JP2003299485A - Temperature control-type microreactor and microreactor system - Google Patents

Temperature control-type microreactor and microreactor system

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JP2003299485A
JP2003299485A JP2002108252A JP2002108252A JP2003299485A JP 2003299485 A JP2003299485 A JP 2003299485A JP 2002108252 A JP2002108252 A JP 2002108252A JP 2002108252 A JP2002108252 A JP 2002108252A JP 2003299485 A JP2003299485 A JP 2003299485A
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JP2002108252A
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Inventor
Satoshi Tamaki
聡史 玉木
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Sekisui Chem Co Ltd
積水化学工業株式会社
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a temperature control-type microreactor highly compatible with automatic analysis, enabling a nucleic acid to be detected in high accuracy in a short time using a small amount of a sample and also applicable to the aimed nucleic acid aliquot and its amplification by PCR technique, and to provide a microreactor system using said microreactor. <P>SOLUTION: The temperature control-type microreactor has flow channels whose surface is immobilized with a deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid, wherein the temperature of the flow channels can be controlled at positions where the deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid is immobilized. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 【0001】 【発明の属する技術分野】本発明は、自動分析への対応性が高く、少量のサンプルを用いて、短時間に高い精度で核酸の検出が可能であり、目的核酸の分取やPCR法による増幅にも応用可能な温度制御型マイクロリアクター及びこれを用いたマイクロリアクターシステムに関する。 BACKGROUND OF THE INVENTION [0001] [Technical Field of the Invention The present invention has high adaptability to automatic analysis, using a small amount of sample, it is possible to detect the nucleic acid in a short time to high accuracy relates to microreactor system employing also temperature controlled microreactors and this can be applied to amplification by preparative, PCR purposes nucleic acid. 【0002】 【従来の技術】多種類のデオキシリボ核酸又はリボ核酸等の核酸を含むサンプルを分析する手段として、人為的に設計した塩基配列を持つデオキシリボ核酸又はリボ核酸(ヌクレオチドプローブ、以下、プローブともいう) [0002] As a means for analyzing a sample containing BACKGROUND ART variety of deoxyribonucleic acid or nucleic acid ribonucleic acid such as deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid (nucleotide probes with artificially designed base sequence, the following probe both Say)
を用い、サンプル中の特定の核酸と相補鎖結合(ハイブリダイゼーション)させることにより、検出を行う方法が知られている。 The use, by a complementary strand binding to a specific nucleic acid in a sample (hybridization), a method of performing detection is known. 【0003】この方法は、例えば数万種類以上の極めて多数のプローブを用いることで、1度に多くの種類の核酸を検出することにも応用可能である。 [0003] The method, for example by using tens of thousands or more very large number of probes, it is also applicable to the detection of many types of nucleic acid at a time. このような方法が、Science vol. Such a method, Science vol. 270、467−470 270,467-470
(1995年)に記載されている。 It has been described in (1995). しかし、核酸同士の相補鎖結合はプローブとサンプルの核酸の塩基が多数の水素結合を形成した結果であることから、その結合の強さはプローブを構成する塩基配列に大きな影響を受け、 However, since the complementary strand nucleic acid binding each other is the result of a nucleic acid base of the probe and the sample to form a large number of hydrogen bonds, the strength of the binding significantly affected the nucleotide sequence constituting the probe,
プローブを構成する塩基配列によってハイブリダイゼーション可能な温度に差異が生じる。 Difference in the hybridization temperature capable by nucleotide sequence constituting the probe occurs. 【0004】すなわち、核酸同士の相補鎖結合は塩基間の水素結合によりなされるが、アデニン(A)とチミン(T)の結合又はアデニン(A)とウラシル(U)の結合は1塩基あたり2カ所の水素結合であるのに対し、グアニン(G)とシトシン(C)の結合は1塩基あたり3 [0004] That is, the complementary strand binding between nucleic acids is done by hydrogen bonding between the bases, adenine (A) and coupling of thymine (T) of the binding or adenine (A) and uracil (U) is one base per 2 to which the hydrogen bonds of locations, guanine binding (G) and cytosine (C) is 3 per base
カ所の水素結合である。 Is a hydrogen bonding sites. したがって、相補鎖結合の熱安定性はプローブを構成する塩基配列がグアニン(シトシン)リッチであるほど高く、アデニン(チミン又はウラシル)リッチであるほど低くなる。 Thus, the thermal stability of complementary strand binding as high as nucleotide sequence constituting the probe is a guanine (cytosine) rich, decreases as are adenine (thymine or uracil) rich. 相補鎖結合の熱安定性は、一般的に、結合とその解離が50%ずつ生じる温度(融解温度:Tm)で表されるが、ハイブリダイゼーションは各プローブの相補鎖結合のTm付近の温度で行うことが好ましい。 The thermal stability of complementary strand binding is generally binding and dissociation occurs by 50% temperature (melting temperature: Tm) is represented by the hybridization at temperatures near the Tm of the complementary strand binding of each probe it is preferable to perform. Tmより高温の条件下でハイブリダイゼーションを行っても相補鎖結合は形成されにくく、 Complement binding even performing hybridization at high temperature conditions than Tm is hardly formed,
逆に、Tmより低温での条件下でハイブリダイゼーションを行うと、ミスマッチ結合が起こりやすくなる。 Conversely, when the hybridization conditions at a temperature lower than Tm, tends to occur mismatch binding. 【0005】したがって、例えば、Aプローブの相補鎖結合のTmが60℃、Bプローブの相補鎖結合のTmが40℃であるとしたとき、ハイブリダイゼーション温度を60℃に設定すると、Aプローブに対応する配列を有する核酸を検出することはできるが、Bプローブに対応する配列を有する核酸を検出することはできない。 [0005] Thus, for example, Tm is 60 ° C. of the complementary strand binding A probe, when the Tm of the complementary strand binding B probe has to be 40 ° C., by setting the hybridization temperature to 60 ° C., corresponding to A probe it is possible to detect a nucleic acid having a sequence but is unable to detect a nucleic acid having a sequence corresponding to the B probe. しかし、例えばハイブリダイゼーション温度を40℃に設定すると、Bプローブに対応する配列を有する核酸も検出することが可能になるが、Aプローブに対応する核酸については誤検出が増加してしまう。 However, for example, if you set the hybridization temperature to 40 ° C., a nucleic acid having a sequence corresponding to the B probe also becomes possible to detect, for nucleic acid corresponding to A probe increases erroneous detection. このようにハイブリダイゼーション温度の設定は非常に重要である。 In this way the hybridization temperature setting is very important. 【0006】これに対して、特開2001−23546 [0006] On the other hand, JP-2001-23546
9号公報には、ハイブリダイゼーション温度をプローブの固定場所毎に変化させることにより検出精度を向上させる方法が開示されている。 The 9 discloses a method to improve the detection accuracy by changing the hybridization temperature for each fixed location of the probe is disclosed. しかしながら、この方法でプローブの全面とサンプルとを接触させるには、多量のサンプルを用いてサンプルとプローブとの接触時間を例えば1昼夜等の長時間にする必要があった。 However, contacting the whole surface and the sample probe in this method, it is necessary to for a long time, such as, for example, one day the contact time between the sample and probe using a large amount of sample. 多量のサンプルを確保するためには、細胞、微生物等の検体量を増やすか、又は、少量のサンプルをポリメラーゼチェインリアクション法(PCR法)により増幅する等の必要がある。 To ensure a large amount of sample, cells, increase the amount of analyte such as microorganisms, or is required, such that a small amount of sample is amplified by polymerase chain reaction (PCR method). しかし、貴重な実験材料である細胞、微生物等を多量に入手することは費用や時間の面で困難な場合が多い。 However, a valuable experimental material cells, that a large amount of available microorganisms, such as is often difficult in terms of cost and time. また、PCR法は、核酸の塩基配列によって増幅効果が異なることや、元の配列とは異なった(変異が起こった)塩基配列が増幅される場合がある。 Also, PCR methods may by sequencing the amplification effect is different and the nucleic acid, different from the original sequence (happened mutant) nucleotide sequence is amplified. また、接触時間が長時間であることは、必然的に作業効率の低下をもたらし、例えば遺伝子診断等の時間当たり多数の検体処理が要求される場合には適さない。 Further, that the contact time is long results in a decrease in inevitably working efficiency, for example not suitable when a large number of specimens per treatment time of genetic diagnosis and the like are required. 以上の問題点により、特開2001−235469号公報に開示されている方法も不充分であった。 The above problems were also insufficient method disclosed in JP-A-2001-235469. 【0007】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に鑑み、自動分析への対応性が高く、少量のサンプルを用いて、短時間に高い精度で核酸の検出が可能であり、目的核酸の分取やPCR法による増幅にも応用可能な温度制御型マイクロリアクター及びこれを用いたマイクロリアクターシステムを提供することを目的とする。 [0007] [SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above circumstances, high adaptability to automatic analysis, using a small amount of sample, it is possible to detect the nucleic acid in a short time to high accuracy , and an object thereof is to provide a microreactor system employing also temperature controlled microreactors and this can be applied to amplification by preparative, PCR purposes nucleic acid. 【0008】 【課題を解決するための手段】本発明は、近年研究が著しいマイクロリアクター又はμTAS(micro/m [0008] Means for Solving the Problems The present invention has recently research significant microreactor or μTAS (micro / m
iniaturized Total Amalysi iniaturized Total Amalysi
s System)の技術に注目して鋭意検討を行った結果、フローインジェクション型のμTAS装置にプローブ固定場所毎の温度制御を行うという槻念を取り入れることにより、核酸検出精度の向上や数々の有用な効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。 s System) technology interest and result of intensive studies by the of the flow by incorporating Keyakinen that performs temperature control for each probe a fixed location to the injection-type μTAS device, nucleic acid detection accuracy improvement and a number of useful It found that there is an effect, and have completed the present invention. 本発明は、表面にデオキシリボ核酸又はリボ核酸が固定化された流路を有する温度制御型マイクロリアクターであって、前記デオキシリボ核酸又はリボ核酸が固定化された位置において流路の温度を制御できるものである温度制御型マイクロリアクターである。 The present invention is a temperature control microreactor having a channel deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid is immobilized to a surface, it can control the temperature of the flow path at a position where the deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid is immobilized a temperature controlled microreactor is. 以下に本発明を詳述する。 The present invention will be described in detail below. 【0009】本発明の温度制御型マイクロリアクターは、表面にデオキシリボ核酸(以下、DNAともいう) [0009] Temperature control microreactor of the present invention, deoxyribonucleic acid on the surface (hereinafter, also referred to as DNA)
又はリボ核酸(以下、RNAともいう)が固定化された流路を有する。 Or ribonucleic acid (hereinafter also referred to as RNA) has a fixed flow paths. 流路中でハイブリダイゼーションを行うことにより、極微量のサンプルでも流路を通過する過程で、固定化されたDNA又はRNA(以下、プローブともいう)と確実に接触させることができる。 By performing the hybridization in the flow path, very even flow path trace amounts of samples in the process of passing through the immobilized DNA or RNA (hereinafter also referred to as a probe) and can be reliably contacted. また、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出において感度を向上させるのに必須である洗浄工程も、確実かつ簡便に行うことができる。 Moreover, it is essential cleaning process for improving the sensitivity in the detection of nucleic acids by hybridization can also be performed reliably and easily. 更に、サンプルをハイブリダイゼーションする工程とリアクター内を洗浄する工程とを同じ装置内で実施できることから、自動化が容易である。 Further, the step of cleaning the process and the reactor hybridizing a sample from can be implemented in the same apparatus, it is easy to automate. 【0010】上記プローブとしては、目的とする核酸に対応する塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、本発明の温度制御型マイクロリアクターを用いて目的核酸の分取を行う場合には、制限酵素で消化可能な塩基配列を含有することが好ましい。 [0010] As the probe is not particularly limited as long as it has a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid of interest, in the case of fractionation of the nucleic acid of interest using a temperature-controlled microreactor of the present invention, preferably contains digestible nucleotide sequence with restriction enzyme. これにより、制限酵素を用いれば、特定の核酸のみを容易に分取することが可能となる。 Thus, the use of restriction enzymes, it is possible to preparative readily min only specific nucleic acid. 分取した核酸は、クローニングやシークエンス等の他の分析に使用可能であるので、本発明によるリアクターの価値が更に高まる。 Nucleic acids fractionated are the available to other analysis such cloning and sequencing, further increasing the value of the reactor according to the present invention. 【0011】本発明でプローブとして用いるDNA又はRNAは、微生物、動物(ヒト等)、植物、ウイルス等の自然界から入手できるものだけでなく、DNA合成装置により合成されたものや各種修飾(ビオチン化、チオール化、メチル化、蛍光色素付加等)されたものであってもよい。 [0011] DNA or RNA used as a probe in the present invention, a microorganism, an animal (such as human), as well as those available plants, from nature, such as viruses, those synthesized by a DNA synthesizer and various modifications (biotinylated , thiolated, or may be methylated, are fluorochromes such as addition). 特に、ヒトの遺伝子の塩基配列又はそれと相補的な塩基配列を少なくとも部分的に含むDNA又はR In particular, DNA or R comprises a nucleotide sequence or complementary to the nucleotide sequence of the human gene at least in part
NAをプローブとした場合には、本発明の温度制御型マイクロリアクターはヒトの遺伝子配列の分析、例えばシークエンス、遺伝子診断、1塩基置換変異多型(SNP In the case where the NA probe is temperature controlled microreactor of the present invention is the analysis of human gene sequences, for example sequences, gene diagnosis, single base substitution polymorphisms (SNP
s)分析に用いることができる。 s) can be used for analysis. またサンプルが微生物由来の16SリボソームRNAを含む場合には、それと相補的な塩基配列を少なくとも部分的に含むDNA又はRNAを固定化することにより、微生物の同定も可能となる。 Further, when the sample contains a 16S ribosomal RNA from microorganisms, therewith by immobilizing at least partially containing DNA or RNA complementary base sequence, it is possible the identification of microorganisms. 【0012】多種類のDNA又はRNAの同時分析を行う場合には、上記固定化されるDNA又はRNAは、塩基配列が2種類以上からなることが好ましい。 [0012] When the simultaneous analysis of many types of DNA or RNA, DNA or RNA is the fixation is preferably a base sequence composed of two or more. これにより、多種類の核酸の分析を同時に効率よく行うことができる。 This makes it possible to simultaneously efficiently analyze various kinds of nucleic acids. 【0013】本発明の温度制御型マイクロリアクターの流路の表面にDNA又はRNAを固定化する方法としては特に限定されず、従来公知の技術を用いれば良い。 [0013] As a method for immobilizing DNA or RNA in a flow path surface of the temperature control microreactor of the present invention is not particularly limited, may be used a conventionally known technique. 例えば流路がガラスからなる場合にあっては、各種の表面処理剤を用いてガラス表面にアミノ基やアルデヒド基等を導入し、固定化するDNA又はRNAの5'又は3' For example, in cases where the flow channel is made of glass, using various surface treatment agent to introduce an amino group and an aldehyde group on the glass surface, 5 of DNA or RNA immobilized 'or 3'
末端にもアミノ基、アルデヒド基、チオール基、ビオチン等の官能基又は分子・原子団を導入して両者を共有結合させる方法やポリリジン等の陽イオンでガラス表面を処理し、DNA又はRNAの負電荷と静電気的に結合させる方法等が挙げられる。 Terminus amino group, an aldehyde group, a thiol group, and treating the glass surface with a cation such as methods and polylysine covalently bonding them together by introducing a functional group or molecule-atom group such as biotin, DNA or RNA negative and a method for charge and electrostatically bond. なかでも、共有結合で固定化する方法が、固定化された核酸の剥がれが抑制されるために好ましい。 Among them, a method of covalently immobilized is preferred for peeling the immobilized nucleic acid is suppressed. 【0014】また、特に多種類のDNA又はRNAを固定化する場合のプロセスとして、いわゆるDNAチップ(DNAマイクロアレイ又はオリゴDNAマイクロアレイ)で使用される技術を例示することができる。 Further, in particular a variety of DNA or RNA as a process in the case of immobilized illustrates the technique used in so-called DNA chip (DNA microarray or oligo DNA microarrays). DNA DNA
マイクロアレイは、予め別途作製したプローブDNAを含む溶液をスポッター又はアレイヤーという特別の装置で数nLから数pLの微小体積でチップ表面に並べ、基板上の特定領域に固定する方法で作製される。 Microarrays are prepared by the method of arranging the chip surface with a solution very small volume of a few pL several nL with a special device called spotter or arrayer the containing previously separately fabricated probe DNA, is fixed to a specific region on the substrate. この場合、末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、チオール基、ビオチン等を導入したプローブDNAと、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤等で表面処理した基板を用いることにより、プローブDNAを共有結合で固定化できる。 In this case, use terminal amino group as a functional group, an aldehyde group, a thiol group, a probe DNA was introduced biotin, amino group, aldehyde group, a substrate surface-treated with various silane coupling agents having an epoxy group it allows immobilized probe DNA covalently. また、 Also,
オリゴDNAマイクロアレイは、基板上で直接プローブDNAを合成する方法で作製する。 Oligo DNA microarray is manufactured by a method of synthesizing directly probe DNA on a substrate. 例として、光照射で選択的に除去される保護基を持つ物質を使い、フォトリソグラフィー技術と固相合成技術を組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域に選択的にDNAを合成する方法がある。 As an example, using a substance having a protecting group is selectively removed by light irradiation, in combination photolithography and solid phase synthesis techniques, there is a method of selectively synthesizing DNA in a predetermined area of ​​the small matrices . 本発明では、後述の流路形成方法により流路が形成された基材に対して、上述のスポッターやフォトリソグラフィー技術等を用いればよい。 In the present invention, with respect to the flow path forming method by flow path is formed substrates will be described later, it may be used above the spotter and a photolithography technique or the like. 流路形成による基材の凹凸が問題となる場合には、凹凸のない基材にDNA等の固定化を行い、その後、流路が形成された基材と貼り合わせる等すればよい。 When the unevenness of the base material due to the flow path forming becomes a problem performs immobilization of DNA or the like without unevenness substrate, then, may be like the channel is bonded to the formed substrate. このように本発明では、極めて多種類のDNA又はRNAを固定したマイクロリアクターを簡便に作製可能である。 In this way the present invention, it is easily possible to produce a microreactor fixed very wide variety of DNA or RNA. 【0015】上記DNA又はRNAを固定化する濃度としては特に限定されないが、固定化の状態を簡便に確認できることから、好ましい下限は0.001pmol/ [0015] No particular limitation is imposed on the concentration of immobilizing the DNA or RNA, since it can be confirmed easily the state of immobilization, preferable lower limit is 0.001 pmol /
mm 2である。 a mm 2. また、上記DNA又はRNAを固定化する面積としては特に限定されないが、溶液の進行方向に対して周囲を囲むように固定化することが検出感度を向上するために好ましい。 There are no particular restrictions on the area to immobilize the DNA or RNA, preferably in order to improve the detection sensitivity be immobilized so as to surround the periphery with respect to the traveling direction of the solution. 【0016】本発明の温度制御型マイクロリアクターは、DNA又はRNAが固定化された位置において能動的に流路の温度を制御できるものである。 [0016] Temperature control microreactor of the present invention, it is possible to control the temperature of the actively passage at a position where DNA or RNA is immobilized. これによりプローブ毎の塩基配列に最適なハイブリダイゼーション温度を迅速に設定することができ、核酸の検出精度が大幅に向上するとともに、反応時間の短縮が可能となる。 Thus it is possible to quickly set the optimal hybridization temperature of the nucleotide sequence of each probe, along with the detection accuracy of a nucleic acid is significantly improved, it is possible to shorten the reaction time. 【0017】温度制御可能な範囲としては、0〜10 [0017] As the temperature control range is from 0 to 10
0.0℃が好ましい。 0.0 ℃ is preferable. これより温度範囲が狭い場合、例えば40〜60℃が制御範囲である場合には、範囲外で最適なハイブリダイゼーション温度を有するプローブについて検出感度が悪くなったり、結合したサンプルの分取が困難となったりすることがある。 If this the temperature range is narrow, for example when 40 to 60 ° C. is a control range, may become poor detection sensitivity for probes having optimal hybridization temperature range, fractionation of the sample bound is difficult there is to be or become. 【0018】上記温度制御範囲で高温、例えば95℃等に温度を上昇させた場合、リアクター内で気泡が発生することがある。 [0018] high temperature above the temperature control range, for example, when the temperature was raised to 95 ° C. and the like, may be bubbles are generated in the reactor. 発生した気泡はサンプルの均一な流れを乱したり、サンプルと固定化DNA又はRNAとの接触を阻害したりするので好ましくない。 Bubbles generated or disrupt the uniform flow of the sample, undesirably or inhibiting contact between the sample and the immobilized DNA or RNA. 上記気泡の発生を抑制する方法としては特に限定されず、例えば、サンプル溶液をリアクターに流す前に脱気する方法やリアクターに流している間リアクターの内圧を高める方法等が挙げられる。 It is not particularly restricted but includes the method of suppressing the generation of said bubble, for example, and a method of increasing the internal pressure during reactor is flowing to the method and reactor for degassing prior to flowing the sample solution in a reactor and the like. 上記脱気する方法としては、例えば、真空脱気、超音波脱気、加熱脱気等の公知の方法等が挙げられる。 Above for a method of degassing, for example, vacuum degassing, ultrasonic degassing, a known method such as heating degassing and the like. 上記リアクターの内圧を高める方法としては、例えば、流路途中にバルブを設置した構造を有するリアクターを用いる方法等が挙げられる。 As a method for increasing the internal pressure of the reactor, for example, a method of using a reactor having a structure in which established the valve during the passage thereof. 【0019】温度の制御精度は、温度制御型マイクロリアクター使用時に設定値に対して±0.5℃以内の変化であることが好ましい。 The control accuracy of the temperature is preferably the change within ± 0.5 ° C. with respect to the set value when the temperature control microreactor used. この範囲外では、本発明の効果を得ることが難しい。 In this range, it is difficult to obtain the effect of the present invention. より好ましくは±0.1℃以内である。 And more preferably within ± 0.1 ° C.. また、ある塩基配列と類似の配列を分取する等、 Further, etc. to retrieve the similar sequences that there nucleotide sequence min,
1つのプローブで複数種類の核酸をハイブリダイゼーションさせる場合にも、上述のような高精度の温度制御は有効である。 Also a plurality of types of nucleic acid in case of hybridization with one of the probes, highly accurate temperature control as described above is effective. 【0020】温度を制御するための加熱及び/又は冷却手段としては特に限定されず、例えば、ヒーター、加熱素子、空冷ファン、冷却素子、熱電変換素子等を単独又は組み合わせて用いる方法等が挙げられる。 [0020] is not particularly restricted but includes heating and / or cooling means for controlling the temperature, for example, a heater, heating element, cooling fan, and cooling element, a method of using a thermoelectric conversion element or the like alone or in combination is . なかでも、 Among them,
熱電効果を有する熱電変換材料を含む熱電変換素子は、 Thermoelectric conversion element including the thermoelectric conversion material having a thermoelectric effect,
その電流の向きを調節することで加熱と冷却を行うこと可能であるため、ハイブリダイゼーション温度を精密かつ迅速に制御することができ好ましい。 Since possible it for cooling and heating by adjusting the direction of the current, preferably it is possible to control the hybridization temperature precisely and quickly. また、熱電変換素子を用いることにより、装置全体の簡素化及び小型化も可能となる。 Moreover, by using the thermoelectric conversion element, it is possible also simplified and miniaturization of the entire apparatus. かかる熱電変換素子としては、例えば、 Such a thermoelectric conversion element, for example,
Bi、Te、Se及びSb元素からなる群より選択された少なくとも2種類以上の元素を含有する合金に適当なドーパントを添加したP型あるいはN型熱電変換素子及びそれらをモジュール化した、いわゆるペルチェ素子が挙げられる。 Bi, Te, and P-type or N-type thermoelectric conversion elements and their modular adding suitable dopants to an alloy containing at least two or more elements selected from the group consisting of Se and Sb elements, so-called Peltier element and the like. また、これらの熱電変換素子を製造する方法としては、例えば、Bi、Te、Se又はSb粉末とドーパントを所定量秤量して粉末を混合、溶融し、得られた合金塊を粉砕して合金粉末とした後、焼結させる方法等が挙げられる。 These as a method for producing a thermoelectric conversion element, for example, Bi, Te, Se or Sb powder and a dopant in a predetermined amount is weighed mixed powder is melted, and grinding the resulting alloy ingot alloy powder after a method for sintering and the like. 【0021】また、温度を制御するための温度を測定する手段としては特に限定されず、例えば、サーミスタ、 Further, no particular limitation is imposed on the means for measuring the temperature for controlling the temperature, for example, a thermistor,
熱電対、白金測温体等の温度検出素子を用いる方法等が挙げられる。 Thermocouple, and a method using a temperature detecting element such as platinum temperature detector and the like. なかでも、サーミスタを用いる方法が温度制御の厳密性の点で好ましい。 Among them, preferred from the viewpoint method using a thermistor of stringency temperature control. 【0022】ただし、熱電変換素子や温度検出素子は高価であることから、これらの素子は、温度制御型リアクターの外部表面を通して、流路に接するように設置することが好ましい。 [0022] However, since the thermoelectric conversion element and the temperature sensing element is expensive, these elements, through an external surface of the temperature-controlled reactor is preferably placed in contact with the flow path. これにより、リアクター部分を使い捨てにして、熱電変換素子や温度検出素子は再利用することができる。 Thus, the reactor part disposable, the thermoelectric conversion element and the temperature sensing element can be reused. 【0023】固定化するDNA又はRNAが2種類以上の塩基配列からなり、それぞれを分取又は分析する場合には、固定場所を2カ所以上に分けて、それぞれを異なる温度で制御できることが好ましい。 [0023] DNA or RNA immobilized consists of two or more nucleotide sequences, when collected each minute or analysis, divides a fixed location in two or more places, it is preferable to be controlled each at different temperatures. 種類の異なるプローブに対して、最適なハイブリダイゼーション温度を設定することにより、多種類の核酸の分析を精度良く実施できる。 Against different types of probes, by setting the optimum hybridization temperature, the analysis of many kinds of nucleic acids can be accurately performed. 【0024】また、サンプル中の核酸の分子量が大きくばらついていない場合、ハイブリダイゼーション温度が流路の上流から順に、高温から低温となるようにプローブを配置することが好ましい。 Further, if the molecular weight of the nucleic acid in the sample does not vary greatly, in order hybridization temperature from the upstream of the flow path, it is preferable to arrange the probe so that the low temperature from the high temperature. サンプルの核酸を熱変性し、それをハイブリダイゼーションする場合、流路の上流側がより高温であるため、マイクロリアクターにサンプルを流すと、まず最も上流側の核酸が固定化された位置で、最も高い温度で好適なハイブリダイゼーションが実施できる。 If the nucleic acid of the sample was thermally denatured, hybridized it, because the upstream side of the flow path is hotter, the flow samples in the microreactor, first at the most upstream side of the nucleic acid is immobilized position, the highest suitable hybridization temperature can be performed. 次に先程より下流で先程より低い温度で好適なハイブリダイゼーションを実施できる。 Then it can be carried out suitable hybridization at a temperature lower than the previous downstream than before. 逆に、ハイブリダイゼーション温度が低いプローブが、高いプローブより上流側に固定化されている場合、サンプル中の核酸の再変性が必要な場合や、ハイブリダイゼーション温度が低いプローブの固定化位置で誤検出が起こることがある。 Conversely, the hybridization temperature is lower probe, if it is immobilized higher probe upstream, when renaturation of nucleic acids in a sample is required and, erroneous hybridization temperature is immobilized position of the lower probe detection sometimes it occurs. 【0025】また、本発明の温度制御型マイクロリアクターは、流路内の多数の位置で温度を制御する際、時分割及び/又は領域分割で制御できることが好ましい。 Further, the temperature control microreactor of the present invention, when controlling the temperature in multiple locations in the flow path, it is preferred that can be controlled by dividing and / or area division time. 流路上の多数の核酸固定化位置について温度制御を行う場合、各位置で制御系を準備することは、コスト面で不経済である。 When performing temperature control for a large number of nucleic acid-immobilized position of the flow path, providing a control system in each position, it is uneconomical in terms of cost. そのため、複数の位置それぞれに加熱及び/ Therefore, heating and to each of a plurality of positions /
又は冷却手段と温度検出素子を準備し、それを1つの温度制御装置により時分割で制御すること、又は、複数の位置それぞれに加熱及び/又は冷却手段を準備し、それを1つの温度検出素子と1つの温度制御装置により領域分割で制御することが好ましい。 Or cooling means and the temperature detecting element is prepared, it is controlled by time division so that one of the temperature control device, or, to prepare a heating and / or cooling means to a plurality of positions, one temperature sensing element it When it is desirable to control the region divided by one of the temperature control device. 【0026】図1に本発明の温度制御型マイクロリアクターの一実施態様を示す模式図を示した。 [0026] shows a schematic diagram showing one embodiment of a temperature control microreactor of the present invention in FIG. 基材5としては特に限定されず、ガラス、セラミックス等の無機物; It is not particularly restricted but includes substrate 5, glass, inorganic materials such as ceramics;
ポリメチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン等のプラスッチックスを含む有機化合物;金属等からなるものが挙げられる。 Polymethyl methacrylate, an organic compound containing a positive Tsu Chicks such as polydimethylsiloxane; made of metal. なかでも、リサイクル性を考慮するならば、ガラス、熱可塑性プラスチックス又は金属からなるものが好ましく、加工性を考えるならばプラスチックスからなるものがより好ましい。 Among them, if considering recyclability, glass, made of thermoplastic plastics or metals are preferred, those made of plastic if considering the workability is more preferable. 温度を調整するための素子等は、公知の技術を用いて作製したものを基板5 Element or the like for adjusting the temperature, the substrate a disk produced by a known technique 5
上に固定、又は、基板上に直接形成、又は、図2に示したように別の基板上に固定又は形成する。 Fixed to the upper, or formed directly on the substrate, or to fixed or formed on another substrate, as shown in FIG. 【0027】上記基材5上には、サンプルを流すための流路4が形成されている。 [0027] On the substrate 5, a flow path 4 for supplying a sample are formed. 上記流路4の断面積としては特に限定されないが、1mm 2以下であることが好ましい。 No particular limitation is imposed on the cross-sectional area of the flow path 4, it is preferably 1 mm 2 or less. 1mm 2を超えると、流路の温度制御が困難になることがある。 Exceeds 1 mm 2, the temperature control of the flow path may be difficult. より好ましくは0.09mm 2以下である。 More preferably 0.09 mm 2 or less. 【0028】上記基材5上に流路4を形成する方法としては、基材5の材質と流路の大きさ、要求される加工精度にもよるが、例えば、レーザー加工、感光ガラス材料のフォトマスクを介した露光、フォトリソグラフィーとエッチング、原子線エッチング、プラスチック加工で汎用される射出成形等の成形技術、予め流路形状を形成した基材の積層等が挙げられる。 [0028] As a method for forming a flow path 4 on the substrate 5, the material and the flow passage of the size of the substrate 5, depending on the required processing accuracy, for example, laser processing, the photosensitive glass material exposure through a photomask, photolithography and etching, atomic beam etching, molding techniques such as injection molding, which is generally used in plastics processing, and lamination etc. beforehand flow channel shape to form the substrate. これらの技術により、平面のみならず立体的な流路構造も形成できる。 These technologies, three-dimensional flow path structure not plane only can be formed. 【0029】本発明は、上述のように主として微細加工技術で流路を形成する。 [0029] The present invention forms a flow path primarily microfabrication techniques, as described above. そのため、サンプルに対する固定化DNA又はRNAの接触面積を非常に大きくとることが可能であり、単位面積当たりの分析能力が極めて高い。 Therefore, it is possible to take a very large contact area of ​​the immobilized DNA or RNA to the sample, a very high analytical capacity per unit area. また、本発明の特徴である温度制御も容易かつ極めて正確に行うことができる。 The temperature control is also easy and is a feature of the present invention can be very accurately performed it. 更に、形成できる流路の形状も制限されないので、他のリアクターとの複合化による分析作業全体の迅速化、簡便化、流路途中に分岐を設けてサンプルの一部を分取し、同時並行で他の分析作業を行うこと等も可能である。 Furthermore, the shape of the formed can flow passage is also not limited, faster overall analysis work by complexing with other reactors, simplify, some of the samples aliquoted provided a branch in the middle flow channel, concurrently in that for performing other analytical work it is possible. 【0030】流路が形成された基板は、サンプルを流路で移動させる手段、例えばシリンジポンプを利用した液の圧送等、流路の密閉が必要な場合、別の基板と貼り合せる等することが好ましい。 The flow channel substrate formed with the means for moving the sample in the flow channel, for example, pumping, etc. of the liquid using the syringe pump, when sealing of the channel is required, to such bonding to another substrate It is preferred. 【0031】本発明の温度制御型マイクロリアクターの大きさは特に限定されないが、マイクロリアクターとしてのハンドリング性を考慮すると1000cm 3以下であることが好ましい。 The magnitude of the temperature control microreactor of the present invention is not particularly limited, is preferably 1000 cm 3 or less considering the handling property as a microreactor. 【0032】本発明の温度制御型マイクロリアクターの対象となるサンプルとしては、微生物、動物(ヒト等)、植物、ウイルス等の自然界から入手できるDNA [0032] As a sample to be temperature controlled microreactor of the present invention, DNA available microorganisms, animals (such as human), plant, from nature, such virus
又はRNAのみならず、DNA合成装置により合成されたもの、DNA又はRNAに各種修飾(ビオチン化、チオール化、メチル化、蛍光色素付加等)を行ったものを含む溶液又は液滴が挙げられる。 Or not only RNA, were synthesized by DNA synthesizer, various modifications in the DNA or RNA (biotinylated, thiol, methylation, fluorescent dye addition and the like), and the solution or droplets including those performed. 溶液等には、サザンブロッティング(Southern Blotting) The solution or the like, Southern blotting (Southern Blotting)
で汎用されるSSC液(クエン酸−塩化ナトリウム水溶液)のような無機塩類、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤、ポリエチレングリコールのような有機化合物が含まれていてもよい。 In SSC solution to be universal - inorganic salts, such as (citric acid aqueous sodium chloride solution), surfactant such as sodium dodecyl sulfate, may contain organic compounds such as polyethylene glycol. これらにより、ハイブリダイゼーションの精度を調整することができる。 Accordingly, it is possible to adjust the accuracy of the hybridization. サンプルとして、ヒト由来又はそれと塩基配列が同じ核酸を用いる場合には、本発明の温度制御型マイクロリアクターはヒトの遺伝子配列の分析、例えば遺伝子診断、1塩基置換変異多型(SNPs)分析に用いることができる。 As a sample, when the human or the nucleotide sequence using the same nucleic acid, the temperature-controlled microreactor of the present invention is the analysis of human gene sequences, used for example genetic diagnosis, single base substitution mutation form of single nucleotide polymorphisms (SNPs) analysis be able to. またサンプルが微生物由来の16SリボソームRNAを含む場合には、それと相補的なDNA又はRNAを固定化することにより、微生物の同定も可能となる。 Further, when the sample contains a 16S ribosomal RNA from microorganisms, therewith by fixing the complementary DNA or RNA, the identification of microorganisms is also possible. 【0033】ただし、サンプルとなる核酸が2本鎖又は3本鎖のように1本鎖以外の場合には、熱変性等によりサンプルの核酸を1本鎖に変性させてから試験に供することが検出感度向上の為に好ましい。 [0033] However, when nucleic acid as a sample of non-single-stranded as double-stranded or triple-stranded, it can be subjected to the test after the nucleic acid sample is denatured to single strands by heat denaturation, etc. It preferred for the detection sensitivity improvement. 【0034】このように、本発明の温度制御型マイクロリアクターは、土圏、水圏等の環境中に存在する微生物、ウイルス等が有する各個体・生物種の核酸分析、又は微生物群等の生物相全体を対象とした核酸分析、人間を含む動物、植物等に関する各固体・生物種の核酸分析に使用することができる。 [0034] Thus, the temperature-controlled microreactor of the present invention, the soil area, microorganisms present in the environment of the hydrosphere, etc., each individual-species of the nucleic acid analysis with the virus or the like, or microorganisms such as biota the whole target nucleic acid analysis, it is possible to use an animal, including humans, to each solid-species of the nucleic acid analysis plants like. 【0035】本発明の温度制御型マイクロリアクターの1実施態様として、本発明の温度制御型マイクロリアクターを用いた核酸の分取の方法を、図3を用いて説明する。 [0035] As one embodiment of the temperature control microreactor of the present invention, the preparative methods of nucleic acid using a temperature-controlled microreactor of the present invention will be described with reference to FIG. この温度制御型マイクロリアクターには、7、8、 The temperature control microreactor, 7,8,
9の3種の異なる塩基配列を有するプローブが固定化されている。 Probes with 3 different base sequence of 9 are immobilized. そして各プローブの塩基配列は、制限酵素E The nucleotide sequence of each probe, restriction enzyme E
coRIで一箇所消化することができる。 It can be digested one place in coRI. この例では8 In this example 8
の塩基配列を有する核酸を分取したいものとする。 And what you want to preparative nucleic acid having a base sequence. 【0036】操作は、まずこの温度制御型マイクロリアクターにサンプルを流し、固定化された核酸にサンプル中の核酸をハイブリダイゼーションさせる。 The operation is first flushed with sample temperature control microreactor, the nucleic acids in the sample are hybridized to the immobilized nucleic acid. そして洗浄を行った後、温度制御型マイクロリアクターの液温を4 And after washing, the liquid temperature of the temperature controlled microreactor 4
℃まで下げる。 ℃ down to. 次に制限酵素EcoRI及び酵素反応に必要な物質を含む溶液をリアクター中に満たす。 Satisfying a solution containing the following substances necessary for restriction enzymes EcoRI and the enzyme reaction in the reactor. このときもリアクターの液温は4℃で維持する。 The liquid temperature is also the reactor at this time is maintained at 4 ° C.. そして8の塩基配列を有するプローブの位置の温度のみを、制限酵素が働く37℃に上昇させる。 Then only the temperature of the position of the probe having the nucleotide sequence of 8, is raised to 37 ° C. the restriction enzyme acts. 37℃はハイブリダイゼーションが外れることがない一方で、制限酵素には至適な温度である。 The 37 ° C. While never hybridization is out, the restriction enzyme is an optimum temperature. そのため、この位置において、制限酵素消化が起こる。 Therefore, in this position, restriction enzyme digestion to occur. それに対して流路の他の場所では、温度が低すぎて制限酵素による消化は起こらない。 Elsewhere it against the flow path, digestion with restriction enzymes the temperature is too low will not occur. 一定時間後、8の塩基配列を有するプローブの位置の温度を4℃ After a certain time, 4 ° C. The temperature of the position of the probe having the nucleotide sequence of 8
に戻した後、リアクター内の液を採取する。 After returning to, to collect the liquid in the reactor. このとき消化が起こった位置のみ核酸が基板から外れているので、 Since nucleic acid only position digestion occurred at this time it is out of the substrate,
特定の核酸のみを回収することができる。 It can be recovered only specific nucleic acid. 【0037】また、上述の核酸の分取方法の改良として、固定化の際に、隣接するプローブ同士は異なる制限酵素で消化するように塩基配列を設計する方法が挙げられる。 Further, as an improvement of the preparative methods described above for nucleic acid, when immobilized, the probe Adjacent include a method of designing a nucleotide sequence as digested with different restriction enzymes. これにより作業者の予期しない位置で消化が起こる事を防げる。 This prevents that the digestion takes place in the unexpected position of the worker. また核酸の分取方法の他の例として、それぞれ異なる制限酵素で消化可能なプローブを固定化する方法も挙げられる。 As another example of the preparative method of nucleic acids, a method of immobilizing a digestible probes with different restriction enzymes, respectively. 【0038】次に、本発明の温度制御型マイクロリアクターの1実施態様として、本発明の温度制御型マイクロリアクターを用い、特定の核酸配列をポリメラーゼチェインリアクション法(PCR法)を用いて増幅、分取する方法を、図4を用いて説明する。 Next, as one embodiment of temperature controlled microreactor of the present invention, using a temperature-controlled microreactor of the present invention, amplification of specific nucleic acid sequences using the polymerase chain reaction method (PCR method), minutes the method of preparative will be described with reference to FIG. この温度制御型マイクロリアクターには、10、11、12、13の4種の異なる塩基配列を有するプローブが固定化されている。 The temperature-controlled microreactor probe with four different nucleotide sequences of 10, 11, 12 and 13 are immobilized.
そして各プローブの塩基配列は、制限酵素EcoRIで一箇所消化することができる。 The nucleotide sequence of each probe may be one place digested with the restriction enzyme EcoRI. そして、10、11、1 Then, 10,11,1
3のプローブは全く重ならないように固定化されているのに対して、11と12のプローブは同じ位置に固定化され、サンプル中の同じ核酸を標的にしているものとする。 Whereas 3 of the probe is immobilized so as not to overlap at all, the probes 11 and 12 are fixed to the same position, the same nucleic acid in a sample assumed to be a target. ただし、11の塩基配列を有するプローブはサンプルの核酸の(+)鎖(又はセンス鎖)にハイブリダイゼーションするのに対して、12の塩基配列を有するプローブは(−)鎖(又はアンチセンス鎖)にハイブリダイゼーションし、11の塩基配列を有するプローブと12 However, the probe having a probe whereas hybridize to (+) strand (or a sense strand) of a nucleic acid sample, 12 nucleotide sequence of which has a nucleotide sequence of 11 (-) strand (or antisense strand) hybridized to the probe and 12 having the nucleotide sequence of 11
の塩基配列を有するプローブとはハイブリダイゼーション温度が異なり、11の塩基配列を有するプローブのハイブリダイゼーション温度の方が高いものとする。 The probe having a base sequence different hybridization temperature, it is assumed that the higher hybridization temperature of the probe having the nucleotide sequence of 11. この例では11の塩基配列を有するプローブとハイブリダイゼーションするサンプルを増幅、分取したいものとする。 In this example amplification Sample probe and hybridizable with the nucleotide sequence of 11, it is assumed to be collected. 【0039】操作は、まずこの温度制御型マイクロリアクターにサンプルを流し、固定化されたプローブにサンプル中の核酸をハイブリダイゼーションさせる。 The operation is first flushed with sample temperature control microreactor, the nucleic acids in the sample are hybridized to the immobilized probe. このとき同じ位置に固定化されたの11及び12の塩基配列を有するプローブは、11の塩基配列を有するプローブのハイブリダイゼーション温度に合わせれば、11の塩基配列を有するプローブのみハイブリダイゼーションを行うことができる。 In this case the probe having the nucleotide sequence of the 11 and 12 of immobilized same position, combined in the hybridization temperature of the probe having the nucleotide sequence of 11, is possible to perform hybridization only probes having the nucleotide sequence of 11 it can. そして洗浄を行った後、温度制御型マイクロリアクターの液温を4℃まで下げる。 Then after washing, reducing the liquid temperature of the temperature control microreactor to 4 ° C.. 次に制限酵素EcoRI及びPCR用酵素、酵素反応又はPCR反応の実施に必要な物質を含む溶液を温度制御型マイクロリアクター中に満たす。 Then the restriction enzymes EcoRI and PCR enzyme, satisfies the solution containing the substances necessary for implementation of an enzyme reaction or the PCR reaction in a temperature-controlled microreactor. このときもリアクターの液温は4℃で維持する。 The liquid temperature is also the reactor at this time is maintained at 4 ° C.. そして11の塩基配列を有するプローブ及び12の塩基配列を有するプローブが固定化された位置の温度を制限酵素が働く37℃に上昇させる。 The 11 probes having the nucleotide sequence of the probe and 12 having the nucleotide sequence raises to 37 ° C. which acts restriction enzyme the temperature of the immobilized position of. これにより固定化されていた11及び12の塩基配列を有するプローブは基板から外れ、これらはPCR反応でのプライマー及び鋳型として使用される。 Thus the probe is disengaged from the substrate having the nucleotide sequence of the 11 that had been immobilized and 12, which are used as primers and template for PCR reactions. 次に11及び12 Then 11 and 12
の塩基配列を有するプローブの位置の温度をPCR反応が起こる温度に上昇させる。 The temperature of the position of the probe having the nucleotide sequence of raising the temperature at which occurs the PCR reaction. 流路の他の場所では、温度が低すぎてPCR反応は起こらない。 In other places in the flow path, PCR reaction temperature is too low will not occur. PCR反応の反応サイクル終了後、液温を4℃に戻した後、リアクター内の液を採取する。 After the reaction cycle end of the PCR reaction, after returning the liquid temperature at 4 ° C., and collecting the liquid in the reactor. このとき消化が起こった位置のみプローブが基板から外れているので、特定の核酸のみ回収することが可能である。 At this time the probe only digestion has occurred position is out of the substrate, it is possible to recover only the specific nucleic acid. 【0040】また、上述の本発明の温度制御型マイクロリアクターを用い、特定の核酸配列をポリメラーゼチェインリアクション法(PCR法)を用いて増幅、分取する方法の改良として、サンプル中の特定の核酸とハイブリダイゼーションするプローブとPCR反応のプライマーとなる核酸とを、別の制限酵素で消化可能なように設計する方法等も挙げられる。 Further, using a temperature-controlled microreactor of the present invention described above, amplification of specific nucleic acid sequences using the polymerase chain reaction method (PCR method), as an improvement of a method for fractionation, a particular nucleic acid in a sample and a nucleic acid as a primer probe and PCR reactions that hybridization method designed to allow digestion with a different restriction enzymes and the like can be mentioned. これによりPCR反応のプライマー濃度をより厳密に制御することが可能である。 This makes it possible to control the primer concentrations of the PCR reaction more closely. 【0041】本発明の温度制御型マイクロリアクターを用いてなることを特徴とするマイクロリアクターシステムもまた、本発明の1つである。 Microreactor system characterized by using a temperature-controlled microreactor [0041] The present invention is also one of the present invention. 本発明のマイクロリアクターシステムは、本発明の温度制御型マイクロリアクターと周辺機器とからなる。 Microreactor system of the present invention consists of a temperature controlled microreactor and peripherals present invention. 上記周辺機器としては、温度制御型マイクロリアクター内でサンプルを移動させる装置(以下、移動装置ともいう)、温度制御型マイクロリアクターを通過した液を回収する装置(以下、回収装置ともいう)、固定化したプローブにハイブリダイゼーションしたサンプルを検出する装置(以下、検出装置ともいう)等が挙げられる。 As the peripheral devices, apparatus for moving the sample in a temperature controlled microreactor (hereinafter, also referred to as a mobile device), a device for collecting the liquid passing through the temperature-controlled microreactor (hereinafter, also referred to as a recovery device), the fixed apparatus for detecting a sample hybridized to a probe made into (hereinafter, also referred to as a detector), and the like. なお、本発明の温度制御型マイクロリアクターは、他のマイクロリアクター、例えばPCR用マイクロリアクターと組み合わせる、又は、同じ基板上に集積して使用することができる。 The temperature control microreactor of the present invention, other microreactor, for example combined with PCR microreactor, or can be used in integrated on the same substrate. 【0042】上記移動装置としては、例えば、脈流が起こらない利点を有するシリンジポンプ、実験室内のみならず現場持ち込みが容易なエアポンプ、サンプル移動制御が容易な電気泳動を行うための電極及び電源等が挙げられる。 [0042] As the mobile device, e.g., a syringe pump has the advantage that pulsating does not occur, the field bringing easy air pump not laboratory only, electrodes for sample movement control makes easy electrophoresis and power, etc. and the like. 上記回収装置としては、例えば、液体クロマトグラフィー等で汎用されるオートサンプラー等が挙げられる。 Examples of the recovery system, for example, autosampler and the like which are commonly used in liquid chromatography. 上記検出装置としては、例えば、PCR用のサーマルサイクラー、表面プラズモン共鳴装置、熱レンズ顕微鏡、質量分析装置、紫外線分光光度計、蛍光スキャナー等が挙げられる。 As the detection device, e.g., a thermal cycler for PCR, surface plasmon resonance device, a thermal lens microscope, mass spectrometer, ultraviolet spectrophotometer, a fluorescence scanner, and the like. 【0043】また、本発明のマイクロリアクターシステムは、温度制御型マイクロリアクターと同一基板上又は別個に2本鎖又は3本鎖の核酸からなるサンプルを熱変性させて1本鎖にする装置を有することが好ましい。 [0043] Further, the microreactor system of the present invention comprises a device for the sample of temperature controlled microreactor same substrate or with separate double-stranded or triple stranded nucleic acid into single strands by heat denaturation it is preferable. この装置を別個に設ける場合、サンプルを予め加熱して、 If the device is provided separately, by heating the sample in advance,
2本鎖等を1本鎖に変性させた後、氷水等で急冷する装置等が挙げられる。 After denaturing the double-stranded and the like into single strands, and a device such as quenching with ice water or the like. また、この操作を温度制御型マイクロリアクターと同一基板上で行う場合には、プローブが固定化されている位置よりサンプル注入側に近い場所で、流路内を変性温度とする方法等が挙げられる。 Further, when performing this operation in a temperature-controlled microreactor over the same substrate, the probe is in location near the sample injection side of the position is fixed, and a method of the flow path and the modified temperature . 【0044】上記変性の温度としては、サンプルの核酸の塩基配列により異なるが、好ましくは90℃、より好ましくは95℃以上である。 [0044] As the temperature of the modified varies by the base sequence of a nucleic acid sample, preferably 90 ° C., more preferably 95 ° C. or higher. 90℃未満であると、サンプルの核酸の変性が不充分となるため、検出感度が大幅に低下する場合が多い。 If it is less than 90 ° C., since the denaturation of the nucleic acid of the sample is insufficient, it is often the detection sensitivity is greatly reduced. ただし、温度制御型マイクロリアクターと同一基板上で変性を行う際には、変性に伴う加温のため、それまでサンプル溶液に溶解していた空気等がリアクター内で気化し、ハイブリダイゼーションを阻害することがある。 However, when performing denaturation at a temperature controlled microreactor over the same substrate, for heating due to denaturation, such as air dissolved in the sample solution is vaporized in the reactor and inhibit hybridization so far Sometimes. そのためサンプル溶液は加温前に予め脱気を行う事が好ましい。 Therefore the sample solution is preferably performed in advance degassed before heating. 脱気の方法としては特に限定されず、例えば、真空脱気、超音波脱気、加熱脱気等の公知の方法が挙げられる。 Is not particularly limited as degassing method, for example, vacuum degassing, ultrasonic degassing, include known methods such as heating deaeration. 【0045】上述のような各装置を組み合わせることにより、本発明のマイクロリアクターは、屋内で用いる以外にも、分析を必要とする現場に持ち込む形態をとることができる。 [0045] By combining the apparatus as described above, the microreactor of the present invention, in addition to use indoors can also take the form to bring the scene that requires analysis. 【0046】本発明の温度制御型マイクロリアクター及びマイクロリアクターシステムを用いることにより、従来に比べて高い感度で分析を行うことができる。 [0046] By using the temperature-controlled microreactors and microreactor system of the present invention can be analyzed with high sensitivity as compared with the prior art. これは従来法では試料量の問題で測定できなかったものについても、分析対象とすることが可能となることを意味する。 This for those that could not be measured in a sample of problems in the conventional method also means that it is possible to be analyzed. また、特定流路に液を流す工程が基本であることから、自動化が容易である。 Further, since the step of flowing the liquid to a particular passage is fundamental, it is easy to automate. これは分析作業の効率化及び省力化を実施する為に有用である。 This is useful for implementing the efficiency and labor saving of analytical work. 【0047】また、分析対象として、例えば、下水処理場の活性汚泥中の微生物種の分析を行う場合には、処理能力の向上やバルキング防止等の効果を期待できる。 Further, as the analyte, for example, in the case of microbial species analysis in activated sludge sewage treatment plant it can be expected the effect of improvement and bulking prevention of capacity. 同様に、バイオレメディエーション施工地で土壌中の微生物の動態を解析することに利用すれば、施工の効果的実施や期間の短縮を図ることができる。 Similarly, it can be utilized to analyze the dynamics of microorganisms in soil bioremediation construction locations, shorten the effective implementation and duration of the construction. このことはバイオレメディエーション技術の有用性を高める。 This can enhance the utility of the bioremediation technique. 【0048】またヒト遺伝子のSNPs分析等遺伝子診断に用いた場合には、誤診が少ない検査となるので、診断の有用性を高めることができる。 [0048] In the case of using the SNPs analysis such genetic diagnosis of the human gene, so misdiagnosis is small inspection, it is possible to enhance the usefulness of the diagnosis. 【0049】本発明の温度制御型マイクロリアクター及びマイクロリアクターシステムを用いれば、核酸の分析のみならず、特定の核酸を分取することも可能である。 With the temperature controlled microreactor and microreactor system [0049] The present invention, not only the analysis of nucleic acids, it is also possible to retrieve the specific nucleic min.
分取された核酸は也の分析に使用可能であるので、本装置は核酸を用いた研究開発の効率化に有用である。 Since fractionated nucleic acid can be used to analyze ya, the apparatus is useful for efficient research using nucleic acid. 【0050】 【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 [0050] EXAMPLES While in working examples illustrate the present invention in further detail below, the present invention is not limited to these examples. 【0051】(実施例1)(1)DNAの固定化カバーガラス(長さ76mm、幅26mm、厚さ0.0 [0051] (Example 1) (1) Immobilization cover glass (length 76mm of DNA, width 26 mm, thickness 0.0
8mm)にクロロホルム及び0.1M塩酸を垂らした。 It hung down chloroform and 0.1M hydrochloric acid 8 mm).
次に、このカバーガラスに、NH 4 OH/H 22 /H 2 Then, this cover glass, NH 4 OH / H 2 O 2 / H 2 O
溶液(重量比1:1:5)を垂らし、更に、HCl/H Solution (weight ratio 1: 1: 5) hanging, further, HCl / H
22 /H 2 O溶液(重量比1:1:5)を垂らした。 2 O 2 / H 2 O solution (weight ratio 1: 1: 5) was hung down. 次に、このカバーガラスに2%γ−アミノプロピルトリエトキシシラン(以下、APTESともいう)−トルエン溶液を垂らして、24hr室温で放置した。 Then, 2% .gamma.-aminopropyltriethoxysilane to the cover glass (hereinafter, also referred to as APTES) - hanging the toluene solution was allowed to stand at 24hr at room temperature. 次に、このカバーガラスに1%無水マレイン酸−クロロホルム溶液を垂らし、更に、0.2MN−エチル−N'−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド(以下、EDC)と0.05MN−ヒドロキシサクシンイミド混合溶液を垂らした。 Then, 1% maleic anhydride to the cover glass - hanging chloroform solution, further, 0.2MN- ethyl -N '- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (hereinafter, EDC) and 0.05MN- hydroxy succinimide mixed solution was hanging. 次に、このカバーガラスに1Mエタノールアミン塩酸塩水溶液(pH9)を垂らした。 Next, it hung down a 1M ethanolamine hydrochloride solution to this cover glass (pH 9). そして次に、このカバーガラスに配列1の5' And then 5 array 1 to the cover glass'
末端チオール基修飾合成DNAを垂らした。 It was dropped on terminal thiol group-modified synthetic DNA. 最後に一昼夜室温で室温放置して合成DNAを固定化した。 Finally fixing the synthetic DNA is left at room temperature overnight at room temperature. 【0052】(2)温度制御型マイクロリアクターの作製カバーガラス(長さ76mm、幅26mm、厚さ0.0 [0052] (2) Temperature Preparation cover glass (length 76mm control microreactor, width 26 mm, thickness 0.0
8mm)に別のカバーガラス(長さ76mm、幅13m Another cover glass (length 76mm to 8 mm), width 13m
m、厚さ0.30mm)を2枚重ならないように載せて、2枚の間に厚さ0.15mmのガラスを挟んだ状態でクリップで固定し、シリコーンレジン(製品名:SR m, put so as not to overlap two sheets of thickness 0.30 mm), and fixed with a clip in a state of sandwiching the glass having a thickness of 0.15mm between two silicone resin (product name: SR
2410、東レダウコーニング社製)を滴下して接着した。 2410, was adhered by dropping the Toray manufactured by Dow Corning Co., Ltd.). 接着後、挟んだガラスを除くと、断面が凹状で上面は1本の溝のある厚さ0.38mmの長方体状の積層カバーガラスが得られた。 After bonding, except for the glass sandwiching cross section upper surface concave is cuboid-shaped laminated cover glass with a thickness of 0.38mm with a single groove is obtained. この積層カバーガラス上に、 In the laminated cover on the glass,
(1)で得られた合成DNAを固定したカバーガラスを積層し、これも同レジンで接着した。 The cover glass and the synthetic DNA were fixed obtained in (1) was laminated, which was also adhered by the resin. これにより流路が密閉され、内部にDNAが共有結合で固定化されたリアクターを作製できた。 Thereby the flow path is sealed, it was manufactured reactor DNA inside is covalently immobilized. なお流路径は、横幅0.15m It should be noted that the channel diameter, width 0.15m
m、深さ0.30mm、流路長さは76mmであった。 m, the depth 0.30 mm, the channel length was 76 mm.
また、固定化DNAが流路に露出している面積は1.5 The area of ​​immobilized DNA is exposed to the flow path is 1.5
mm 2であった。 It was mm 2. 【0053】(3)周辺機器のセット図5のように各機器を接続した。 [0053] (3) connecting the respective devices as set Figure 5 peripherals. 各機器は、市販のものを使用した。 Each device was used a commercially available. 【0054】(4)DNA検出実験沸騰させた滅菌済み蒸留水を用いて、ハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×De [0054] (4) using a sterile distilled water was DNA detection experiment boils, hybridization buffer (6 × SSC, 0.2% SDS, 5 × De
nhardt's溶液、50%ホルムアミド)を調製し、シリンジに注入した。 Nhardt's solution, 50% formamide) was prepared and injected into the syringe. このシリンジをポンプにセットし、流量0.5ml/hrで流した。 Set this syringe pump, it flowed at a flow rate of 0.5ml / hr. 同時にDNA変性ヒーターを95℃(サンプルに好ましい変性温度)、 95 ° C. The DNA denaturation heaters simultaneously (preferred denaturation temperature in the sample),
固定化部ヒーターを60.5℃(サンプルと固定化DN Immobilized DN fixing unit heater and 60.5 ° C. (Sample
Aに好適なハイブリダイゼーション温度)にセットして、流路を加熱した。 Set preferred hybridization temperature) to A, it was heated flow passage. 【0055】ポンプを一時停止し、500ngの配列2 [0055] to pause the pump, the sequence of 500ng 2
のDNA及び色素を含むサンプル緩衝液(6×SSC、 Sample buffer (6 × SSC containing DNA and dyes,
0.2%SDS、5×Denhardt's溶液、50 0.2% SDS, 5 × Denhardt's solution, 50
%ホルムアミド)3μlを配管内に注入した。 The% formamide) 3 [mu] l was injected into the pipe. その後、 after that,
ポンプを再び作動させた。 Pump was allowed to again operate. サンプルに含まれる色素がD Dye contained in the sample D
NA固定位置を通過した後、更に60分間緩衝液を流した。 After passing through the NA stationary position, further flushed for 60 minutes buffer. その後、固定化部のヒーターを95℃にセットし、 Then, set the heater of the fixing unit to 95 ° C.,
液回収部で溶出液を回収した。 Eluate was collected in the liquid collection portion. 【0056】回収したサンプルをテンプレートとして、 [0056] collected the sample as a template,
配列3及び配列4のプライマーを利用してPCR反応を実施した。 The PCR reaction was performed using primers of SEQ 3 and SEQ 4. そして通常のゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で検出した。 And detected by conventional gel electrophoresis and ethidium bromide staining. 得られたゲル電気泳動像を紫外線照射下暗所で目視にて観察し、以下の基準により検出強度を評価した。 The resulting gel electrophoresis image was visually observed in the dark under ultraviolet irradiation was evaluated detected intensity by the following criteria. ◎:強い染色による検出〇:弱い染色による検出×:染色による検出なし結果を表1に示した。 ◎: detection by strong staining 〇: detection by weak staining ×: None detection by staining results are shown in Table 1. 【0057】(比較例1)(1)DNAの固定化及びD [0057] (Comparative Example 1) (1) immobilization and D of DNA
NAチップの作製実施例1と同様の方法により、配列1のチオール基修飾合成DNAをカバーガラス(長さ26mm、幅26m In the same manner as in Production Example 1 of NA chip, array 1 of thiol group-modified synthetic DNA cover glass (length 26 mm, width 26m
m、厚さ0.08mm)の中央に固定化した。 m, was immobilized to the center of thickness 0.08 mm). 固定面積は1.5mm 2とした。 Fixed area was 1.5 mm 2. 次に、DNAを固定化した部分の周囲、面積12mm 2 (3×4mm、実施例1の流路面積と同等)部分を残して、カバーガラスを厚さ0.3 Then, around the portion of immobilized DNA, the area 12 mm 2 leaving the (3 × 4 mm, the flow passage area equivalent to Example 1) portion, the thickness of the cover glass is 0.3
mmの樹脂フィルムで覆った。 Covered with a resin film of mm. 【0058】(2)DNA検出実験500ngの配列2のDNAを含むサンプル緩衝液(6 [0058] (2) Sample buffer containing sequences 2 of DNA of a DNA detection experiments 500 ng (6
×SSC、0.2%SDS、5×Denbardt's × SSC, 0.2% SDS, 5 × Denbardt's
溶液、50%ホルムアミド)3μlを固定化DNA上に滴下した後、リアクターの上部を別のカバーガラスで塞いだ(カバーガラスで樹脂フィルムを挟み込む状態)。 The solution was added dropwise onto immobilized DNA 50% formamide) 3 [mu] l, closes the top of the reactor in a separate cover glass (the state sandwiching the resin film with a cover glass).
これを95℃のペルチェ素子上にセットした。 This was set on the Peltier element 95 ° C.. 10秒間加熱した後、1分間で60.5℃まで冷却した。 After heating for 10 seconds, and cooled to 60.5 ° C. for 1 minute. 次いで、リアクターの上部のカバーガラスを外し、チップ上の液を取り除いた。 Then, remove the cover glass of the top of the reactor to remove the liquid on the chip. 次にハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×Denhard Then hybridization buffer (6 × SSC, 0.2% SDS, 5 × Denhard
t's溶液、50%ホルムアミド)を固定化DNA上に滴下した後、95℃で1分間加熱し、液を回収した。 t's solution, was added dropwise 50% formamide) immobilized on DNA, and heated for 1 minute at 95 ° C., was recovered liquid. 回収した液をテンプレートとして、配列3及び配列4のプライマーを利用してPCR反応を実施し、通常のゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で検出した。 The recovered liquid as a template, a PCR reaction was performed using primers of SEQ 3 and SEQ 4, detected by conventional gel electrophoresis and ethidium bromide staining. 得られたゲル電気泳動像を紫外線照射下暗所で目視にて観察し、実施例1と同様の基準により検出強度を評価した。 The resulting gel electrophoresis image was visually observed in the dark under ultraviolet irradiation was evaluated detected intensity by the same criteria as in Example 1.
結果を表1に示した。 The results are shown in Table 1. 【0059】 【表1】 [0059] [Table 1] 【0060】(実施例2)(1)DNAの固定化及びマイクロリアクターの作製実施例1と同様の方法により、配列1及び配列5の5' [0060] (Example 2) (1) in the same manner as Preparation Example 1 of DNA immobilization and microreactor, 5 sequence 1 and sequence 5 '
末端チオール基修飾合成DNAを図6のリアクターに固定化した。 The terminal thiol group-modified synthetic DNA was immobilized reactor of FIG. また、マイクロリアクターの作製についても、実施例1と同様に行った。 As for the manufacturing of the microreactor was carried out as in Example 1. 【0061】(2)周辺機器のセット図7のように各機器を接続した。 [0061] (2) connecting each device as set Figure 7 peripherals. 各機器は市販のものを使用した。 Each device was used commercially available ones. 【0062】(3)DNAの検出実験沸騰させた滅菌済み蒸留水を用いて、ハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×De [0062] (3) using a detection experiment boiled allowed the sterile distilled water DNA, hybridization buffer (6 × SSC, 0.2% SDS, 5 × De
nhardt's溶液、50%ホルムアミド)を調製し、シリンジに注入した。 Nhardt's solution, 50% formamide) was prepared and injected into the syringe. このシリンジをシリンジポンプにセットし、流量0.5ml/hrで流した。 Set this syringe into the syringe pump and flowed at a flow rate of 0.5 ml / hr. 同時にDNA変性ヒーターを95℃、ペルチェ素子(高温側) 95 ° C. The DNA denaturation heaters simultaneously, the Peltier element (high temperature side)
を61.0℃、ペルチェ素子(低温側)を60.7℃にセットして、流路を加熱した。 The 61.0 ° C., then set the Peltier element (low temperature side) to 60.7 ° C., was heated flow passage. この時、ペルチェ素子の温度は各サーミスタで制御し、流路温度は流路温度検出素子で測定した。 At this time, the temperature of the Peltier element is controlled by the thermistors, the channel temperature is measured at the channel temperature detecting element. 【0063】ポンプを一時停止し、配列2及び配列6のDNAを各々500ngと色素を含むサンプル緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×Denhard [0063] pump to pause, SEQ sample buffer (6 × SSC, each containing 500ng and dye 2 and DNA sequence 6, 0.2% SDS, 5 × Denhard
t's溶液、50%ホルムアミド)3μlを配管内に注入した。 t's solution, was injected 50% formamide) 3 [mu] l in the pipe. その後、ポンプを再び作動させた。 Thereafter, the pump is again operated. サンプルに含まれる色素がDNA固定位置を通過した後、更に60 After dye contained in the sample has passed the DNA fixed position, an additional 60
分間緩衝液を流した。 Minutes buffer shed. その後、まず低温側ペルチェ素子を95℃にセットし、ハイブリダイゼーションしたDN Then, first set the low-temperature side Peltier element 95 ° C., hybridized DN
Aを回収した。 It was collected A. 次に高温側ペルチェ素子を95℃にセットし、ハイブリダイゼーションしたDNAを回収した。 Then set the high temperature side Peltier element 95 ° C., was recovered hybridized DNA. 【0064】低温側ペルチェの回収液をテンプレートとして、配列3及び配列4のプライマーを利用してPCR [0064] The recovering solution of the low-temperature side Peltier as a template, using primers of SEQ 3 and SEQ 4 PCR
反応を実施した。 The reaction was carried out. また、それとは別個に、配列7及び配列8のプライマーを利用してPCR反応を実施した。 Furthermore, separately from that, the PCR reaction was performed using primers of SEQ 7 and SEQ 8. また高温側ペルチェの回収液をテンプレートとして、配列7及び配列8プライマーを利用して、PCR反応を実施した。 As template recovery liquid on the high temperature side Peltier utilizes sequence 7 and sequence 8 primers, PCR was performed. また、それとは別個に、配列3及び配列4のプライマーを利用してPCR反応を実施した。 Furthermore, separately from that, the PCR reaction was performed using primers of SEQ 3 and SEQ 4. この各々について通常のゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で検出した。 This respectively detected by conventional gel electrophoresis and ethidium bromide staining. 得られたゲル電気泳動像を紫外線照射下暗所で目視にて観察し、以下の基準により検出強度を評価した。 The resulting gel electrophoresis image was visually observed in the dark under ultraviolet irradiation was evaluated detected intensity by the following criteria. 〇:検出あり×:検出なし結果を表2に示した。 ○: Detection Yes ×: None detection results are shown in Table 2. 【0065】 【表2】 [0065] [Table 2] 【0066】(実施例3)(1)DNAの固定化及びマイクロリアクターの作製実施例1と同様の方法により、配列9及び配列10のチオール基修飾合成DNAを図8のリアクターに固定化した。 [0066] (Example 3) (1) In a similar manner as in Production Example 1 of DNA immobilization and microreactor was immobilized thiol group-modified synthetic DNA sequence 9 and sequence 10 in the reactor of FIG. また、マイクロリアクターの作製についても、実施例1と同様に行った。 As for the manufacturing of the microreactor was carried out as in Example 1. 【0067】(2)周辺機器のセット図9のように各機器を接続した。 [0067] (2) connecting each device to a set of peripherals Figure 9. 各機器は市販のものを使用した。 Each device was used commercially available ones. 【0068】(3)DNAの検出実験沸騰させた滅菌済み蒸留水を用いて、ハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×De [0068] (3) using a detection experiment boiled allowed the sterile distilled water DNA, hybridization buffer (6 × SSC, 0.2% SDS, 5 × De
nhardt's溶液、50%ホルムアミド)を調製し、シリンジに注入した。 Nhardt's solution, 50% formamide) was prepared and injected into the syringe. このシリンジをシリンジポンプにセットし、流量0.5ml/hrで流した。 Set this syringe into the syringe pump and flowed at a flow rate of 0.5 ml / hr. 同時にDNA変性用ペルチェ素子を95℃、ペルチェ素子(固定化部用)を66.0℃にセットして、流路を加熱した。 At the same time 95 ° C. The DNA denaturation Peltier element, sets Peltier element (for immobilization part) to 66.0 ° C., was heated flow passage. この時、ペルチェ素子の温度は各サーミスタで制御し、流路温度は流路温度検出素子で測定した。 At this time, the temperature of the Peltier element is controlled by the thermistors, the channel temperature is measured at the channel temperature detecting element. 【0069】ポンプを一時停止し、配列6のDNAを5 [0069] pump to pause, the DNA sequence 6 5
00mgと色素を含むサンプル緩衝液(6×SSC、 Sample buffer (6 × SSC containing 00mg and dyes,
0.2%SDS、5×Denhardt's溶液、50 0.2% SDS, 5 × Denhardt's solution, 50
%ホルムアミド)3μlを配管内に注入した。 The% formamide) 3 [mu] l was injected into the pipe. その後、 after that,
ポンプを再び作動させた。 Pump was allowed to again operate. 【0070】サンプルに含まれる色素がDNA固定位置を通過した後、更に60分間緩衝液を流した。 [0070] After the dye contained in the sample has passed the DNA fixed position, further flushed for 60 minutes buffer. 次に流路の温度を4℃にして、制限酵素ApaLI 10ユニット(宝酒造社製)、DNA増幅用酵素Takara T Next, with the temperature of the flow path 4 ° C., restriction enzymes ApaLI 10 units (manufactured by Takara Shuzo), DNA amplification enzyme Takara T
aq5ユニット(宝酒造社製)、及び、増幅溶液(10 aq5 unit (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the amplification solution (10
mMTris−HCl(pH8.2)、50mMKC mMTris-HCl (pH8.2), 50mMKC
l、1.5MMgCl 2 、0.05mMDTT(Dit l, 1.5MMgCl 2, 0.05mMDTT (Dit
hiothreitol)、0.2mM dATP、 hiothreitol), 0.2mM dATP,
0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2 0.2mM dTTP, 0.2mM dCTP, 0.2
mM dGTP)でリアクター内を置換した。 Was replaced in the reactor in mM dGTP). 【0071】置換後、ポンプの運転を停止し、固定化部のペルチェ素子を37℃にセットして酵素を15分間反応させた。 [0071] After the replacement, stop the operation of the pump, and set the Peltier element immobilization part in 37 ° C. reacting the enzyme for 15 min. そして固定化部のペルチェ素子を95℃1分間、61.0℃2分間、72.0℃3分間を1サイクルとして、20サイクル作動させた。 The 95 ° C. 1 minute Peltier elements of the fixed unit, 61.0 ° C. 2 min, one cycle between 72.0 ° C. 3 minutes to 20 cycling. そして最初の緩衝液を再び流して、増幅されたDNAを回収した。 The flowing first buffer again, to recover the amplified DNA. 回収したDNAは、通常のゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で検出した。 The recovered DNA was detected by conventional gel electrophoresis and ethidium bromide staining. 得られたゲル電気泳動像を紫外線照射下暗所で目視にて観察し、以下の基準により検出強度を評価した。 The resulting gel electrophoresis image was visually observed in the dark under ultraviolet irradiation was evaluated detected intensity by the following criteria. 〇:検出あり×:検出なし結果を表3に示した。 ○: Detection Yes ×: None detection results are shown in Table 3. 【0072】 【表3】 [0072] [Table 3] 【0073】(実施例4)(1)DNAの固定化及びマイクロリアクターの作製実施例1と同様の方法により、配列1及び配列5の5' [0073] (Example 4) (1) in the same manner as Preparation Example 1 of DNA immobilization and microreactor, 5 sequence 1 and sequence 5 '
末端チオール基修飾合成DNAを図10のリアクターに固定化した。 The terminal thiol group-modified synthetic DNA was immobilized to the reactor of FIG. 10. また、マイクロリアクターの作製についても、実施例1と同様に行った。 As for the manufacturing of the microreactor was carried out as in Example 1. このとき、図10のように切替装置を設置した。 At this time, it was installed switching device as shown in FIG. 10. この装置は、ペルチェ素子及びサーミスタと温度制御装置の間に設置され高温側と低温側のペルチェ素子の切り替え及び高温側と低温側のサーミスタの切り替えを行うものである。 This device is intended to switch the switching and hot and cold sides of the thermistor hot and cold sides of the Peltier element is disposed between the Peltier element and the thermistor and the temperature control device. 【0074】(2)周辺機器のセット図11のように各機器を接続した。 [0074] (2) connecting the respective devices as peripheral devices of the set 11. FIG. 各機器は市販のものを使用した。 Each device was used commercially available ones. 【0075】(3)DNAの検出実験沸騰させた滅菌済み蒸留水を用いて、ハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×De [0075] (3) using a detection experiment boiled allowed the sterile distilled water DNA, hybridization buffer (6 × SSC, 0.2% SDS, 5 × De
nhardt's溶液、50%ホルムアミド)を調製し、シリンジに注入した。 Nhardt's solution, 50% formamide) was prepared and injected into the syringe. このシリンジをポンプにセットし、流量0.1ml/hrで流した。 Set this syringe pump, it flowed at a flow rate of 0.1ml / hr. DNA変性ヒーターを95℃、ペルチェ素子(高温側)を61.0℃、 The DNA denaturation heater 95 ° C., a Peltier element (high temperature side) 61.0 ° C.,
ペルチェ素子(低温側)を60.7℃にセットした。 A Peltier element (lower temperature side) was set at 60.7 ° C.. 切り替え器は、1秒毎に高温側と低温側を切り替えるようにした。 Switch has to switch the hot and cold sides every second. 【0076】ポンプを一時停止し、配列2及び配列6のDNAを各々500ngと色素を含むサンプル緩衝液(6×SSC、0.2%SDS、5×Denbard [0076] pump to pause, SEQ sample buffer (6 × SSC, each containing 500ng and dye 2 and DNA sequence 6, 0.2% SDS, 5 × Denbard
t's溶液、50%ホルムアミド)3μlを配管内に注入した。 t's solution, was injected 50% formamide) 3 [mu] l in the pipe. その後、ポンプを再び作動させた。 Thereafter, the pump is again operated. 【0077】サンプルに含まれる色素がDNA固定位置を通過した後、更に60分間緩衝液を流した。 [0077] After the dye contained in the sample has passed the DNA fixed position, further flushed for 60 minutes buffer. その後、 after that,
まず低温側ペルチェ素子を95℃にセットし、ハイブリダイゼーションしたDNAを回収した。 First set cold side Peltier element 95 ° C., was recovered hybridized DNA. 次に高温側ペルチェ素子を95℃にセットし、ハイブリダイゼーションしたDNAを回収した。 Then set the high temperature side Peltier element 95 ° C., was recovered hybridized DNA. 【0078】低温側ペルチェの回収液をテンプレートとして、配列3及び配列4のプライマーを利用してPCR [0078] The recovering solution of the low-temperature side Peltier as a template, using primers of SEQ 3 and SEQ 4 PCR
反応を実施した。 The reaction was carried out. また、それとは別個に配列7及び配列8のプライマーを利用してPCR反応を実施した。 Further, a PCR reaction was performed using primers of different sequence-7 and SEQ 8 with it. また高温側ペルチェの回収液をテンプレートとして、配列7 As template recovery liquid on the high temperature side Peltier, sequence 7
及び配列8のプライマーを利用して、PCR反応を実施した。 And using primers of SEQ 8, a PCR reaction was performed. また、それとは別個に配列3及び配列4のプライマーを利用してPCR反応を実施した。 Further, a PCR reaction was performed using primers of separate sequences 3 and SEQ 4 with it. そして通常のゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で検出した。 And detected by conventional gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
得られたゲル電気泳動像を紫外線照射下暗所で目視にて観察し、以下の基準により検出強度を評価した。 The resulting gel electrophoresis image was visually observed in the dark under ultraviolet irradiation was evaluated detected intensity by the following criteria. 〇:検出あり×:検出なし結果を表4に示した。 ○: Detection Yes ×: None detection results are shown in Table 4. 【0079】 【表4】 [0079] [Table 4] 【0080】 【発明の効果】本発明によれば、自動分析への対応性が高く、少量のサンプルを用いて、短時間に高い精度で核酸の検出が可能であり、目的核酸の分取やPCR法による増幅にも応用可能な温度制御型マイクロリアクター及びこれを用いたマイクロリアクターシステムを提供できる。 [0080] According to the present invention, high adaptability to automatic analysis, using a small amount of sample, it is possible to detect the nucleic acid in a short time to high accuracy, preparative Ya minute target nucleic acids to amplification by the PCR method can provide a microreactor system using a temperature-controlled microreactors and this can be applied. 【0081】 【配列表】 <110>積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO.,LTD. <120>温度制御型マイクロリアクター及びマイクロリアクターシステム<130>00P00507 <160>10 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 tcggtgatgt cggcgatata 20 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ttc tcg gag cac tgt ccg acc gct ttg gcc gcc gcc cag tcc tgc tcg 48 ctt cgc tac ttg gag cca cta tcg act acg cga tca tgg cga cca cac 96 ccg cgc ggg atc gag atc tcg atc ctc tac gcc gga cgc atc gtg gcc 144 ggc atc acc ggc gcc aca ggt gcg gtt gct ggc gcc tat atc gcc gac 192 atc acc ga 200 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tcggtgatgt cggcgatata 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ttctcggagc actgtccg 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 cggcacctgt cctacgagtt 20 <210> 6 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ttg ttt cgg cgt gg [0081] [Sequence Listing] <110> Sekisui Chemical Co., Ltd. SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> temperature controlled microreactor and microreactor system <130> 00P00507 <160> 10 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 tcggtgatgt cggcgatata 20 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ttc tcg gag cac tgt ccg acc gct ttg gcc gcc gcc cag tcc tgc tcg 48 ctt cgc tac ttg gag cca cta tcg act acg cga tca tgg cga cca cac 96 ccg cgc ggg atc gag atc tcg atc ctc tac gcc gga cgc atc gtg gcc 144 ggc atc acc ggc gcc aca ggt gcg gtt gct ggc gcc tat atc gcc gac 192 atc acc ga 200 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tcggtgatgt cggcgatata 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ttctcggagc actgtccg 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 cggcacctgt cctacgagtt 20 <210> 6 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400 > 6 ttg ttt cgg cgt gg g tat ggt ggc agg ccc cgt ggc cgg ggg act gtt 48 ggg cgc cat ctc ctt gca tgc acc att cct tgc ggc ggc ggt gct caa 96 cgg cct tca acc cag tca gct cct tcc ggt ggg cgc ggg gca tga cta 144 tcg tcg ccg cac tta tga ctg tct tct tta tca tgc aac tcg tag gac 192 agg tgc cg 200 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cggcacctgt cctacgagtt 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ttgtttcggc gtgggtat 18 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 cgtttcggtg atgacggtga gtgcaccggc acctgtccta cgagtt 46 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cgtttcggtg atgacggtga gtgcacttgt ttcggcgtgg gtat 44 g tat ggt ggc agg ccc cgt ggc cgg ggg act gtt 48 ggg cgc cat ctc ctt gca tgc acc att cct tgc ggc ggc ggt gct caa 96 cgg cct tca acc cag tca gct cct tcc ggt ggg cgc ggg gca tga cta 144 tcg tcg ccg cac tta tga ctg tct tct tta tca tgc aac tcg tag gac 192 agg tgc cg 200 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cggcacctgt cctacgagtt 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ttgtttcggc gtgggtat 18 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 cgtttcggtg atgacggtga gtgcaccggc acctgtccta cgagtt 46 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cgtttcggtg atgacggtga gtgcacttgt ttcggcgtgg gtat 44

【図面の簡単な説明】 【図1】本発明の温度制御型マイクロリアクターの一実施態様を示す模式図である。 It is a schematic view showing an embodiment of a temperature controlled microreactor BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS [Figure 1] present invention. 【図2】別の基板上に温度を調整する素子を固定又は形成した本発明の温度制御型マイクロリアクターの一実施態様を示す模式図である。 It is a schematic view showing an embodiment of a temperature control microreactor of the present invention; FIG the element for adjusting the temperature was fixed or formed on another substrate. 【図3】3種の異なる塩基配列を有するプローブが固定化され核酸の分取可能な本発明の温度制御型マイクロリアクターの一実施態様を示す模式図である。 [3] a probe having three different base sequences is a schematic diagram showing one embodiment of a temperature controlled microreactor preparative possible present invention nucleic acid is immobilized. 【図4】4種の異なる塩基配列を有するプローブが固定化されPCR法の実施可能な本発明の温度制御型マイクロリアクターの一実施態様を示す模式図である。 4 is a schematic diagram showing one embodiment of a temperature controlled microreactor feasible present invention the probe is immobilized PCR method with four different nucleotide sequence. 【図5】実施例1で用いたマイクロリアクターシステムを示す模式図である。 5 is a schematic view showing a microreactor system used in Example 1. 【図6】実施例2で用いたマイクロリアクターを示す模式図である。 6 is a schematic view showing a microreactor used in Examples 2. 【図7】実施例2で用いたマイクロリアクターシステムを示す模式図である。 7 is a schematic view showing a microreactor system used in Example 2. 【図8】実施例3で用いたマイクロリアクターを示す模式図である。 8 is a schematic view showing a microreactor used in Example 3. 【図9】実施例3で用いたマイクロリアクターシステムを示す模式図である。 9 is a schematic view showing a microreactor system used in Example 3. 【図10】実施例4で用いたマイクロリアクターを示す模式図である。 10 is a schematic view showing a microreactor used in Examples 4. 【図11】実施例4で用いたマイクロリアクターシステムを示す模式図である。 11 is a schematic view showing a microreactor system used in Example 4. 【符号の説明】 1 加熱及び/又は冷却素子2 温度検出素子3 固定化した核酸4 流路5 基材6 基板7 固定化された核酸8 固定化された核酸9 固定化された核酸10 固定化された核酸11 固定化された核酸12 固定化された核酸13 固定化された核酸 [EXPLANATION OF SYMBOLS] 1 heating and / or cooling element 2 temperature detecting element 3 immobilized nucleic fourth channel 5 substrate 6 substrate 7 immobilized nucleic acid 8 immobilized nucleic 9 immobilized nucleic acid 10 immobilized nucleic acid 11 immobilized nucleic acid 12 immobilized nucleic acid 13 immobilized nucleic acid

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 35/08 G01N 37/00 101 37/00 101 C12N 15/00 ZNAA // G01N 27/447 G01N 27/26 315Z ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) G01N 35/08 G01N 37/00 101 37/00 101 C12N 15/00 ZNAA // G01N 27/447 G01N 27 / 26 315Z

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項1】 表面にデオキシリボ核酸又はリボ核酸が固定化された流路を有する温度制御型マイクロリアクターであって、前記デオキシリボ核酸又はリボ核酸が固定化された位置において流路の温度を制御できるものであることを特徴とする温度制御型マイクロリアクター。 Claims We claim: 1. A deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid to the surface of a temperature controlled microreactor with immobilized flow path, the flow at a position where the deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid is immobilized temperature control microreactor, characterized in that it is possible to control the temperature of the road. 【請求項2】 デオキシリボ核酸又はリボ核酸は、塩基配列が2種類以上からなることを特徴とする請求項1記載の温度制御型マイクロリアクター。 2. A deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid, the temperature-controlled microreactor according to claim 1, wherein the nucleotide sequence is composed of two or more. 【請求項3】 デオキシリボ核酸又はリボ核酸は、制限酵素で消化可能な塩基配列を含有することを特徴とする請求項1又は2記載の温度制御型マイクロリアクター。 3. A deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid according to claim 1 or 2 temperature controlled microreactor according characterized in that it contains a digestible base sequence with a restriction enzyme. 【請求項4】 流路内の2箇所以上を異なる温度で制御できるものであること特徴とする請求項1、2又は3記載の温度制御型マイクロリアクター。 4. The method of claim 1, 2 or 3 temperature controlled microreactor wherein it is intended that the two or more positions in the flow path can be controlled at different temperatures. 【請求項5】 時分割及び/又は領域分割で流路の温度を制御できるものであることを特徴とする請求項1、 Claim 1, wherein the at 5. time division and / or region division it is possible to control the temperature of the flow path,
    2、3又は4記載の温度制御型マイクロリアクター。 2, 3 or 4 temperature controlled microreactor according. 【請求項6】 加熱及び/又は冷却のために熱電変換材料を用いることを特徴とする請求項1、2、3、4又は5記載の温度制御型マイクロリアクター。 6. The heating and / or temperature-controlled microreactor according to claim 1, 2, 3, 4 or 5, wherein the use of thermoelectric material for cooling. 【請求項7】 請求項1、2、3、4、5又は6記載のマイクロリアクターを用いてなることを特徴とするマイクロリアクターシステム。 7. A microreactor system characterized by using the microreactor according to claim 2, 3, 4, 5 or 6, wherein.
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