JP4422019B2 - Microbe identification probe and identification method using the same - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、微生物、特に医療及び食品等の分野において有害な細菌を検出、同定する特異的なプローブ及びそれを用いた検出及び／又は同定方法に関する。
背景技術
表１に記載した細菌の検出は、種々の医学、公衆衛生に関して重要であり、検出方法については次の２つの方法が知られている。
第２の方法としては、迅速に検査を行うことができるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法と呼ばれる方法が開発され実用化されている。このＰＣＲ法では細菌を同定するプローブとして１６Ｓ ｒＲＮＡまたは２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を使用することが知られている。このようなリボソームの塩基配列を使用した細菌同定用プローブ及び同定方法は、例えば特許第３１１６３５３号、特許第３１３５９０９号、特許第３０３００３４号、特願２００２−１７３５６号、特開２００２−３４５７８号などに開示されている。
しかしながら、これらの出願には、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子の５’末端に由来の４００〜５００塩基の領域が系統学的に保存された属の近縁の種間を識別するために有効な領域であり、それらの領域の一部の塩基配列を有するプローブを調製してある特定の微生物を検出、同定することは報告されてはいるが、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列のうち、微生物間の保存性が低く、特定の種に対して特異性が高いＶ１、Ｖ２及びＶ３領域は個々に特定されておらず、その領域の塩基配列からプローブを調製し、本願発明の表１に示す微生物を効率よく特異的に検出、同定する方法については全く報告されていない。
発明の開示
従って、本発明は、医療及び食品等の分野において有害な微生物を、１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の種に対して特異性が高いＶ１、Ｖ２及びＶ３領域の塩基配列に基づいて、迅速かつ確実に微生物を検出及び／又は同定するプローブ及びそのプローブを用いた検出及び／又は同定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列のうち、特に種に対して特異性が高い特定のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域の塩基配列に着目し、医療及び食品等の分野において有害な細菌を特異的に検出及び／又は同定し得るプローブを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の１〜６６を提供する。
（１） アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シトロバクター・フレンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ベイヨネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ）、プロビデンシア・スチュアーティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、ナイセリア・ゴノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・ワルネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブセラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクアチウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｑｕａｔｉｕｍ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、サルモネラ・パラチフィＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ）、クレブセラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、モラキセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）から選択される１又は複数の微生物を検出及び／又は同定するためのプローブであって、検出及び／又は同定すべき微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及び／又はＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの各塩基配列又はその相補配列からなるプローブ。
（２） 配列番号１〜１５２で示される塩基配列またはその相補配列から選ばれる、（１）に記載のプローブ。
（３） 配列番号１、２又は３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４） 配列番号４、５又は６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、アシネトバクター・カルコアセチカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５） 配列番号７、８又は９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ヘモフィルス・インフルエンザを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（６） 配列番号１０、１１又は１２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ステノトロフォモナス・マルトフィリアを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（７） 配列番号１３、１４又は１５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、プロテウス・ミラビリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（８） 配列番号１６、１７又１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（９） 配列番号１９、２０又は２１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、シュードモナス・エルギノサを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１０） 配列番号２２、２３又は２４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、シトロバクター・フレンディを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１１） 配列番号２５、２６又は２７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ベイヨネラ・パルブーラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１２） 配列番号２８、２９又は３０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、プロビデンシア・スチュアーティを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１３） 配列番号３１、３２又は３３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ナイセリア・ゴノローエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１４） 配列番号３４、３５又は３６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・アガラクチエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１５） 配列番号３７、３８又は３９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、モルガネラ・モルガニを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１６） 配列番号４０、４１又は４２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、バクテロイデス・フラジリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１７） 配列番号４３、４４又は４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ホミニスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１８） 配列番号４６、４７又は４８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ワルネリを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１９） 配列番号４９、５０又は５１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ヘモリティカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２０） 配列番号５２、２３又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロバクター・クロアカを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２１） 配列番号５４、５５又は５６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロバクター・アエロゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２２） 配列番号５７、５８又は５９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・エピデルミディスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２３） 配列番号６０、６１又は６２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・コンステラータスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２４） 配列番号６３、２３又は６４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、セラチア・マルセッセンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２５） 配列番号６５、６６又は６７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・アンギノサスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２６） 配列番号６８、６９又は７０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エシェリシア・コリを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２７） 配列番号５４、７１又は７２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クレブセラ・ニューモニエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２８） 配列番号７３、７４又は７５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・フェカリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２９） 配列番号７６、７７又は７８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・フェシウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３０） 配列番号７９、８０又は８１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・サングイスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３１） 配列番号８２、８３又は１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ミティスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３２） 配列番号６０、８４又は６７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・インターメディウスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３３） 配列番号８５、８６又は８７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、リステリア・モノサイトゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３４） 配列番号８８、８９又は９０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クロストリジウム・パーフリゲンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３５） 配列番号９１、９２又は９３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、コリネバクテリウム・アクアチウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３６） 配列番号９４、９５又は１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・オラリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３７） 配列番号９６、９７又は９８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・アウレウスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３８） 配列番号９９、１００又は１０１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ナイセリア・メニンギチディスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３９） 配列番号１０２、１０３又は１０４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、カンピロバクター・フェタスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４０） 配列番号１０５、１０６又は１０７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・ガリナルムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４１） 配列番号１０８、１０６又は１０９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・カセリフラバスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４２） 配列番号１１０、１１１又は１１２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エロモナス・ハイドロフィラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４３） 配列番号１１３、１１４又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、サルモネラ・パラチフィＡを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４４） 配列番号１１５、１１４又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、サルモネラ・チフィを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４５） 配列番号１１６、１１７又は１１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・エクイシミリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４６） 配列番号１１９、１２０又は１２１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・カニスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４７） 配列番号５２、２３又は１２２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クレブセラ・オキシトカを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４８） 配列番号４６、１２３又は１２４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・サプロフィティカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４９） 配列番号１２５、１２６又は１２７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、パスツレラ・ムルトシダを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５０） 配列番号１２８、１２９又は１３０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エイケネラ・コロデンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５１） 配列番号１３１、１３２又は１３３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５２） 配列番号１３４、１３５又は１３６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、モラキセラ・カタラリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５３） 配列番号１３７、１３８又は１３９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、レジオネラ・ニューモフィラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５４） 配列番号１４０、１４１又は１４２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５５） 配列番号１４３、１４４又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・アビウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５６） 配列番号１４６、１４７又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・イントラセルラレを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５７） 配列番号１４８、１４９又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・カンサシを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５８） 配列番号１５０、１５１又は１５２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・ゴルドネを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５９） 複数の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における相同性検索によって、それぞれの微生物におけるＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域を特定し、該Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域の塩基配列において２種以上の微生物間で比較してミスマッチ部位を決定し、該ミスマッチ部位を含み、かつ塩基長が２０〜１００ｂｐの領域を決定することを含む、プローブの設計方法。
（６０） （１）又は（２）に記載のプローブの１種以上を用いることを特徴とする、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、アシネトバクター・カルコアセチカス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、プロテウス・ミラビリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、シュードモナス・エルギノサ、シトロバクター・フレンディ、ベイヨネラ・パルブーラ、プロビデンシア・スチュアーティ、ナイセリア・ゴノローエ、ストレプトコッカス・アガラクチエ、モルガネラ・モルガニ、バクテロイデス・フラジリス、スタフィロコッカス・ホミニス、スタフィロコッカス・ワルネリ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、エンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ストレプトコッカス・コンステラータス、セラチア・マルセッセンス、ストレプトコッカス・アンギノサス、エシェリシア・コリ、クレブセラ・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・インターメディウス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリネバクテリウム・アクアチウム、ストレプトコッカス・オラリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・メニンギチディス、カンピロバクター・フェタス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・カセリフラバス、エロモナス・ハイドロフィラ、サルモネラ・パラチフィＡ、サルモネラ・チフィ、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・カニス、クレブセラ・オキシトカ、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、パスツレラ・ムルトシダ、エイケネラ・コロデンス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、モラキセラ・カタラリス、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・ゴルドネから選択される１又は複数の微生物の検出及び／又は同定方法。
（６１） 微生物由来の塩基配列とプローブの塩基配列間でミスマッチが４個以上ある場合にハイブリダイズしないストリンジェンシー条件を用いて両配列をハイブリダイズさせることを含む、（６０）に記載の方法。
（６２） 同定すべき微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが３個以下である塩基配列を有する２種以上の微生物を検出し、該２種以上の微生物と異なる微生物のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１種以上を用い、該２種以上の微生物のうち１種の微生物をさらに同定することを含む、（６０）又は（６１）に記載の方法。
（６３） 以下の工程：（ａ）同定すべき微生物から核酸を調製する工程、（ｂ）該核酸を請求項１又は２に記載のプローブとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイズの有無を検出し、各プローブに対するその検出シグナルパターンを特定する工程、（ｄ）工程（ｃ）において得られた検出シグナルパターンと、予め特定しておいた微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき微生物の種類を特定する工程、からなる（６０）又は（６１）に記載の方法。
（６４） 配列番号１５３及び１５４で示されるプライマーを用いて標的配列を含むヌクレオチドを増幅した後にプローブとハイブリダイズさせる、（６０）〜（６３）のいずれかに記載の方法。
（６５） 標的配列を含むヌクレオチドの増幅の際に、蛍光物質を用いて標識を行う、（６０）〜（６４）のいずれかに記載の方法。
（６６） ＤＮＡチップ上で検出する、（６０）〜（６５）のいずれかに記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００２−１７４５６４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号１５３は合成ＤＮＡである。
配列番号１５４は合成ＤＮＡである。
発明を実施するための形態
本発明の微生物検出同定用のプローブ及びそれを用いた検出及び／又は同定方法についてさらに詳細に説明する。
本発明の第１の態様は、前述の表１に示す微生物から選択される１または複数の微生物を検出及び／又は同定するためのプローブであって、検出及び／又は同定すべき微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブである。
本発明においてプローブとは、核酸の相補的な配列が互いに特異的に結合する性質を利用して、ＤＮＡやＲＮＡ断片の中から特定の断片を検出し得るオリゴヌクレオチドＤＮＡやＲＮＡであり、特に、微生物由来の１６Ｓ ｒＲＮＡまたは１６Ｓ ｒＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する標的核酸と特異的に結合するオリゴヌクレオチド配列である。
本発明の各微生物を検出及び／又は同定し得るプローブは、各微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域について検出同定対象の２種以上の微生物間でマルチプルアライメントを行ってミスマッチ部位を決定し、特に各微生物に対して特異性が高い領域を決定して当該プローブを作製することができる（図１参照）。本明細書において、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域とは、各微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡの５’領域遺伝子配列（約５００ｂｐ）のうち、保存性の低い３つの領域であって、Ｖ１領域は５’末端からおおよそ第５０〜第１２０番目の塩基の領域であり、Ｖ２領域はおおよそ第１５０〜第２６０番目の塩基の領域であり、Ｖ３領域はおおよそ第４２０〜第５２０番目の塩基の領域である。
これらのＶ１〜Ｖ３領域から作製し得る検出同定用プローブは、検出、同定感度の点から検出同定すべき微生物間においてミスマッチが多い領域を用いるのが適当であり、ミスマッチは４ヶ所以上存在するのが好ましい。また、同定方法における検出感度、コスト等を考慮すると、プローブの塩基配列は２０〜１００ｂｐが好ましく、特に３０〜８０ｂｐが好ましい。なお、これらのプローブは、対応する各々の領域に応じて、ｖ１プローブ、ｖ２プローブ、ｖ３プローブと称する。
これらのプローブは、表１に示す微生物が特異的に検出、同定出来る限り、一部が修飾され、又はその塩基配列に欠失、置換又は付加が存在していてもよい。
具体的には、表１に記載した微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における相同性検索によってそれぞれの微生物におけるＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域を特定し、該Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域において２種以上の微生物の塩基配列を比較してミスマッチ部位を決定する。その結果を基にして、該ミスマッチ部位を含み、かつ塩基長が２０〜１００ｂｐのプローブを作製する。ミスマッチ部位はプローブの中央付近になるように設計するのが好ましい。表１に示す微生物のうち、その微生物自身のＶ１〜Ｖ３領域の塩基配列とその微生物以外の微生物由来のｖ１〜ｖ３プローブの塩基配列の間に最小ミスマッチ数が４個以上ある微生物は、プローブを単独で用いることによって検出、同定可能な微生物である。また、最小ミスマッチ数が３個以下の微生物は、複数のプローブによる検出結果を総合的に判断することによって検出、同定可能な微生物である。
各微生物に対する検出同定用プローブのＩＤとその配列番号を表２及び表３に示す。
例えば、表２からわかるように、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスを単独で特異的に検出同定し得るプローブは、配列番号２に示される塩基配列を有する０１ ｖ２プローブ及び配列番号３に示される塩基配列を有する０１ ｖ３プローブ、またはそれぞれの相補配列を有するプローブであり、アシネトバクター・カルコアセティカスを単独で特異的に検出同定し得るプローブは、配列番号４に示される塩基配列を有する０２ ｖ１プローブ、配列番号５に示される塩基配列を有する０２ ｖ２プローブ、配列番号６に示される塩基配列を有する０２ ｖ３プローブ、またはそれぞれの相補配列を有するプローブである。
また、表３には、他の微生物との１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が類似しているため、単独プローブによる検出・同定が困難な微生物を示してある。これら微生物の場合には、該当微生物の検出用に設計されたプローブだけでなく、他の微生物の検出用に設計されたプローブによるハイブリダイゼーションパターンを利用して、個々の微生物の検出同定を行う。例えば、表４に示されるように、ストレプトコッカス・ニューモニエを検出するための配列番号１６〜１８のプローブ０６ ｖ１〜ｖ３はいずれも、Ｖ１〜Ｖ３領域で他の微生物との間で最小のミスマッチ数が３塩基以内であるため、単独でストレプトコッカス・ニューモニエの検出・同定が困難である。そこで、配列番号１６〜１８のプローブ０６ ｖ１〜ｖ３だけでなく、配列番号８２、８３、１８のプローブ２９ ｖ１〜ｖ３および、配列番号９４、９５、１８のプローブ３４ ｖ１〜ｖ３、またはそれぞれの相補配列を有するプローブの検出結果を組み合わせて利用することで、検出・同定を行う。
これらのプローブは、天然由来のものであっても、化学合成等の常法によるものであってもよく、化学合成は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホロアミダイト法により合成できる。また、公知のリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスファイト法等を用いることもできる。
本発明の第２の態様は、表１に示す微生物から選択される１または複数の微生物の検出及び／又は同定方法であって、検出同定すべき微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１以上を用いることを特徴とする方法である。
すなわち、具体的には、本発明の検出同定方法は、微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体に上記プローブを接触させてハイブリダイゼーションを行い、標識を指標にして表１の微生物を検出、同定する方法である。
微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体は、核酸が微量である場合には、表１に示す微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む塩基配列を増幅させることができるプライマーを用いて増幅させる。なお、プライマーとは、核酸の合成反応にあたりポリヌクレオチド鎖が伸長していく出発点として働くポリヌクレオチドであり、本発明におけるフォワードプライマーは、Ｖ１領域より上流の各微生物間において保存性の高い領域であるおおよそ１から７０番目の塩基に存在する領域から設計するのが好ましく、リバースプライマーは、Ｖ３領域より下流の各微生物間において保存性の高い領域であるおおよそ４５０から６２０番目の塩基に存在する領域から設計するのが好ましい。また、そのサイズは、１５〜３５ｍｅｒが好ましく、特に１８〜３０ｍｅｒが好ましい。例えば、一例として、フォワードプライマーとしては、おおよそ第１から第７０番目の塩基に位置する、以下の配列番号１５３に示される２７Ｆプライマー、リバースプライマーとしては、おおよそ第４５０から第６２０番目の塩基に位置する、以下の配列番号１５４に示される５２５Ｒを用いることができる。これらのプライマーは天然由来のものであっても、常法により化学合成されたものであってもよい。化学合成は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホロアミダイト法により合成できる。また、公知のリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスファイト法等を用いることもできる。
次に、抽出した核酸を鋳型とし、上記のプライマーを用いてＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０（１９８５））を実施する。本発明においては、上記プライマー（配列番号１５３及び１５４）を用いることによって、微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の５’末端からおおよそ第２７〜第５２５番目の塩基及びその近傍の配列を増幅させることが好ましい。ＰＣＲ法の反応条件や反応溶液は公知の情報に基づいて任意に設定することができる。例えば、熱変性：９０〜９５℃で１〜３０秒、アニーリング：３７〜６５℃で０〜３０秒、伸長反応：５０〜７５℃で１０〜６０秒、これを１サイクルとして３０〜５０サイクル行って増幅するのが好ましい。ＰＣＲ法の増幅結果は、必要に応じ、反応を終えた溶液をそのままアガロールゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチドの存在、及びその長さを確認することができる。
増幅された微生物の核酸は、上記の本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーションに用いることができる。本発明において、ハイブリダイゼーションとは、特定の条件下において、相補的な配列を有する２つの１本鎖の塩基配列が結合して、２本鎖を形成することを意味する。また、特定の条件とは、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーな条件を意味し、特に、本発明では、微生物由来の塩基配列と本発明のプローブの塩基配列間でミスマッチが４個以上ある場合にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェンシーな条件は、実施されるハイブリダイゼーションの条件によって異なるが、当業者であればハイブリダイゼーションのプロトコルに基づいて、温度、塩濃度、活性剤濃度等の溶媒組成等の条件を適宜設定することができる。一例としては、５０ｍｅｒのプローブとのハイブリダイゼーションの場合、５５℃、０．５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで実施することができる。なお、目的に応じ、ストリンジェンシーを高くすることによって、ミスマッチ数が３個以上、２個以上、又は１個以上でハイブリダイズすることができないように設定することが可能である。また、ストリンジェンシーを低くすることによって、ミスマッチが５個以下、６個以下等でもハイブリダイズできるように設定することもできる。
ハイブリダイズの可否は、上記のように調製した微生物から抽出し、増幅した核酸を予めフルオロセインイソチオシアネートやテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質やハプテン等で標識し、プローブを前記の標識化した核酸とハイブリダイズさせた後、蛍光色素等の標識を測定することによって確認することができる。標識化は、例えば、ニックトランスレーション法、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法や５’側の末端が蛍光物質またはハプテン等で標識された標識化プライマーを用いて核酸増幅を行うことにより得ることができる。
本発明の検出同定方法には、単独のプローブの使用によって、表２に示す特定の微生物を検出、同定する方法が含まれる。例えば、同定すべき微生物自身のＶ１〜Ｖ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列と、その微生物以外の微生物由来の塩基配列との間に最小ミスマッチ数が４個以上存在する前記プローブを使用することによって、微生物を検出するとともに同定することができる（表２及び表４を参照）。
また、本発明の方法には、本発明の複数のプローブによる検出結果を総合的に判断することによって、表３に示す特定の微生物を検出し、さらに同定する方法も含まれる。具体的には、第１ステップとして、同定すべき微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが３個以下である塩基配列を有する２種以上の微生物を検出し、第２ステップとして、該２種以上の微生物と異なる微生物のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１種以上を用い、該２種以上の微生物のうち１種の微生物をさらに同定する方法である。
例えば、一例を表６１に示している（実施例３参照）。ＩＤ ０６微生物（ストレプトコッカス・ニューモニエ）の０６ ｖ１〜ｖ３プローブとＩＤ ２９微生物（ストレプトコッカス・ミティス）に対応する塩基配列とはミスマッチが３個以下であるので、０６ ｖ１〜ｖ３プローブを用いて検出される微生物は、ＩＤ ０６微生物とＩＤ ２９微生物のいずれであるかまでは同定できない。しかしながら、第２ステップとして、ＩＤ ３４微生物（ストレプトコッカス・オラリス）由来の３４ ｖ１〜ｖ３プローブを用いて検出方法を行うと、ＩＤ ０６微生物は３４ ｖ３プローブとのみハイブリダイズしてシグナルが検出され、ＩＤ ２９微生物は３４ ｖ２及びｖ３プローブとそれぞれハイブリダイズしてシグナルが検出される。従って、０６ ｖ１〜ｖ３プローブを用いて検出された微生物は、さらにＩＤ ３４微生物（ストレプトコッカス・オラリス）由来の３４ ｖ１〜ｖ３プローブを用いた検出を行うことによって、ＩＤ ０６微生物であるかＩＤ ２９微生物であるかを同定することができる。
なお、臨床や食品衛生の分野において、検出すべき微生物が試料中に存在する可能性があるか否かをいち早く確認することが必要であり、微生物の同定まで行う必要がない場合、また、同時に検出され得る複数の微生物が近縁の種であり、それら複数の微生物に対する治療方法などの対処方法がすでに明らかである場合には、上記の第１ステップを実施するだけでよい。
また、本発明の方法には、（ａ）同定すべき微生物から核酸を調製する工程、（ｂ）該核酸を本発明のプローブとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイズの有無を検出し、各プローブに対するその検出シグナルパターンを特定する工程、（ｄ）工程（ｃ）において得られた検出シグナルパターンと、予め特定しておいた、表１に示す微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき微生物の種類を特定する工程からなる方法も含まれる。この場合、検出シグナルパターンをコンピュータ処理等によって解析することによって、微生物の検出、同定効率を一層高めることができる。また、この検出シグナルパターンによる方法は、ＤＮＡチップ上で実施することによって、より迅速に、効果的に行うことができる。
ＤＮＡチップ上での検出同定方法としては、具体的には、以下のように実施することができる。本発明のプローブを、例えば、ガラス、シリコン等の支持体上の各位置（スポット）に共有結合等により固定化する。その支持体上に、上記のようにして得られた標識化核酸を含む溶液をかけると、各スポット内のプローブの塩基配列に相補的な塩基配列を有する試料中の微生物由来核酸の塩基配列がハイブリダイズして二本鎖を形成し、支持体上に残る。ハイブリダイゼーションした結合体の標識又はハイブリダイゼーションしなかった標識を測定することによって、被検体中の微生物を検出同定することができる。
実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］ 微生物同定用プローブの調製と同定チップの作製
（プローブ調製用微生物）
本発明のプローブを調製するために、表１に示す微生物を標準菌株として用いた。なお、微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ株）、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の微生物株分譲業務を引継ぎ、微生物の分譲を行っている）（ＩＦＯ株）、東京大学医科学研究所（ＩＩＤ株）等から入手可能である。
（微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ ５’領域遺伝子配列（約５００ｂｐ）のＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域の決定とプローブとして利用可能な塩基配列の決定とプローブの調製）
表１に示す微生物のＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡをシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）で解読した塩基配列についてマルチプルアライメント（日立ソフトＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ）を実行し、決定した。更に、ブラストと呼ばれるアルゴリズム（日立ソフトＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ）を用いて、それらの領域においてミスマッチ部位を特定した。該ミスマッチ部位が中央付近にくるようにプローブの塩基配列を設計した。
表４に、それぞれの微生物について設計されたｖ１〜ｖ３プローブについて、各プローブが由来する微生物以外の微生物のＶ１〜Ｖ３領域の配列とハイブリダイズさせることを想定した場合のミスマッチ塩基数の中で最小となる数値（最小ミスマッチ数）を示す。ｖ１〜ｖ３プローブのいずれかにおいて最小ミスマッチ数が４以上であれば、単独のプローブによってその微生物が検出・同定可能である。ｖ１〜ｖ３プローブのいずれにおいても最小ミスマッチ数が３以下であるばあいには単独のプローブによって検出・同定ができないが、後述するように本発明の方法によって検出・同定できる。なお、表４中、ｎｏｎｅとは、有意な相同性のある配列がなかったということを表す。
表１に示す微生物の各ｖ１〜ｖ３プローブを合成し、ＨＰＬＣ精製の後凍結乾燥した状態で保存した。これらを２０μＭに調整し、マイクロアレイスポッティングソリューション（ジェネティックス社）と１：１で混合した。全てのサンプルをスポッター（日立ソフト社 ＳＰＢＩＯ）にて２×４ブロックにスポットし、レプリカを含め合計４×４ブロックとした。それぞれのブロックの４端にはポジティブコントロールをスポットした。スポッターで使用するピンは、ステンレス・スチールピン１５０μｍとした。スポットした後、０．２％ ＳＤＳ溶液・水・沸騰水に入れ、スライドウォッシャー（バイオフィールド社）にてチップを洗浄し、以下の実験に用いた。
［実施例２］ 微生物同定プローブを用いた微生物の同定方法
（微生物ＤＮＡ抽出溶液の調製）
表１に示す微生物をＬＢ培地寒天培地（酵母エキス５ｇ、トリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．４）で培養した後、集菌した。３００μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ），６０Ｕｎｉｔ Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ），６００Ｕｎｉｔ Ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬）を含むＣｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（溶菌酵素液）を加え懸濁し、３７℃で２時間加温した。次に、６００ｍＵ／μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を３０μｌ加え、７０℃で１０分間加温した。
この溶液に５Ｍグアニジン塩酸−１００ｍＭトリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）を３３０μｌ加え、１０分間混合した。その後、ＴＥ飽和フェノール：クロロホルム液（１：１）６００μｌを加えて懸濁した後、微量高速遠心分離機を用い１５，０００ｒｐｍ １０分間２５℃で遠心分離した。上層を６００μｌ分取し、６０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１８００μｌの９９．５％エタノールを加え混和し、−８０℃で１０分間放置後、８，０００ｒｐｍ１５分間４℃で遠心分離した。７０％冷エタノールでリンスした後、沈殿を乾燥させ、滅菌蒸留水１００μｌを加えて十分に溶解した。この溶液をＰＣＲに供した。
（ＰＣＲによるターゲットＤＮＡの増幅）
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、５０μｌの反応液量で行った。反応液５０μｌ中には、１μｌの鋳型ＤＮＡ（上記微生物ＤＮＡ抽出溶液）、５μｌの１０Ｘバッファー（Ｚ−Ｔａｑ用）、０．７５ｕｎｉｔｓ Ｚ−Ｔａｑ（宝酒造）、６ｎｍｏｌｅ ｄＮＴＰｓ、フォワードプライマー２７Ｆ（配列番号１５３）、リバースプライマー５２５Ｒ（配列番号１５４）各６ｐｍｏｌｅが含まれる。
ＰＣＲの条件は、９８℃で２分の後、９８℃で１秒、６０℃で９０秒を１サイクルとし、３５サイクル反応させ、微生物中のターゲット遺伝子のＰＣＲ増幅産物を得た。反応終了後、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０ Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）によるスピンカラム法により基質を除去後、凍結乾燥により濃縮乾固させ、１０μｌの滅菌超純水にて溶解し、ターゲットＤＮＡ溶液とした。
（ＰＣＲ増幅産物の標識）
Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、上記のターゲットＤＮＡをＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋＴＭＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識した。標識反応液２０μｌ中には、１μｇの上記ターゲットＤＮＡ溶液、３．５μｌＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．０４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．０４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０４ｍＭ ｄＧＴＰ、２μｌ １０ｘ ｂｕｆｆｅｒ、０．１ｍＭ ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋＴＭＣｙ５−ｄＵＴＰが含まれる。反応条件は、１５℃、２時間で行った。反応後、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０ Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）によるスピンカラム法で精製した。精製した反応物を凍結乾燥し、１０μｌ滅菌超純水に溶解した。
（ハイブリダイゼーション）
２μｌの上記標識ターゲットＤＮＡを加えて、最終濃度が５０％ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣ、２％ＳＤＳ、１％ＢＳＡとなるようにハイブリダイゼーション溶液を調整した。この溶液１５μｌを９８℃、２分間ディネイチャーさせた。
実施例１で作製した微生物同定チップ上に滴下し、２４ｘ２５ｍｍハイブリカバースライド（ビーエム機器社）を乗せ、５５℃の恒温槽で２時間反応させた。反応後、細菌同定チップを２ｘ ｓｓｃ溶液に浸し、ハイブリカバースライドを滑り落とした。さらに、２ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液へ移し、５分間洗浄後、０．２ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで５分間洗浄した。さらに０．５ｘ ＳＳＣで１分間洗浄した。
微生物同定チップを２０００ｒｐｍ、１分間遠心乾燥した後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ ４０００（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＣｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）で常温、室温の元、シグナル検出した。なお、シグナルの強度をより明確に判断するために、検出されたシグナルを日立ソフトＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ａｒｒａｙによって数値化し、輝度値とした。
表５には、微生物ＩＤ ０１のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドを微生物同定チップに調製された各微生物のｖ１プローブ、ｖ２プローブ及びｖ３プローブとハイブリダイズさせ、シグナルの輝度値が高かった上位１０種類のプローブを各領域毎に示した。表５中、プローブＩＤは、表１に示す微生物ＩＤの番号とｖ１〜ｖ３領域を組み合わせて示している。
例えば、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１領域の結果をみると、プローブ０１ ｖ１の輝度値が著しく高いので、プローブ０１ ｖ１は被検体中にアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスが存在する可能性があることを検出することができる。ただし、この場合、プローブ０１ ｖ１以外にプローブ０３ ｖ１が類似の輝度値を示すので、プローブ０１ ｖ１の単独使用による同定はできない。これは、プローブ０１ ｖ１の塩基配列が他の微生物由来の塩基配列に対してミスマッチ塩基数が３個以下であるため、類似のプローブ０１ ｖ１と相同性の高い塩基配列を有する他の微生物ともハイブリダイズしてしまうからである（表１を参照）。従って、プローブ０１ ｖ１によって検出された微生物がいずれの微生物であるかを詳細に同定する必要がある場合には、さらなる同定ステップを行う必要がある。
一方、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ２領域の結果をみると、プローブ０１ ｖ２の輝度値のオーダーが他のプローブに比べて著しく高いので、プローブ０１ ｖ２を用いて被検体中のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの存在を検出、同定することができる。
また、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ３領域の結果をみると、プローブ０１ ｖ３の輝度値のオーダーが他のプローブに比べて著しく高いので、プローブ０１ ｖ３を用いて被検体中のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの存在を検出、同定することができる。
また、Ｖ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域のプローブの組合せから総合的に判断して、ｖ１プローブにおいて比較的シグナル強度の高いプローブは０３ ｖ１および０１ ｖ１であり、ｖ２プローブにおいて比較的シグナル強度の高いプローブは０１ ｖ２であり、ｖ３プローブにおいて比較的シグナル強度の強いプローブは０１ ｖ３であることから、対象微生物は、全ての領域に共通して強いシグナル強度が検出されたアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスであると検出・同定することができる。
上記表３に記載された微生物由来のｖ１、ｖ２及びｖ３プローブは、いずれもその塩基配列と他の微生物由来の塩基配列とのミスマッチが３個以下であるため、他の微生物由来の塩基配列とクロスハイブリダイゼーションを起こしやすく、単独のプローブによって検出、同定することが困難であった。このため、上記表３に記載された微生物については、その検出シグナルの傾向からグループ分けを行い、それら微生物由来のｖ１、ｖ２及びｖ３プローブを用いたハイブリダイゼーションの検出シグナルの結果を総合的に検討し、その微生物がいずれの属種であるかを同定した。
例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ ０６）、ストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ ２９）及びストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ ３４）は同属の菌であるため相同性が高く、互いの区別が困難であり、特にストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ミティスは単独プローブによる区別が不可能であった。そこでこれらをグループＡとしてまとめ、被検体がこれら３種のいずれかであると判定された場合、各々に対応する３種のｖ１〜ｖ３プローブを用いた更なる同定作業を行った。そして、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ ０６）、ストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ ２９）及びストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ ３４）の３種類の微生物について、検出シグナルの結果を各微生物の各プローブについて表６１のようにまとめた。
同様に、スタフィロコッカス・ホミニス（微生物ＩＤ １５）、スタフィロコッカス・ワルネリ（微生物ＩＤ １６）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（微生物ＩＤ １７）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（微生物ＩＤ ２０）、スタフィロコッカス・アウレウス（微生物ＩＤ ３５）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（微生物ＩＤ ４６）は同属であるために１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の類似性が高く、互いの区別が困難であり、特に、スタフィロコッカス・ホミニス、ストレプトコッカス・ワルネリ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカス・エピデルミディスは、単独プローブによる区別が不可能であった。そのため、これら微生物をグループＢとして、各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。その結果を表６２に示す。その結果、各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基づいて、微生物を同定することができることがわかった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列のうち、特に特異性が高いＶ１、Ｖ２及びＶ３領域の塩基配列から設計したプローブを用い、被検体である微生物から抽出した核酸を鋳型としてＰＣＲ法によって増幅を行い、得られた増幅産物を解析することにより、医療及び食品等の分野において有害な細菌を特異的にかつ迅速に検出、同定することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域を示す図である。Technical field
The present invention relates to a specific probe for detecting and identifying microorganisms, particularly bacteria harmful in the fields of medicine and food, and a detection and / or identification method using the same.
Background art
The detection of bacteria described in Table 1 is important for various medicines and public health, and the following two methods are known as detection methods.
As a second method, a method called a PCR (polymerase chain reaction) method capable of performing a test quickly has been developed and put into practical use. In this PCR method, it is known to use the base sequence of 16S rRNA or 23S rRNA as a probe for identifying bacteria. For example, Japanese Patent No. 3116353, Japanese Patent No. 3135909, Japanese Patent No. 3030034, Japanese Patent Application No. 2002-17356, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-34578, and the like are known. It is disclosed.
However, in these applications, a region of 400-500 bases derived from the 5 ′ end of the 16S rRNA molecule is an effective region for distinguishing between closely related species of the phylogenetically conserved genus, Although it has been reported that a probe having a partial base sequence in these regions is prepared to detect and identify a specific microorganism, among the base sequences of 16S rRNA, the conservation between microorganisms is low, The V1, V2 and V3 regions having high specificity for a specific species are not individually identified, and probes are prepared from the base sequences of these regions to efficiently and specifically identify the microorganisms shown in Table 1 of the present invention. No method for detection or identification has been reported.
Disclosure of the invention
Therefore, the present invention allows microorganisms harmful in the fields of medicine and food to be quickly and reliably identified based on the base sequences of the V1, V2 and V3 regions having high specificity for specific species of 16S rRNA. It is an object of the present invention to provide a probe for detection and / or identification and a detection and / or identification method using the probe.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have focused on the base sequences of specific V1, V2, and V3 regions that are particularly specific to the species, among the 16S rRNA base sequences. The present inventors have found a probe that can specifically detect and / or identify harmful bacteria in the fields of medicine and food, and completed the present invention.
That is, this invention provides the following 1-66.
(1) Actinobacillus actinomycetemcomitans (Actinobacillus actinomycetemcomitans), Acinetobacter calcoaceticus (Acinetobacter calcoaceticus), Haemophilus influenzae (Haemophilus influenzae), Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia), Proteus mirabilis (Proteus mirabilis ), Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter Freundi reundii), Veillonella-Parubura (Veillonella parvula), Providencia Stu artistic (Providencia stuartii), Neisseria Gonoroe (Neisseria gonorrhoeae), Streptococcus agalactiae (Streptococcus agalactiae), Morganella morganii (Morganella morganii), Bacteroides fragilis (Bacteroides fragilis ), Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hemolyticus (Staphylococcus humilicus) emolliticus, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerosnes, staphylococcus epidermidis, Strepococcus epidermidis, Streptococcus conc -Streptococcus anginosus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis (E terococcus faecalis), Enterococcus faecium (Enterococcus faecium), Streptococcus sanguis (Streptococcus sanguis), Streptococcus mitis (Streptococcus mitis), Streptococcus intermedius (Streptococcus intermedius), Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes), Clostridium perf Lingens (Clostridium perfringens), Corynebacterium aquatium, Streptococcus oralis (Streptococcus oral) s), Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis (Neisseria meningitidis), Campylobacter fetus (Centyrobacter fetus), Enterococcus galocrine, Aeromonas hydrophila, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Streptococcus equisiris (Streptococcus equis) milis, Streptococcus canis, Klebsiella oxytoca, Staphylococcus saprophyticus, Pasteurella multid Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis tu selected from berculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellularis, Mycobacterium kansasii, or Mycobacterium gordon A probe for detecting and / or identifying a plurality of microorganisms, each base sequence of 20 to 100 bp in the V1, V2 and / or V3 region of the 16S rRNA of the microorganism to be detected and / or identified, or a complementary sequence thereof A probe consisting of
(2) The probe according to (1), which is selected from the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1-152 or its complementary sequence.
(3) A probe for detecting and / or identifying Actinobacillus actinomycetemcomitans, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3, or a complementary sequence thereof.
(4) A probe for detecting and / or identifying Acinetobacter calcoaceticus comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6 or a complementary sequence thereof.
(5) A probe for detecting and / or identifying Haemophilus influenza, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, 8, or 9 or a complementary sequence thereof.
(6) A probe for detecting and / or identifying Stenotrophomonas maltophilia, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, 11 or 12, or a complementary sequence thereof.
(7) A probe for detecting and / or identifying Proteus mirabilis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13, 14, or 15 or a complementary sequence thereof.
(8) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus pneumoniae, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17, or 18 or a complementary sequence thereof.
(9) A probe for detecting and / or identifying Pseudomonas aeruginosa, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, 20, or 21 or a complementary sequence thereof.
(10) A probe for detecting and / or identifying Citrobacter frendi comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22, 23 or 24, or a complementary sequence thereof.
(11) A probe for detecting and / or identifying Bayonella parvula comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, 26 or 27, or a complementary sequence thereof.
(12) A probe for detecting and / or identifying Providencia stuati comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, 29 or 30, or a complementary sequence thereof.
(13) A probe for detecting and / or identifying Neisseria gonorrhoeae comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31, 32 or 33 or a complementary sequence thereof.
(14) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus agalactiae, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34, 35 or 36, or a complementary sequence thereof.
(15) A probe for detecting and / or identifying Morganella morgani, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37, 38 or 39, or a complementary sequence thereof.
(16) A probe for detecting and / or identifying Bacteroides fragilis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40, 41 or 42, or a complementary sequence thereof.
(17) A probe for detecting and / or identifying Staphylococcus hominis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43, 44 or 45, or a complementary sequence thereof.
(18) A probe for detecting and / or identifying Staphylococcus varnerii comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 46, 47 or 48 or a complementary sequence thereof.
(19) A probe for detecting and / or identifying Staphylococcus hemolyticus comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 49, 50 or 51, or a complementary sequence thereof.
(20) A probe for detecting and / or identifying Enterobacter cloaca comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 52, 23 or 53, or a complementary sequence thereof.
(21) A probe for detecting and / or identifying Enterobacter aerogenes, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 54, 55 or 56, or a complementary sequence thereof.
(22) A probe for detecting and / or identifying Staphylococcus epidermidis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 57, 58 or 59, or a complementary sequence thereof.
(23) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus constitutus comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 60, 61 or 62, or a complementary sequence thereof.
(24) A probe for detecting and / or identifying Serratia marcescens, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 63, 23 or 64, or a complementary sequence thereof.
(25) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus anginosas, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 65, 66 or 67, or a complementary sequence thereof.
(26) A probe for detecting and / or identifying Escherichia coli comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 68, 69 or 70, or a complementary sequence thereof.
(27) A probe for detecting and / or identifying Klebsiella pneumoniae, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 54, 71 or 72, or a complementary sequence thereof.
(28) A probe for detecting and / or identifying Enterococcus faecalis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 73, 74 or 75, or a complementary sequence thereof.
(29) A probe for detecting and / or identifying Enterococcus faecium, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 76, 77 or 78, or a complementary sequence thereof.
(30) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus sanguis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 79, 80 or 81, or a complementary sequence thereof.
(31) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus mitis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 82, 83 or 18 or a complementary sequence thereof.
(32) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus intermedius, comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 60, 84 or 67, or a complementary sequence thereof.
(33) A probe for detecting and / or identifying Listeria monocytogenes comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 85, 86 or 87, or a complementary sequence thereof.
(34) A probe for detecting and / or identifying Clostridium perfringens, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 88, 89 or 90, or a complementary sequence thereof.
(35) A probe for detecting and / or identifying Corynebacterium aquatium, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 91, 92 or 93, or a complementary sequence thereof.
(36) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus oralis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 94, 95 or 18 or a complementary sequence thereof.
(37) A probe for detecting and / or identifying Staphylococcus aureus comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 96, 97 or 98, or a complementary sequence thereof.
(38) A probe for detecting and / or identifying Neisseria meningitidis, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 99, 100 or 101, or a complementary sequence thereof.
(39) A probe for detecting and / or identifying Campylobacter fetus comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 102, 103 or 104 or a complementary sequence thereof.
(40) A probe for detecting and / or identifying Enterococcus gallinalum comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 105, 106 or 107, or a complementary sequence thereof.
(41) A probe for detecting and / or identifying Enterococcus caselliflavus comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 108, 106 or 109, or a complementary sequence thereof.
(42) A probe for detecting and / or identifying Aeromonas hydrophila comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 110, 111 or 112, or a complementary sequence thereof.
(43) A probe for detecting and / or identifying Salmonella paratyphi A comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 113, 114 or 53, or a complementary sequence thereof.
(44) A probe for detecting and / or identifying Salmonella typhi comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 115, 114 or 53, or a complementary sequence thereof.
(45) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus equisimilis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 116, 117 or 118, or a complementary sequence thereof.
(46) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus canis comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 119, 120 or 121, or a complementary sequence thereof.
(47) A probe for detecting and / or identifying Klebsiella oxytoca comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 52, 23 or 122, or a complementary sequence thereof.
(48) A probe for detecting and / or identifying Staphylococcus saprophyticus comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 46, 123 or 124, or a complementary sequence thereof.
(49) A probe for detecting and / or identifying Pasteurella multocida comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 125, 126 or 127, or a complementary sequence thereof.
(50) A probe for detecting and / or identifying Echenella collodence, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 128, 129 or 130, or a complementary sequence thereof.
(51) A probe for detecting and / or identifying Streptococcus pyogenes, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 131, 132 or 133, or a complementary sequence thereof.
(52) A probe for detecting and / or identifying Moraxella catarrhalis comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 134, 135 or 136, or a complementary sequence thereof.
(53) A probe for detecting and / or identifying Legionella pneumophila comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 137, 138 or 139, or a complementary sequence thereof.
(54) A probe for detecting and / or identifying Mycobacterium tuberculosis, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 140, 141 or 142, or a complementary sequence thereof.
(55) A probe for detecting and / or identifying Mycobacterium avium, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 143, 144 or 145, or a complementary sequence thereof.
(56) A probe for detecting and / or identifying Mycobacterium intracellulare comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146, 147 or 145, or a complementary sequence thereof.
(57) A probe for detecting and / or identifying Mycobacterium kansasi comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 148, 149 or 145, or a complementary sequence thereof.
(58) A probe for detecting and / or identifying Mycobacterium gordonone, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 150, 151 or 152, or a complementary sequence thereof.
(59) The V1, V2, and V3 regions in each microorganism are identified by homology search in the base sequence of 16S rRNA of a plurality of microorganisms, and between two or more types of microorganisms in the base sequences of the V1, V2, and V3 regions A method for designing a probe, which comprises determining a mismatch site by comparison, and determining a region containing the mismatch site and having a base length of 20 to 100 bp.
(60) Actinobacillus actinomycetemcomitans, Acinetobacter calcoaceticus, Haemophilus influenza, Stenotrophomonas maltofilia, characterized by using one or more probes according to (1) or (2) , Proteus mirabilis, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter frendi, Bayonella parvula, Providencia stuati, Neisseria gonoroe, Streptococcus agaractie, Morganella morgani, Bactosteros Philococcus varnerii, Staphylococcus haemolyticus, Enterobacter cloaca, Enterobacter aerogenes, Sta Philococcus epidermidis, Streptococcus constellatus, Serratia marcescens, Streptococcus anginosas, Escherichia coli, Klebcera pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus fescium, Streptococcus sanguis, Streptococcus medica Monocytogenes, Clostridium perfringens, Corynebacterium aquatium, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Campylobacter fetus, Enterococcus gallinalum, Enterococcus casei flavus, Aeromonas hydrophila, Tiffy A, Salmonella typhi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus canis, Klebcella oxytoka, Staphylococcus saprophyticus, Pasteurella multocida, Aikenella colodense, Streptococcus piogenes, Morakisera phylamoreu A method for detecting and / or identifying one or more microorganisms selected from bacteria tuberculosis, Mycobacterium abium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasi, Mycobacterium gordonae.
(61) The method according to (60), comprising hybridizing both sequences using stringency conditions that do not hybridize when there are four or more mismatches between the base sequence derived from the microorganism and the base sequence of the probe.
(62) Two types having a base sequence having no more than 3 mismatches with a 20-100 bp base sequence in the V1, V2 and V3 regions of the 16S rRNA of the microorganism to be identified or a base sequence of a probe consisting of its complementary sequence Detecting the above-mentioned microorganisms, using one or more probes consisting of a base sequence of 20 to 100 bp in the V1, V2 and V3 regions of the microorganisms different from the two or more microorganisms or a complementary sequence thereof, The method according to (60) or (61), further comprising identifying one kind of microorganism among microorganisms.
(63) The following steps: (a) a step of preparing a nucleic acid from a microorganism to be identified, (b) a step of hybridizing the nucleic acid with the probe according to claim 1 or 2, (c) in step (b) The step of detecting the presence or absence of hybridization and specifying the detection signal pattern for each probe, (d) comparing the detection signal pattern obtained in step (c) with the detection signal pattern of the microorganism specified in advance The method according to (60) or (61), comprising the step of specifying the type of microorganism to be identified.
(64) The method according to any one of (60) to (63), wherein a nucleotide containing the target sequence is amplified using the primers represented by SEQ ID NOs: 153 and 154 and then hybridized with the probe.
(65) The method according to any one of (60) to (64), wherein labeling is performed using a fluorescent substance when a nucleotide containing a target sequence is amplified.
(66) The method according to any one of (60) to (65), wherein detection is performed on a DNA chip.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2002-174564, which is the basis of the priority of the present application.
Description of sequence listing
SEQ ID NO: 153 is a synthetic DNA.
SEQ ID NO: 154 is a synthetic DNA.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The probe for detection and identification of microorganisms of the present invention and the detection and / or identification method using the probe will be described in more detail.
A first aspect of the present invention is a probe for detecting and / or identifying one or more microorganisms selected from the microorganisms shown in Table 1 above, and the 16S rRNA of the microorganism to be detected and / or identified A probe comprising a base sequence of 20 to 100 bp in the V1, V2 and V3 regions of or a complementary sequence thereof.
In the present invention, a probe is an oligonucleotide DNA or RNA that can detect a specific fragment from DNA or RNA fragments by utilizing the property that complementary sequences of nucleic acids specifically bind to each other. It is an oligonucleotide sequence that specifically binds to a target nucleic acid having a nucleotide sequence contained in 16S rRNA or 16S rDNA derived from a microorganism.
The probe capable of detecting and / or identifying each microorganism of the present invention determines a mismatch site by performing multiple alignment between two or more microorganisms to be detected and identified for the V1, V2 and V3 regions of the 16S rRNA of each microorganism. In particular, a region having high specificity to each microorganism can be determined to produce the probe (see FIG. 1). In the present specification, the V1, V2, and V3 regions are three regions of low conservative among the 5S region gene sequences (about 500 bp) of 16S rRNA of each microorganism, and the V1 region is from the 5 'end. It is a region of the 50th to 120th base, the V2 region is a region of the 150th to 260th base, and the V3 region is a region of the 420th to 520th base.
For the detection and identification probe that can be prepared from these V1 to V3 regions, it is appropriate to use a region having many mismatches between microorganisms to be detected and identified from the viewpoint of detection and identification sensitivity, and there are four or more mismatches. Is preferred. Further, considering the detection sensitivity, cost, etc. in the identification method, the base sequence of the probe is preferably 20 to 100 bp, particularly preferably 30 to 80 bp. Note that these probes are referred to as a v1 probe, a v2 probe, and a v3 probe depending on the corresponding regions.
As long as the microorganisms shown in Table 1 can be specifically detected and identified, these probes may be partially modified, or deletions, substitutions or additions may exist in the base sequence.
Specifically, the V1, V2, and V3 regions in each microorganism are identified by homology search in the base sequence of the 16S rRNA of the microorganism described in Table 1, and two or more types of microorganisms are identified in the V1, V2, and V3 regions. The base sequence is compared to determine the mismatch site. Based on the result, a probe containing the mismatch site and having a base length of 20 to 100 bp is prepared. The mismatch site is preferably designed to be near the center of the probe. Among the microorganisms shown in Table 1, a microorganism having a minimum mismatch number of 4 or more between the base sequence of the V1 to V3 region of the microorganism itself and the base sequence of the v1 to v3 probe derived from a microorganism other than the microorganism is a probe. It is a microorganism that can be detected and identified when used alone. A microorganism having a minimum mismatch number of 3 or less is a microorganism that can be detected and identified by comprehensively judging the detection results of a plurality of probes.
Tables 2 and 3 show the ID of the detection identification probe for each microorganism and its sequence number.
For example, as can be seen from Table 2, probes capable of specifically detecting and identifying Actinobacillus actinomycetemcomitans alone are shown in the 01 v2 probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. A 01 v3 probe having a base sequence, or a probe having a complementary sequence thereof, and a probe capable of specifically detecting and identifying Acinetobacter calcoaceticus alone has a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 A probe, a 02 v2 probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, a 02 v3 probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a probe having a complementary sequence thereof.
Table 3 also shows microorganisms that are difficult to detect and identify with a single probe because the 16S rRNA gene sequences are similar to those of other microorganisms. In the case of these microorganisms, individual microorganisms are detected and identified using not only probes designed for detection of the corresponding microorganisms but also hybridization patterns by probes designed for detection of other microorganisms. For example, as shown in Table 4, any of probes 06 v1 to v3 of SEQ ID NOs: 16 to 18 for detecting Streptococcus pneumoniae has the smallest number of mismatches with other microorganisms in the V1 to V3 region. Since it is within 3 bases, it is difficult to detect and identify Streptococcus pneumoniae alone. Therefore, not only probes 06 v1 to v3 of SEQ ID NOs: 16 to 18, but also probes 29 v1 to v3 of SEQ ID NOs: 82, 83, and 18 and probes 34 v1 to v3 of SEQ ID NOs: 94, 95, and 18, or their complements Detection / identification is performed by using a combination of detection results of probes having sequences.
These probes may be of natural origin or by conventional methods such as chemical synthesis, and chemical synthesis may be performed using phosphoramidite using a DNA synthesizer of ABI (Applied Biosystem Inc.), for example. It can be synthesized by the method. Moreover, a well-known phosphoric acid triester method, H-phosphonate method, a phosphite method, etc. can also be used.
A second aspect of the present invention is a method for detecting and / or identifying one or more microorganisms selected from the microorganisms shown in Table 1, which are within the V1, V2 and V3 regions of the 16S rRNA of the microorganism to be detected and identified. Using one or more probes comprising a base sequence of 20-100 bp or a complementary sequence thereof.
Specifically, in the detection and identification method of the present invention, hybridization is performed by bringing the probe into contact with a specimen containing a microorganism or nucleic acid derived therefrom, and the microorganisms in Table 1 are detected and identified using the label as an index. It is a method to do.
A specimen containing a microorganism or a nucleic acid derived therefrom is amplified using a primer capable of amplifying a base sequence containing the V1-V3 region of the 16S rDNA of the microorganism shown in Table 1 when the amount of nucleic acid is small. . A primer is a polynucleotide that serves as a starting point for the elongation of a polynucleotide chain during a nucleic acid synthesis reaction. A forward primer in the present invention is a region that is highly conserved among microorganisms upstream from the V1 region. It is preferable to design from a region present at about the 1st to 70th base, and the reverse primer is a region present at the about 450th to 620th base, which is a highly conserved region among microorganisms downstream from the V3 region. It is preferable to design from The size is preferably 15 to 35 mer, and particularly preferably 18 to 30 mer. For example, as a forward primer, the 27F primer shown in SEQ ID NO: 153 below is located approximately at the first to 70th bases, and the reverse primer is approximately located at the 450th to 620th bases. 525R shown in SEQ ID NO: 154 below can be used. These primers may be naturally derived or chemically synthesized by a conventional method. The chemical synthesis can be performed, for example, by the phosphoramidite method using a DNA synthesizer manufactured by ABI (Applied Biosystem Inc.). Moreover, a well-known phosphoric acid triester method, H-phosphonate method, a phosphite method, etc. can also be used.
Next, a PCR method (Science 230, 1350 (1985)) is performed using the extracted nucleic acid as a template and the above primers. In the present invention, by using the above primers (SEQ ID NOs: 153 and 154), the 27th to 525th bases from the 5 ′ end of the 16S rDNA base sequence of the microorganism and the sequence in the vicinity thereof can be amplified. preferable. Reaction conditions and reaction solutions for the PCR method can be arbitrarily set based on known information. For example, heat denaturation: 90 to 95 ° C. for 1 to 30 seconds, annealing: 37 to 65 ° C. for 0 to 30 seconds, extension reaction: 50 to 75 ° C. for 10 to 60 seconds, and this as one cycle for 30 to 50 cycles Is preferably amplified. As a result of amplification by the PCR method, the presence of the amplified nucleotide and its length can be confirmed by subjecting the solution after the reaction to agarol gel electrophoresis as it is.
The amplified microorganism nucleic acid can be used for hybridization using the probe of the present invention. In the present invention, hybridization means that two single-stranded base sequences having complementary sequences are combined to form a double strand under specific conditions. The specific condition means a stringent condition in hybridization. In particular, in the present invention, hybridization occurs when there are 4 or more mismatches between the base sequence derived from the microorganism and the base sequence of the probe of the present invention. It means a condition that does not. Stringent conditions vary depending on the hybridization conditions to be performed, but those skilled in the art should appropriately set conditions such as solvent composition such as temperature, salt concentration, and active agent concentration based on the hybridization protocol. Can do. As an example, in the case of hybridization with a 50-mer probe, it can be carried out at 55 ° C., 0.5 × SSC, and 0.2% SDS. Depending on the purpose, the stringency can be increased so that the number of mismatches is 3 or more, 2 or more, or 1 or more. In addition, by setting the stringency low, it is possible to set so that hybridization can be performed even when there are 5 or less mismatches or 6 or less mismatches.
Whether hybridization is possible or not was extracted from the microorganism prepared as described above, and the amplified nucleic acid was previously labeled with a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate or tetramethylrhodamine isothiocyanate or a hapten, and the probe was labeled as described above. After hybridization with a nucleic acid, it can be confirmed by measuring a label such as a fluorescent dye. The labeling can be obtained, for example, by performing nucleic acid amplification using a nick translation method, a method using DNA polymerase, or a labeled primer whose 5 ′ end is labeled with a fluorescent substance or a hapten.
The detection and identification method of the present invention includes a method of detecting and identifying specific microorganisms shown in Table 2 by using a single probe. For example, the minimum mismatch number is 4 between the base sequence of a probe consisting of a base sequence of 20 to 100 bp in the V1 to V3 region of the microorganism itself to be identified or its complementary sequence and the base sequence derived from a microorganism other than the microorganism. By using more than one probe, microorganisms can be detected and identified (see Tables 2 and 4).
The method of the present invention also includes a method of detecting and further identifying specific microorganisms shown in Table 3 by comprehensively judging the detection results obtained by the plurality of probes of the present invention. Specifically, as a first step, there are 3 or fewer mismatches with a 20-100 bp nucleotide sequence in the V1, V2 and V3 regions of the 16S rRNA of the microorganism to be identified or a probe nucleotide sequence consisting of its complementary sequence. A probe comprising a 20-100 bp nucleotide sequence in the V1, V2 and V3 regions of a microorganism different from the two or more microorganisms or a complementary sequence thereof as a second step, detecting two or more microorganisms having a certain nucleotide sequence The method of further identifying one of the two or more microorganisms using one or more of the above.
For example, an example is shown in Table 61 (see Example 3). The 06 v1-v3 probe of the ID 06 microorganism (Streptococcus pneumoniae) and the base sequence corresponding to the ID 29 microorganism (Streptococcus mitis) have 3 or fewer mismatches, and are detected using the 06 v1-v3 probe. Microorganisms cannot be identified until they are ID 06 microorganisms or ID 29 microorganisms. However, as a second step, when a detection method is performed using 34 v1 to v3 probes derived from ID 34 microorganisms (Streptococcus oralis), the ID 06 microorganisms hybridize only with the 34 v3 probes and signals are detected. The 29 microorganisms hybridize with the 34 v2 and v3 probes, respectively, and the signal is detected. Therefore, the microorganism detected using the 06 v1 to v3 probe is further detected using the 34 v1 to v3 probe derived from the ID 34 microorganism (Streptococcus oralis), so that it is an ID 06 microorganism or an ID 29 microorganism. Can be identified.
In the field of clinical and food hygiene, it is necessary to quickly check whether there is a possibility that the microorganism to be detected is present in the sample. When a plurality of microorganisms that can be detected are closely related species and a coping method such as a treatment method for the plurality of microorganisms is already clear, it is only necessary to perform the first step.
The method of the present invention includes (a) a step of preparing a nucleic acid from a microorganism to be identified, (b) a step of hybridizing the nucleic acid with the probe of the present invention, (c) a step of hybridization in step (b). A step of detecting presence / absence and specifying a detection signal pattern for each probe, (d) a detection signal pattern obtained in step (c), and a detection signal pattern of microorganisms shown in Table 1 specified in advance A method comprising the step of identifying the type of microorganism to be identified by comparing the above is also included. In this case, the detection and identification efficiency of the microorganism can be further enhanced by analyzing the detection signal pattern by computer processing or the like. In addition, the method based on the detection signal pattern can be performed more rapidly and effectively by being performed on a DNA chip.
Specifically, the detection and identification method on the DNA chip can be carried out as follows. The probe of the present invention is immobilized by covalent bonding or the like at each position (spot) on a support such as glass or silicon. When the solution containing the labeled nucleic acid obtained as described above is applied to the support, the base sequence of the nucleic acid derived from the microorganism in the sample having a base sequence complementary to the base sequence of the probe in each spot is obtained. Hybridizes to form a double strand and remains on the support. By measuring the label of the hybridized conjugate or the label that has not been hybridized, the microorganism in the sample can be detected and identified.
Example
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Preparation of probe for identification of microorganism and production of identification chip
(Microbe for probe preparation)
In order to prepare the probe of the present invention, the microorganisms shown in Table 1 were used as standard strains. Microorganisms have been transferred to the American Type Culture Collection (ATCC Co., Ltd.) and the National Institute for Product Evaluation Technology Biological Genetic Resources Division (Fermentation Research Institute (IFO)), and have been transferring microorganisms. ) (IFO Co., Ltd.), the University of Tokyo Institute of Medical Science (IID Co., Ltd.), etc.
(Determination of V1, V2, and V3 regions of 16S rDNA 5 ′ region gene sequence (about 500 bp) of microorganism, determination of base sequence usable as probe, and preparation of probe)
The V1, V2, and V3 regions of the microorganisms shown in Table 1 were determined by performing multiple alignment (Hitachi Soft DNASIS Pro) on the base sequence obtained by decoding 16S rRNA with a sequencer (Applied Biosystem). Furthermore, mismatch sites were identified in these regions using an algorithm called blast (Hitachi Soft DNASIS Pro). The base sequence of the probe was designed so that the mismatch site was near the center.
Table 4 shows the minimum number of mismatched bases in the case of assuming that the v1 to v3 probes designed for each microorganism are hybridized with the sequences of the V1 to V3 regions of microorganisms other than the microorganism from which each probe is derived. Is a numerical value (minimum mismatch number). If any of the v1 to v3 probes has a minimum mismatch number of 4 or more, the microorganism can be detected and identified by a single probe. In any of the v1 to v3 probes, when the minimum mismatch number is 3 or less, detection and identification cannot be performed by a single probe, but detection and identification can be performed by the method of the present invention as described later. In Table 4, “none” means that there was no significant homologous sequence.
Each v1 to v3 probe of the microorganisms shown in Table 1 was synthesized and stored in a lyophilized state after HPLC purification. These were adjusted to 20 μM and mixed 1: 1 with a microarray spotting solution (Genetics). All samples were spotted on 2 × 4 blocks with a spotter (Hitachi Soft SPBIO) to make a total of 4 × 4 blocks including replicas. Positive controls were spotted at the four ends of each block. The pin used in the spotter was a stainless steel pin 150 μm. After spotting, it was placed in 0.2% SDS solution / water / boiling water, and the chip was washed with a slide washer (Biofield) and used for the following experiments.
[Example 2] Microbial identification method using microorganism identification probe
(Preparation of microbial DNA extraction solution)
The microorganisms shown in Table 1 were cultured on LB medium agar medium (yeast extract 5 g, tryptone 10 g, NaCl 5 g, agar 20 g, distilled water 1 L, pH 7.4), and then collected. Cell Suspension Solution (Gentra System) solution at 37 ° C. with 300 μl of 1% Tween20 (Sigma), 60 Unit Lytic Enzyme (Gentra Systems), 600 Unit Achromopeptidase (Wako Pure Chemicals) at 37 ° C. Warm up. Next, 30 μl of 600 mU / μl Proteinase K solution was added and heated at 70 ° C. for 10 minutes.
To this solution, 330 μl of 5M guanidine hydrochloride-100 mM Tris hydrochloric acid solution (pH 8.0) was added and mixed for 10 minutes. Thereafter, 600 μl of TE saturated phenol: chloroform solution (1: 1) was added and suspended, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at 25 ° C. using a micro high-speed centrifuge. 600 μl of the upper layer was collected, 60 μl of 3M sodium acetate (pH 6.0), 1800 μl of 99.5% ethanol were added and mixed, allowed to stand at −80 ° C. for 10 minutes, and then centrifuged at 8,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. After rinsing with 70% cold ethanol, the precipitate was dried, and 100 μl of sterilized distilled water was added and dissolved sufficiently. This solution was subjected to PCR.
(Amplification of target DNA by PCR)
PCR was performed using a GeneAmp9600 system (Roche diagnostics) in a reaction volume of 50 μl. In 50 μl of the reaction solution, 1 μl of template DNA (the above microbial DNA extraction solution), 5 μl of 10 × buffer (for Z-Taq), 0.75 units Z-Taq (Takara Shuzo), 6 nmole dNTPs, forward primer 27F (SEQ ID NO: 153) ), Reverse primer 525R (SEQ ID NO: 154), each containing 6 pmole.
PCR conditions were 98 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 1 second and 60 ° C. for 90 seconds for 1 cycle, and 35 cycles were reacted to obtain a PCR amplification product of the target gene in the microorganism. After the reaction, Sephadex TM After removing the substrate by spin column method using G50 Fine (Amersham pharmacia biotech), it was concentrated to dryness by lyophilization and dissolved in 10 μl of sterilized ultrapure water to obtain a target DNA solution.
(Label of PCR amplification product)
Using the Nick Translation Kit (Roche Diagnostics), the above target DNA was fluorinated. TM Labeled with Cy5-dUTP (Amersham pharmacia biotech). In 20 μl of labeling reaction solution, 1 μg of the above target DNA solution, 3.5 μl Enzyme mix, 0.04 mM dATP, 0.04 mM dCTP, 0.04 mM dGTP, 2 μl 10 × buffer, 0.1 mM FluoroLink TM Cy5-dUTP is included. The reaction conditions were 15 ° C. and 2 hours. After reaction, Sephadex TM It refine | purified by the spin column method by G50 Fine (Amersham pharmacia biotech). The purified reaction product was lyophilized and dissolved in 10 μl of sterile ultrapure water.
(Hybridization)
2 μl of the labeled target DNA was added, and the hybridization solution was adjusted so that the final concentration was 50% formamide, 5 × SSC, 2% SDS, 1% BSA. 15 μl of this solution was denatured at 98 ° C. for 2 minutes.
The solution was dropped onto the microorganism identification chip prepared in Example 1, 24 × 25 mm hybrid cover slide (BM Equipment Co., Ltd.) was placed, and reacted in a constant temperature bath at 55 ° C. for 2 hours. After the reaction, the bacteria identification chip was immersed in a 2 × ssc solution, and the hybrid cover slide was slid down. Further, it was transferred to 2 × SSC, 0.2% SDS solution, washed for 5 minutes, and then washed with 0.2 × SSC, 0.2% SDS for 5 minutes. Further, it was washed with 0.5 × SSC for 1 minute.
The microorganism identification chip was centrifuged and dried at 2000 rpm for 1 minute, and then signals were detected at room temperature and room temperature using ScanArray 4000 (Packard BioChip Technologies, LLC). In order to determine the intensity of the signal more clearly, the detected signal was quantified by Hitachi Soft DNASIS (Registered Trademark) Array to obtain a luminance value.
Table 5 shows a polynucleotide having a sequence containing the V1-V3 region of 16S rRNA of Actinobacillus actinomycetemcomitans with microorganism ID 01, v1 probe, v2 probe, and v3 of each microorganism prepared on a microorganism identification chip. The top 10 probes that were hybridized with the probes and had high signal luminance values were shown for each region. In Table 5, the probe ID is a combination of the microorganism ID number shown in Table 1 and the v1 to v3 regions.
For example, when looking at the results of the V1 region of 16S rRNA of Actinobacillus actinomycetemcomitans, the luminance value of probe 01 v1 is remarkably high, so that probe 01 v1 has actinobacillus actinomycetemcomitans in the subject. It can be detected that it may exist. However, in this case, since the probe 03 v1 shows a similar luminance value other than the probe 01 v1, identification by using the probe 01 v1 alone cannot be performed. This is because the base sequence of probe 01 v1 has 3 or fewer mismatched bases relative to base sequences derived from other microorganisms, and therefore hybridizes with other microorganisms having a base sequence highly homologous to similar probe 01 v1. This is because soybeans are produced (see Table 1). Therefore, if it is necessary to identify in detail which microorganism is detected by the probe 01 v1, it is necessary to perform a further identification step.
On the other hand, the results of the 16S rRNA V2 region of Actinobacillus actinomycetemcomitans show that the order of the luminance value of probe 01 v2 is significantly higher than that of other probes. The presence of Actinobacillus actinomycetemcomitans can be detected and identified.
Further, when the results of the 16S rRNA V3 region of Actinobacillus actinomycetemcomitans are examined, the order of the luminance value of probe 01 v3 is significantly higher than that of other probes. The presence of Actinobacillus actinomycetemcomitans can be detected and identified.
Also, comprehensively judging from the combination of probes in the V1, V2, and V3 regions, the probes with relatively high signal intensity in the v1 probe are 03 v1 and 01 v1, and the signal intensity is relatively high in the v2 probe. Since the probe is 01 v2 and the probe having a relatively strong signal intensity in the v3 probe is 01 v3, the target microorganism is actinobacillus actinomycetemcomi in which a strong signal intensity is detected in all regions. It can be detected and identified as an instance.
The microorganism-derived v1, v2, and v3 probes listed in Table 3 above all have 3 or fewer mismatches between the nucleotide sequence and the nucleotide sequence derived from another microorganism. Cross hybridization is likely to occur, and it was difficult to detect and identify with a single probe. For this reason, the microorganisms listed in Table 3 above are grouped according to their detection signal trends, and the results of hybridization detection signals using v1, v2 and v3 probes derived from these microorganisms are comprehensively examined. Then, it was identified which genus species the microorganism was.
For example, Streptococcus pneumoniae (microorganism ID 06), Streptococcus mitis (microorganism ID 29) and Streptococcus oralis (microorganism ID 34) are bacteria of the same genus and are highly homologous and difficult to distinguish from each other.・ Pneumonier and Streptococcus mitis were indistinguishable with a single probe. Therefore, these were collected as group A, and when it was determined that the subject was one of these three types, further identification work was performed using three types of v1 to v3 probes corresponding to each. Table 61 shows the detection signal results for each probe for each of the three types of microorganisms, Streptococcus pneumoniae (microorganism ID 06), Streptococcus mitis (microorganism ID 29), and Streptococcus oralis (microorganism ID 34). It was summarized in.
Similarly, Staphylococcus hominis (microorganism ID 15), Staphylococcus varnerii (microorganism ID 16), Staphylococcus haemolyticus (microorganism ID 17), Staphylococcus epidermidis (microorganism ID 20), Staphylococcus Aureus (microorganism ID 35) and staphylococcus saprophyticus (microorganism ID 46) have the same genus and thus have high similarity in 16S rRNA gene sequences and are difficult to distinguish from each other.・ Hominis, Streptococcus varnerii, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis could not be distinguished by a single probe. Therefore, these microorganisms were set as group B, and unique detection signal patterns for each probe of each microorganism were examined. The results are shown in Table 62. As a result, it was found that the microorganisms can be identified based on the unique detection signal pattern of each microorganism.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
Industrial applicability
Among the 16S rRNA base sequences of the microorganism of the present invention, a probe designed from the base sequences of the V1, V2 and V3 regions with particularly high specificity is used to amplify by PCR using a nucleic acid extracted from the microorganism as the template By performing and analyzing the obtained amplification product, harmful bacteria can be specifically and rapidly detected and identified in the fields of medicine and food.
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing V1, V2, and V3 regions in the base sequence of 16S rRNA of microorganisms.
Claims (8)
（ａ）試料中の微生物から核酸を調製する工程、
（ｂ）該核酸と、検出及び／又は同定すべき複数種の微生物の16s rRNAのV1、V2及びV3領域内の20〜100bpの塩基配列又はその相補配列から選択される配列からなるプローブとを、該核酸の塩基配列と該プローブの塩基配列間でミスマッチが４個以上ある場合にハイブリダイズしないようにストリンジェンシー条件を設定して、そのストリンジェンシー条件を用いてハイブリダイズさせる工程であって、但し該プローブとして、該微生物の16s rRNAのV1、V2及びV3領域のそれぞれに由来するプローブを含む３種以上のプローブを用いる、工程、
（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイズの有無を検出し、各プローブに対するその検出シグナルパターンを特定する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において得られた検出シグナルパターンと、予め特定しておいた検出及び／又は同定すべき各微生物の検出シグナルパターンとを比較して、微生物の種類を特定する工程、
を含む微生物の検出及び／又は同定方法。The following steps:
(A) a step of preparing a nucleic acid from a microorganism in a sample;
(B) a probe comprising the nucleic acid and a sequence selected from a base sequence of 20 to 100 bp in the V1, V2 and V3 regions of 16s rRNA of a plurality of types of microorganisms to be detected and / or identified or a complementary sequence thereof A stringency condition is set so as not to hybridize when there are four or more mismatches between the nucleic acid base sequence and the probe base sequence, and hybridization is performed using the stringency condition, However, a process using three or more kinds of probes including probes derived from the V1, V2 and V3 regions of the 16s rRNA of the microorganism as the probes,
(C) detecting the presence or absence of hybridization in the step (b), and specifying the detection signal pattern for each probe;
(D) comparing the detection signal pattern obtained in step (c) with the detection signal pattern of each microorganism to be detected and / or identified in advance, and identifying the type of microorganism,
A method for detecting and / or identifying a microorganism comprising
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