JP4426528B2

JP4426528B2 - Nucleic acid analysis method, nucleic acid analysis cell, and nucleic acid analyzer

Info

Publication number: JP4426528B2
Application number: JP2005511265A
Authority: JP
Inventors: 智晴梶山; 智高橋
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2003-12-03
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2023-12-03
Also published as: WO2005054458A1; JPWO2005054458A1

Description

本発明は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどの核酸（ポリヌクレオチド）の分析方法、核酸分析用セル、および核酸分析装置に関する。 The present invention relates to a method for analyzing a nucleic acid (polynucleotide) such as DNA or mRNA, a cell for nucleic acid analysis, and a nucleic acid analyzer.

サンプル中に存在するＤＮＡ或いはｍＲＮＡの種類を測定する技術として、ＤＮＡチップが知られている。ＤＮＡチップは、遺伝子などの関心のある核酸（標的核酸）をハイブリダイゼーション（相補鎖結合）により相補的に結合（捕捉），合成するために、種々の一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを、基板上に高密度に整列固定してなる。代表的なものとしては、アフィメトリックス社（米国）のＤＮＡチップのように、フォトリソグラフィ技術を用いて半導体チップ上に標的核酸を捕捉するためにオリゴヌクレオチドプローブを高密度に整列固定するものが周知である。また、関心のあるｍＲＮＡの発現量を定量計測する技術として、リアルタイムＰＣＲ法、及びＴａｑＭａｎプローブ法などが周知である。
さらに、従来の生化学反応装置では、特開平５−３１７０３０号公報に開示されるように、二次元平面上に配列された多数の孔（チャンバ）を持つ生化学反応装置（マイクロマルチチャンバ）において、各々のチャンバに温度調節機能を組み込んで、チャンバごとに温度を独立して制御可能にした技術が開示されている。
また、同公報には、このようなマイクロマルチチャンバを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ法）による核酸増幅反応を行う技術が記載されている。この技術は、それぞれのチャンバに微少容量の種々のＰＣＲ用の反応液（生化学的試料）を与え、チャンバ毎に反応液に応じた温度サイクル制御を行うことにより、同時の多種，多数のＰＣＲを可能にしている。チャンバ母材は、例えばシリコンが用いられ、異方性エッチングによってチャンバとなる孔が掘られ、チャンバ内に温度調節手段として、半導体ペルティエ素子を形成している。
一方、特開２０００−３４２２６４号公報、特開２００１−２３５４６９号公報、特開２００１−２３５４７４号公報においては、核酸検出用チップにおいて、一つの基板上に複数の独立した温度条件を設定することが可能な区域（区画）を設ける技術が開示されている。この従来技術は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡ等の核酸（ポリヌクレオチド）をハイブリダイゼーションにより検出（捕捉）することを目的としている。また、独立した温度制御が可能な複数の区画については、区画ごとに異なるオリゴヌクレオチドプローブ（核酸検出用プローブ）が固定されること、標的核酸を含む試料溶液の種類は各区画に共通の試料であり、その試料が基板上（チップ表面）に添加されること、各区画は各核酸検出用プローブのハイブリダイゼーションに適した温度に設定されることが述べられている。
上記したように、従来の技術には、種々の一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを、基板上に高密度に整列固定するＤＮＡチップや、多種，多数の試料を、一つの基板上の複数のチャンバで個別に温度制御して核酸増幅する技術や、一つの基板上で種別ごとの核酸検出用プローブ（オリゴヌクレオチドプローブ）を、独立して温度制御が可能な区画に固定する技術が開示されている。これらの技術では、ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどの関心のある核酸（標的核酸）を専ら増幅或いは検出するために用いるものとして開示されている。しかしながら、多種，多数の核酸を同時に増幅・検出可能にする技術については開示されていない。
ところで、遺伝子発現が創薬分野などで重要となるに従い、１０〜２０ないし１００種類の限定した関心のある遺伝子に関して、その発現量を定量評価することが求められている。従来の技術では、発現の増減などは、ＤＮＡチップを用いることにより評価することが可能であったが、定量性に乏しく、また標的核酸の増幅手順を外部で行うため、煩雑である問題があった。また、核酸の増幅においては、最適な温度制御に種類差が存在するため、一度に増幅が可能な種類数も限られていた。
一方、発現量の定量評価を行う技術であるリアルタイムＰＣＲやＴａｑＭａｎ法は、増幅と同時に検出が行えるため、検出の精度が良く、簡便である。しかし、１チューブで１種類の遺伝子しか検討できないため、関心のある遺伝子が複数ある場合は、その分リアクションが増加し、コストと煩雑さが激増する。さらに、測定サンプルを分注により小分けする必要があり、１リアクションあたりのサンプル量が減少してしまう。一般に、遺伝子発現で検討を行うサンプルは、微量であることがほとんどであり、小分けによる検出能の低下は、大きな問題である。A DNA chip is known as a technique for measuring the type of DNA or mRNA present in a sample. DNA chips are used to bind various single-stranded oligonucleotide probes on a substrate in order to complementarily bind (capture) and synthesize nucleic acids of interest such as genes (target nucleic acids) by hybridization (complementary strand binding). It is aligned and fixed at high density. A typical example is a DNA chip manufactured by Affymetrix (USA), in which oligonucleotide probes are aligned and fixed at high density in order to capture a target nucleic acid on a semiconductor chip using photolithography technology. It is. As techniques for quantitatively measuring the expression level of mRNA of interest, the real-time PCR method, the TaqMan probe method, and the like are well known.
Further, in the conventional biochemical reaction apparatus, as disclosed in JP-A-5-317030, in a biochemical reaction apparatus (micro multi-chamber) having a large number of holes (chambers) arranged on a two-dimensional plane. A technique is disclosed in which a temperature adjustment function is incorporated in each chamber so that the temperature can be independently controlled for each chamber.
The publication also describes a technique for performing a nucleic acid amplification reaction by PCR (polymerase chain reaction: PCR method) using such a micro multi-chamber. In this technology, a small volume of various PCR reaction solutions (biochemical samples) are given to each chamber, and temperature cycle control according to the reaction solution is performed for each chamber, so that various PCRs can be performed simultaneously. Is possible. For example, silicon is used as the chamber base material, and holes serving as chambers are dug by anisotropic etching, and semiconductor Peltier elements are formed in the chamber as temperature adjusting means.
On the other hand, in JP 2000-342264 A, JP 2001-235469 A, and JP 2001-235474 A, a plurality of independent temperature conditions can be set on one substrate in a nucleic acid detection chip. A technique for providing a possible area is disclosed. The purpose of this conventional technique is to detect (capture) a nucleic acid (polynucleotide) such as DNA or mRNA by hybridization. Also, for multiple compartments that can be controlled independently, different oligonucleotide probes (nucleic acid detection probes) are fixed for each compartment, and the type of sample solution containing the target nucleic acid is a common sample for each compartment. In addition, it is stated that the sample is added onto the substrate (chip surface), and that each section is set to a temperature suitable for hybridization of each nucleic acid detection probe.
As described above, in the conventional technique, various single-stranded oligonucleotide probes are aligned and fixed at high density on a substrate, and various types of samples are placed in a plurality of chambers on one substrate. And a technique for amplifying nucleic acids by individually controlling the temperature, and a technique for immobilizing nucleic acid detection probes (oligonucleotide probes) for each type on a single substrate in compartments that can be independently temperature controlled. . These techniques are disclosed as being used exclusively for amplifying or detecting nucleic acids of interest (target nucleic acids) such as DNA and mRNA. However, there is no disclosure of a technique that enables amplification and detection of a large number of nucleic acids at the same time.
By the way, as gene expression becomes important in the field of drug discovery, it is required to quantitatively evaluate the expression level of 10 to 20 to 100 kinds of limited genes of interest. In the conventional technique, it was possible to evaluate the increase / decrease in expression by using a DNA chip. However, there is a problem that the quantitative procedure is poor and the amplification procedure of the target nucleic acid is performed externally, which is complicated. It was. Further, in nucleic acid amplification, there are types of differences in optimum temperature control, and therefore the number of types that can be amplified at one time is limited.
On the other hand, real-time PCR and TaqMan method, which are techniques for quantitatively evaluating the expression level, can be detected simultaneously with amplification, and therefore have high detection accuracy and are simple. However, since only one type of gene can be examined in one tube, if there are a plurality of genes of interest, the reaction increases accordingly, and the cost and complexity increase drastically. Furthermore, it is necessary to divide the measurement sample by dispensing, and the sample amount per reaction is reduced. In general, most of the samples examined by gene expression are in a very small amount, and a decrease in detection ability due to subdivision is a big problem.

本発明の目的は、関心のある遺伝子などの核酸（標的核酸）が１０〜２０ないし１００種類程度存在する場合であっても、それらの標的核酸（ＤＮＡ，ｍＲＮＡなど）を同時に増幅し、一括で定量検定することが可能となる核酸分析方法の提供に関する。
本発明は、基本的には、次のように構成する。試料，試薬などの溶液を収容するためのスペース（反応層）を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための区画（核酸増幅用区画）と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための区画（核酸検出用区画）とを、互いに独立した温度制御が可能になるよう形成する。そして、核酸増幅用区画では、核酸増幅のための温度サイクル制御を、核酸検出用区画では、特異的な捕捉に適した設定温度制御を行うことにより、単一の反応層にて核酸の増幅と検出を行う。
各区画は、温度センサーとヒーターのセットを個々に有し、それぞれ独立に制御することが可能である。
核酸増幅用区画は、核酸増幅用のプローブを備え、かつ少なくとも１以上形成される。例えば、標的核酸がｍＲＮＡである場合には、核酸増幅用区画の表面には、ｍＲＮＡの末端の特徴的配列であるポリＡ配列と相補的な、ポリＴ配列のプローブが固定されている。
核酸検出用区画は、複数形成され、各核酸検出用区画には、２種以上の関心のある標的核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするために２種以上の検出用プローブ（オリゴヌクレオチドプローブ）が種別ごとに各核酸検出用区画に固定される。
それぞれの核酸検出用区画では、核酸検出用プローブとそれに相補的に結合するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの熱安定性を保証するために、核酸検出プローブの種別ごとにハイブリダイゼーション温度が設定される。核酸検出には標識化プライマーを用いた増幅物を利用する。
さらに、核酸検出において、チップ上部の板に励起レーザーを入射し、その励起光の界面しみだし現象であるエバネッセント光を利用する装置も提案する。
以下、上記およびその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。なお、図面はもっぱら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。The object of the present invention is to amplify the target nucleic acids (DNA, mRNA, etc.) at the same time, even if there are about 10-20 to 100 types of nucleic acids (target nucleic acids), such as genes of interest. The present invention relates to provision of a nucleic acid analysis method that enables quantitative assay.
The present invention is basically configured as follows. Hybridization after separation of nucleic acid amplification compartment (nucleic acid amplification compartment) and the generated amplified nucleic acid on at least one side that forms a space (reaction layer) for accommodating solutions such as samples and reagents Thus, a compartment for capturing specifically (nucleic acid detection compartment) is formed so that temperature control independent of each other is possible. In the nucleic acid amplification section, temperature cycle control for nucleic acid amplification is performed, and in the nucleic acid detection section, set temperature control suitable for specific capture is performed. Perform detection.
Each compartment has a set of temperature sensors and heaters individually and can be controlled independently.
The nucleic acid amplification section includes a nucleic acid amplification probe and is formed of at least one. For example, when the target nucleic acid is mRNA, a poly T sequence probe complementary to the poly A sequence, which is a characteristic sequence at the end of the mRNA, is immobilized on the surface of the nucleic acid amplification compartment.
A plurality of nucleic acid detection sections are formed, and each of the nucleic acid detection sections has two or more types of detection probes (oligonucleotide probes) so that two or more types of target nucleic acids can be captured by hybridization. Each type is fixed to each nucleic acid detection section.
In each of the nucleic acid detection sections, a hybridization temperature is set for each type of nucleic acid detection probe in order to ensure the thermal stability of hybridization between the nucleic acid detection probe and a polynucleotide that binds complementarily thereto. An amplified product using a labeled primer is used for nucleic acid detection.
Furthermore, an apparatus is also proposed that uses an evanescent light, which is a phenomenon in which an excitation laser is incident on a plate above the chip and detects the interface of the excitation light in detecting nucleic acids.
The above and other novel features and effects of the present invention will be described below with reference to the drawings. It should be noted that the drawings are for explanation only and do not limit the scope of the present invention.

第１図は、本発明の第１の実施例に用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）におけるチップ（基板）の上面図。第２図は、第１実施例のチップに配設される温度制御可能な区画の一つを取り出して示す詳細構造図。第３図は、第２図の温度制御可能な区画を等価回路で示した図。第４図は、第２図に示す区画の温度制御系を示す基本回路図。第５図は、第２図の区画に設けられる温度検出用ダイオードの温度特性例を示す図。第６図は、本発明の温度制御を行うシステムの全体構成図。第７図は、本発明の第１の実施例に係る核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）の断面図。第８図は、本発明の第１の実施例に用いる核酸増幅・検出セルと検出システムの概略図。第９図は、本発明の第１の実施例における検出手順のフローを示す図。第１０図は、本発明の第１の実施例における検出手順の温度条件を示す図。第１１図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、初期状態を示している。第１２図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、増幅用のポリＴプローブに、ｍＲＮＡがハイブリダイズ状態を示している。第１３図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、逆転写反応（ＲＴ反応）によりｍＲＮＡの相補鎖伸張物が合成されている状態を示している。第１４図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、ｍＲＮＡの相補鎖伸張物の１本鎖の状態を示している。第１５図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、ｍＲＮＡの相補鎖伸張物の１本鎖に増幅用プライマーがハイブリダイズしている状態を示している。第１６図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、増幅用プライマーの伸張により、蛍光標識化した検出用増幅物が合成されている状態を示している。第１７図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、蛍光標識化した検出用増幅物が、検出区画のプローブに特異的にハイブリダイズしている状態を示している。第１８図は、本発明の第２の実施例に用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）の模式図（断面図）。第１９図は、本発明の第２の実施例のセルに、エバネッセント光による励起を利用する例を示す模式図。第２０図は、本発明の第３の実施例に用いる核酸増幅・検出用チップの初期状態において、核酸増幅用区画には、標的核酸（目的遺伝子）に特異的なリバースプライマーが固定されている例を示す鳥瞰図。第２１図は、本発明の第３の実施例において、核酸増幅用プライマー（リバースプライマー）にｍＲＮＡがハイブリダイズし、相補鎖伸張合成が行われる例を示す鳥瞰図。第２２図は、本発明の第３の実施例において、リバースプライマーの伸張した部分に、蛍光標識付フォワードプライマーがハイブリダイズしている例を示す鳥瞰図。第２３図は、本発明の第３の実施例において、蛍光標識付フォワードプライマーが伸張されて、蛍光標識化した検出用増幅物となる例を示す図。第２４図は、本発明の第５実施例に係るに用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）におけるチップ（基板）の上面図。 FIG. 1 is a top view of a chip (substrate) in a nucleic acid amplification / detection cell (for example, a detection cell for gene expression analysis) used in the first embodiment of the present invention. FIG. 2 is a detailed structural view showing one of the temperature-controllable sections arranged on the chip of the first embodiment. FIG. 3 is a diagram showing the temperature-controllable section of FIG. 2 with an equivalent circuit. FIG. 4 is a basic circuit diagram showing a temperature control system of the section shown in FIG. FIG. 5 is a diagram showing an example of temperature characteristics of a temperature detection diode provided in the section of FIG. FIG. 6 is an overall configuration diagram of a system for performing temperature control according to the present invention. FIG. 7 is a sectional view of a nucleic acid amplification / detection cell (for example, a detection cell for gene expression analysis) according to the first embodiment of the present invention. FIG. 8 is a schematic view of a nucleic acid amplification / detection cell and detection system used in the first embodiment of the present invention. FIG. 9 is a diagram showing a flow of a detection procedure in the first embodiment of the present invention. FIG. 10 is a diagram showing the temperature condition of the detection procedure in the first embodiment of the present invention. FIG. 11 is a diagram for explaining a nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, and shows an initial state. FIG. 12 is a diagram for explaining a nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, in which mRNA is hybridized with a poly-T probe for amplification. FIG. 13 is a diagram for explaining a nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, and shows a state in which a complementary strand extension product of mRNA is synthesized by a reverse transcription reaction (RT reaction). FIG. 14 is a diagram for explaining a nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, and shows a single strand state of a complementary strand extension product of mRNA. FIG. 15 is a diagram for explaining a nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, and shows a state in which an amplification primer is hybridized to one strand of a complementary strand extension product of mRNA. Yes. FIG. 16 is a diagram for explaining the nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, and shows a state in which a fluorescently labeled detection amplification product is synthesized by extension of the amplification primer. Yes. FIG. 17 is a diagram for explaining a nucleic acid amplification / detection method according to the first embodiment of the present invention, in which a fluorescently labeled detection amplification product is specifically hybridized to a probe in a detection section. Is shown. FIG. 18 is a schematic diagram (cross-sectional view) of a nucleic acid amplification / detection cell (for example, a detection cell for gene expression analysis) used in the second embodiment of the present invention. FIG. 19 is a schematic diagram showing an example in which excitation by evanescent light is used in the cell of the second embodiment of the present invention. FIG. 20 shows that in the initial state of the nucleic acid amplification / detection chip used in the third embodiment of the present invention, a reverse primer specific to the target nucleic acid (target gene) is immobilized in the nucleic acid amplification section. The bird's-eye view which shows an example. FIG. 21 is a bird's-eye view showing an example in which mRNA is hybridized to a primer for nucleic acid amplification (reverse primer) and complementary strand extension synthesis is performed in the third embodiment of the present invention. FIG. 22 is a bird's-eye view showing an example in which a forward primer with a fluorescent label is hybridized to the extended portion of the reverse primer in the third embodiment of the present invention. FIG. 23 is a diagram showing an example in which a fluorescently labeled forward primer is extended to become a fluorescently labeled detection amplification product in the third embodiment of the present invention. FIG. 24 is a top view of a chip (substrate) in a nucleic acid amplification / detection cell (for example, a detection cell for gene expression analysis) used in the fifth embodiment of the present invention.

（第１の実施例）
本発明の第１の実施例として、遺伝子発現解析を実施した例を以下に示す。
図１は、本実施例に用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）におけるチップ（基板）の上面図である。
本実施例におけるチップ（基板）１１は、例えば試料，試薬などの溶液を収容するスペース（以下、「反応層」と称する）１２を有し、また、その溶液などの導入口１３−１及び排出口１３−２を有する。
チップ１１における反応層１２の一面には、複数の区画１４および１５−１〜１５−８が形成されている。それぞれの区画には、独立して作動する温度センサーとヒーターの組みが設けられている。温度センサーおよびヒーターの一例については、図２によって後述する。
複数の区画のうち、あるものは、核酸増幅用区画として機能し、あるものは核酸検出用として機能する。図１では、チップ１１において、区画１４が核酸増幅用区画であり、区画１５−１〜１５−８が核酸検出用区画である。本実施例では、核酸増幅用区画１４の両側或いは周囲に複数の核酸検出用区画１５−１〜１５−８を配設することによって、核酸検出用区画１５−１〜１５−８のすべてが、核酸増幅用区画１４に対して等しい距離で配置されている。なお、図１では、核酸増幅用区画１４は、一つ、核酸検出用区画１５は８つものを例示しているが、実際は、この数に限定されるものではなく、また、核酸検出用区画については、数十、数百のオーダとなる。
図２は、図１で示した区画のうち、１つの区画の構造を説明する図である。各区画は、全て同様の構造を有する。各区画は、半導体製造技術を用いて作製される。
温度を検出する温度センサーは、Ｐ型拡散層２１とＮ型拡散層２２の接合で形成されたダイオードであり、その抵抗値の温度依存性を用いてセンサーとして利用する。また、このダイオードは、Ｐ型拡散層２３を保護層として用い、ダイオード部分の電位を制御している。区画全体のチップ基板２４はＮ型基板を用いており、その電位はＮ型拡散層２５により決められる。
チップ２４の電位即ちＮ型拡散層２５の電位を、ダイオードのＰ型拡散層２１の電位と等しくすることによって、保護層２３とチップ基板２４とがＰＮ接合であっても、温度センサーから保護層２３外部にセンサー電流が流出することを防ぐことが可能となる。また、チップ基板２４側からみれば、チップ基板２４と保護層２３は、ＮＰ接合となるので、保護層の外部から温度センサーにノイズ電流が流入することを防止できる。
本実施例では、ヒーターはＮ拡散層２６で形成されている。Ｎ型拡散層２６は、Ｐ型拡散層の保護層２７で囲まれている。保護層２７の電位は、Ｐ型拡散層２８で決まる。
Ｎ型拡散層２６の一端を保護層２７と同電位（−）とし、他端を正極（＋）とすると、Ｎ型拡散層２６と保護層２７はＮＰ接合となるため、ヒーター電流が保護層へリークしない。そのため、Ｎ型拡散層２６は、電熱線の構造と等価となる。このヒーター２６に流れる電流を制御することにより、加熱を制御することができる。センサーと回路の接続は、正極側をＳ（＋）、負極側をＳ（−）と表す。また、ヒーターと回路の接続は、正極側をＲ（＋）、負極側をＲ（−）と表す。これらの構造を、等価回路で表すと、図３となる。温度センサーは、ダイオード３１であり、ヒーターは３２で表される。
区画の温度を制御する基本回路の概略およびチップ上の区画との接続を図４に示す。これは、１つの区画について、温度を検出し、加熱を制御する回路の１例である。
温度センサーのダイオード３１には、定電流回路が接続する。この回路は、抵抗４１が、ダイオードの抵抗値が無視できる程大きい場合、抵抗４１で決まるほぼ一定の電流が流れる定電流回路となる。ダイオード３１における電圧降下は、電圧計４２で測定し、その値は制御部４３に送られる。
制御部４３は、予め設定された電圧値（設定値Ｖｓ）と、電圧計４２における測定値（Ｖｘ）を比較し、Ｖｓ＜Ｖｘの場合はゲート４４をＯＮ、Ｖｓ＞Ｖｘの場合はゲート４４をＯＦＦとする制御を行う。ヒーター側回路は、ゲートＯＮ時に両端に電圧４５が印加され、ＯＦＦ時には電圧印加が切れる。この基本回路を用いる制御について、以下に説明する。
ダイオード３１両端の電圧降下とチップの区画温度との関係（１例）を、図５に示した。以下、この例を用いて説明する。図５に示すとおり、チップの温度（Ｔ［摂氏度］）と電圧降下（Ｖｘ［ｍＶ］）は、直線性を示し、その傾きは、本例では約−２ｍＶ／度である。そのため、以下の近似式（１）で示される。
Ｖｘ＝−２Ｔ＋５６０ …（１）
つまりチップの区画温度が１度上昇すると、電圧降下が約２ｍＶ減少する。予め、この関係式を測定しておくことにより、電圧降下からチップ温度を計算することが可能となる。なお、傾きの値は、測定条件等により異なる。また、本特許では説明しないが、ダイオードの抵抗値の温度依存性を、定電圧条件や、その他の条件を用いて関係式を求めることも可能であることは言うまでもない。
図５で示した通り、本例では、温度上昇は、電圧降下の低下で観測される。そこで、チップ内における任意の区画の温度を、以下の通りに制御することが可能である。
例えば、ある区画を、Ｔ＝摂氏５０度で制御する場合を説明する。区画の温度が、所望の温度条件である摂氏５０度より低い場合、センサーにおける電圧降下は、摂氏５０度における電圧降下量４６０ｍＶより大きい。設定値Ｖｓを、Ｖｓ＝４６０とすると、Ｖｘ＞Ｖｓの条件が成り立つため、ゲート４４がＯＮ制御となり、本回路はＶｘ＜Ｖｓとなるまでヒーター回路に電流が流れ、区画は加熱される。加熱により区画の温度が上昇し、Ｖｘ＜Ｖｓが達成されると、ゲートがＯＦＦとなり、加熱が停止するため、それ以上の温度上昇は発生しない。熱拡散により、区画の温度が下がり、再度Ｖｘ＞Ｖｓとなると、ゲートは再度ＯＮとなり、加熱が再開する。この制御により、区画の温度は摂氏５０度に維持される。
本実施例では、この基本回路をチップの全ての区画に、それぞれ１回路ずつ接続し、その各設定値を独立に制御することにより、各区画の温度を独立に制御することが可能となる。すなわち、単一のチップ（基板）１１に、核酸を増幅するための区画１４と、増幅された核酸をハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための区画１５−１〜１５−８とが、互いに独立して温度制御が可能なヒーターを伴って形成される。
図６は、本実施例のシステム全体を示す図である。６１および６２−１〜６２−８は、区画１４および区画１５−１〜１５−８に接続する基本回路の制御部を示している。コンピューター６３は、システム全体を制御し、予めプログラムされた温度制御を行い、インターフェース６４は、コンピューター６３と全部の制御部６１、６２−１〜６２−８を接続する。
コンピューター６３には、各区画の時刻ごとの設定温度或いは、それに対応する設定電圧値が、予めプログラムされている。コンピューター６３は、そのプログラムに則り、インターフェース６４を介し、各基本回路の制御部６１、６２−１〜６２−８へ、設定された温度或いはそれに対応する電圧値を、その時刻ごとの設定値Ｖｓとして入力する。この結果、各区画はプログラムされた温度シーケンスを忠実に実現することができる。以上が本発明のチップにおける、区画の構造、並びにその区画に接続する回路およびシステムの概要である。
つぎに、チップの構造について説明する。図１において、核酸増幅用区画１４には、その表面に、サンプル中の発現遺伝子（標的核酸例えばｍＲＮＡ）を捕捉するポリＴプローブが、配列末端５’側を区画表面側に向けて固定されている。ポリＴプローブは、配列番号１で示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、発現遺伝子が末端に有するポリＡ領域に、特異的にハイブリザイズする機能を有する。ここでは、配列長として２０ｍｅｒのものを採用した。しかし、ポリＴプローブとしては、長さとして８〜２００ｍｅｒの範囲のポリＴオリゴヌクレオチドを利用できる。８ｍｅｒより短い物では、ハイブリダイズ時の安定性に欠ける。また、２００ｍｅｒより長い物の場合、機能としては充分であるが、製造のコストがかかる短所がある。また、ポリＴオリゴの５’末端側に、Ｔ以外も並ぶ領域を任意に付加する場合もある。これは、固相表面からの距離を大きくする効果があり、ハイブリダイゼーションの効率が高まる。

核酸検出用区画１５−１〜１５−８は、その表面に、目的の遺伝子に対応する増幅物に、特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブが固定されている。このプローブは、目的の遺伝子ごとに、最適な配列のものが選択される。本実施例では、ＧＡＰＤＨとＰ５３の２種類のｍＲＮＡについて、その発現量を測定することを試みた。ＧＡＰＤＨ及びＰ５３のｍＲＮＡを検出するプローブの配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号３である。

これらの配列は、それぞれ、区画１５−１及び区画１５−５に固定されているとする。固定化の方法は、アミノシラン化処理を行ったチップ表面に対し、リンカーとして、１，４−ＰｈｅｎｙｌｅｎｅＤｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅを用い、３’末端をアミノ修飾した上記オリゴプローブを固定する方法が、もっとも簡便である。ここで、特に、３’側をチップ表面に固定することが重要である。これにより、このプローブにおいて、ポリメラーゼによる伸張反応が発生しない。同様の目的には、５’末端側を固定側とする場合において、プローブの３’側末端塩基を、伸張反応が発生しないように化学処理することも有効である。
これらの核酸検出用区画に、目的とする遺伝子に対応した増幅物がハイブリダイズするため、その量を検出することにより、目的遺伝子の量が決定できる。その詳細は、後述する。
本発明で用いる核酸増幅・検出セルは、図７に示すように、既述した核酸増幅用区画１４及び核酸検出用区画１５−１〜１５−８を有するチップ１１と、そのチップ１１の面上に、チップ面と対向するように配置された透明なシート（上部板）７２とを有し、このチップ１１と上部板７２とにより挟まれる空間１２にサンプル（試料，試薬などの溶液）７２を保有する。ここでは、チップ１１と、上部板７２とを合わせたものを「セル」と称する。
図１では、上部板７２を外した状態でチップ１１を見ているものであり、図７は、図１において、区画１５−１と１５−５を通る断面図である。
チップ（基板）１１及び上部板７２との間の層状の空間が、サンプルを収容する反応層１２となり、基板１７をリソグラフィにより加工することにより形成される。なお、チップ１１と上部７２とをシートにより形成し、その間にスペーサを介在することで反応層１２を形成することも可能である。
上部板７２は、厚さは、０．０１ｍｍ〜１ｍｍが最適である。材質は、ガラス、各種のプラスチックなどが利用できるが、その内部に蛍光物質をなるべく含まないことが重要である。また、厚さ１ｍｍを越える材料を用いることも可能であるが、上部板が熱伝達物質として働いてしまうため、本発明の目的である、チップ内の温度独立性を保つことが、難しくなる。一方、０．０１ｍｍ以下では、強度に問題がある。サンプルの層７３は、０．０５ｍｍ〜１ｍｍが好適である。１ｍｍを越えると、チップ内のサンプル溶液において、熱による対流が発生するため、熱の独立性が劣化する。
核酸増幅用区画１４と核酸検出用区画１５−１〜１５−８との間及び核酸検出用区画間は、熱の独立性を保つための薄膜状の構造が重要である。これは、シリコン酸化膜を用いることが工業的に有効であるが、そのほか、プラスチックやポリイミドフィルムに代表される様な、他の有機材料フィルムを用いることも可能である。また、このチップは、平面的なため、上下方法への熱拡散効率が高い。そのため、検知温度が高い場合は、単にヒーターをｏｆｆ条件とすることにより、冷却機能を設けずに、所定の温度まで下げることが可能である。
チップ表面上の核酸検出用区１５−１〜１５−８で捕捉した蛍光標識付き核酸増幅産物の量は、蛍光量として検出される（蛍光標識付き増幅産物の生成については後述する）。図８にその検出系を、セルに付加した状態を示す。
本実施例では、蛍光検出系は、共焦点顕微鏡と同様な構成で行う。他の検出方法に関しては、後述の実施例で説明する。
蛍光検出系は、レンズ８１を用いるより、光検出器８２と、励起レーザー８３は、セル表面に対して共焦点関係８４にあり、レーザー８３で励起された反応層１２中の各検出用区画における蛍光標識（蛍光量）が光検出器８２により測定される。
検出器８２、レーザー８３、レンズ８１はユニットとして一体に組み立てられており、それ全体で水平方向（図中矢印で表示）に移動して、セル表面のスキャニングを行う。
次に、本実施例のチップを用いた核酸増幅の前処理、核酸増幅および検出の操作手順と、チップ上（セル内）で生成される生成物の変遷について、図９〜図１７を用いて説明する。
サンプルは、一例として体細胞より抽出した全ＲＮＡである。また、今回の標的核酸（ターゲット）は、ＧＡＰＤＨとＰ５３の２種類のｍＲＮＡである。
図９は、本実施例の操作手順をまとめたものである。図１０は、それぞれの手順における、核酸増幅用区画、核酸検出用区画１５−１の温度制御条件をまとめたものである。
図１１は、チップ１１の表面を模式的に説明する鳥瞰図である。図１１に示すように、チップ表面の初期状態では、核酸増幅用区画１４の表面にポリＴプローブ１１１（配列番号１）が、ＧＡＰＤＨ用核酸検出用区画１５−１にはＧＡＰＤＨ用プローブ１１２（配列番号２）が固定されている。
全ＲＮＡを含むサンプル溶液をチップ１１の反応層１２内に注入し、その後、図１０に示す温度条件（１）に設定する。この温度条件は、増幅用区画１４がハイブリダイズに適した３５℃、核酸増幅用区画１５−１〜１５−８は、それよりもはるかに高温の７５℃である。その結果、サンプル中のｍＲＮＡは、核酸増幅用区画１４のポリＴプローブ１１１とハイブリダイズして固定される。
図１２は、ｍＲＮＡが、核酸増幅用区画１４にポリＴプローブ１１１によって捕捉された様子を模式的に示す鳥瞰図である。ここでは、全てのｍＲＮＡが、種類を問わずに捕捉される。例えば、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ１２１、ｐ５３のｍＲＮＡ１２２及びそれ以外のｍＲＮＡ１２３が捕捉される。一方、核酸検出用区画１５−１は、高温条件のため、ハイブリダイズは生じない。
次に、不要物を洗浄し、逆転写用試薬（ＲＴ試薬）を導入して、図１０に示す温度条件（２）とすると、核酸増幅用区画において、逆転写が生じる。このときは、増幅用区画１４の温度は、逆転写に適した温度４２℃に設定される。核酸検出用区画１５−１は、引き続き７５℃の高温条件に維持される。
図１３は、逆転写により、ポリＴプローブ１１１が伸張された様子を示す図である。ここで、伸張したプローブは、ｍＲＮＡの存在量を忠実に再現していることが肝要である。つまり、ここでは、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡによる伸張物１３１と、Ｐ５３のｍＲＮＡによる伸張物１３２、及びそれ以外のｍＲＮＡによる伸張物１３３が存在する。
つぎに、図１０の温度条件（３）とし、チップ内を洗浄すると、ｍＲＮＡは全て排出され、核酸増幅用区画１４内には、図１４の通り、伸張したプローブ（逆転写産物）１３１〜１３３の１本鎖のみとなる。
以上の過程が標的核酸を増幅するためのリバースプローブを形成する前処理であり、この前処理では、既述のように核酸検出用区画に固定された標的核酸検出用のプローブが前処理中にハイブリダイゼーション動作を起こさない温度（例えば７５℃の高温条件）に制御される。
次に、反応層１２に核酸増幅試薬を導入し、温度条件を図１０の（４）の温度に設定する。このときの温度条件は、増幅用区画１４が６０℃、検出用区画１５−１が６５度である。
この温度条件の下では、図１５に示す動作がなされる。すなわち、核酸増幅試薬中には、５’末端に蛍光標識を有するＧＡＰＤＨ用のプライマー１５１とｐ５３のプライマー１５２とがあるため、これらのプライマーが伸張した増幅用プローブの１本鎖の所定の配列にハイブリダイズすることができる。ここでは、ＧＡＰＤＨ用のプライマー１５１は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡによる伸張物１３１にハイブリダイズし、Ｐ５３用のプライマー１５２は、Ｐ５３のｍＲＮＡによる伸張物１３２にハイブリダイズする。
ここで、温度条件（５）として、増幅区画１４ではサーマルサイクルとすると、増幅区画において、ＧＡＰＤＨとＰ５３のそれぞれの伸張物から、リニア増幅により蛍光標識付き増幅物１６１、１６２が生成される。
図１６は、それぞれの蛍光標識付き増幅物１６１、１６２が合成された様子を示している。一方、核酸検出用区画１５−１及び１５−５は、それぞれのプローブがハイブリダイズするために最適な温度条件に設定されている。そのため、リニア増幅された増幅物が各プローブに特異的にハイブリダイズする（図１７）。この量を、増幅と並行して、リアルタイムで検出すると、増幅サイクルＮ回に対し、本来のｍＲＮＡ量の２Ｎ倍の信号が検出できる。
本実施例では、説明を簡単にするため、２種類のｍＲＮＡの検出について説明したが、本発明ではそれ以上の複数種類のｍＲＮＡを、核酸検出用区画の数だけ同時に測定することが可能である。
以上より、本実施例によれば、１つのチップ内において、増幅と検出を並行して行うことが可能であり、１サンプル中の複数種類のｍＲＮＡ発現量を、同時に、迅速で簡便に測定することが可能である。
（第２の実施例）
第２の実施例として、第１の実施例の検出性能をさらに向上させた核酸増幅・検出用セルについて、図１８及び図１９を用いて説明する。
図１８は、チップ１１とこれと対向する上部板１８２との間に反応層（サンプル層）７３を介在させた模式図（断面図）である。チップ１１には、第１の実施例と同様に核酸増幅用区画と核酸検出用区画とを配設しているが、ここでは、図の便宜上、核酸検出用区画の一つである１５−１のみを誇張して表示している。
本実施例では、核酸検出用のプローブ１８１（第１実施例のプローブ１１２に相当するもの）は、核酸検出用区画のヒーター表面ではなく、それと向かい面、すなわち上部板部分（透明シート）１８２に固定されている。上部板１８２は、第１実施例の上部板７２に相当するものである。換言すれば、核酸検出用区画で標的核酸を捕捉する検出用プローブ１８１は、温度制御可能な区画１５１−１…１５１−ｎなどのヒーター面と対向する面に固定されている。
すなわち、本実施例における核酸検出用区画は、基板１１とシート１８２間の対向する面に機能を分けて形成され、基板１１側の対向面には核酸検出用区画の温度サイクル制御を区画ごとに行うヒーター機能が設けられ、シート１８２側の対向面には、核酸検出用プローブ１８１が固定されて核酸検出機能が与えられている。
本実施例のセルにおいて、反応層７３の厚さが１．０ｍｍ以下の条件では、区画（１５１−１…１５１−ｎ）の温度とそれに対向する上部板１８２表面の温度は、ほぼ等しい。
そのため、本実施例の構造においても、プローブ固定領域の温度を、それぞれのハイブリダイゼーション条件に制御することが可能である。そのため、プローブ１８１にハイブリダイズした測定対象物は、上部板表面に固定される。
核酸増幅と並行に検出用プローブ１８１に増幅産物（増幅用プローブから乖離した蛍光標識付き増幅産物）が捕捉されている過程において、図１９に示すように、上部板１８２には、上部板１８２の側方に配置したレーザー光源１９１から横方向に励起レーザー１９２が入射される。図１９は、上部板１８２へ励起レーザー１９２を入射させた場合を模式的に表している。
この励起レーザーは、上部板１８２内を全反射しながら進行し、上部板１８２の外部には射出されない角度に制御してある。すると、上部板１８２の近傍にだけ、エバネッセント光として、励起レーザー１９２の漏れだしが発生する。その結果、上部板表面に存在する蛍光標識付き増幅産物１９３だけが励起され、サンプル層中程に浮遊する蛍光標識付き増幅産物１９４は、励起されない。したがって、本実施例によれば、第１の実施例の効果に加えて、反応溶液中に存在するプライマーは蛍光発光に寄与しないため、蛍光検出のバックグラウンドが著しく減少し、測定Ｓ／Ｎが向上する。
（第３の実施例）
次に本発明の第３実施例について、図２０〜図２３を用いて説明する。本実施例と第１実施例との相違点は、核酸増幅用区画１４に固定されるオリゴヌクレオチドプローブの配列構造である。核酸検出用区画については変わらない。
本実施例では、核酸増幅用区画に固定するプローブとして、第１実施例のような前処理を施すことなく、目的のｍＲＮＡを相補的かつ特異的にとらえるリバースプライマーを用いる例を示す。先と実施例と同様に、標的核酸としては、ＧＡＰＤＨとＰ５３の２種類のｍＲＮＡを例として説明する。これらの２種類のｍＲＮＡに、それぞれ特異的なプライマーとして、配列４〜配列７を用意する。

ここで、配列４と配列５は、ＧＡＰＤＨに対するフォワード及びリバースであり、配列６と配列７は、Ｐ５３に対するフォワード及びリバースである。リバースプライマーは、核酸増幅用区画の表面に符号２０１，２０２に示すように固定されている。一方、フォワードプライマーは、５’末端部に蛍光標識を有する。これらを用いて、核酸増幅を行う。核酸増幅用区画における反応を、以下に説明する。
図２０は、チップ内部の鳥瞰図である。チップ１１の反応層にサンプルとして、全ＲＮＡを注入すると、そのうち、固定されているリバースプライマー２０１及びプライマー２０２に特異的な物、即ちＧＡＰＤＨ及びＰ５３のみ、対応するリバースプライマーにハイブリダイズする（図２１）。伸張反応により、リバースプライマー２１１、２１２は伸張し、ｍＲＮＡと相補的な配列となる。この核酸増幅におけるサーマルサイクルにより、乖離したｍＲＮＡは別のリバースプライマーに再びハイブリダイズする。一方、フリーのフォワードプライマーは、伸張したリバースプライマーと相補的に結合し（ハイブリダイズ）し、伸張する（図２２）。
以上を繰り返すと、固定している伸張リバースプライマーと、伸張したフリーなフォワードプライマー（蛍光標識付き）が、初期のｍＲＮＡ量の２のＮ乗倍で生成される（図２３）。伸張したフリーなフォワードプライマーは、核酸検出用区画のプライマーと相補的配列であるため、第１及び第２の実施例と同様に、検出区画において検出される。本方法は、増幅率が著しく大きいため、微量のターゲットも検出することが可能である。
なお、本実施例は、２種類のプライマーセットの温度サイクルを、それぞれ最適な条件とする必要がある。そのため、アニーリング温度を配列ごとに、個別に設定する方が精度が良い。その場合、核酸増幅用区画を複数個準備すれば、チップ内で複数種類の温度サイクルを同時に実現することが可能である。即ち、ＧＡＰＤＨに対する核酸増幅用区画と、Ｐ５３に対する核酸増幅用区画を、それぞれ別々に設ける。本実施例では、それぞれのリバースプライマーが、区画表面に固定されているため、それぞれの増幅反応は、対応する区画内でのみ発生させることが可能である。
（第４の実施例）
以上の各実施例では、核酸の増幅と検出を同時に行っていた。そのため、第１の実施例のように、サンプル中にフリーのプライマーが存在するため、バックグラウンドが高くなる場合がある。この場合、増幅と同時の検出は、信号量の概算評価とし、精密の評価に際しては、フリー成分を洗浄する行程を行うことが、精度向上に有効である。
（第５実施例）
図２４は、核酸増幅用区画として、２４１−１及び２４１−２の２個が１反応層内に設けられている実施例である。その他の構成は、第１実施例〜第４実施例のいずれかの構成が採用される。２４２−１〜２４２−ｎは核酸検出用区画である。
核酸増幅の温度サイクルは、仕様する核酸増幅用のプライマーの配列により、最適条件が異なる。第一の実施例では、図１０に示したとおり、温度サイクルとして（９５℃：５秒→５５℃：１５秒→７２℃：１５秒）を利用した。しかし、プライマーのＧＣ率が大きい場合は、偽ハイブリダイズによる偽物合成があるため、プライマーのハイブリ温度を５５℃よりも、５度高い６０℃とすることが有効な場合もある。また、生成物の塩基長が長い場合は、伸張合成時間である１５秒を、さらに長くする必要もある。本発明の目的である核酸解析の精度向上のためには、これらの温度サイクルを、ターゲットとする核酸ごとに最適化することが有効である。その実現には、反応層内に核酸増幅用区画を複数設け、異なる温度サイクルで制御する必要があり、図２４の構成が有効である。
上記各実施例によれば、単一サンプル内の複数種類のターゲットに対し、その増幅と個々の検出を同時に行うことにより、簡便・安価で、高精度の遺伝子発現解析方法を提供することができる。(First embodiment)
As a first example of the present invention, an example of gene expression analysis is shown below.
FIG. 1 is a top view of a chip (substrate) in a nucleic acid amplification / detection cell (for example, a detection cell for gene expression analysis) used in this example.
The chip (substrate) 11 in the present embodiment has a space (hereinafter referred to as “reaction layer”) 12 for accommodating a solution such as a sample and a reagent, for example. It has an outlet 13-2.
A plurality of sections 14 and 15-1 to 15-8 are formed on one surface of the reaction layer 12 in the chip 11. Each compartment is provided with a pair of temperature sensors and heaters that operate independently. An example of the temperature sensor and the heater will be described later with reference to FIG.
Some of the plurality of compartments function as nucleic acid amplification compartments, and some function as nucleic acid detection. In FIG. 1, in the chip 11, the section 14 is a section for nucleic acid amplification, and the sections 15-1 to 15-8 are sections for nucleic acid detection. In this example, by arranging a plurality of nucleic acid detection sections 15-1 to 15-8 on both sides or around the nucleic acid amplification section 14, all of the nucleic acid detection sections 15-1 to 15-8 are The nucleic acid amplification sections 14 are arranged at an equal distance. In FIG. 1, one nucleic acid amplification section 14 and eight nucleic acid detection sections 15 are illustrated as an example. However, the number is not limited to this number, and the nucleic acid detection sections are not limited to this number. Is on the order of tens or hundreds.
FIG. 2 is a diagram for explaining the structure of one of the sections shown in FIG. Each section has the same structure. Each compartment is made using semiconductor manufacturing techniques.
The temperature sensor for detecting the temperature is a diode formed by the junction of the P-type diffusion layer 21 and the N-type diffusion layer 22 and is used as a sensor by using the temperature dependence of its resistance value. In addition, this diode uses the P-type diffusion layer 23 as a protective layer to control the potential of the diode portion. The chip substrate 24 of the entire partition uses an N-type substrate, and its potential is determined by the N-type diffusion layer 25.
By making the potential of the chip 24, that is, the potential of the N-type diffusion layer 25 equal to the potential of the P-type diffusion layer 21 of the diode, even if the protective layer 23 and the chip substrate 24 are PN junctions, 23, it is possible to prevent the sensor current from flowing out. Further, when viewed from the chip substrate 24 side, the chip substrate 24 and the protective layer 23 form an NP junction, so that noise current can be prevented from flowing into the temperature sensor from the outside of the protective layer.
In this embodiment, the heater is formed of the N diffusion layer 26. The N-type diffusion layer 26 is surrounded by a protective layer 27 for the P-type diffusion layer. The potential of the protective layer 27 is determined by the P-type diffusion layer 28.
If one end of the N-type diffusion layer 26 is set to the same potential (−) as that of the protective layer 27 and the other end is set to the positive electrode (+), the N-type diffusion layer 26 and the protective layer 27 become an NP junction. Does not leak. Therefore, the N-type diffusion layer 26 is equivalent to a heating wire structure. By controlling the current flowing through the heater 26, the heating can be controlled. The connection between the sensor and the circuit is represented by S (+) on the positive electrode side and S (-) on the negative electrode side. In addition, the connection between the heater and the circuit is represented by R (+) on the positive electrode side and R (-) on the negative electrode side. These structures are represented by an equivalent circuit as shown in FIG. The temperature sensor is a diode 31, and the heater is represented by 32.
FIG. 4 shows an outline of a basic circuit for controlling the temperature of the compartment and connection with the compartment on the chip. This is an example of a circuit that detects temperature and controls heating for one section.
A constant current circuit is connected to the diode 31 of the temperature sensor. This circuit is a constant current circuit in which a substantially constant current determined by the resistor 41 flows when the resistance 41 is so large that the resistance value of the diode can be ignored. The voltage drop in the diode 31 is measured by the voltmeter 42, and the value is sent to the control unit 43.
The control unit 43 compares the preset voltage value (set value Vs) with the measured value (Vx) in the voltmeter 42. When Vs <Vx, the gate 44 is turned on, and when Vs> Vx, the gate 44 is turned on. Control to turn off the. In the heater side circuit, the voltage 45 is applied to both ends when the gate is turned on, and the voltage application is turned off when the gate is turned off. Control using this basic circuit will be described below.
The relationship (one example) between the voltage drop across the diode 31 and the partition temperature of the chip is shown in FIG. Hereinafter, this example will be described. As shown in FIG. 5, the temperature (T [degrees Celsius]) and the voltage drop (Vx [mV]) of the chip show linearity, and the slope is about −2 mV / degree in this example. Therefore, it is represented by the following approximate expression (1).
Vx = -2T + 560 (1)
That is, when the chip partition temperature rises once, the voltage drop decreases by about 2 mV. By measuring this relational expression in advance, the chip temperature can be calculated from the voltage drop. Note that the slope value varies depending on the measurement conditions and the like. Although not explained in this patent, it goes without saying that the temperature dependence of the resistance value of the diode can be obtained by using a constant voltage condition or other conditions.
As shown in FIG. 5, in this example, the temperature increase is observed as the voltage drop decreases. Therefore, the temperature of an arbitrary section in the chip can be controlled as follows.
For example, a case where a certain section is controlled at T = 50 degrees Celsius will be described. If the compartment temperature is lower than the desired temperature condition of 50 degrees Celsius, the voltage drop at the sensor is greater than the voltage drop amount of 460 mV at 50 degrees Celsius. When the set value Vs is Vs = 460, the condition of Vx> Vs is satisfied. Therefore, the gate 44 is turned ON, and current flows through the heater circuit until the circuit satisfies Vx <Vs, and the section is heated. When the temperature of the section rises by heating and Vx <Vs is achieved, the gate is turned off and the heating stops, so that no further temperature rise occurs. When the temperature of the section decreases due to thermal diffusion and Vx> Vs again, the gate is turned on again, and heating is resumed. With this control, the compartment temperature is maintained at 50 degrees Celsius.
In this embodiment, this basic circuit is connected to all the sections of the chip one by one, and each set value is controlled independently, whereby the temperature of each section can be controlled independently. That is, a section 14 for amplifying nucleic acid and sections 15-1 to 15-8 for specifically capturing the amplified nucleic acid by hybridization on a single chip (substrate) 11 are independent of each other. Thus, it is formed with a heater capable of temperature control.
FIG. 6 is a diagram showing the entire system of this embodiment. Reference numerals 61 and 62-1 to 62-8 denote control units of basic circuits connected to the section 14 and the sections 15-1 to 15-8. The computer 63 controls the entire system and performs pre-programmed temperature control, and the interface 64 connects the computer 63 and all the control units 61, 62-1 to 62-8.
The computer 63 is programmed in advance with a set temperature for each time of each section or a set voltage value corresponding to the set temperature. In accordance with the program, the computer 63 sends the set temperature or the corresponding voltage value to the control units 61 and 62-1 to 62-8 of each basic circuit via the interface 64, and the set value Vs for each time. Enter as. As a result, each compartment can faithfully realize the programmed temperature sequence. The above is the outline of the structure of the partition and the circuit and system connected to the partition in the chip of the present invention.
Next, the structure of the chip will be described. In FIG. 1, a poly T probe that captures an expressed gene (target nucleic acid, for example, mRNA) in a sample is immobilized on the surface of the nucleic acid amplification section 14 with the sequence terminal 5 ′ side facing the surface of the section. Yes. The poly T probe is an oligonucleotide probe having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a function of specifically hybridizing to the poly A region at the end of the expressed gene. Here, a 20-mer array length was adopted. However, as a poly T probe, a poly T oligonucleotide having a length in the range of 8 to 200 mer can be used. When the length is shorter than 8 mer, the stability at the time of hybridization is lacking. Moreover, in the case of a thing longer than 200 mer, although it is sufficient as a function, there exists a fault which requires the manufacturing cost. In addition, an area other than T may be arbitrarily added to the 5 ′ end side of the poly T oligo. This has the effect of increasing the distance from the surface of the solid phase and increases the efficiency of hybridization.

In each of the nucleic acid detection sections 15-1 to 15-8, an oligonucleotide probe capable of specifically binding to an amplification product corresponding to the target gene is immobilized on the surface. For this probe, an optimal sequence is selected for each target gene. In this example, an attempt was made to measure the expression levels of two types of mRNA, GAPDH and P53. The sequences of probes for detecting GAPDH and P53 mRNA are SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.

These arrays are assumed to be fixed to the sections 15-1 and 15-5, respectively. As the immobilization method, the simplest method is to immobilize the above oligo probe having an amino modification at the 3 ′ end using 1,4-phenylene diisothiocynate as a linker on the surface of the chip that has been subjected to aminosilanization treatment. Here, it is particularly important to fix the 3 ′ side to the chip surface. Thereby, in this probe, the extension reaction by the polymerase does not occur. For the same purpose, it is also effective to chemically treat the base at the 3 ′ end of the probe so that no extension reaction occurs when the 5 ′ end is the fixed side.
Since the amplified product corresponding to the target gene is hybridized with these nucleic acid detection sections, the amount of the target gene can be determined by detecting the amount thereof. Details thereof will be described later.
As shown in FIG. 7, the nucleic acid amplification / detection cell used in the present invention includes the chip 11 having the nucleic acid amplification section 14 and the nucleic acid detection sections 15-1 to 15-8 described above, and the surface of the chip 11. In addition, a transparent sheet (upper plate) 72 arranged to face the chip surface is provided, and a sample (solution of sample, reagent, etc.) 72 is placed in the space 12 sandwiched between the chip 11 and the upper plate 72. Possess. Here, a combination of the chip 11 and the upper plate 72 is referred to as a “cell”.
In FIG. 1, the chip 11 is viewed with the upper plate 72 removed, and FIG. 7 is a cross-sectional view through sections 15-1 and 15-5 in FIG.
A layered space between the chip (substrate) 11 and the upper plate 72 becomes the reaction layer 12 that accommodates the sample, and is formed by processing the substrate 17 by lithography. It is also possible to form the reaction layer 12 by forming the chip 11 and the upper part 72 by a sheet and interposing a spacer between them.
The upper plate 72 is optimally 0.01 mm to 1 mm in thickness. Glass, various plastics, etc. can be used as the material, but it is important that the fluorescent material is not contained therein as much as possible. Although it is possible to use a material having a thickness exceeding 1 mm, it is difficult to maintain temperature independence in the chip, which is an object of the present invention, because the upper plate functions as a heat transfer substance. On the other hand, if it is 0.01 mm or less, there is a problem in strength. The sample layer 73 is preferably 0.05 mm to 1 mm. If it exceeds 1 mm, convection due to heat is generated in the sample solution in the chip, so that the independence of heat deteriorates.
A thin film-like structure for maintaining heat independence is important between the nucleic acid amplification section 14 and the nucleic acid detection sections 15-1 to 15-8 and between the nucleic acid detection sections. For this, it is industrially effective to use a silicon oxide film, but it is also possible to use other organic material films such as plastic and polyimide films. Moreover, since this chip is planar, the thermal diffusion efficiency to the up and down method is high. Therefore, when the detected temperature is high, it is possible to lower the temperature to a predetermined temperature without providing a cooling function by simply setting the heater to the off condition.
The amount of the fluorescence-labeled nucleic acid amplification product captured by the nucleic acid detection sections 15-1 to 15-8 on the chip surface is detected as a fluorescence amount (the generation of the fluorescence-labeled amplification product will be described later). FIG. 8 shows a state where the detection system is added to the cell.
In this embodiment, the fluorescence detection system has the same configuration as that of the confocal microscope. Other detection methods will be described in the examples described later.
In the fluorescence detection system, the optical detector 82 and the excitation laser 83 are in a confocal relationship 84 with respect to the cell surface rather than using the lens 81, and in each detection section in the reaction layer 12 excited by the laser 83. The fluorescent label (fluorescence amount) is measured by the photodetector 82.
The detector 82, the laser 83, and the lens 81 are integrally assembled as a unit, and move as a whole in the horizontal direction (indicated by an arrow in the figure) to scan the cell surface.
Next, the pretreatment of nucleic acid amplification using the chip of this example, the operation procedure of nucleic acid amplification and detection, and the transition of the products generated on the chip (in the cell) will be described with reference to FIGS. explain.
The sample is, for example, total RNA extracted from somatic cells. In addition, the target nucleic acid (target) this time is two kinds of mRNAs, GAPDH and P53.
FIG. 9 summarizes the operation procedure of this embodiment. FIG. 10 summarizes the temperature control conditions of the nucleic acid amplification section and the nucleic acid detection section 15-1 in each procedure.
FIG. 11 is a bird's-eye view schematically illustrating the surface of the chip 11. As shown in FIG. 11, in the initial state of the chip surface, the poly T probe 111 (SEQ ID NO: 1) is placed on the surface of the nucleic acid amplification compartment 14 and the GAPDH probe 112 (array) is placed on the GAPDH nucleic acid detection compartment 15-1. Number 2) is fixed.
A sample solution containing total RNA is injected into the reaction layer 12 of the chip 11, and then the temperature condition (1) shown in FIG. 10 is set. This temperature condition is 35 ° C at which the amplification section 14 is suitable for hybridization, and the nucleic acid amplification sections 15-1 to 15-8 are at a much higher temperature of 75 ° C. As a result, the mRNA in the sample is hybridized and fixed with the poly T probe 111 in the nucleic acid amplification section 14.
FIG. 12 is a bird's-eye view schematically showing how mRNA is captured by the poly-T probe 111 in the nucleic acid amplification section 14. Here, all mRNA is captured regardless of the type. For example, GAPDH mRNA 121, p53 mRNA 122, and other mRNA 123 are captured. On the other hand, the nucleic acid detection section 15-1 does not hybridize because of high temperature conditions.
Next, when unnecessary substances are washed, a reverse transcription reagent (RT reagent) is introduced, and the temperature condition (2) shown in FIG. 10 is established, reverse transcription occurs in the nucleic acid amplification section. At this time, the temperature of the amplification section 14 is set to a temperature of 42 ° C. suitable for reverse transcription. The nucleic acid detection section 15-1 is continuously maintained at a high temperature condition of 75 ° C.
FIG. 13 is a diagram illustrating a state in which the poly T probe 111 is expanded by reverse transfer. Here, it is important that the extended probe faithfully reproduces the abundance of mRNA. That is, here, there are an extension 131 of GAPDH mRNA, an extension 132 of P53 mRNA, and an extension 133 of other mRNAs.
Next, when the temperature condition (3) in FIG. 10 is used and the inside of the chip is washed, all mRNA is discharged, and in the nucleic acid amplification section 14, as shown in FIG. 14, extended probes (reverse transcription products) 131-133. Of only one strand.
The above process is a pretreatment for forming a reverse probe for amplifying the target nucleic acid. In this pretreatment, as described above, the target nucleic acid detection probe fixed to the nucleic acid detection section is being pretreated. The temperature is controlled so as not to cause a hybridization operation (for example, a high temperature condition of 75 ° C.).
Next, a nucleic acid amplification reagent is introduced into the reaction layer 12, and the temperature condition is set to the temperature of (4) in FIG. The temperature conditions at this time are 60 ° C. for the amplification section 14 and 65 degrees for the detection section 15-1.
Under this temperature condition, the operation shown in FIG. 15 is performed. That is, in the nucleic acid amplification reagent, there are a GAPDH primer 151 having a fluorescent label at the 5 ′ end and a p53 primer 152, so that these primers are extended to a predetermined single-stranded sequence of the amplification probe. It can hybridize. Here, the GAPDH primer 151 hybridizes to the GAPDH mRNA extension 131, and the P53 primer 152 hybridizes to the P53 mRNA extension 132.
Assuming that the temperature condition (5) is a thermal cycle in the amplification section 14,

amplification products

161 and 162 with fluorescent labels are generated by linear amplification from the respective extensions of GAPDH and P53 in the amplification section.
FIG. 16 shows how the fluorescently labeled amplified

products

161 and 162 are synthesized. On the other hand, the nucleic acid detection sections 15-1 and 15-5 are set to optimum temperature conditions for the respective probes to hybridize. Therefore, the linearly amplified amplification product specifically hybridizes to each probe (FIG. 17). When this amount is detected in real time in parallel with amplification, a signal 2N times the original amount of mRNA can be detected for N amplification cycles.
In this example, detection of two types of mRNA has been described for the sake of simplicity, but in the present invention, it is possible to simultaneously measure a plurality of types of mRNA more than the number of nucleic acid detection sections. .
As described above, according to the present embodiment, amplification and detection can be performed in parallel in one chip, and multiple types of mRNA expression levels in one sample can be measured simultaneously and quickly. It is possible.
(Second embodiment)
As a second embodiment, a nucleic acid amplification / detection cell in which the detection performance of the first embodiment is further improved will be described with reference to FIGS.
FIG. 18 is a schematic view (cross-sectional view) in which a reaction layer (sample layer) 73 is interposed between the chip 11 and the upper plate 182 opposed thereto. The chip 11 is provided with a nucleic acid amplification section and a nucleic acid detection section as in the first embodiment, but here, for convenience of illustration, 15-1 is one of the nucleic acid detection sections. Only exaggerated.
In this embodiment, the nucleic acid detection probe 181 (corresponding to the probe 112 of the first embodiment) is not on the heater surface of the nucleic acid detection section, but on the opposite surface, that is, on the upper plate portion (transparent sheet) 182. It is fixed. The upper plate 182 corresponds to the upper plate 72 of the first embodiment. In other words, the detection probe 181 that captures the target nucleic acid in the nucleic acid detection section is fixed to a surface facing the heater surface, such as the temperature controllable sections 151-1 to 151 -n.
That is, the nucleic acid detection section in this embodiment is formed by dividing the function on the facing surface between the substrate 11 and the sheet 182, and the temperature cycle control of the nucleic acid detection section is performed on the facing surface on the substrate 11 side for each section. A heater function is provided, and a nucleic acid detection probe 181 is fixed to the opposite surface on the sheet 182 side to provide a nucleic acid detection function.
In the cell of the present embodiment, under the condition that the thickness of the reaction layer 73 is 1.0 mm or less, the temperature of the section (151-1... 151 -n) and the temperature of the surface of the upper plate 182 facing it are substantially equal.
Therefore, also in the structure of this example, the temperature of the probe fixing region can be controlled to the respective hybridization conditions. Therefore, the measurement object hybridized with the probe 181 is fixed to the upper plate surface.
In the process in which an amplification product (amplification product with a fluorescent label separated from the amplification probe) is captured by the detection probe 181 in parallel with the nucleic acid amplification, as shown in FIG. An excitation laser 192 is incident laterally from a laser light source 191 disposed on the side. FIG. 19 schematically shows the case where the excitation laser 192 is incident on the upper plate 182.
The excitation laser travels while being totally reflected in the upper plate 182 and is controlled to an angle that is not emitted to the outside of the upper plate 182. Then, only the vicinity of the upper plate 182 leaks the excitation laser 192 as evanescent light. As a result, only the fluorescently labeled amplification product 193 existing on the surface of the upper plate is excited, and the fluorescently labeled amplification product 194 floating in the middle of the sample layer is not excited. Therefore, according to this example, in addition to the effect of the first example, the primer present in the reaction solution does not contribute to fluorescence emission, so the background of fluorescence detection is significantly reduced and the measurement S / N is reduced. improves.
(Third embodiment)
Next, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. The difference between the present embodiment and the first embodiment is the sequence structure of the oligonucleotide probe fixed to the nucleic acid amplification section 14. There is no change in the nucleic acid detection compartment.
In this example, an example is shown in which a reverse primer that captures a target mRNA in a complementary and specific manner without pretreatment as in the first example is used as a probe to be immobilized on a nucleic acid amplification section. As in the previous example, the target nucleic acid will be described by taking two types of mRNA, GAPDH and P53, as an example. Sequences 4 to 7 are prepared as specific primers for these two types of mRNAs.

Here, arrays 4 and 5 are forward and reverse for GAPDH, and arrays 6 and 7 are forward and reverse for P53. The reverse primer is fixed on the surface of the compartment for nucleic acid amplification as indicated by

reference numerals

201 and 202. On the other hand, the forward primer has a fluorescent label at the 5 ′ end. Nucleic acid amplification is performed using these. The reaction in the compartment for nucleic acid amplification will be described below.
FIG. 20 is a bird's-eye view inside the chip. When total RNA is injected as a sample into the reaction layer of the chip 11, only those specific to the fixed reverse primer 201 and primer 202, that is, only GAPDH and P53, hybridize to the corresponding reverse primer (FIG. 21). ). Due to the extension reaction, the

reverse primers

211 and 212 are extended into a sequence complementary to the mRNA. Due to the thermal cycle in this nucleic acid amplification, the deviated mRNA is hybridized again with another reverse primer. On the other hand, the free forward primer complementarily binds (hybridizes) with the extended reverse primer and extends (FIG. 22).
By repeating the above, a fixed extension reverse primer and an extension free forward primer (with a fluorescent label) are generated by N times the initial mRNA amount (FIG. 23). Since the extended free forward primer has a sequence complementary to the primer of the nucleic acid detection section, it is detected in the detection section as in the first and second embodiments. Since this method has a remarkably large amplification factor, it is possible to detect a very small amount of target.
In this example, the temperature cycles of the two types of primer sets need to be optimal conditions, respectively. Therefore, it is more accurate to set the annealing temperature for each array individually. In that case, if a plurality of nucleic acid amplification sections are prepared, a plurality of types of temperature cycles can be simultaneously realized in the chip. That is, a nucleic acid amplification section for GAPDH and a nucleic acid amplification section for P53 are provided separately. In this example, since each reverse primer is immobilized on the surface of each compartment, each amplification reaction can be generated only in the corresponding compartment.
(Fourth embodiment)
In each of the above examples, nucleic acid amplification and detection were performed simultaneously. Therefore, as in the first embodiment, since a free primer exists in the sample, the background may be increased. In this case, the detection at the same time as the amplification is an approximate evaluation of the signal amount, and in the case of a precise evaluation, it is effective to improve the accuracy to perform a process of washing free components.
(5th Example)
FIG. 24 shows an example in which two nucleic acids 241-1 and 241-2 are provided in one reaction layer as the nucleic acid amplification section. As the other configuration, any one of the first to fourth embodiments is adopted. 242-1 to 242-n are nucleic acid detection compartments.
The optimum conditions for the temperature cycle of nucleic acid amplification differ depending on the primer sequence for nucleic acid amplification to be specified. In the first example, as shown in FIG. 10, the temperature cycle (95 ° C .: 5 seconds → 55 ° C .: 15 seconds → 72 ° C .: 15 seconds) was used. However, when the GC ratio of the primer is large, there is a fake synthesis by pseudo-hybridization, so it may be effective to set the primer hybridization temperature to 60 ° C., which is 5 degrees higher than 55 ° C. Further, when the base length of the product is long, it is necessary to further increase the extension synthesis time of 15 seconds. In order to improve the accuracy of nucleic acid analysis which is the object of the present invention, it is effective to optimize these temperature cycles for each target nucleic acid. To realize this, it is necessary to provide a plurality of nucleic acid amplification sections in the reaction layer and control them with different temperature cycles, and the configuration of FIG. 24 is effective.
According to each of the above-described embodiments, it is possible to provide a simple, inexpensive and highly accurate gene expression analysis method by simultaneously performing amplification and individual detection on a plurality of types of targets in a single sample. .

本発明によれば、例えば、関心のある核酸（例えば遺伝子）が１０〜２０ないし１００種類程度存在する場合に、それらの遺伝子を同時に増幅し、一括で定量検定できる。また、単一反応層内で行うため、サンプルの小分けによる微量化の問題が生じず、従来より高感度の検出が可能となる。 According to the present invention, for example, when about 10 to 20 to 100 kinds of nucleic acids of interest (for example, genes) are present, those genes can be simultaneously amplified and quantitatively assayed at once. In addition, since it is carried out in a single reaction layer, there is no problem of micro-measurement due to the subdivision of the sample, and detection with higher sensitivity than before is possible.

Claims

At least one side of a reaction layer for nucleic acid analysis formed by a space for containing a solution such as a sample or a reagent is separated from a nucleic acid amplification section for generating nucleic acid by amplification from the generated amplified nucleic acid. A plurality of nucleic acid detection sections for specific capture by hybridization are formed so as to enable temperature control independent of each other, and the nucleic acid amplification section includes a nucleic acid amplification probe or a primer for reverse transcription. A plurality of nucleic acid detection sections, each of which has a nucleic acid detection probe for capturing a nucleic acid amplification product of interest for each type by hybridization, and a solution of a sample or a reagent in the reaction layer. housing to, in the nucleic acid amplification compartment, for reverse transcription, or for temperature cycle control of nucleic acid amplification by PCR, the nucleic acid detection Zone In order to during reverse transcription performed at the nucleic acid amplification compartment does not cause hybridization or to capture the interest generated by the nucleic acid amplification compartment nucleic acid amplification product, suitable for each compartment by performing the temperature control, a nucleic acid analysis method and performing amplification and detection of nucleic acids in a single reaction layer.

The nucleic acid analysis method according to claim 1, wherein nucleic acid amplification and detection are performed in parallel in the reaction layer.

2. The nucleic acid analysis method according to claim 1, wherein a nucleic acid detection probe for capturing a nucleic acid amplification product with a fluorescent label separated from the nucleic acid amplification section is fixed to the nucleic acid detection section, and is captured by the detection probe. A nucleic acid analysis method using evanescent light as excitation light for detecting a fluorescently labeled amplified product.

The nucleic acid analysis method according to claim 1, wherein a plurality of the nucleic acid amplification sections are formed, and each includes a nucleic acid amplification probe or a probe serving as a primer for reverse transcription.

Having a reaction layer for nucleic acid analysis formed by a space for accommodating solutions such as samples and reagents,
On at least one surface forming a reaction layer, and a nucleic acid amplification compartment to produce the amplified nucleic acid, compartment and is a plurality of nucleic acid detection to specifically captured by hybridization of amplified nucleic acid generated after divergence The nucleic acid amplification section is formed with a nucleic acid amplification probe or a probe that serves as a primer for reverse transcription, and the plurality of nucleic acid detection sections can capture nucleic acid amplification products of interest for each type by hybridization. Characterized in that the nucleic acid amplification section and the nucleic acid detection section are formed so that independent temperature control is possible for each section in accordance with each probe. Cell for nucleic acid analysis.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5 , wherein a probe having a poly T sequence that is complementary to a poly A sequence of mRNA is fixed on the surface of the nucleic acid amplification section.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5 , wherein a nucleic acid amplification probe capable of specifically hybridizing with the mRNA of interest is fixed on the surface of the nucleic acid amplification section.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5, wherein a plurality of the nucleic acid amplification sections are formed, and a nucleic acid amplification probe or a probe serving as a primer for reverse transcription is fixed to each of the sections.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5 , wherein the reaction layer is formed between a substrate and a light-transmitting sheet disposed to face the substrate, and the nucleic acid amplification section and the nucleic acid detection section are A nucleic acid analysis cell provided on at least one surface of the substrate.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5 , wherein the reaction layer is formed between a substrate and a light-transmitting sheet disposed to face the substrate, and the reaction layer has a thickness of 0.05 mm to 1 mm. A nucleic acid analysis cell satisfying at least one condition of a sheet thickness of 0.01 mm to 1 mm.

The cell for nucleic acid analysis according to claim 5 , wherein the reaction layer is formed between a substrate and a light-transmitting sheet disposed to face the substrate.
The nucleic acid amplification section is formed on one surface of the substrate,
The nucleic acid detection section has a nucleic acid detection function having a nucleic acid detection probe for capturing a nucleic acid amplification product of interest on a surface facing the substrate and the sheet, and temperature control suitable for capturing the nucleic acid amplification product. the heater function and is formed separately performed, the heater function setting vignetting on the opposing surfaces of the substrate, the nucleic acid detection function the sheet side cells for nucleic acid analysis which is provided on the opposing face of the.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5 , wherein a plurality of the nucleic acid detection sections are provided on both sides of or around the nucleic acid amplification section.

6. The nucleic acid analysis cell according to claim 5 , wherein all of the nucleic acid detection sections are arranged at an equal distance from the nucleic acid amplification section.

A reaction layer for nucleic acid analysis formed by a space for accommodating a solution of a sample, a reagent, etc., and a nucleic acid amplification section for generating nucleic acid by amplification on at least one surface forming the reaction layer; And a plurality of nucleic acid detection sections for specifically capturing the nucleic acid amplification product generated by separation after hybridization, and the nucleic acid amplification section serves as a nucleic acid amplification probe or a primer for reverse transcription. A plurality of the nucleic acid detection sections, each having a probe, and a nucleic acid detection probe for making it possible to capture a fluorescently labeled nucleic acid amplification product of interest for each type by hybridization, and the nucleic acid amplification section and the nucleic acid Nucleic acid analysis cells formed such that detection compartments can be controlled independently for each compartment according to each probe ;
A temperature control means for temperature control for nucleic acid amplification or reverse transcription of the nucleic acid amplification compartment,
A temperature control means for performing a set temperature control suitable for specific capture by hybridization according to the type of nucleic acid amplification product of interest in each of the plurality of nucleic acid detection sections;
Detection means for optically detecting the fluorescent nucleic acid amplification product captured in the nucleic acid detection section;
A nucleic acid analyzer comprising:

The nucleic acid analyzer according to claim 14, wherein the reaction layer is formed between a substrate and a light-transmitting sheet disposed to face the substrate.
The nucleic acid amplification section is formed on one surface of the substrate,
The nucleic acid detection compartment, the opposing surfaces of the substrate and the sheet, the temperature control suitable for capturing the nucleic acid amplification product and the nucleic acid detection with a nucleic acid detection probe to capture interest nucleic acid amplification product are formed separately and a heater function for the heater function setting vignetting on the opposing surfaces of the substrate, the nucleic acid detection function provided on the opposite surface of the sheet side,
A nucleic acid analyzer that uses evanescent light that is set so that the nucleic acid amplification product with a fluorescent label is captured by the probe for detecting a nucleic acid, and the fluorescent amount is detected so as to ooze out to the inner surface of the sheet.

15. The nucleic acid analyzer according to claim 14, wherein the cell includes a plurality of nucleic acid amplification sections and performs different temperature cycle control in each of the nucleic acid amplification sections.