、mRNAと相補的な配列となる。 The extension reaction, reverse primer 211 and 212 extends, the mRNA sequence complementary. この核酸増幅におけるサーマルサイクルにより、乖離したmRNAは別のリバースプライマーに再びハイブリダイズする。 The thermal cycle in the nucleic acid amplification, divergence mRNA was again hybridize to another reverse primer. 一方、フリーのフォワードプライマーは、伸張したリバースプライマーと相補的に結合し(ハイブリダイズ)し、伸張する(図22)。 On the other hand, free forward primer complementarily binds to the stretched reverse primer (hybridizing) decompresses (Figure 22).
以上を繰り返すと、固定している伸張リバースプライマーと、伸張したフリーなフォワードプライマー(蛍光標識付き)が、初期のmRNA量の2のN乗倍で生成される(図23)。 When repeating the above, the stretching reverse primer that secure, stretched free forward primer (with a fluorescent label) is generated by the second N-th power of the initial amount of mRNA (Figure 23). 伸張したフリーなフォワードプライマーは、核酸検出用区画のプライマーと相補的配列であるため、第1及び第2の実施例と同様に、検出区画において検出される。 Stretched free forward primer are the complementary sequence and a primer for nucleic acid detection zone, as in the first and second embodiments, is detected in the detection zone. 本方法は、増幅率が著しく大きいため、微量のターゲットも検出することが可能である。 The method for the amplification factor is remarkably large, it is also possible to detect trace amounts of target.
なお、本実施例は、2種類のプライマーセットの温度サイクルを、それぞれ最適な条件とする必要がある。 Note that this embodiment, the temperature cycle of the two primer sets, it is necessary to make the optimum conditions respectively. そのため、アニーリング温度を配列ごとに、個別に設定する方が精度が良い。 Therefore, the annealing temperature for each array, a good accuracy better to set individually. その場合、核酸増幅用区画を複数個準備すれば、チップ内で複数種類の温度サイクルを同時に実現することが可能である。 In that case, if a plurality providing a nucleic acid amplification compartment, it is possible to realize a plurality of types of temperature cycling at the same time in the chip. 即ち、GAPDHに対する核酸増幅用区画と、P53に対する核酸増幅用区画を、それぞれ別々に設ける。 That is, a nucleic acid amplification compartment for GAPDH, a compartment for nucleic acid amplification for P53, respectively provided separately. 本実施例では、それぞれのリバースプライマーが、区画表面に固定されているため、それぞれの増幅反応は、対応する区画内でのみ発生させることが可能である。 In this embodiment, each of the reverse primer, since it is fixed to the partition surface, each of the amplification reaction, it is possible to generate only the corresponding partition.
(第4の実施例) (Fourth Embodiment)
以上の各実施例では、核酸の増幅と検出を同時に行っていた。 In the embodiments described above, it was subjected to amplification and detection of nucleic acids at the same time. そのため、第1の実施例のように、サンプル中にフリーのプライマーが存在するため、バックグラウンドが高くなる場合がある。 Therefore, as in the first embodiment, because of the presence of free primers in the sample, there is a case where the background is high. この場合、増幅と同時の検出は、信号量の概算評価とし、精密の評価に際しては、フリー成分を洗浄する行程を行うことが、精度向上に有効である。 In this case, detection of amplification and simultaneous, the signal amount of approximate evaluation, when the precision of the evaluation, be a step of washing the free component is effective to improve accuracy.
(第5実施例) (Fifth Embodiment)
図24は、核酸増幅用区画として、241−1及び241−2の2個が1反応層内に設けられている実施例である。 Figure 24 is a nucleic acid amplification compartment, an embodiment in which two 241-1 and 241-2 are provided in the first reaction layer. その他の構成は、第1実施例〜第4実施例のいずれかの構成が採用される。 Other configurations, any one of the first to fourth embodiments are employed. 242−1〜242−nは核酸検出用区画である。 242-1~242-n is a section for detecting nucleic acids.
核酸増幅の温度サイクルは、仕様する核酸増幅用のプライマーの配列により、最適条件が異なる。 Temperature cycling nucleic acid amplification, the sequence of the primer for nucleic acid amplification to specifications, the optimal conditions are different. 第一の実施例では、図10に示したとおり、温度サイクルとして(95℃:5秒→55℃:15秒→72℃:15秒)を利用した。 In the first embodiment, as shown in FIG. 10, as the temperature cycles (95 ° C.: 5 sec → 55 ° C.: 15 seconds → 72 ° C.: 15 seconds) was used. しかし、プライマーのGC率が大きい場合は、偽ハイブリダイズによる偽物合成があるため、プライマーのハイブリ温度を55℃よりも、5度高い60℃とすることが有効な場合もある。 However, if GC index of the primer is high, because there is a fake synthesis by false hybridized than the hybridization temperature of the primer 55 ° C., it is sometimes effective to five degrees higher 60 ° C.. また、生成物の塩基長が長い場合は、伸張合成時間である15秒を、さらに長くする必要もある。 Also, if the base length of the product is long, the 15 seconds which is stretched synthesis time, it is also necessary to further increase. 本発明の目的である核酸解析の精度向上のためには、これらの温度サイクルを、ターゲットとする核酸ごとに最適化することが有効である。 For increased accuracy of nucleic acid analysis is an object of the present invention, these temperature cycle, it is effective to optimize for each nucleic acid to be targeted. その実現には、反応層内に核酸増幅用区画を複数設け、異なる温度サイクルで制御する必要があり、図24の構成が有効である。 Its realization, a plurality of nucleic acid amplification compartment in the reaction layer, must be controlled by different temperature cycle, it is effective arrangement of Figure 24.
上記各実施例によれば、単一サンプル内の複数種類のターゲットに対し、その増幅と個々の検出を同時に行うことにより、簡便・安価で、高精度の遺伝子発現解析方法を提供することができる。 According to each of the above embodiments, the plurality kinds of targets in a single sample, by performing the amplification and the individual detected simultaneously, a simple and inexpensive, it is possible to provide a highly accurate method of gene expression analysis .

本発明によれば、例えば、関心のある核酸(例えば遺伝子)が10〜20ないし100種類程度存在する場合に、それらの遺伝子を同時に増幅し、一括で定量検定できる。 According to the present invention, for example, if there about 100 kinds to nucleic acid (e.g., gene) from 10 to 20 no of interest, it amplified the genes simultaneously, quantitatively assayed in bulk. また、単一反応層内で行うため、サンプルの小分けによる微量化の問題が生じず、従来より高感度の検出が可能となる。 Moreover, since carried out in a single reaction layer, does not occur in trace amounts of by dispensing the sample problem, it is possible to conventionally sensitive detection.

Claims (16)

  1. 試料,試薬などの溶液を収容するためのスペースにより形成される核酸分析のための反応層の少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための核酸増幅用区画と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための複数の核酸検出用区画とを、互いに独立した温度制御が可能になるよう形成し、 前記核酸増幅用区画は、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備え、複数の前記核酸検出用区画は、種別ごとの関心のある核酸増幅物をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするための核酸検出用プローブを備え、前記反応層に試料又は試薬の溶液を収容して、前記核酸増幅用区画では、 逆転写のため、又はPCRによる核酸増幅の温度サイクル制御のため、前記核酸検出用区 Sample, at least one surface of a reaction layer for the solution nucleic acid analysis which is formed by the space for accommodating the like reagents, nucleic acid and a nucleic acid amplification compartment for generating the amplification, the amplified nucleic acids produced after divergence and a plurality of nucleic acid detection compartment for specifically captured by hybridization, to form so as to be capable of independent temperature control to one another, wherein the nucleic acid amplification compartment and a primer at the time of nucleic acid amplification probes or reverse transcription comprising a probe comprising a plurality of the nucleic acid detection zone comprises a nucleic acid detection probes to allow capture nucleic acid amplification product of interest for each type by hybridization, a solution of the sample or reagent into the reaction layer housing to, in the nucleic acid amplification compartment, for reverse transcription, or for temperature cycle control of nucleic acid amplification by PCR, the nucleic acid detection Zone では、 前記核酸増幅用区画で行われる逆転写の間にハイブリダイゼーションを起こさないため、又は、前記核酸増幅用区画で生成された関心ある核酸増幅物を捕捉するために、それぞれの区画ごとに適した温度制御を行うことにより、単一の反応層にて核酸の増幅と検出を行うことを特徴とする核酸分析方法。 In order to during reverse transcription performed at the nucleic acid amplification compartment does not cause hybridization or to capture the interest generated by the nucleic acid amplification compartment nucleic acid amplification product, suitable for each compartment by performing the temperature control, a nucleic acid analysis method and performing amplification and detection of nucleic acids in a single reaction layer.
  2. 請求項1の核酸分析方法において、前記反応層で核酸の増幅と検出とを並行させる核酸分析方法。 In the method of nucleic acid analysis according to claim 1, nucleic acid analysis method of parallel detection and amplification of nucleic acids in the reaction layer.
  3. 請求項1の核酸分析方法において、前記核酸検出用区画には、前記核酸増幅用区画から乖離した蛍光標識付きの核酸増幅物を捕捉する核酸検出用プローブが固定され、この検出用プローブに捕捉された蛍光標識付き増幅物を検出する励起光としてエバネッセント光を用いる核酸分析方法。 In the method of nucleic acid analysis according to claim 1, the nucleic acid detection compartment, a nucleic acid detection probe that captures fluorescence labeled nucleic acid amplification product deviates from the nucleic acid amplification compartment is fixed, it is trapped in the detector probe nucleic acid analysis method using the evanescent light as the excitation light for detecting the fluorescence labeled amplification product.
  4. 請求項1の核酸分析方法において、前記核酸増幅用区画を複数形成し、それぞれに、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備える核酸分析方法。 In the method of nucleic acid analysis according to claim 1, wherein the nucleic acid amplification compartment and a plurality of formed, respectively, nucleic acid analysis method comprising a probe comprising a primer during nucleic acid amplification probes or reverse transcription.
  5. 試料,試薬などの溶液を収容するためのスペースにより形成される核酸分析のための反応層を有し、 Samples having a reaction layer for the solution analysis nucleic acid to be formed by the space for accommodating the like reagent,
    この反応層を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための核酸増幅用区画と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための複数の核酸検出用区画とが形成され、前記核酸増幅用区画は、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備え、複数の前記核酸検出用区画は、種別ごとの関心のある核酸増幅物をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするための核酸検出用プローブを備え、前記核酸増幅用区画及び前記核酸検出用区画が、それぞれのプローブに応じて区画ごとに独立した温度制御が可能になるよう形成してなることを特徴とする核酸分析用セル。 On at least one surface forming a reaction layer, and a nucleic acid amplification compartment to produce the amplified nucleic acid, compartment and is a plurality of nucleic acid detection to specifically captured by hybridization of amplified nucleic acid generated after divergence is formed, the nucleic acid amplification compartment is provided with a probe comprising a primer during nucleic acid amplification probes or reverse transcription, a plurality of the nucleic acid detection compartment, the interested of each type nucleic acid amplification product can be captured by hybridization comprising a nucleic acid detection probes to the said nucleic acid amplification compartment and the nucleic acid detection compartments, and characterized by being formed so as to be capable of independent temperature control for each compartment in response to each probe nucleic acid analysis for the cell to be.
  6. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画の表面には、mRNAのポリA配列と相補的な配列をなすポリT配列のプローブが固定されている核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the nucleic acid amplification surface of the compartment, mRNA poly (A) sequence with a poly-T sequence cell nucleic acid analysis probe is fixed forming a complementary sequence.
  7. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画の表面には、関心のあるmRNAが特異的にハイブリダイズ可能な核酸増幅用プローブが固定されている核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the nucleic acid amplification surface of the compartment, the cell for nucleic acid analysis mRNA is capable of specifically hybridizing nucleic acid amplification probes of interest is fixed.
  8. 請求項5の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画が複数形成され、それぞれに、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブが固定されている核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the nucleic acid amplification compartment is formed with a plurality, each cell for nucleic acid analysis probe is fixed to a primer at the time of nucleic acid amplification probes or reverse transcription.
  9. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、前記核酸増幅用区画と前記核酸検出用区画とは少なくとも前記基板の一面に併設されている核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the reaction layer is formed between the sheet having a substrate and a light transmitting placed it in opposite, the nucleic acid amplification compartment and said nucleic acid detection compartment At least cell for nucleic acid analysis that are juxtaposed on one surface of the substrate.
  10. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、前記反応層の厚みが0.05mm〜1mm及び前記シートの厚みが0.01mm〜1mmの少なくとも一つの条件を満たしている核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the reaction layer is formed between the sheet having a substrate and it is arranged opposite the light transmittance, the thickness of the reaction layer 0.05mm~1mm and the cell for nucleic acid analysis the thickness of the sheet meets at least one condition of 0.01 mm to 1 mm.
  11. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the reaction layer is formed between the sheet having a substrate and it is arranged opposite the light transmittance,
    前記核酸増幅用区画は、前記基板の一面に形成され、 The nucleic acid amplification compartment is formed on one surface of the substrate,
    前記核酸検出用区画は、前記基板と前記シート間の対向する面に、関心ある核酸増幅物を捕捉する核酸検出用プローブを有する核酸検出機能と前記核酸増幅物を捕捉するのに適した温度制御を行うヒーター機能とが分けて形成され、 前記ヒーター機能は前記基板側の対向面に設けられ、 前記核酸検出機能は前記シート側の対向面に設けられている核酸分析用セル。 The nucleic acid detection compartment, the opposing surfaces between the substrate and the sheet, the temperature control suitable for capturing the nucleic acid amplification product and the nucleic acid detection with a nucleic acid detection probe to capture interest nucleic acid amplification product the heater function and is formed separately performed, the heater function setting vignetting on the opposing surfaces of the substrate, the nucleic acid detection function the sheet side cells for nucleic acid analysis which is provided on the opposing face of the.
  12. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画の両側或いは周囲に前記核酸検出用区画が複数配設される核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein the sides or cell for nucleic acid analysis the surrounding nucleic acid detection zone is more disposed of nucleic acid amplification compartment.
  13. 請求項の核酸分析用セルにおいて、前記核酸検出用区画のすべてが、前記核酸増幅用区画と等しい距離で配置されている核酸分析用セル。 In nucleic acid analysis cell of claim 5, wherein all of the nucleic acid detection compartment, the nucleic acid amplification compartment equal cell for nucleic acid analysis which is arranged at a distance.
  14. 試料,試薬などの溶液を収容するためのスペースにより形成される核酸分析のための反応層を有し、この反応層を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための核酸増幅用区画と、生成された核酸増幅物を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための複数の核酸検出用区画とが形成され、前記核酸増幅用区画は、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備え、複数の前記核酸検出用区画は、種別ごとの関心のある蛍光標識付き核酸増幅物をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするための核酸検出用プローブを備え、前記核酸増幅用区画及び前記核酸検出用区画が、それぞれのプローブに応じて区画ごとに独立した温度制御が可能になるよう形成してなる核酸分析用セルと、 Samples having a reaction layer for the solution nucleic acid analysis which is formed by the space for accommodating the like reagents, at least on one surface to form the reaction layer, and a nucleic acid amplification compartment to produce the amplified nucleic acid , formed the resulting nucleic acid amplification product and a plurality of nucleic acid detection compartment for specifically captured by hybridization after divergence is, the nucleic acid amplification compartment is a primer during nucleic acid amplification probes or reverse transcription comprising a probe, a plurality of the nucleic acid detection zone comprises a nucleic acid detection probes to allow capture fluorescent labeled nucleic acid amplification product of interest for each type by hybridization, the nucleic acid amplification compartment and said nucleic acid detection compartment, a nucleic acid analysis cell obtained by forming so as to be capable of independent temperature control for each compartment in response to each probe,
    前記核酸増幅用区画の核酸増幅又は逆転写のための温度制御を行う温度制御手段と、 A temperature control means for temperature control for nucleic acid amplification or reverse transcription of the nucleic acid amplification compartment,
    複数の前記核酸検出用区画で、 区画ごとに関心のある核酸増幅物の種別に応じたハイブリダイゼーションによる特異的な捕捉に適した設定温度制御を行う温度制御手段と、 A plurality of the nucleic acid detection zone, and a temperature control means for setting the temperature control suitable for specific capture by hybridization according to the type of nucleic acid amplification product of interest for each partition,
    前記核酸検出用区画で捕捉された前記蛍光核酸増幅物を光学的に検出する検出手段と、 Detecting means for detecting the fluorescent nucleic acid amplification product captured by the nucleic acid detection zone optically,
    を備えることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer, characterized in that it comprises a.
  15. 請求項14の核酸分析装置において、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、 In the nucleic acid analyzer according to claim 14, wherein the reaction layer is formed between the sheet having a substrate and it is arranged opposite the light transmittance,
    前記核酸増幅用区画は、前記基板の一面に形成され、 The nucleic acid amplification compartment is formed on one surface of the substrate,
    前記核酸検出用区画は、前記基板と前記シートとの対向する面に、関心ある核酸増幅物を捕捉する核酸検出用プローブを有する核酸検出機能と前記核酸増幅物を捕捉するのに適した温度制御を行うヒーター機能とが分けて形成され、 前記ヒーター機能は前記基板側の対向面に設けられ、 前記核酸検出機能は前記シート側の対向面に設けられ、 The nucleic acid detection compartment, the opposing surfaces of the substrate and the sheet, the temperature control suitable for capturing the nucleic acid amplification product and the nucleic acid detection with a nucleic acid detection probe to capture interest nucleic acid amplification product are formed separately and a heater function for the heater function setting vignetting on the opposing surfaces of the substrate, the nucleic acid detection function provided on the opposite surface of the sheet side,
    前記核酸検出用プローブには、蛍光標識付きの核酸増幅産物が捕捉されるようにし、その蛍光量の検出手段として、前記シートの内面にしみ出すように設定したエバネッセント光を用いる核酸分析装置。 Wherein the nucleic acid detection probes, as nucleic acid amplification products with fluorescent labels is captured, as a fluorescent light amount detecting means, a nucleic acid analyzer using the evanescent light was set to ooze to the inner surface of the sheet.
  16. 請求項14の核酸分析装置において、前記セルは、核酸増幅用区画を複数有し、それぞれの核酸増幅用区画で異なる温度サイクル制御を行う核酸分析装置。 In the nucleic acid analyzer according to claim 14, wherein the cell has a plurality of nucleic acid amplification compartment, a nucleic acid analyzer for performing different temperature cycle control in each of the nucleic acid amplification compartment.
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