JP4415079B2 - Method for measuring the absolute expression level of genes - Google Patents
Method for measuring the absolute expression level of genes Download PDFInfo
- Publication number
- JP4415079B2 JP4415079B2 JP2003317031A JP2003317031A JP4415079B2 JP 4415079 B2 JP4415079 B2 JP 4415079B2 JP 2003317031 A JP2003317031 A JP 2003317031A JP 2003317031 A JP2003317031 A JP 2003317031A JP 4415079 B2 JP4415079 B2 JP 4415079B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- spike
- sample
- amount
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 36
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 61
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 47
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 13
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 231100000045 chemical toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N pentachlorophenol Chemical compound OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 2
- SRUQARLMFOLRDN-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,5-Trihydroxyphenyl)-1-butanone Chemical compound CCCC(=O)C1=CC(O)=C(O)C=C1O SRUQARLMFOLRDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100219091 Bacillus subtilis (strain 168) bshB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100039386 Ketimine reductase mu-crystallin Human genes 0.000 description 1
- 101000772180 Lithobates catesbeianus Transthyretin Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108091006208 SLC3 Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046764 Uterine atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101100068489 Vicia faba AGPC gene Proteins 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- XFIOKOXROGCUQX-UHFFFAOYSA-N chloroform;guanidine;phenol Chemical compound NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 XFIOKOXROGCUQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- -1 jojF Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011173 large scale experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 101150012611 lys gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 101150023849 pheA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100001042 uterine atrophy Toxicity 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、遺伝子の絶対発現量を測定する方法、詳しくはcDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the absolute expression level of a gene, and more particularly to a method for measuring the absolute expression level of a gene per cell in a comprehensive mRNA measurement such as a cDNA microarray method.
一つの生物や細胞における遺伝子の発現状態の全貌であるトランスクリプトームを網羅的にハイスループットに解析する強力なツールとして、cDNAマイクロアレイが利用されている。cDNAマイクロアレイ法は、アレイ基板上に数百〜数万のDNAのためのプローブを整列・固定させ、標識した試料RNA（ターゲット）をハイブリダイズさせることによって、ゲノムスケールで全ての遺伝子の発現パターンを同時に知ることができる。 CDNA microarrays are used as a powerful tool for comprehensively analyzing high-throughput transcriptome, which is the entire state of gene expression in one organism or cell. In the cDNA microarray method, probes for hundreds to tens of thousands of DNAs are aligned and fixed on an array substrate, and labeled sample RNA (target) is hybridized to express the expression pattern of all genes on a genome scale. You can know at the same time.
マイクロアレイデータは、別々に調製された異なるサンプルからのシグナルを異なる蛍光物質で標識して検出するので、複数のサンプルからの生データを正規化（ノーマライゼーション）する必要がある。正規化の方法としては、(i)各スポットから得られる蛍光シグナルの総計や中間(median)値より補正係数を算出し、各スポットの蛍光シグナル強度を補正するグローバル補正（非特許文献１）、（ii)各細胞における発現量が一定と考えられる遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の蛍光シグナル強度より補正係数を算出し、各スポットの蛍光シグナル強度を補正する方法（非特許文献２）などがある。これらの方法は、「大多数の遺伝子の発現レベルは一定であって、わずかな遺伝子だけしか事象（疾病、薬剤投与など）によって変化しない。」という仮定に基づいていることから、大幅に変動した遺伝子以外で実際に変動している遺伝子の存在が無視されてしまう点、あるいは実際に変動している遺伝子と変動しなかった遺伝子との区別が不可能であるという点で、正確性を欠く。 Since microarray data detects signals from different samples prepared separately and labeled with different fluorescent materials, it is necessary to normalize the raw data from multiple samples. As a normalization method, (i) a global correction (Non-patent Document 1) for calculating a correction coefficient from the total or median value of fluorescence signals obtained from each spot and correcting the fluorescence signal intensity of each spot, (Ii) A method of calculating a correction coefficient from the fluorescence signal intensity of a gene (eg, housekeeping gene) whose expression level is considered to be constant in each cell, and correcting the fluorescence signal intensity of each spot (Non-Patent Document 2), etc. is there. These methods have varied greatly because they are based on the assumption that the expression level of the majority of genes is constant and only a few genes change with events (disease, drug administration, etc.). The accuracy is lacking in that the presence of a gene that is actually fluctuating other than a gene is ignored, or that it is impossible to distinguish between a fluctuating gene and a gene that has not fluctuated.
また、現在のトランスクリプトーム解析は、mRNAの絶対量を得るようには設計されていない。例えば、ハイブリダイゼーション条件を最適範囲に保持するために、同量の全RNAが各マイクロアレイに適用される。しかしながら、このようなアプローチでは、標的組織又は細胞中のmRNAの定量的情報が抹消され、高濃度で存在するmRNAも微量に存在するmRNAも全RNAに対する比率として扱われてしまう。 Also, current transcriptome analysis is not designed to obtain absolute amounts of mRNA. For example, the same amount of total RNA is applied to each microarray to keep the hybridization conditions in the optimal range. However, in such an approach, quantitative information of mRNA in the target tissue or cell is deleted, and mRNA present at a high concentration and mRNA present in a minute amount are treated as a ratio to the total RNA.
さらに、データは通常、同時に存在する対照（１又は複数）に対して、又は実験全体の全遺伝子発現レベルに対して何倍増加したか、又は何倍減少したかという比率で表される。対照に対する比率をとった場合、分母がゼロに近いとノイズが比率データにおいて著しく増幅されるといったような不都合や、対照の発現プロフィールが実験間で異なると実験間で比率データを容易に比較することができないなどの問題がある。このような欠点は、薬剤や化学物質の毒性試験のような大規模スケールの複数の実験からなるデータベースを作成することを目的としたプロジェクトにおいて致命的である。 Furthermore, the data is usually expressed as a ratio of how many times increased or decreased relative to the co-existing control (s) or to the total gene expression level of the whole experiment. When taking a ratio to the control, it is easy to compare the ratio data between experiments if the denominator is close to zero and noise is significantly amplified in the ratio data, or if the control expression profile differs between experiments. There are problems such as being unable to. Such drawbacks are fatal in projects aimed at creating a database of multiple large-scale experiments such as drug and chemical toxicity tests.
一方、マイクロアレイ上の多くの遺伝子の発現量を正確に定量するため、アレイ上に大腸菌遺伝子用のプローブを配置し、大腸菌遺伝子由来のcDNAの一定量をサンプル中に混合し、その検出シグナルをコントロール（スパイキングコントロール）とすることによって、アレイ間の標準化を行うという手法がある。しかしながら、この方法は、マイクロアレイ上での蛍光強度を標準化するもの、換言すれば、全RNA量を対象に標準化するものである。また、ある一つの濃度での補正であるから、原点（無添加）との２点を結んだ直線に対してのみ標準化するにすぎず、アレイ上の測定スポットのシグナル／濃度特性が比例関係にあるという前提でしか使用できない。その結果、細胞１個当たりの絶対量を求めることは不可能であるのみならず、全RNAに対してもマイクロアレイの特性を無視した不正確な補正にとどまる。 On the other hand, in order to accurately quantify the expression level of many genes on the microarray, probes for E. coli genes are placed on the array, and a certain amount of cDNA derived from E. coli genes is mixed in the sample, and the detection signal is controlled. There is a technique of performing standardization between arrays by using (spiking control). However, this method standardizes the fluorescence intensity on the microarray, in other words, standardizes the total RNA amount. In addition, since it is correction at a certain concentration, it is only standardized for the straight line connecting the two points with the origin (no addition), and the signal / concentration characteristics of the measurement spot on the array are proportional. Can only be used on the premise that there is. As a result, it is not only impossible to determine the absolute amount per cell, but it is also an inaccurate correction that ignores the characteristics of the microarray for all RNAs.
かかる状況下、マイクロアレイ解析において、生物学的興味の対象は対照サンプルに対する変化よりはむしろ、単一細胞中の各mRNA分子数の変化をモニタリングすることに移行してきている。データが「細胞１個当たりの」値として生成されるならば、複数の実験からデータベースを構築するために、そして最終的には各生物学的イベントに関与する遺伝子カスケード情報を得るために最適である。 Under such circumstances, in microarray analysis, the subject of biological interest has moved to monitoring changes in the number of each mRNA molecule in a single cell, rather than changes relative to a control sample. If the data is generated as “per cell” values, it is best to build a database from multiple experiments and ultimately to obtain genetic cascade information involved in each biological event. is there.
従って、本発明は、cDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for measuring the absolute expression level of a gene per cell in comprehensive mRNA measurement such as cDNA microarray method.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを含む混合物が、用量−作用標準曲線として用いられると同時にサンプル中の細胞数の直接的指標となりうるという知見を得た。そして、この混合物をサンプルの細胞数又はDNA濃度に比例する量で添加して遺伝子発現を測定すると、対照を含む全てのサンプルのデータがゼロから始まる均等目盛でプロットでき、得られた測定値が細胞１個当たりの絶対量に変換できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used a mixture containing spike RNAs having a plurality of different base sequences as a dose-effect standard curve, and at the same time, directly calculating the number of cells in a sample. The knowledge that it can become a target index was obtained. And when this mixture is added in an amount proportional to the cell number or DNA concentration of the sample and the gene expression is measured, the data of all the samples including the control can be plotted on a uniform scale starting from zero, and the measured value obtained is The inventors have found that it can be converted into an absolute amount per cell, and have completed the present invention.
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の工程を含む、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法。
(a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程
(b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程
(c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程
(d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for measuring the absolute expression level of a gene per cell, comprising the following steps.
(a) A step of measuring the number of homogenates in a biological sample or measuring the amount of DNA
(b) a step of preparing a mixture that does not cross-hybridize with the gene in the homogenate and includes spike RNAs having a plurality of different base sequences at multiple concentrations
(c) adding a known amount of the mixture that correlates with the number of cells or the amount of DNA to the homogenate, and extracting the RNA to prepare a sample sample
(d) A step of determining the absolute expression level of the gene per cell from the measured value of the RNA of the sample sample using a calibration curve prepared based on the measured value of the spike RNA
(2) スパイクRNAの測定値が、下記式で表される直線上にプロットされることを特徴とする、(1)に記載の方法。 (2) The method according to (1), wherein the measured values of spike RNA are plotted on a straight line represented by the following formula:
(3) 検体サンプルのRNAの測定値が、cDNAマイクロアレイ法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られたものである、(1)又は(2)に記載の方法。 (3) The method according to (1) or (2), wherein the RNA measurement value of the specimen sample is obtained by a cDNA microarray method or a quantitative RT-PCR method.
本発明の方法によれば、cDNAマイクロアレイ法等が生成する遺伝子データを細胞１個当たりの絶対量としてゼロを原点する均等目盛（linear scale)表示をすることができる。従って、従来の比率表示や対数表示を介したノーマライズ化手法による数値変換を一切必要としない。また、遺伝子発現量の多寡や、対照群での発現の有無に左右されず、生成された遺伝子データの全てを用いたデータベースを構築することが可能となり、トランスクリプトーム解析を飛躍的に効率化、精密化することが可能となる。 According to the method of the present invention, gene data generated by the cDNA microarray method or the like can be displayed on a linear scale from zero as the absolute amount per cell. Therefore, there is no need for any numerical conversion by the normalization method via the conventional ratio display or logarithmic display. In addition, it is possible to construct a database using all gene data generated regardless of the amount of gene expression and the presence or absence of expression in the control group, dramatically improving the efficiency of transcriptome analysis. It becomes possible to refine.
本発明によれば、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法が提供され、該方法は以下のステップを含む。
(a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程
(b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程
(c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程
(d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程
各工程について以下に説明する。
According to the present invention, a method for measuring the absolute expression level of a gene per cell is provided, and the method includes the following steps.
(a) A step of measuring the number of homogenates in a biological sample or measuring the amount of DNA
(b) a step of preparing a mixture that does not cross-hybridize with the gene in the homogenate and includes spike RNAs having a plurality of different base sequences at multiple concentrations
(c) adding a known amount of the mixture that correlates with the number of cells or the amount of DNA to the homogenate, and extracting the RNA to prepare a sample sample
(d) Step of obtaining an absolute expression level of a gene per cell from a measured value of RNA of a sample sample using a calibration curve created based on the measured value of spike RNA Each step will be described below.
まず、工程(a)では、培養細胞や臓器などの生体試料よりホモジネートを調製する。ここで、測定対象とする生体試料としては組織又は細胞が挙げられる。 First, in step (a), a homogenate is prepared from a biological sample such as cultured cells or organs. Here, the biological sample to be measured includes tissues or cells.
生体試料のホモジネートの調製は定法に従って行う。例えば、組織の場合、凍結した組織を液体窒素中でホモジナイザーなどの細胞破砕装置を使用して粉砕する方法で行えばよい。 A homogenate of a biological sample is prepared according to a conventional method. For example, in the case of a tissue, the frozen tissue may be pulverized in liquid nitrogen using a cell crushing device such as a homogenizer.
次に、培養細胞のように細胞数を容易に計測又は確実に推定できる場合は、その細胞数を計測し、臓器のように細胞数を測定することが手技的に困難な場合は、DNA量を測定する。 Next, if the number of cells can be easily measured or reliably estimated as in cultured cells, the number of cells should be measured, and if it is difficult to measure the number of cells as in organs, the amount of DNA Measure.
細胞数の計測の方法は生体試料の種類によって異なるが、培養細胞の場合を例にとると、RNA抽出用と同一条件で培養した細胞を単離し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントすることによって行う。 The method for measuring the number of cells varies depending on the type of biological sample. For example, in the case of cultured cells, cells cultured under the same conditions as for RNA extraction are isolated, and the number of cells is counted using a hemocytometer By doing.
DNA量を測定する場合は、Picogreen色素を利用した「DNA量直接測定法」により行う。本方法は上記のホモジネートのアリコートを10μlという極微量用いるだけでDNA量を測定できるので、次の工程で行うRNA抽出用の試料を十分な量確保できる上で好ましい。 When measuring the amount of DNA, the “direct DNA amount measurement method” using Picogreen dye is used. This method is preferable in that a sufficient amount of a sample for RNA extraction to be performed in the next step can be ensured because the amount of DNA can be measured only by using an aliquot of the above-mentioned homogenate in an extremely small amount of 10 μl.
また、RNA抽出サンプルの一部を用いて実施できるのでDNAとRNAのための別個のサンプルを必要とせず、迅速かつ簡便であり、しかも再現性もよい。 Moreover, since it can carry out using a part of RNA extraction sample, it does not require the separate sample for DNA and RNA, it is quick and simple, and also reproducibility is good.
具体的には、標準試料としてλファージDNAを用い、上記ホモジネートのアリコートにRNase及びProtenase K処理を施した粗精製検体に蛍光色素Picogreenを加え、振とう、インキュベーション後、蛍光測定（励起485nm／発光538nm）を行う。蛍光測定には市販の蛍光測定装置（例えば、FluorImager(アマシャム ファルマシア バイオテク社製）等が利用できる。 Specifically, λ phage DNA was used as a standard sample, and the fluorescent dye Picogreen was added to a crudely purified sample that had been treated with RNase and Protenase K to an aliquot of the homogenate. After shaking, incubation, fluorescence measurement (excitation 485 nm / luminescence) 538 nm). A commercially available fluorescence measuring device (for example, FluorImager (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech)) or the like can be used for the fluorescence measurement.
DNA量（濃度）は、蛍光測定装置で読み取った蛍光測定値（Ｆ）から、下記の濃度-蛍光換算式を用いて求めることができる。 The DNA amount (concentration) can be determined from the fluorescence measurement value (F) read by the fluorescence measuring device using the following concentration-fluorescence conversion formula.
1個の細胞のDNA量は生物の種（species)によって既知で一定であるから、ここで測定されるDNA量からホモジネート中の細胞数が一義的に決定できる。 Since the amount of DNA in one cell is known and constant depending on the species of the organism, the number of cells in the homogenate can be uniquely determined from the amount of DNA measured here.
次に、工程(b)では、前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する。 Next, in step (b), a mixture is prepared which contains spike RNAs having a plurality of different base sequences that do not cross-hybridize with the genes in the homogenate and have a plurality of different base sequences.
本明細書において、「スパイクRNA」とは、mRNA測定系に添加する検量線作成用の標準RNAをいう。スパイクRNAは、ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズしない遺伝子、例えば、ヒト、マウス、ラットに発現しない遺伝子であれば特に限定はされないが、具体的には、大腸菌(E.coli)、枯草菌（B.subtilis)のRNAなどが好適に使用される。用いるスパイクRNAは異なる塩基配列を有していればよく、数はスパイクRNAの測定値（cDNAマイクロアレイ法ではシグナル強度、定量的RT-PCR法ではCt値）から検量線を作成する上で、４〜８個、好ましくは、５〜７個とすることが例示される。 In the present specification, “spike RNA” refers to standard RNA for preparing a calibration curve added to the mRNA measurement system. The spike RNA is not particularly limited as long as it is a gene that does not cross-hybridize with the gene in the homogenate, for example, a gene that is not expressed in humans, mice, or rats. Specifically, E. coli, Bacillus subtilis ( B. subtilis) RNA and the like are preferably used. The spike RNA to be used only needs to have a different base sequence, and the number is 4 in creating a calibration curve from the spike RNA measurement value (signal intensity in the cDNA microarray method, Ct value in the quantitative RT-PCR method). -8, preferably 5-7 is exemplified.
スパイクRNAの多段階濃度の範囲は、測定する検体サンプル中のRNA量（例えば、GeneChipTM(Affymetrix)を用いる場合ハイブリダイゼーション液中で1.2pM〜97.2pM）をカバーできるような範囲に、連続希釈系列(例えば、ｘ、３ｘ、３２ｘ、３３ｘ・・・・）で設定する。本明細書において、このスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を「多段階用量スパイクカクテル(GSC:graded-dosed spike cocktail)」という。 The range of the spike RNA multi-step concentration is a range that can cover the amount of RNA in the sample to be measured (for example, 1.2 pM to 97.2 pM in the hybridization solution when GeneChip TM (Affymetrix) is used). Set in series (for example, x, 3x, 3 2 x, 3 3 x...). In the present specification, a mixture containing this spike RNA at multiple levels is referred to as “graded-dosed spike cocktail (GSC)”.
工程(c)では、生体試料のホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の上記「多段階用量スパイクカクテル」を添加し、RNA抽出を行って検体サンプルを調製する。ここで、「細胞数又はDNA量と相関する既知量」とは、細胞数又はDNA量から一次関数式（生体試料によって異なる）によって計算される量で、細胞数又はDNA量とは比例関係にある。「多段階用量スパイクカクテル」の細胞数又はDNA量と相関する添加量は、工程（ｂ）で求めたDNA量（濃度）にホモジネート液量（ｑ）及びスパイクカクテル最適添加率（ｒ）を乗じて決定する（下式参照）。 In step (c), a known amount of the “multi-step dose spike cocktail” correlated with the number of cells or the amount of DNA is added to a homogenate of a biological sample, and RNA extraction is performed to prepare a specimen sample. Here, “a known amount that correlates with the number of cells or the amount of DNA” is an amount calculated from the number of cells or the amount of DNA by a linear function formula (which varies depending on the biological sample), and is proportional to the number of cells or the amount of DNA is there. The addition amount correlating with the number of cells or the amount of DNA of the “multi-step dose spike cocktail” is obtained by multiplying the amount of DNA (concentration) obtained in step (b) by the amount of homogenate (q) and the optimum spike cocktail addition rate (r). (See the following formula).
上記式中、多段階用量スパイクカクテルの最適添加率（ｒ）は、Spike facorと呼び、マウスやラットの肝臓や腎臓、一般的なマウス由来の細胞株の場合は0.02(μl／ngDNA)
である。
In the above formula, the optimum addition rate (r) of the multi-step dose spike cocktail is called Spike facor, and 0.02 (μl / ngDNA) for mouse and rat livers and kidneys, and general mouse-derived cell lines
It is.
生体試料のホモジネートからのRNA抽出は、当該分野において通常用いられる手法、例えば、グアニジン／塩化セシウム法、グアニジン／チオシアネート法（グアニジン／セシウムＴＦＡ法）、塩化リチウム／尿素法、ホットフェノール法、ＡＧＰＣ法（アシッドグアニジウム−フェノール−クロロホルム法）などに従って実施することができる。RNA抽出に際しては、RNeasy等の市販のRNA抽出用キットに添付される抽出プロトコルを改良した独自のプロトコルに従って行うことが好ましい。 RNA extraction from a homogenate of a biological sample can be performed by techniques commonly used in the art, for example, guanidine / cesium chloride method, guanidine / thiocyanate method (guanidine / cesium TFA method), lithium chloride / urea method, hot phenol method, AGPC method. (Acid guanidinium-phenol-chloroform method) and the like. RNA extraction is preferably performed according to a unique protocol obtained by improving the extraction protocol attached to a commercially available RNA extraction kit such as RNeasy.
最後に、工程（ｄ）では検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める。 Finally, in step (d), the absolute expression level of the gene per cell is determined from the measured value of the RNA of the specimen sample using a calibration curve created based on the measured value of the spike RNA.
検量線は、多段階用量スパイクカクテルの用量−作用（濃度−シグナル強度）関係が次式(I)のHill の式に従うという仮定に基づき、両パラメータをlog-log 変換することによって作成する。例えば、cDNAマイクロアレイ法ではスパイクRNAの濃度の対数を横軸にとり、cDNAマイクロアレイ法で測定したシグナル強度（直読値）の対数（シグナル強度が十分に最大シグナル強度より低い場合）、あるいはS／Smax−Sの対数（シグナル強度が最大シグナル強度に近い場合）を縦軸にプロットすればよい。また、定量的RT-PCR法ではスパイクRNA量（鋳型量）の対数を横軸にとり、測定したCt値を縦軸にプロットすればよい。作成された検量線は、次式(II)で表される直線化式で表される。 A calibration curve is generated by log-log conversion of both parameters based on the assumption that the dose-action (concentration-signal intensity) relationship of the multi-step dose spike cocktail follows the Hill equation of the following equation (I). For example, in the cDNA microarray method, the logarithm of the spike RNA concentration is plotted on the horizontal axis, and the logarithm of the signal intensity (direct reading) measured by the cDNA microarray method (when the signal intensity is sufficiently lower than the maximum signal intensity), or S / Smax− The logarithm of S (when the signal intensity is close to the maximum signal intensity) may be plotted on the vertical axis. In the quantitative RT-PCR method, the logarithm of the spike RNA amount (template amount) may be plotted on the horizontal axis, and the measured Ct value plotted on the vertical axis. The created calibration curve is represented by a linearization formula represented by the following formula (II).
検体サンプルに添加した多段階スパイクカクテルの量は既知であるので、上記検量線から求めた検体サンプル中のmRNA量（濃度）は、「細胞1個当たり」の絶対量に変換することができる。 Since the amount of the multi-step spike cocktail added to the sample is known, the amount (concentration) of mRNA in the sample obtained from the calibration curve can be converted to an absolute amount “per cell”.
本発明の方法が適用できるmRNA測定系としては、代表的にはcDNAマイクロアレイ法であるが、定量的RT-PCR法であってもよい。従って、上記の「測定値」は、cDNAマイクロアレイ法にあっては、蛍光シグナル強度をいい、定量的RT-PCR法にあってはCt(threshold cycle)値をいう。また、cDNAマイクロアレイ法は、Gene ChipTM(Affymetrix)を用いることが好ましいが、これに限定されるわけではない。 The mRNA measurement system to which the method of the present invention can be applied is typically a cDNA microarray method, but may be a quantitative RT-PCR method. Therefore, the above “measured value” refers to the fluorescence signal intensity in the cDNA microarray method, and the Ct (threshold cycle) value in the quantitative RT-PCR method. The cDNA microarray method preferably uses Gene Chip ™ (Affymetrix), but is not limited thereto.
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１） スパイクRNAの調製、多段階用量スパイクカクテルの確立
Affymetrix社製GeneChipTM:MG-U74v2、RG-U34、HG-U95、HG-U133、RAE230、及びMOE430において共通に調製され、かつ 標準Affymetrix プロトコルでは用いられてない 下記の５つの枯草菌 (Bacillus subtilis)のRNA配列(TRP,DAP,PHE,LYS,THR)をAffymetrix GeneChipTMの遺伝子リストから選択した。
(i)TRP(AFFX-TrpX-3_at):B subtilis K01391 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号１）の1883番〜4400 番に対応するTrpE タンパク質、TrpD タンパク質、TrpC タンパク質
(ii)THR(AFFX-ThrX-3_at):B subtilis X04603 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号２）の248番〜2229番に対応するthrC、thrB遺伝子
(iii)DAP(AFFX-DapX-3_at):B subtilis L38424 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号３）の1358番〜3197番に対応するdapB、jojF、jojG 遺伝子
(iv)PHE(AFFX-PheX-3_at):B subtilis M24537 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号４）の2017番〜3334番に対応するpheB、pheA 遺伝子
(v)LYS(AFFX-LysX-3_at):B subtilis X17013 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号５）の350番〜1345番に対応するdiaminopimelate decarboxylaseのlys遺伝子
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but these examples do not limit the present invention.
(Example 1) Preparation of spike RNA, establishment of multi-step dose spike cocktail
Affymetrix GeneChip TM : Commonly prepared in MG-U74v2, RG-U34, HG-U95, HG-U133, RAE230, and MOE430, and not used in the standard Affymetrix protocol, the following five Bacillus subtilis ) RNA sequences (TRP, DAP, PHE, LYS, THR) were selected from the gene list of Affymetrix GeneChip ™ .
(i) TRP (AFFX-TrpX-3_at): TrpE protein, TrpD protein, TrpC protein corresponding to nucleotides 1883 to 4400 of the nucleotide sequence of B subtilis K01391 (SEQ ID NO: 1)
(ii) THR (AFFX-ThrX-3_at): thrC and thrB genes corresponding to nucleotides 248 to 2229 in the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of B subtilis X04603
(iii) DAP (AFFX-DapX-3_at): dapB, jojF, jojG genes corresponding to nucleotides 1358-3197 of the nucleotide sequence of B subtilis L38424 (SEQ ID NO: 3)
(iv) PHE (AFFX-PheX-3_at): pheB and pheA genes corresponding to the numbers from 2017 to 3334 of the nucleotide sequence of B subtilis M24537 (SEQ ID NO: 4)
(v) LYS (AFFX-LysX-3_at): lys gene of diaminopimelate decarboxylase corresponding to positions 350 to 1345 of the nucleotide sequence of B subtilis X17013 (SEQ ID NO: 5)
これら５つの枯草菌遺伝子のcDNAをATCC 遺伝子ライブラリー (http://www.atcc.org/) から購入し、発現ベクターに挿入し、大腸菌 (E. coli) で増幅し、MEGAscript キット (Ambion Inc.社製)により転写し、MACS mRNA(Miltenyi Biotec GmbH.社製)により精製した。 These five Bacillus subtilis gene cDNAs were purchased from the ATCC gene library (http://www.atcc.org/), inserted into an expression vector, amplified in E. coli, and the MEGAscript kit (Ambion Inc. And purified by MACS mRNA (Miltenyi Biotec GmbH).
また、スパイクRNAとしてこれら５つの枯草菌遺伝子のmRNAを、latin square コンビネーション（表１）にて混合し、多段階用量のスパイクRNAを含むサンプル（スパイクカクテル）を調製した。 Further, mRNAs of these five Bacillus subtilis genes were mixed as spike RNA in a latin square combination (Table 1) to prepare a sample (spike cocktail) containing multi-step doses of spike RNA.
図１は、各サンプルの測定結果を均等目盛／均等目盛スケールでプロットした用量−作用（濃度−シグナル強度）曲線である（ｘ軸は調整濃度Ｃ（μM）；ｙ軸はシグナル強度Ｓ）。用量−作用（濃度−シグナル強度）特性は、Langmuir の式ではなく、前記式（I)に示すHillの式（Sigmoid Emax model)に従った（図１Ａ（ａ））。この５つのスパイクサンプルのデータを前記式（II）によって直線化すると、スパイクRNAの添加量に比例してほぼ直線パターンとなった（図１Ａ（ｂ））（この時、γ（Hill係数）は約１＞γ＞０.８の範囲のであった）。 FIG. 1 is a dose-effect (concentration-signal intensity) curve in which the measurement results of each sample are plotted on a uniform scale / uniform scale (x axis is adjusted concentration C (μM); y axis is signal intensity S). The dose-effect (concentration-signal intensity) characteristic was not the Langmuir equation but the Hill equation (Sigmoid Emax model) shown in the above equation (I) (FIG. 1A (a)). When the data of these five spike samples were linearized by the above formula (II), a linear pattern was obtained in proportion to the spike RNA addition amount (FIG. 1A (b)) (in this case, γ (Hill coefficient) is About 1> γ> 0.8).
各濃度において５つのスパイクRNAのうちから１つずつ重複しないように、かつ広範囲のシグナル強度をカバーするように選択したスパイクRNA（図１Ａ（ｂ）、丸で囲んだ）を混合して多段階用量スパイクカクテルとした。その組成を表２に示す。 Multi-step mixing of spike RNAs (Figure 1A (b), circled) selected so as not to overlap one of the five spike RNAs at each concentration and to cover a wide range of signal intensities Dose spike cocktail. The composition is shown in Table 2.
本スパイクカクテルは、最終ハイブリダイゼーション溶液中で約1.2pM〜97.2pMのRNA
をカバーできる。
This spike cocktail is about 1.2 pM-97.2 pM RNA in the final hybridization solution
Can cover.
また、図１ｃには、上記の５つの多段階用量スパイクRNAを混合したスパイクカクテルを含む空サンプル、及び５つの同用量（最高用量）スパイクRNAを含む空サンプルの遺伝子発現の散布図を示す（５つのスパイクRNAは矢印付きの黒色点で表す）。スパイクRNAは、GeneChipTM（MG-U74v2）において20未満のシグナル強度を示す他のプローブセットとクロスハイブリダイズしないことが示された。 Also, FIG. 1c shows a scatter plot of gene expression of an empty sample containing a spike cocktail mixed with the above five multi-stage dose spike RNAs and an empty sample containing five equal dose (highest dose) spike RNAs ( Five spike RNAs are represented by black dots with arrows). Spike RNA was shown not to cross-hybridize with other probe sets showing a signal intensity of less than 20 in GeneChip ™ (MG-U74v2).
図１ｄは、スパイクカクテルを含む肝臓サンプルと含まない肝臓サンプルの遺伝子発現の散布図を示す（５つのスパイクRNAは矢印付きの黒色点で表す）。スパイクカクテルを含まない肝臓サンプルのシグナル強度は100未満であり、肝臓サンプル中のRNAがスパイクRNAとクロスハイブリダイズしないことが示された。 FIG. 1d shows a scatter plot of gene expression of liver samples with and without spike cocktail (5 spike RNAs are represented by black dots with arrows). The signal intensity of the liver sample without spike cocktail was less than 100, indicating that the RNA in the liver sample did not cross hybridize with the spike RNA.
（実施例２） 多段階用量スパイクカクテルの添加量算定の例
マウス肝臓ホモジネート液（4倍希釈）を、DNA直接測定法のプロトコル（後記実施例３参照）に従って処理し、蛍光測定した結果、蛍光測定値（Ｆ)が6.925であった。用量−蛍光換算式：Ｃ=Ｆ/0.023903（ＣはDNA濃度（ng/ml)、Ｆは蛍光測定値、ｐはλファージDNAの希釈範囲内で求めたF/C比）によりDNA濃度（Ｃ）を求めたところ、1158.85ng/mlとなった。
(Example 2) Example of calculation of addition amount of multi-step dose spike cocktail Mouse liver homogenate solution (4-fold dilution) was treated according to the DNA direct measurement protocol (see Example 3 below) and measured for fluorescence. The measured value (F) was 6.925. Dose-fluorescence conversion formula: C = F / 0.023903 (C is the DNA concentration (ng / ml), F is the fluorescence measurement value, and p is the F / C ratio determined within the dilution range of λ phage DNA). ) Was 1158.85 ng / ml.
これより、RNA抽出に用いるホモジネート液量を350μlとすると、添加すべき多段階用量スパイクカクテル量は1158.85ng/ml×0.35×0.02＝8.11μlと算定できる。 From this, assuming that the amount of the homogenate used for RNA extraction is 350 μl, the amount of the multi-step dose spike cocktail to be added can be calculated as 1158.85 ng / ml × 0.35 × 0.02 = 8.11 μl.
一方、マウス赤血球前駆細胞由来の細胞株（4倍体細胞）SLC3において、細胞2.63×10７個に含まれる全DNAを測定したところ90.1ngであった。よって、肝臓細胞などの２倍体の正常マウス体細胞では、1×10６個あたりのDNA量は1.71ngと算定できる。これより、上記肝臓ホモジネート350μlに含まれる細胞数は、1158.85×0.35／1.71＝2.37×10８個となるので、DNA量と相関する多段階用量スパイクカクテル添加量は、細胞数と相関する添加量に変換できる。 On the other hand, in the cell line (tetraploid cell) SLC3 derived from mouse erythroid progenitor cells, the total DNA contained in 2.63 × 10 7 cells was measured and found to be 90.1 ng. Therefore, in a diploid normal mouse somatic cell such as a liver cell, the DNA amount per 1 × 10 6 can be calculated as 1.71 ng. As a result, the number of cells contained in 350 μl of the above liver homogenate is 1158.85 × 0.35 / 1.71 = 2.37 × 10 8 , so the amount of multistage dose spike cocktail that correlates with the amount of DNA is the amount that correlates with the number of cells. Can be converted to
（実施例３） 多段階用量スパイクカクテルを用いた細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量測定方法
(1)RNA抽出及び組織ホモジナイズ
重量約30〜60mgの組織塊のサンプルを2mlプラスチック製チューブ (Eppendorf GmbH.社製）に入れ、RNA later (Ambion Inc.社製) に４℃で一夜浸漬し、RNA抽出操作まで保存した。次いで、RNA later を除去し、0.1mlのRLT緩衝液 (Qiagen GmbH.社製）及び直径5mmのジルコニウムビーズ (Funakoshi社製）を加え、MixerMill 300 (Qiagen GmbH.社製)によって20Hzの速度で5分間振盪し、組織をホモジナイズした。このホモジネートのアリコートを以下に述べるDNA量の測定に用いた。
(Example 3) Method for measuring the absolute expression level of a gene per cell using a multistage dose spike cocktail
(1) RNA extraction and tissue homogenization Place a tissue mass sample weighing approximately 30-60 mg into a 2 ml plastic tube (Eppendorf GmbH.) And immerse it in RNA later (Ambion Inc.) at 4 ° C. overnight. The RNA extraction operation was stored. RNA later is then removed, 0.1 ml of RLT buffer (Qiagen GmbH.) And 5 mm diameter zirconium beads (Funakoshi) are added, and MixerMill 300 (Qiagen GmbH.) Is added at a rate of 20 Hz. Shake for minutes and homogenize the tissue. An aliquot of this homogenate was used to measure the amount of DNA described below.
(2) DNA量の測定
(1)で採取したアリコート10μｌを1.5ml密栓チューブ内で、RNase(Nippon Gene Inc.社製）にて37℃で30分間、次いでプロテナーゼＫ (Roche Diagnostics GmbH.社製）にて55℃で3時間処理した。処理したサンプルを、標準DNAを含む96ウェルプレート (λファージDNA, PicoGreen キット, Molecular Probes Inc.社製）に移し、蛍光染料 PicoGreen (Molecular Probes Inc.社製）を各ウェルに加え、10秒間ずつ4回振盪し、30℃で2分間インキュベートし、DNA濃度を96ウェル蛍光プレートリーダー（励起485nm／発光538nm）で測定した。本方法（Picogreen法）は、標準法であるフェノール抽出法とよく相関し、互換性のあるデータを生成した（図２）。
(2) Measurement of DNA content
10 μl of aliquot collected in (1) is placed in a 1.5 ml sealed tube with RNase (Nippon Gene Inc.) for 30 minutes at 37 ° C., then with proteinase K (Roche Diagnostics GmbH.) At 55 ° C. for 3 minutes. Time processed. The treated sample is transferred to a 96-well plate containing standard DNA (λ phage DNA, PicoGreen kit, manufactured by Molecular Probes Inc.), and a fluorescent dye PicoGreen (Molecular Probes Inc.) is added to each well for 10 seconds.
(3) LBM（肝臓-脳ミックスを語源とする名称）標準サンプルセットを用いた用量相関性の確認
非類似の遺伝子発現パターンを有する１対のサンプルを用いて、前記(1)に従って調製したサンプルのホモジネートに、前記(2)の手法に従ってDNA量を測定し、このDNA量に相関する既知量の多段階用量スパイクカクテルをそれぞれ加え、２つのサンプルのホジネートを、100：0、75：25、50：50、25：75及び0：100の比率で混合したサンプルを調製した。マウスを対象とする場合は、マウスの肝臓と脳を１対のサンプルとし、ヒトを対象とする場合は、ヒト由来の２つの癌細胞株（卵巣癌細胞株OVCAR-4、直腸癌細胞株HT-29)を１対のサンプルとして選択した（これら５つの混合サンプルのセットをLBM標準サンプルセットと呼ぶ：LBMは、肝臓-脳ミックスを語源とする名称）。
(3) Confirmation of dose correlation using LBM (named after liver-brain mix) standard sample set Sample prepared according to (1) above using a pair of samples with dissimilar gene expression patterns The amount of DNA was measured according to the method of (2) above, and a known amount of a multi-step dose spike cocktail correlated with the amount of DNA was added to each of the homogenates. Mixed samples were prepared at ratios of 50:50, 25:75 and 0: 100. When targeting mice, a pair of mouse liver and brain are used as samples, and when targeting humans, two human cancer cell lines (ovarian cancer cell line OVCAR-4, rectal cancer cell line HT) -29) was selected as a pair of samples (the set of these five mixed samples is referred to as the LBM standard sample set: LBM is derived from the liver-brain mix).
ヒト由来の２つの癌細胞株（卵巣癌細胞株OVCAR-4、直腸癌細胞株HT-29)を選択した場合、これらの５つのサンプルについて、Affymetrix HG-U133 GeneChipを用いて遺伝子発現を測定した。図３ａはMAS5(Micro Array Suite version 5)ソフトウェアで直接生成した生データ、図３ｂは全遺伝子の分布を用いてグローバル補正したデータ、図３ｃは、多段階用量スパイクカクテルによって絶対量化したデータをそれぞれ示す。図３ａ、ｂ及びｃは、50：50サンプルでノーマライズした遺伝子の発現比であるから、理想的なマイクロアレイは50：50サンプルの１の点を通る右下がり、右上がり、水平の何れかの直線を生じるはずである。図３ｃに於いて、５本の黒色線で表される多段階用量スパイクカクテルRNAは、いずれも水平の直線であることから検量線として正しく機能し、測定されていることを示している。また、歪みの少ない蝶形パターンは、正しく絶対量化されていることと、このマイクロアレイがいずれかのサンプルで発現される約6000遺伝子に対して極めて良好な用量−作用特性を有することを示すものである。 When two human cancer cell lines (ovarian cancer cell line OVCAR-4, rectal cancer cell line HT-29) were selected, gene expression was measured using Affymetrix HG-U133 GeneChip for these five samples. . Fig. 3a is raw data directly generated by MAS5 (Micro Array Suite version 5) software, Fig. 3b is data corrected globally using the distribution of all genes, and Fig. 3c is data obtained by absolute quantification by multi-step dose spike cocktail. Show. Figures 3a, b and c are the expression ratios of genes normalized in 50:50 samples, so the ideal microarray is either a right-down, right-up, or horizontal line through one point of 50:50 samples. Should result. In FIG. 3 c, the multi-step dose spike cocktail RNA represented by five black lines is a horizontal straight line, indicating that it functions correctly as a calibration curve and is measured. The low distortion butterfly pattern also indicates that it is correctly absolute quantified and that this microarray has very good dose-action characteristics for about 6000 genes expressed in any sample. is there.
図３ｄはLBM標準サンプルセットによる約6000の各遺伝子の5点の直線性を検討するために求めた回帰直線の確定係数（Ｒ２値）の累積分布を示す。多段階用量スパイクカクテルによる絶対量化データがより直線状に配列する5点のデータ（Ｒ２が生データ及びグローバルデータよりもより１に近づく）を生成することが示される。 Figure 3d shows the cumulative distribution of the deterministic factor of the regression line determined to consider the linearity of the five points of each gene of approximately 6000 by LBM standard sample set (R 2 value). Absolute quantification data by multistage dose spike cocktail that is shown to generate a (more closer to 1 than R 2 are the raw data and global data) more of five points arranged in a line data.
（実施例４） 測定データの絶対量化の例
雌マウスの卵巣を摘出して14日間経過し、子宮の萎縮を確認した後、試験化合物（エストロジェン作動性化学物質：THBP）を0、30、100、300及び1000mg/kgの用量で７日間皮下投与した。図４ａに用量−相関子宮重量増加をモニタリングした結果を示す。
(Example 4) Example of absolute quantification of measurement data After 14 days have passed since the ovaries of female mice were removed and uterine atrophy was confirmed, 0, 30, 100 test compounds (estrogenic chemicals: THBP) were added. , 300 and 1000 mg / kg for 7 days subcutaneously. FIG. 4a shows the results of monitoring the dose-related uterine weight increase.
実施例３の方法に従って、子宮組織の遺伝子発現をAffymetrix MG-U74v2 GeneChip を用いて分析し（１グループ当たり三つの平均）、データを GeneSpring ソフトウェア (Silicon Genetics社製）によって可視化した（図４ｂ）。図４ｂ（左）は、Affymetrix MAS5 ソフトウェアから直接読み出した生データ、図４ｂ（中央）は、全遺伝子の分布を用いてデータをグローバル補正したデータ、図４ｂ（右）は、多段階用量スパイクカクテルの検量線を用いて絶対量化したデータを示した。各図は、均等目盛スケール（上）、及び各遺伝子の中央値に対する log 比（下）でプロットしている。 According to the method of Example 3, uterine tissue gene expression was analyzed using Affymetrix MG-U74v2 GeneChip (three averages per group) and the data visualized by GeneSpring software (Silicon Genetics) (FIG. 4b). Fig. 4b (left) is raw data read directly from Affymetrix MAS5 software, Fig. 4b (middle) is data globally corrected using the distribution of all genes, and Fig. 4b (right) is a multi-step dose spike cocktail. Data obtained by absolute quantification using the calibration curve was shown. Each figure is plotted with a uniform scale (top) and a log ratio (bottom) to the median of each gene.
多段階用量スパイクカクテルを示す黒色線が平行に整列していること（細胞数が一定であることを示す）、そして大多数の遺伝子が試験化合物のエストロジェン刺激に応答した子宮重量増加と相関していることが観察された。 The black lines representing the multi-step dose spike cocktail are aligned in parallel (indicating a constant cell number) and the majority of genes correlate with increased uterine weight in response to estrogen stimulation of the test compound It was observed that
（実施例５） 測定データの絶対量化の例
12週齢雄性C57BL/6マウスを用い、ペンタクロロフェノールの毒性試験を行った。マウスは１群につき３匹とし、投与開始からの経過時間について４時点（2時間、4時間、８時間、24時間）、投与量について４用量（0mg／体重kg、10mg／体重kg、30mg／体重kg、100mg／体重kg）からなる合計16群を設定した（溶媒：CMC)。
(Example 5) Example of absolute quantification of measurement data
Toxicity tests for pentachlorophenol were conducted using 12-week-old male C57BL / 6 mice. Three mice per group, 4 time points (2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours) from the start of administration, 4 doses (0 mg / kg body weight, 10 mg / kg body weight, 30 mg / day) A total of 16 groups consisting of body weight (kg, 100 mg / kg body weight) were set (solvent: CMC).
時間をｘ軸、用量をｙ軸、cDNAマイクロアレイ法によって測定した肝臓の遺伝子発現データを実施例３の方法に従って絶対量化したシグナル強度をz軸にとると、ゼロから均等目盛表示した三次元グラフに描画することができた（図５）。 When the z-axis is the signal intensity obtained by absolute quantification of the liver gene expression data measured by the cDNA microarray method according to the method of Example 3 on the x-axis, the dose is the y-axis, and a three-dimensional graph displayed on a uniform scale from zero. I was able to draw (Fig. 5).
一つの遺伝子は4×4の立体地図状の曲面を描くので、22690遺伝子がマイクロアレイ（GeneChipTM)に載っている場合、一つの実験グラフは、22690枚の曲面からなる（これを「ミルフィーユ」データと名づけた）。 Since one gene draws a 4x4 3D map-like curved surface, if 22690 genes are placed on the microarray (GeneChip TM ), one experimental graph consists of 22690 curved surfaces (this is called "Millefeuille" data) Named).
このミルフィーユデータ表示によれば、例えば、日内変動、溶媒効果、対照群では全く発現が無く処置によってのみ誘導がかかる遺伝子群の把握のほか、曲面の可視化を通して動的な遺伝子カスケードの情報の抽出が著しく促進されると同時に、アーティファクトの判定とその除去にも大きく貢献する。さらに、発現がゼロである遺伝子の表記が問題なく可能であることから、遺伝子ノックアウト動物と野生型動物のデータを対等に記載し比較することが可能である。 According to this Millefeuille data display, for example, in addition to grasping of gene groups that are not expressed in the diurnal variation, solvent effect, control group and are induced only by treatment, dynamic gene cascade information can be extracted through curved surface visualization. While being significantly promoted, it also contributes greatly to the determination and removal of artifacts. Furthermore, since the expression of a gene with zero expression is possible without any problem, it is possible to describe and compare the data of gene knockout animals and wild-type animals on an equal basis.
本発明の方法は、cDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を得ることができるので、その値をサンプル間で、あるいは独立して実施された複数の実験間で直接比較することが可能となる。したがって、本発明の方法は、薬剤や化学物質の毒性評価、薬剤や化学物質の毒性発現予測データベースの構築、疾患関連遺伝子の探索と同定、創薬標的遺伝子の探索と同定、創薬の有効性評価、新規遺伝子の機能推定、早期癌遺伝子診断、癌患者の分類と予後の予測などにおいて非常に有用である。 In the method of the present invention, in the comprehensive mRNA measurement such as the cDNA microarray method, the absolute expression level of the gene per cell can be obtained. Therefore, the value can be obtained between samples or independently. It is possible to directly compare between these experiments. Therefore, the method of the present invention can be used to evaluate the toxicity of drugs and chemicals, construct a database for predicting toxicity of drugs and chemicals, search for and identify disease-related genes, search for and identify target genes for drug discovery, and effectiveness of drug discovery. It is very useful in evaluation, function estimation of new genes, early cancer genetic diagnosis, cancer patient classification and prognosis prediction.
Claims (2)
(a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程
(b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程
(c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程
(d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した下記式で表される検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程
（化１）
log(Ｓ/Ｓ MAX -Ｓ）=γlogＣ-γlogＳＣ 50
（式中、Ｓは測定値、Ｓ MAX は最大測定値、ＣはスパイクRNAの濃度、ＳＣ 50 は50％反応濃度、γはHill係数を示す。） A method for measuring the absolute expression level of a gene per cell, comprising the following steps.
(a) A step of measuring the number of homogenates in a biological sample or measuring the amount of DNA
(b) a step of preparing a mixture that does not cross-hybridize with the gene in the homogenate and includes spike RNAs having a plurality of different base sequences at multiple concentrations
(c) adding a known amount of the mixture that correlates with the number of cells or the amount of DNA to the homogenate, and extracting the RNA to prepare a sample sample
(d) A step of obtaining the absolute expression level of the gene per cell from the measured value of the RNA of the sample sample using a calibration curve represented by the following formula created based on the measured value of the spike RNA
(Chemical formula 1)
log (S / S MAX -S) = γlogC-γlogSC 50
(In the formula, S represents a measured value, S MAX represents a maximum measured value, C represents a spike RNA concentration, SC 50 represents a 50% reaction concentration, and γ represents a Hill coefficient.)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003317031A JP4415079B2 (en) | 2003-09-09 | 2003-09-09 | Method for measuring the absolute expression level of genes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003317031A JP4415079B2 (en) | 2003-09-09 | 2003-09-09 | Method for measuring the absolute expression level of genes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005080588A JP2005080588A (en) | 2005-03-31 |
| JP4415079B2 true JP4415079B2 (en) | 2010-02-17 |
Family
ID=34416746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003317031A Expired - Lifetime JP4415079B2 (en) | 2003-09-09 | 2003-09-09 | Method for measuring the absolute expression level of genes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4415079B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006138823A (en) * | 2004-11-15 | 2006-06-01 | Sony Corp | Method for standardizing expressed amount in gene, program, and system |
| JP2006170670A (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-29 | Sony Corp | Standardization method for gene expression level, program and system |
| JP2007097574A (en) * | 2005-09-06 | 2007-04-19 | Dna Chip Research Inc | QUANTITATIVE METHOD FOR mRNA OF OBJECTIVE GENE |
-
2003
- 2003-09-09 JP JP2003317031A patent/JP4415079B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005080588A (en) | 2005-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7115779B2 (en) | Methods and uses thereof for standardized sequencing of nucleic acids | |
| US8700341B2 (en) | Partition defined detection methods | |
| Prokopec et al. | Systematic evaluation of medium-throughput mRNA abundance platforms | |
| KR101562644B1 (en) | Prognosis prediction for colorectal cancer | |
| US20150292001A1 (en) | Methods for Standardized Sequencing of Nucleic Acids and Uses Thereof | |
| Roth | Quantifying gene expression | |
| CN108410961A (en) | A kind of kit and its method of detection CYP3A4, CYP3A5 polymorphic site | |
| CN102439167A (en) | Method for determining DNA copy number by competitive pcr | |
| Garnis et al. | High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples | |
| CN107075578B (en) | method and device for comparative analysis of miRNA expression level | |
| JP4415079B2 (en) | Method for measuring the absolute expression level of genes | |
| Liu et al. | A mixture detection method based on separate amplification using primer specific alleles of INDELs-a study based on two person's DNA mixture | |
| JP6571526B2 (en) | Methods to improve microarray performance by excluding strands | |
| Viale et al. | Big results from small samples: evaluation of amplification protocols for gene expression profiling | |
| JP4359805B2 (en) | Mathematical analysis to estimate changes in gene expression levels | |
| CN106811537A (en) | One kind detection epidermal growth factor receptor gene T790M low frequencies mutant primer and its application | |
| US20060240418A1 (en) | Canine gene microarrays | |
| JP2003500715A5 (en) | ||
| EP3394286B1 (en) | Analytical process for genotoxicity assessment | |
| Evans et al. | Generation and use of a tailored gene array to investigate vascular biology | |
| van Ruissen et al. | Scaling of gene expression data allowing the comparison of different gene expression platforms | |
| Chilimoniuk et al. | Challenges and opportunities in processing NanoString nCounter data | |
| Klinck et al. | High‐Throughput Analysis of Alternative Splicing by RT‐PCR | |
| Luong | Predicting Formalin-fixed Paraffin-embedded (FFPE) Sequencing Artefacts from Breast Cancer Exome Sequencing Data Using Machine Learning | |
| JP2003304884A (en) | Method for estimating compatibility with anticancer agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060905 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090623 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090821 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090929 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091006 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4415079 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151204 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |