JP4408523B2

JP4408523B2 - Fluorescence correlation method

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Publication number: JP4408523B2
Application number: JP2000085368A
Authority: JP
Inventors: 慶記池滝; 正明藤井; 尾松　　孝茂; 卓佐藤
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: JP2001272346A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、蛍光相関法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、一分子レベルでの蛍光分析を高感度で行うことのできる蛍光相関法が知られている。この蛍光相関法は、ブラウン運動などの粒子の拡散運動に関する解析に古くから用いられてきた方法である。たとえば、希薄な蛍光分子の溶液に、細いレーザー励起光ビームを当てて、蛍光強度を長時間測定することを考える。測定領域に入っている蛍光分子数をＮとすると、蛍光強度はＮに比例する。このため、ゆらぎの大きさをＳ／Ｎで表現すると（１／Ｎ）^1/2となる。
【０００３】
蛍光相関法は、このように蛍光の小さなゆらぎの大きさと、後述する時間相関を測定する方法である。蛍光相関関数が１／２に減少する時間、すなわち相関時間τ₀は、次式で表される。
【０００４】
【数１】

【０００５】
数１において、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数であり、Ｗはレーザービームの動径方向の強度分布関数がガウス分布であるときのビーム半径である。物理的には、このτ₀は蛍光分子が拡散によってレーザービームを横切る時間に相当する。
【０００６】
蛍光のゆらぎを測定する際、光電子増倍管の出力電流ｆ（ｔ）を測定するのであるが、レーザー光が極端に大きくない場合には、蛍光量とｆ（ｔ）は比例する。実は、蛍光相関関数はこのｆ（ｔ）について時間に関する相関関数を求めることに他ならない。この相関関数をＧ（ｘ）と書けば、次式で与えられる。
【０００７】
【数２】

【０００８】
もし、レーザー強度がガウス分布に近いときは、
【０００９】
【数３】

【００１０】
と簡略に表現できる。
【００１１】
また、蛍光相関法は、上述したように、蛍光性分子の並進拡散係数（数１におけるＤ）が得られる物理量を測定するものであるが、基本的には蛍光のゆらぎを与える熱力学量であれば、どんな量でも同じ原理で測定できる。
【００１２】
たとえば、蛍光分子の流動によってレーザービームを横切れば、蛍光のゆらぎが観測される。また、化学反応などで蛍光性分子が他の分子と結合することで分子の速度をゆらぎとして観測できる。すなわち、化学反応の進行をリアルタイムで知ることができるのである。また、偏光解析をすることで分子の回転運動をも測定できる。これは自明であるがＧ（τ）の強度から、観察領域に存在する分子数も直接測定できる。具体的には、たとえば図１に例示したように、期待するゆらぎ現象が完結するような特定の計測時間内のゆらぎ関数ｆ（ｔ）を測定し、その測定したｆ（ｔ）から上記数２を用いて相関関数を求めればよい。なお、一般には、励起光源としては、連続発振のアルゴンレーザーやクリプトンレーザーを用いて色素分子の蛍光相関分析を行うのが主流である。
【００１３】
図２は、蛍光相関法を用いて蛍光相関分析を行うシステムの代表的な一例を示したものである。この図２に例示したシステムでは、アルゴンレーザー等の連続発振レーザー（２０１）を励起光源として用い、そのレーザービームを蛍光色素を含有した観察試料溶液（２０２）にレンズ（２０３）によって集光照射する。蛍光は、レンズ（２０３）でコリメートされた後、ビームスプリットミラー（２０４）で折り返され、再びレンズ（２０５）で集光される。集光蛍光はピンホール（２０６）を通過して、光電子増倍管やＣＣＤなどの検出器（２０７）で検出される。検出された蛍光は、電流として出力され、プリアンプ（２０８）で増幅さてた後、アナログ・デジタル変換器（２０９）によってデジタルデータに変換される。最後に、このデジタル蛍光信号は時系列データとしてコンピュータ（２１０）のメモリに取り込まれる。コンピュータ（２１０）内では、上記数２に従って相関関数Ｇ（τ）が計算される。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のとおりの従来の蛍光相関法には、実用上以下のような問題点がある。
【００１５】
すなわち、従来の蛍光相関法は、前記数２からもわかるように、計測時間内では時間を関数として連続的に変化することを前提にしている。これに対し、励起光源として高繰り返しのパルスレーザーを用いた計測システムにおいては、たとえば図３に例示したように、励起光源の発光が間欠的になり、それに応じて蛍光信号も間欠的なパルス波形として観測されるため、従来の蛍光相関法を利用できないのである。
【００１６】
より具体的には、高繰り返しのパルスレーザーを励起光源とした場合、たとえば図３に例示したように、励起パルスが存在せず、且つ蛍光信号も存在しない時間帯ｔ_ｏｆｆが存在する。この時間帯では、単なる検出器の雑音や、外部の迷光といった蛍光分子のゆらぎと全く関係のない信号成分が観測される。このとき数２により蛍光相関をとれば、蛍光現象と全く関係のない信号成分をも含んで積分をしてしまうことになる。極端な場合では、蛍光発光の時間帯ｔ_ｏｎがｔ_ｏｆｆより小さいと、蛍光分子のゆらぎを示す蛍光相関関数を測定しているのではなく、むしろ、光電子像倍管をはじめとする検出器の暗電流のゆらぎを示す蛍光相関関数を計測してしまうことになる。これでは、従来の蛍光相関法はパルスレーザーを励起光源として用いたシステムには適用不可能である。
【００１７】
また、この出願の発明の発明者は、高性能かつ多機能な顕微鏡の一つとして、二重共鳴吸収過程あるいはそれと過渡ラマン散乱過程を用いることにより超解像性を実現した顕微鏡（以下、二重共鳴吸収顕微鏡と呼ぶ）をすでに提案しているが、この二重共鳴吸収顕微鏡においても、励起光源としてパルスレーザーを用いることが多く、従来の蛍光相関法は利用できない。
【００１８】
まず、二重共鳴吸収過程を用いた二重共鳴吸収顕微鏡（特願平６−３２９１６５号、特願平８−３０２２３２号、特願平９−２５５４４４、特願平１０−９７９２４を参照）は、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ₁のポンプ光の光源と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ₂のイレース光の光源と、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段とを備えており、重ね手段を介してポンプ光およびイレース光を試料に照射することにより、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域を一部分抑制することをその基本構成としている。
【００１９】
他方、二重共鳴吸収顕微鏡とともに過渡ラマン散乱過程をも利用した二重共鳴吸収顕微鏡（特願２０００−８２９３０を参照）は、一重項過渡ラマン散乱過程を利用する場合には、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ₁のポンプ光の光源と、第一電子励起状態の試料分子を一重項状態の第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ₂のプローブ光の光源と、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせる重ね手段とを有しており、重ね手段を介してポンプ光およびプローブ光を試料に照射し、試料内のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光を検出することをその基本構成としており、また、三重項過渡ラマン散乱過程を利用する場合には、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ₁のポンプ光の光源と、第一電子励起状態からそれよりも低エネルギーである三重項準位へ遷移した試料分子をその三重項準位よりも高い励起三重項準位へ励起させる波長λ₃のプローブ光の光源と、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせる重ね手段とを有しており、重ね手段を介してポンプ光およびプローブ光を試料に照射し、試料内のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光を検出することをその基本構成としている。
【００２０】
これらの二重共鳴吸収顕微鏡では、たとえば図４に例示したように、ポンプ光およびイレース光（あるいは過渡ラマン散乱過程を併用する場合にはプローブ光）を微妙に調整されたタイミングで試料に照射する必要があり、且つ蛍光を抑制するイレース光は非常に強い強度を有することが必要とされる。このため、検出器にいたるまでの光路に然るべきフィルターを設けるようにしても、完全にはポンプ光およびイレース光、特に強度の強いイレース光、の迷光が検出器に入る恐れがある。仮に、観察領域に蛍光分子が１つしかない場合には蛍光信号の強度が迷光信号に対して相対的に弱くなり、蛍光相関を測定しても、所望しない「光源のゆらぎ」を測定してしまう結果となる。
【００２１】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、パルス光源を用いた場合においても蛍光現象のみによる蛍光相関関数を的確に計測することのできる、新しい蛍光相関法を提供することを課題としている。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、基準クロックを基にパルス励起光を一定周期で試料上に集光しながら、試料に対してパルス励起光を相対的に位置操作して各操作位置における蛍光信号を検出し、検出した蛍光信号を基に蛍光相関関数を求めることにより蛍光相関分析を行う蛍光相関法であって、検出した信号データのうち、前記パルス励起光と同じ周期を有するとともに該周期のうち蛍光信号パルスの時間幅に相当する時間帯は第１のレベルとなりそれ以外の時間帯は第２のレベルとなるゲートパルスにしたがい、ゲートパルスが第１のレベルの時間帯の信号データは有効データとし、第２のレベルの時間帯の信号データは無効データとして蛍光相関関数の演算から除去して蛍光相関関数を求めることを特徴とする蛍光相関法。
【００２３】
また、この出願の発明は、上記蛍光相関方法において、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる励起光波長λ_１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ_２のイレース光とを用い、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせ、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域が一部分抑制された状態となるように、ポンプ光とイレース光を試料上に集光させること（請求項２）や、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ_１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ_２のイレース光とを用い、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせて、ポンプ光およびイレース光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出すること（請求項３）や、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ_１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を一重項状態の第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ_２のプローブ光とを用い、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせて、ポンプ光およびプローブ光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出すること（請求項４）や、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ_１のポンプ光と、第一電子励起状態からそれよりも低エネルギーである三重項準位へ遷移した試料分子をその三重項準位よりも高い励起三重項準位へ励起させる波長λ_３のプローブ光とを用い、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせて、ポンプ光およびプローブ光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出すること（請求項５）をその態様として提供する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
ここでは、この発明の蛍光相関法の原理について説明する。
【００２５】
図５は、この発明の蛍光相関法について説明する図である。この図５において、Ｐは、周期ｔ_cycle、パルス幅t_laserで発振しているパルスレーザーなどのパルス光源からのパルス励起光（図中ポンプ光と表示）のパルス列であり、パルス状で間欠的に発光している様子を表している。Ｓは、蛍光信号列であり、パルス光照射に応じて、蛍光寿命ｔ_gで蛍光分子が発光している様子を表している。Ｇは、ゲート信号のパルス列であり、周期ｔ_cycle、パルス幅t_gの負極性の信号である。このゲート信号パルス列は、完全に蛍光発光の周期と同期しており、位相ずれを持たず、しかも蛍光寿命の幅と同じパルス幅を有している。
【００２６】
図５に例示したように、蛍光信号は無いが、パルスレーザー制御用のゲート信号のパルスが存在する時間帯ｔ_openがある。この時間帯ｔ_openは、全く蛍光信号が存在しないので、計測には全く無関係である。もし、計測時間をＴとして、このような状況で蛍光相関関数を従来の蛍光相関法における前記数２を用いて求めると、ｔ_openという無意味な積分区間を含んで計算してしまい、検出器や光源に起因する不要なゆらぎも積分することとなってしまう。
【００２７】
そこで、この発明の蛍光相関法では、周期的に現れるt_openという時間帯を積分区間から除くことことにより、信号の質を向上する。より具体的には、この発明の蛍光相関法では、次式で与えられる相関関数を用いる。
【００２８】
【数４】

【００２９】
ここで、τは、ｔ_cycleの整数倍となっており、ある整数iとして、
【００３０】
【数５】

【００３１】
で与えられる。
【００３２】
図６は、この関係を例示したものである。すなわち、この図６に例示したように、量子的にt_cycleの整数ｉ倍だけ完全に位相をずらして、蛍光信号ｓ（ｊ）とｓ（ｊ＋１）のパルスの積の積分を行い、そして各ｎについて測定時間に相当するj全ての和をとれば数４の右辺の分子を計算したことになる。分母ついては、ｓ（ｊ）とｓ（ｊ＋１）の積について同じ操作を行えば良い。これにより計算された相関関数Ｇ（τ）^*は連続的でなく、数５が示すようにt_cycle間隔でとびとびの値をとる（図７参照）。なお、その包絡線は数２のＧ（τ）と同じ物理的な意味をもつことは言うまでもない。
【００３３】
したがって、この発明の蛍光相関法によれば、検出器や光源に起因する不要なゆらぎを含むことなく、純粋に蛍光現象に起因したゆらぎのみを検出することができ、高感度・高精度な蛍光分析を実現できるようになる。
【００３４】
また、たとえば前述の二重共鳴吸収顕微鏡においてこの発明の蛍光相関法を用いる場合には、パルス光源と検出器に信号を取り込むタイミングを制御するゲートとを同期させ、間欠的に来る蛍光信号を時系列に測定したｆ（ｔ）より、ハードウェアーまたはソフトウェアー的手段を用いて数４を基に算出すればよい。
【００３５】
この出願の発明は、以上のとおりの特徴を有するものであるが、以下に、添付した図面に沿って実施例を示し、さらに詳しくこの発明の実施の態様について説明する。
【００３６】
【実施例】
［実施例１］
図８は、この発明の蛍光相関法を実現する蛍光相関計測システムの一例を示した概略ブロック図である。
【００３７】
この図８に例示した蛍光相関計測システムの全系は、基本的にコンピュータ（１０１）によって制御される。まず、コンピュータ（１０１）は基準クロックを発生させ、これを基に、パルス光源としてのパルスレーザー（１０２）の発振、試料（１０３）が載置された試料走査ステージ（図示していない）の駆動制御、そして各種データの管理を行う。
【００３８】
より具体的には、系のタイミングは全てコンピュータ（１０１）のクロックに準拠しており、このクロックは分周器（１０４）によってレーザー発振可能な周波数まで分周される。まず、分周されたクロック信号は、ゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）により遅延および波形整形されて、レーザー制御用信号としてのＱスィッチパルスとされ、パルスレーザー（１０２）はこのＱスイッチパルスによって発振制御される。他方、試料（１０３）の試料走査ステージの駆動制御には、パルスレーザー（１０２）のレーザー発振と同期させるために、Ｑスイッチパルスと同期したゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）からのパルス信号が使われる。またさらに、ゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）からは、蛍光相関計測に必要となるＱスイッチパルスと同期したゲート信号であるゲートパルスが、後述するラインセレクター（１０８）に与えられる。
【００３９】
さて、Ｑスイッチパルスに従って発振されたパルスレーザー（１０２）からのパルスレーザー光は種々の光学系を介して試料（１０３）に集光照射され、パルスレーザー光のショット毎に試料（１０３）から蛍光が発生する。
【００４０】
このショット毎の蛍光は、検出器（１０６）で検出される。検出器（１０６）としては、たとえば、回折光子などの分光器およびＩＣＣＤカメラを基本構成としたものを用いることができる。ＩＣＣＤカメラは、マイクロチャンネルプレートの前側および後側それぞれに光電子変換器面を備えたことを基本構成としており、入射した光を前側の光電子変換面によって電子に変換し、マイクロチャンネルプレートでその電子を増幅した後、増幅電子を再度後側の光電変換面で光に変換する装置である。回折格子などの分光器はこのＩＣＣＤカメラの入力側前方に配置されている。この場合、ショット毎の蛍光は、検出器（１０６）において、分光器で分光された後、ＩＣＣＤカメラにより蛍光スペクトルとして検出される。そして、その蛍光波長領域の総光量はＩＣＣＤカメラからアナログ信号として出力され、このアナログ信号はプリアンプ（１０７）で増幅された後、ラインセレクター（１０８）へ入力される。
【００４１】
ラインセレクター（１０８）は、独立に入力される２つのアナログ信号に対して、各々のパルスゲート信号の極性に従ってどちらか一方を通過させるものである。本実施例では、ラインセレクター（１０８）には、プリアンプ（１０７）を介したアナログ蛍光信号が入力されるとともに、前述したようにゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）からのゲートパルスも入力される。そして、ラインセレクター（１０８）は、ゲートパルスが負レベルの場合にはプリアンプ（１０７）からの蛍光信号を通過させ、ゲートパルスが正レベルの場合にはグランドレベルすなわちゼロレベルの信号を出力する。パルスレーザー（１０２）は、ゲートパルスの立ち下がりで発振し、そのパルス幅が丁度プリアンプ（１０７）からの出力信号の時間幅をもつので、パルス幅の間である蛍光発光した時間だけ、蛍光信号がラインセレクター（１０８）を通過することとなる。これは、前述の図５に対応するもであり、実効的に蛍光信号のみがラインセレクター（１０８）を通過する。
【００４２】
そして、もともとゲートパルスは、コンピュータ（１０１）のシステムクロックを分周して生成したものであり、ゲートパルスのパルス周波数はシステムクロックの整数分の１になっているので、このシステムクロックの周波数で、ラインセレクター（１０８）の出力信号をサンプリングする。
【００４３】
システムクロックは同時にカウンター（１１１）を駆動し、その出力バイナリー信号はラインメモリ（１１０）のメモリアドレスを与える。このメモリアドレス信号と同期して、Ａ／Ｄ変換器（１０９）によりデジタル化された蛍光信号は、ラインメモリ（１１０）に格納される。このデータ転送操作により、ある特定の観察領域をレーザー照射したときの蛍光相関関数を求めるのに必要な観測時間分の全データが、ラインメモリ（１１０）に格納することになる。
【００４４】
そして、ラインメモリ（１１０）に格納されたデータは、Ｉ／Ｏポート（１１２）を介して、コンピュータ（１０１）の要求するタイミングで、コンピュータ（１０１）内のメモリに転送される。
【００４５】
以上の手順を繰り返しながら、試料走査ステージの移動およびレーザー発光と同期しながら、各画素ごとの蛍光相関関数を計算するためのデータがコンピュータ（１０１）のメモリに転送される。
【００４６】
コンピュータ（１０１）のメモリに記憶された蛍光スペクトルデータは、コンピュータの数値演算処理により、各画素ごとの蛍光相関関数に変換される。
【００４７】
なお、この蛍光相関計測システムは、たとえば、水銀ランプなどの照射で得られる試料（１０３）の蛍光画像を同時にＣＣＤカメラでモニターし、その画像データを随時フレームメモリーに蓄積できる構成を有していてもよく、この場合では、２次元走査画像とは別に、随時、試料（１０３）の蛍光像の全体をモニターしておくことができる。この他、コンピュータ（１０１）は画像表示や画像処理を随時行い、形成された画像データは、ディスプレイ（１１３）やビデオプリンター（１１４）などの出力手段により出力される。
【００４８】
ここで、蛍光信号が如何にしてラインメモリ（１１０）に格納されるかを、図９を用いてさらに説明する。図９は、レーザーショット毎のＳ（ｎ）番目からＳ（ｎ＋１）番目のパルス列の蛍光信号がラインメモリ（１１０）に入力される場合のタイムチャートを示している。なお、図９では、この発明の蛍光相関法を、二重共鳴吸収過程あるいはそれと過渡ラマン散乱過程を利用した二重共鳴吸収顕微鏡に適用する場合を考えて、パルスレーザー（１０２）からのレーザー光を用いてポンプ光およびイレース光（二重共鳴吸収過程と過渡ラマン散乱過程とを併用する場合にはプローブ光）の２波長光を発生させるものとする。二重共鳴吸収顕微鏡については、特願平６−３２９１６５号、特願平８−３０２２３２号、特願平９−２５５４４４、特願平１０−９７９２４、特願２０００−８２９３０を参照されたい。
【００４９】
さて、この図９において、メモリアクセスクロックはコンピュータ（１０１）のシステムクロックに相当し、そのタイミングでラインメモリ（１１０）のアドレスがカウンター（１１１）より出力される。クロック信号は、前述したように分周器（１０４）およびゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）を介してゲートパルス（図９中ゲート信号と記載）およびＱスイッチパルスに変換される。ラインセレクター（１０８）を制御するゲートパルスは、蛍光信号パルスの時間幅ｔ_gだけ負レベルになり、蛍光信号が存在しないt_openの間は正レベルになる。ポンプ光およびイレース光のパルスは、時間幅ｔ_cycleで周期的に発振する。当然、蛍光信号およびゲートパルスもｔ_cycleの周期で出力される。ここで、各時間幅には、ｔ_cycle ＝ｔ_g＋ｔ_openの関係がある。
【００５０】
図９を、別の時間系列の関係から説明する。まず、メモリークロックを分周したＱスイッチパルスによりポンプ光パルスが発振される。続いて、光路分だけ遅延したイレース光が発振される。これらポンプ光・イレース光パルスによって、時間幅ｔ_gを持った蛍光信号Ｓ（ｎ）がプリアンプ（１０７）から出力される。ゲートパルスもレーザー駆動の周期に、つまりＱスイッチパルスの周期に完全同期をしているが、ポンプ光およびイレース光が発振終了後に、多少遅延してゲートパルスは負レベルになり（図中のｇ（ｎ））、その後ｔ_g間その状態が持続する。続いて、ゲートパルスは正レベルとなってｔ_openの間この状態が続く。ゲートパルスは、蛍光相関を求めるのに十分な時間Ｔに渡って、ｔ_cycleでこの変化を繰り返す。このような操作により、ラインセレクター（１０８）は、Ｓ（ｎ）が存在するときの信号をＡ／Ｄ変換器（１０９）に送り込み、それ以外の時間帯はゼロレベルのグランド電圧の信号を送り込む。
【００５１】
これにより、検出器（１０６）のゆらぎに起因する信号やレーザー散乱光などは、ラインセレクター（１０８）からは出力されず、Ａ／Ｄ変換器（１０９）には入力されないこととなる。
【００５２】
Ａ／Ｄ変換を行う時のサンプリングのタイミングは、コンピュータ（１０１）が供給するシステムクロックのタイミングであり、そのタイミングでラインメモリ（１１０）の特定の番地にデータが書き込まれる。この時の大前提として、ゲートパルスの周波数は、システムクロックの周波数よりも低く、最低限レーザー１ショットで、蛍光信号Ｓ（ｎ）が１個分のデジタルデータが得られなくてはならない。図９では、ｔ_cycleの区間を（ｇ＋ｈ）分のデータサンプルリングを行っている。そのうち、ｇ個は有効信号蛍光Ｓ（ｎ）をサンプリングして、ｈ個は実質的に蛍光相関に関係しないゼロレベルの信号をサンプリングする。当然サンプリング周波数は、レーザーの繰り返し周波数の（ｇ＋ｈ）となる。言い換えると、レーザーの駆動パルス、つまりＱスイッチパルスはシステムクロックを１／（ｇ＋ｈ）に分周したものである。図９によれば、カウンター（１１１）で指定されたアドレスに従って、ｎ（ｇ＋ｈ）番地からｎ（ｇ＋ｈ）＋ｇ番地までデジタル化されたＳ（ｎ）のデータが格納され、ｎ（ｇ＋ｈ）＋ｇ＋１番地から（１＋ｎ）（ｇ＋ｈ）までは無効のゼロ信号が存在する。このようにして、ラインメモリ（１１０）内には、1番地から最終番地までＳ（１）からＳ（Ｍ）までの蛍光信号のデータが格納されることとなる。
【００５３】
このようにして、観測期間Ｔの間に計測したＳ（１）からＳ（Ｍ）までの蛍光信号のデータから、１測定点における蛍光相関関数を求めることができる。具体的には、ラインメモリ（１１０）にあるデータを、いったんＩ／Ｏボード（１１２）を介して、コンピュータ（１０１）内のメモリに転送する。その結果として、全体でＭ（ｇ＋ｈ）個のデジタルデータが、コンピュータ（１０１）内のメモリに存在する。仮に、このデータ群にＤ（Ｉ）という配列名を与え、Ｄ（１）からＤ（Ｍ（ｇ＋ｈ））を具体的なデータとして、蛍相関関数Ｇ（τ）^*の計算に用いる。この場合、蛍光データはＳ（ｎ）間欠的に存在するので、τも離散的な値をとり、レーザーの繰り返し間隔に相当する、（ｇ＋ｈ）の整数倍の値しか取らない。仮に、その整数の標識をｋと書くと、ｋは１からＭまでの整数をとる。したがって、コンピュータ（１０１）内で数値計算をするときはＧ（ｋ）^*という離散的な配列群として与えられる。数4に従い、以下の数6で与えられる積分計算を行えば、観測期間内での蛍光相関関数Ｇ（ｋ）^*を各観測ポイントで求めることができる。ここで、数4の積分は、不連続な関数となるので和の形移行する。
【００５４】
【数６】

【００５５】
この数６は演算方式で不要な積分時間帯を省いたものである。したがって、原理的にはラインセレクター（１０８）を通さなくても相関関数を計算できることにもなる。また、図９のメモリの格納状態を見ると、ｔ_openの区間はラインメモリ（１１０）にはゼロの値が入っているので、数６のように積算区間を考慮した２重和算は必ずしも行わなくてもよく、下記の数７のように簡略化された演算でもよい。
【００５６】
【数７】

【００５７】
この数７によれば、和算操作が一回なので、演算処理が簡単であり、演算アルゴリズムやハードウェアーの設計を簡略化できる。
【００５８】
なお、原理的には、蛍光信号のパルス列Ｓ（ｎ）のデータが存在するメモリアドレスを対応させることができれば、図２に例示したシステムでも、上述したこの発明の蛍光相関法を適用することができる。
【００５９】
以上のように、この発明の蛍光相関法によれば、間欠的な蛍光信号間で、全く蛍光信号成分の無い区間のデータ成分を除いて蛍光相関関数を求めるので、精度良く蛍光分子ゆらぎ以外の成分を除去することができる。したがって、蛍光分子ゆらぎのみに起因する蛍光相関関数を測定し、得られた蛍光相関関数を解析することで、試料（１０３）からの蛍光分子の移動速度や、粘度、分子数といった各物理量を高精度で求めることができる。またさらに、コンピュータ（１１０）のメモリ上で２次元再配列することで、多角的に試料（１０３）の２次元画像を形成することもできる。すなわち、この発明の蛍光相関法は、励起光源としてパルス光源を用いた場合においても、蛍光相関計測による優れた蛍光分析を実現できるのである。
【００６０】
［実施例２］
図１０は、二重共鳴吸収顕微鏡の一例を示した概略図である。この図１０に例示した二重共鳴吸収顕微鏡は、特願２０００―８２９３０に開示されている二重共鳴吸収過程および過渡ラマン散乱過程を併用した二重共鳴吸収顕微鏡と同じものである。この場合、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）がポンプ光およびプローブ光の光源、つまりパルス光源であり、前述したと同様に、この発明の蛍光相関法によって、蛍光分子ゆらぎのみに起因する蛍光相関関数を測定し、優れた蛍光分析を実現することができる。
【００６１】
もちろん、二重共鳴吸収過程のみを利用した二重共鳴吸収顕微鏡においても同様な効果を実現することができる。
【００６２】
したがって、この発明の蛍光相関法を、ポンプおよびイレース光もしくはプローブ光の光源としてパルス光源を備えた二重共鳴吸収顕微鏡において用いれば、二重共鳴吸収顕微鏡の特徴である超解像性の実現（たとえば空間分解を数１０ｎｍで画像化）とともに、蛍光相関関数による様々な物理量の分析および２次元マップ化をも可能となるのである。
【００６３】
以下に、図１０の二重共鳴吸収顕微鏡の説明をしておく。
【００６４】
まず、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）の基本波をＫＤＰ結晶（２）で波長変換することで５３２ｎｍ、３５５ｎｍ、２６６ｎｍ等の高次高調波を発振させる。これらの光をさらにオプティカルパラメトリクジェネレーター（５）によって観察対象の試料分子をＳ₀→Ｓ₁励起可能な波長λ₁に変換し、これをポンプ光とする。
【００６５】
また、ハーフミラー（３)により２倍高調波の１部を取り出し、ハーフミラー（４）を介して別のオプティカルパラメトリクジェネレーター（６）へ入射させ、試料分子をＳ₁→Ｓ₂励起可能な波長λ₂またはＴ₁→Ｔ₂励起な波長λ₃に変換し、これを一重項用プローブ光または三重項用プローブ光とする。これらプローブ光は、遅延光学系（７）により、パルスポンプ光と適当な時間差を得るために光学遅延される。時間差は、遅延光学系（７）に搭載されたプリズム（７１）の平行移動で簡単に調節できる。具体的には、照射時間調整手段としての遅延光学系（７）の光路調整による光学遅延によって、波長λ₂の一重項用プローブ光は、ポンプ光の照射後、試料分子が一重項状態の第一電子励起状態Ｓ₁から三重項準位Ｔ₁へ遷移する前に試料面へ到達するように照射され、他方、波長λ₃の三重項用プローブ光は、ポンプ光の照射後、試料分子が一重項状態の第一電子励起状態Ｓ₁から三重項準位Ｔ₁へ遷移した後に試料面へ到達するように照射される。
【００６６】
このように照射時間調整されるプローブ光は、その光路上の偏光子（９）および揺動ミラー(１０)を介してダイクロイックミラー（１１）へ入射され、ポンプ光は、その光路上の偏光子（８）を介してダイクロイックミラー（１１）へ入射される。両光は、ダイクロイックミラー（１１）によって同一光路とされる。偏光状態可変手段としての偏光子（８）および（９）は、ポンプ光およびプローブ光の偏光面を自由に回転できる。
【００６７】
さらに、本実施例では、重ね手段としての振動ミラー（１０）によって、プローブ光の光路をポンプ光に対して調整することで、集光面上で互いの照射領域を一部分重ね合わせることができる。もちろん両光の照射領域の全部分を重ね合わせるようにしてもよいが、平面分解能をより優れたものとするには、一部分のみを重ね合わせ、且つその重合せ領域を狭くする方が望ましい。
【００６８】
このように照射領域および照射時間が調整されるポンプ光およびプローブ光は、リレーレンズ（１２）により成形されて、ハーフミラー（１３）へ入射され、対物レンズ（１４）を通り試料（１５）上へ集光される。試料（１５）は試料走査ステージ（１６）上に設置されている。
【００６９】
ポンプ光の照射後に、一重項用プローブ光が照射された場合には一重項過渡ラマン散乱光が試料（１５）から発生し、三重項用プローブ光が照射された場合には三重項過渡ラマン散乱光が試料（１５）から発生する。
【００７０】
これら過渡ラマン散乱光は、ハーフミラー（１３）を通過し、ハーフミラー（１７）で反射されて、検出光学系に入射される。本実施例における検出光学系は、偏光子（１８）、レンズ（１９）、ピンホール（２０）、レンズ（２１）、透過型回折光子（２２）、およびＩＣＣＤカメラ（２３）で構成されている。この場合、過渡ラマン散乱光は、偏光子（１８）を介してレンズ（１９）によってピンホール（２０）の中央に集光され、さらにレンズ（２１）によって透過型回折格子（２２）を介して光電子変換原理を用いた高感度のＩＣＣＤカメラ(２３)へ入射される。ピンホール（２０）は空間フィルターとして機能し、試料（１５）以外から発する、たとえば光学系からの蛍光等をカットして測定のＳ／Ｎ比をより高めることができる。また、透過型回折光子（２２）はスペクトルメーターとして機能するので、過渡ラマン散乱光の測定はもちろんのこと、ラマンスペクトルやレーザー照射に対する時間応答をも測定できるので、試料（１５）の化学構造や組成の解析が可能となる。さらにまた、偏光子（８）（９）によってポンプ光およびプローブ光の偏光面を相対的に変化させることで、試料（１５）の組成の空間配向情報も得られる。
【００７１】
このように図１０に例示した二重共鳴吸収顕微鏡は、過渡ラマン散乱光の測定によって極めて優れた平面分解能および三次元分解能を有する、高機能分析型の超解像顕微鏡を実現している。そして、これに前述したこの発明の蛍光相関法を用いることで、さらに様々な蛍光分析が可能となるのである。
【００７２】
なお、過渡ラマン散乱過程を利用した二重共鳴吸収顕微鏡は、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域からの過渡ラマン散乱光を検出するものであるが、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域から検出できる信号は過渡ラマン散乱光に限らず、他にも分子によっては第二電子励起状態より蛍光を発光する場合もある。このように両光の重ね領域からの光応答を検出する二重共鳴吸収顕微鏡においても、この発明の蛍光相関法を用いることができるのは言うまでもない。
【００７３】
もちろん、この発明は以上の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能である。
【００７４】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この出願の発明は、パルス光源を用いた場合においても蛍光現象のみによる蛍光相関関数を的確に計測することのできる、新しい蛍光相関法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の蛍光相関法を説明する図である。
【図２】従来の蛍光相関法を用いて蛍光相関分析を行うシステムの代表的な一例を示した概略図である。
【図３】パルスレーザーを励起光源として用いた計測システムにおけるポンプ光と蛍光信号との時間関係を例示した図である。
【図４】二重共鳴吸収顕微鏡におけるポンプ光・イレース光と蛍光信号との時間関係を例示した図である。
【図５】この発明の蛍光相関法の原理について説明する図である。
【図６】この発明の蛍光相関法の原理について説明する別の図である。
【図７】この発明の蛍光相関法の原理について説明するさらに別の図である。
【図８】この発明の蛍光相関法を実現する蛍光相関計測システムの一例を示したブロック概略図である。
【図９】図８の蛍光相関計測システムにおけるレーザーショット毎のＳ（ｎ）番目からＳ（ｎ＋１）番目のパルス列の蛍光信号がラインメモリ（１１０）に入力される場合のタイムチャートを例示した図である。
【図１０】二重共鳴吸収顕微鏡の一例を示した概略図である。
【符号の説明】
１０１コンピュータ
１０２パルスレーザー
１０３試料
１０４分周器
１０５ゲート＆ディレイジェネレータ
１０６検出器
１０７プリアンプ
１０８ラインセレクター
１０９Ａ／Ｄ変換器
１１０ラインメモリ
１１１カウンター
１１２Ｉ／Ｏボード
１１３ディスプレイ
１１４ビデオプリンタ
２０１連続発振レーザー
２０２観察試料溶液
２０３レンズ
２０４ビームスプリットミラー
２０５レンズ
２０６ピンホール
２０７検出器
２０８プリアンプ
２０９アナログ・デジタル変換器
２１０コンピュータ
１Ｎｄ：ＹＡＧレーザー
２ＫＤＰ結晶
３，４ハーフミラー
５，６オプティカルパラメトリックジェネレーター
７遅延光学系
７１プリズム
８，９偏光子
１０揺動ミラー
１１ダイクロイックミラー
１２リレーレンズ
１３ハーフミラー
１４対物レンズ
１５試料
１６試料走査ステージ
１７反射ミラー
１８偏光子
１９，２１レンズ
２０ピンホール
２２透過型回折光子
２３ＩＣＣＤカメラ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a fluorescence correlation method.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, a fluorescence correlation method capable of performing fluorescence analysis at a single molecule level with high sensitivity is known. This fluorescence correlation method is a method that has been used for a long time to analyze the diffusion motion of particles such as the Brownian motion. For example, consider a case where a thin laser excitation light beam is applied to a dilute solution of fluorescent molecules to measure the fluorescence intensity for a long time. If the number of fluorescent molecules in the measurement region is N, the fluorescence intensity is proportional to N. For this reason, when the magnitude of fluctuation is expressed by S / N, (1 / N) ^1/2 It becomes.
[0003]
The fluorescence correlation method is a method for measuring the magnitude of the small fluctuation of fluorescence and the time correlation described later. The time for the fluorescence correlation function to decrease by half, ie the correlation time τ ₀ Is expressed by the following equation.
[0004]
[Expression 1]

[0005]
In Equation 1, D is the translational diffusion coefficient of the fluorescent molecule, and W is the beam radius when the radial intensity distribution function of the laser beam is a Gaussian distribution. Physically, this τ ₀ Corresponds to the time for the fluorescent molecules to cross the laser beam by diffusion.
[0006]
When measuring the fluctuation of the fluorescence, the output current f (t) of the photomultiplier tube is measured. When the laser light is not extremely large, the amount of fluorescence is proportional to f (t). In fact, the fluorescence correlation function is nothing but finding a correlation function with respect to time for this f (t). If this correlation function is written as G (x), it is given by the following equation.
[0007]
[Expression 2]

[0008]
If the laser intensity is close to a Gaussian distribution,
[0009]
[Equation 3]

[0010]
And can be expressed simply.
[0011]
In addition, as described above, the fluorescence correlation method measures a physical quantity by which the translational diffusion coefficient (D in Equation 1) of a fluorescent molecule is obtained, but is basically a thermodynamic quantity that gives a fluctuation of fluorescence. Any amount can be measured on the same principle.
[0012]
For example, if the laser beam is crossed by the flow of fluorescent molecules, fluorescence fluctuations are observed. In addition, the speed of the molecule can be observed as fluctuations when the fluorescent molecule binds to other molecules by chemical reaction or the like. That is, the progress of the chemical reaction can be known in real time. Moreover, the rotational motion of the molecule can be measured by ellipsometry. This is obvious, but from the intensity of G (τ), the number of molecules present in the observation region can also be directly measured. Specifically, as illustrated in FIG. 1, for example, a fluctuation function f (t) within a specific measurement time such that an expected fluctuation phenomenon is completed is measured, and the above equation 2 is calculated from the measured f (t). What is necessary is just to obtain | require a correlation function using. In general, as an excitation light source, it is the mainstream to perform fluorescence correlation analysis of dye molecules using a continuous wave argon laser or krypton laser.
[0013]
FIG. 2 shows a typical example of a system that performs fluorescence correlation analysis using the fluorescence correlation method. In the system illustrated in FIG. 2, a continuous wave laser (201) such as an argon laser is used as an excitation light source, and the laser beam is focused and irradiated onto an observation sample solution (202) containing a fluorescent dye by a lens (203). . The fluorescent light is collimated by the lens (203), turned back by the beam split mirror (204), and collected again by the lens (205). The condensed fluorescence passes through the pinhole (206) and is detected by a detector (207) such as a photomultiplier tube or CCD. The detected fluorescence is output as a current, amplified by a preamplifier (208), and then converted into digital data by an analog / digital converter (209). Finally, the digital fluorescence signal is taken into the memory of the computer (210) as time series data. In the computer (210), the correlation function G (τ) is calculated according to the above equation 2.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
However, the conventional fluorescence correlation method as described above has the following practical problems.
[0015]
That is, the conventional fluorescence correlation method is based on the premise that the time continuously changes as a function of time within the measurement time, as can be seen from Equation (2). On the other hand, high repetition as an excitation light source Pulse laser In the measurement system using the laser, for example, as illustrated in FIG. 3, the emission of the excitation light source becomes intermittent, and the fluorescence signal is also observed as an intermittent pulse waveform accordingly. It cannot be used.
[0016]
More specifically, high repetition Pulse laser Is an excitation light source, for example, as illustrated in FIG. 3, a time zone t in which no excitation pulse exists and no fluorescence signal exists. _off Exists. In this time zone, signal components that are completely unrelated to fluctuations of fluorescent molecules, such as simple detector noise and external stray light, are observed. At this time, if the fluorescence correlation is obtained by Equation 2, integration is performed including signal components that are completely unrelated to the fluorescence phenomenon. In extreme cases, the fluorescence emission time zone t _on Is t _off If it is smaller, the fluorescence correlation function indicating the fluctuation of the fluorescent molecule is not measured. Na Rather, the fluorescence correlation function indicating the fluctuation of the dark current of the detector including the photoelectron image multiplier is measured. Therefore, the conventional fluorescence correlation method is not applicable to a system using a pulse laser as an excitation light source.
[0017]
The inventor of the invention of this application, as one of high-performance and multifunctional microscopes, uses a double-resonance absorption process or a transient Raman scattering process to achieve super-resolution (hereinafter, two-resolution microscope). In this double resonance absorption microscope, a pulse laser is often used as an excitation light source, and the conventional fluorescence correlation method cannot be used.
[0018]
First, a double resonance absorption microscope using a double resonance absorption process (see Japanese Patent Application No. 6-329165, Japanese Patent Application No. 8-302232, Japanese Patent Application No. 9-255444, Japanese Patent Application No. 10-97924), Wavelength λ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronically excited state ₁ And a wavelength λ that excites the sample molecule in the first electron excited state to the second electron excited state or a higher excited state. ₂ The first electron excited state is obtained by irradiating the sample with the pump light and the erase light through the overlapping means. The basic structure is to partially suppress the emission region when the sample molecules are deexcited to the ground state.
[0019]
On the other hand, a double resonance absorption microscope (see Japanese Patent Application No. 2000-82930) that uses a transient Raman scattering process together with a double resonance absorption microscope, uses a singlet transient Raman scattering process when the sample molecule is in the ground state. Wavelength λ excited from the first electronic excited state of the singlet state to ₁ And a wavelength λ for exciting the sample molecule in the first electron excited state to the second electron excited state in the singlet state or a higher excited state. ₂ A light source for the probe light and a superimposing means for superimposing a part or all of the irradiation area of the pump light and the probe light, and irradiating the sample with the pump light and the probe light via the superimposing means. The basic configuration is to detect the transient Raman scattered light generated from the region where the pump light and probe light overlap, and when using the triplet transient Raman scattering process, the sample molecule is moved from the ground state to the singlet. Wavelength λ excited to the first electronic excited state ₁ And a wavelength λ that excites a sample molecule that has transitioned from the first electronic excited state to a triplet level having a lower energy than that of the first electronic excited state to an excited triplet level higher than the triplet level. _Three A light source for the probe light and a superimposing means for superimposing a part or all of the irradiation area of the pump light and the probe light, and irradiating the sample with the pump light and the probe light via the superimposing means. The basic configuration is to detect transient Raman scattered light generated from a region where pump light and probe light overlap.
[0020]
In these double resonance absorption microscopes, for example, as illustrated in FIG. 4, the sample is irradiated with pump light and erase light (or probe light when a transient Raman scattering process is used in combination) at a finely adjusted timing. The erase light that suppresses the fluorescence is required to have a very strong intensity. For this reason, even if an appropriate filter is provided in the optical path leading to the detector, the stray light of the pump light and the erase light, particularly the strong intense erase light, may enter the detector. If there is only one fluorescent molecule in the observation area, the intensity of the fluorescence signal becomes relatively weak with respect to the stray light signal, and even if the fluorescence correlation is measured, an undesired “light source fluctuation” is measured. Result.
[0021]
The invention of this application was made in view of the circumstances as described above, solves the problems of the prior art, and accurately measures the fluorescence correlation function based only on the fluorescence phenomenon even when a pulsed light source is used. It is an object to provide a new fluorescence correlation method.
[0022]
[Means for Solving the Problems]
The invention of this application is intended to solve the above problems. Based on the reference clock Pulse excitation light At regular intervals While focusing on the sample, position the pulsed excitation light relative to the sample to adjust the position at each operating position. Fluorescence correlation analysis is performed by detecting a fluorescence signal and obtaining a fluorescence correlation function based on the detected fluorescence signal A fluorescence correlation method, Of the detected signal data, the time period corresponding to the time width of the fluorescence signal pulse has the same period as that of the pulse excitation light, and the time period corresponding to the time width of the fluorescence signal pulse is the first level. According to the gate pulse, the signal data in the time zone in which the gate pulse is at the first level is regarded as valid data, and the signal data in the time zone at the second level is regarded as invalid data from the calculation of the fluorescence correlation function to obtain the fluorescence correlation function. Ask A fluorescence correlation method characterized by that.
[0023]
Further, the invention of this application is the above fluorescence correlation method, As the pulse excitation light, Excitation light wavelength λ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronically excited state ₁ Pump light When, Wavelength λ that excites the sample molecule in the first electronic excited state to the second electronic excited state or higher excited state ₂ Erase of Using light, Partial irradiation area of pump light and erase light Superposition, first Luminescence region when electron excited sample molecules are deexcited to ground state As shown in FIG. 2, the pump light and the erase light are collected on the sample so that a part of the pulse excitation light is suppressed. Wavelength λ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronically excited state ₁ Pump light When, Wavelength λ that excites the sample molecule in the first electronic excited state to the second electronic excited state or higher excited state ₂ Erase of Using light, Partial irradiation area of pump light and erase light Superimpose Pump light and erase light Focused on the sample, Area where sample pump light and erase light overlap Detecting a fluorescence signal composed of transient Raman scattered light generated from the light source (claim 3), and as the pulse excitation light, Wavelength λ that excites the sample molecule from the ground state to the singlet excited state of the first electron ₁ Pump light When, Wavelength λ that excites the sample molecule in the first electronic excited state into the singlet second excited state or higher excited state ₂ Probe light And Part or all of irradiation area of pump light and probe light Superimpose Pump light and probe light Detecting a fluorescent signal composed of transient Raman scattered light generated from a region where the pump light and probe light of the sample are overlapped on the sample (claim 4), and as the pulse excitation light, Wavelength λ that excites the sample molecule from the ground state to the singlet excited state of the first electron ₁ Pump light When, Wavelength λ that excites a sample molecule that has transitioned from the first electronically excited state to a lower triplet level to an excited triplet level higher than the triplet level. ₃ The probe light and probe light irradiation area is partially or entirely Superimpose Pump light and probe light Focused on the sample, Transient Raman scattered light generated from the region where the sample pump and probe light overlap Detecting a fluorescence signal comprising (Claim 5) is provided as an embodiment thereof.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Here, the principle of the fluorescence correlation method of the present invention will be described.
[0025]
FIG. 5 is a diagram for explaining the fluorescence correlation method of the present invention. In FIG. 5, P is a period t. _cycle , Pulse width t _laser This is a pulse train of pulse excitation light (denoted as pump light in the figure) from a pulse light source such as a pulse laser oscillating in FIG. S is a fluorescence signal sequence, and the fluorescence lifetime t depends on the pulsed light irradiation. _g This shows how fluorescent molecules emit light. G is a pulse train of the gate signal, and the period t _cycle , Pulse width t _g This is a negative polarity signal. This gate signal pulse train is completely synchronized with the fluorescence emission cycle, has no phase shift, and has the same pulse width as the fluorescence lifetime.
[0026]
As illustrated in FIG. 5, there is no fluorescence signal, but a time period t in which a pulse of a gate signal for pulse laser control exists. _open There is. This time zone t _open Is completely irrelevant to the measurement because no fluorescence signal is present. If the measurement time is T, and the fluorescence correlation function is obtained using the above-described equation 2 in the conventional fluorescence correlation method in such a situation, t _open The calculation includes a meaningless integration interval, and unnecessary fluctuations caused by the detector and the light source are also integrated.
[0027]
Therefore, in the fluorescence correlation method of the present invention, t appearing periodically. _open The signal quality is improved by removing the time zone from the integration interval. More specifically, in the fluorescence correlation method of the present invention, a correlation function given by the following equation is used.
[0028]
[Expression 4]

[0029]
Where τ is t _cycle As an integer i,
[0030]
[Equation 5]

[0031]
Given in.
[0032]
FIG. 6 illustrates this relationship. That is, as illustrated in FIG. _cycle If the phase is completely shifted by an integer i times, the product of the pulses of the fluorescence signals s (j) and s (j + 1) is integrated, and for each n, the sum of all j corresponding to the measurement time is taken, The numerator on the right side of is calculated. For the denominator, the same operation may be performed on the product of s (j) and s (j + 1). Correlation function G (τ) calculated by this ^* Is not continuous, as t = 5 _cycle Jump values are taken at intervals (see FIG. 7). Needless to say, the envelope has the same physical meaning as G (τ) in equation (2).
[0033]
Therefore, according to the fluorescence correlation method of the present invention, it is possible to detect only fluctuations caused purely by the fluorescence phenomenon without including unnecessary fluctuations caused by the detector and the light source, and high-sensitivity and high-precision fluorescence. Analysis can be realized.
[0034]
For example, when the fluorescence correlation method of the present invention is used in the above-described double resonance absorption microscope, the pulsed light source and the gate for controlling the timing of capturing the signal into the detector are synchronized so that the intermittently emitted fluorescence signal is timed. From f (t) measured in series, it may be calculated based on Equation 4 using hardware or software means.
[0035]
The invention of this application has the features as described above. Hereinafter, embodiments will be described with reference to the accompanying drawings, and embodiments of the present invention will be described in more detail.
[0036]
【Example】
[Example 1]
FIG. 8 is a schematic block diagram showing an example of a fluorescence correlation measurement system that realizes the fluorescence correlation method of the present invention.
[0037]
The entire system of the fluorescence correlation measurement system illustrated in FIG. 8 is basically controlled by a computer (101). First, the computer (101) generates a reference clock, and based on this, an oscillation of a pulse laser (102) as a pulse light source and driving of a sample scanning stage (not shown) on which the sample (103) is placed are driven. Control and manage various data.
[0038]
More specifically, all the system timings are based on the clock of the computer (101), and this clock is divided by the frequency divider (104) to a frequency at which laser oscillation is possible. First, the frequency-divided clock signal is delayed and shaped by a gate & delay generator (105) to form a Q switch pulse as a laser control signal, and the pulse laser (102) is controlled to oscillate by this Q switch pulse. Is done. On the other hand, in order to synchronize with the laser oscillation of the pulse laser (102), the pulse signal from the gate & delay generator (105) synchronized with the Q switch pulse is used for driving control of the sample scanning stage of the sample (103). . Furthermore, from the gate & delay generator (105), a gate pulse which is a gate signal synchronized with a Q switch pulse necessary for fluorescence correlation measurement is given to a line selector (108) described later.
[0039]
Now, the pulse laser beam from the pulse laser (102) oscillated according to the Q switch pulse is condensed and irradiated onto the sample (103) through various optical systems, and the fluorescence from the sample (103) is shot for each shot of the pulse laser beam. Occurs.
[0040]
The fluorescence for each shot is detected by the detector (106). As the detector (106), for example, a detector based on a spectroscope such as a diffracted photon and an ICCD camera can be used. The ICCD camera has a basic configuration in which a photoelectric conversion surface is provided on each of the front and rear sides of the microchannel plate. The incident light is converted into electrons by the front photoelectric conversion surface, and the electrons are converted by the microchannel plate. After amplification, the amplified electrons are converted again into light on the rear photoelectric conversion surface. A spectroscope such as a diffraction grating is disposed in front of the input side of the ICCD camera. In this case, the fluorescence for each shot is separated by the spectroscope in the detector (106) and then detected as a fluorescence spectrum by the ICCD camera. The total amount of light in the fluorescence wavelength region is output as an analog signal from the ICCD camera. The analog signal is amplified by the preamplifier (107) and then input to the line selector (108).
[0041]
The line selector (108) allows two analog signals input independently to pass either one according to the polarity of each pulse gate signal. In this embodiment, the line selector (108) receives the analog fluorescence signal via the preamplifier (107) and also receives the gate pulse from the gate & delay generator (105) as described above. The line selector (108) passes the fluorescent signal from the preamplifier (107) when the gate pulse is at a negative level, and outputs a ground level signal, that is, a zero level signal when the gate pulse is at a positive level. The pulse laser (102) oscillates at the falling edge of the gate pulse, and its pulse width has the time width of the output signal from the preamplifier (107). Will pass the line selector (108). This corresponds to FIG. 5 described above, and effectively only the fluorescence signal passes through the line selector (108).
[0042]
The gate pulse is originally generated by dividing the system clock of the computer (101), and the pulse frequency of the gate pulse is 1 / integer of the system clock. The output signal of the line selector (108) is sampled.
[0043]
The system clock simultaneously drives the counter (111) and its output binary signal gives the memory address of the line memory (110). In synchronization with the memory address signal, the fluorescence signal digitized by the A / D converter (109) is stored in the line memory (110). By this data transfer operation, all data for the observation time required to obtain the fluorescence correlation function when a specific observation region is irradiated with laser is stored in the line memory (110).
[0044]
The data stored in the line memory (110) is transferred to the memory in the computer (101) via the I / O port (112) at the timing requested by the computer (101).
[0045]
While repeating the above procedure, data for calculating the fluorescence correlation function for each pixel is transferred to the memory of the computer (101) while synchronizing with the movement of the sample scanning stage and the laser emission.
[0046]
The fluorescence spectrum data stored in the memory of the computer (101) is converted into a fluorescence correlation function for each pixel by numerical calculation processing of the computer.
[0047]
The fluorescence correlation measurement system has a configuration in which, for example, a fluorescence image of a sample (103) obtained by irradiation with a mercury lamp or the like is simultaneously monitored with a CCD camera, and the image data can be stored in a frame memory as needed. In this case, in addition to the two-dimensional scanning image, the entire fluorescent image of the sample (103) can be monitored at any time. In addition, the computer (101) performs image display and image processing as needed, and the formed image data is output by output means such as the display (113) and the video printer (114).
[0048]
Here, how the fluorescence signal is stored in the line memory (110) will be further described with reference to FIG. FIG. 9 shows a time chart when the fluorescence signals of the S (n) th to S (n + 1) th pulse trains for each laser shot are input to the line memory (110). In FIG. 9, considering the case where the fluorescence correlation method of the present invention is applied to a double resonance absorption microscope using a double resonance absorption process or a transient Raman scattering process, laser light from a pulse laser (102) is used. Are used to generate two-wavelength light of pump light and erase light (probe light when a double resonance absorption process and a transient Raman scattering process are used in combination). Regarding the double resonance absorption microscope, refer to Japanese Patent Application No. 6-329165, Japanese Patent Application No. 8-302232, Japanese Patent Application No. 9-255444, Japanese Patent Application No. 10-97924, and Japanese Patent Application No. 2000-82930.
[0049]
In FIG. 9, the memory access clock corresponds to the system clock of the computer (101), and the address of the line memory (110) is output from the counter (111) at that timing. As described above, the clock signal is converted into a gate pulse (described as a gate signal in FIG. 9) and a Q switch pulse through the frequency divider (104) and the gate & delay generator (105). The gate pulse for controlling the line selector (108) is the time width t of the fluorescence signal pulse. _g Only negative level, no fluorescence signal present _open During this period, the level is positive. The pulse of the pump light and the erase light has a time width t _cycle Oscillates periodically. Of course, the fluorescence signal and the gate pulse are also t _cycle Is output in the cycle. Here, each time width includes t _cycle = T _g + T _open There is a relationship.
[0050]
FIG. 9 will be described from the relationship of another time series. First, a pump light pulse is oscillated by a Q switch pulse obtained by dividing the memory clock. Subsequently, erase light delayed by the optical path is oscillated. By these pump light / erase light pulses, the time width t _g The fluorescence signal S (n) having the signal is output from the preamplifier (107). The gate pulse is also completely synchronized with the period of the laser drive, that is, the period of the Q switch pulse, but after the oscillation of the pump light and the erase light, the gate pulse becomes negative level with a slight delay (g in the figure). (N)), then t _g The state lasts for a while. Subsequently, the gate pulse becomes positive level and t _open This state continues for The gate pulse is t for a time T sufficient to determine the fluorescence correlation. _cycle Repeat this change. By such an operation, the line selector (108) sends a signal when S (n) is present to the A / D converter (109), and sends a signal of a zero level ground voltage during other times. .
[0051]
As a result, signals due to fluctuations of the detector (106), laser scattered light, and the like are not output from the line selector (108) and are not input to the A / D converter (109).
[0052]
The sampling timing when performing A / D conversion is the timing of the system clock supplied by the computer (101), and data is written to a specific address of the line memory (110) at that timing. As a major premise at this time, the frequency of the gate pulse is lower than the frequency of the system clock, and it is necessary to obtain digital data corresponding to one fluorescence signal S (n) with at least one laser shot. In FIG. 9, t _cycle (G + h) worth of data sampling is performed in the interval. Of these, g samples the effective signal fluorescence S (n), and h samples a zero level signal substantially unrelated to fluorescence correlation. Naturally, the sampling frequency is the laser repetition frequency (g + h). In other words, the laser drive pulse, that is, the Q switch pulse is obtained by dividing the system clock by 1 / (g + h). According to FIG. 9, data of S (n) digitized from address n (g + h) to address n (g + h) + g is stored according to the address specified by the counter (111), and address n (g + h) + g + 1 is stored. Through (1 + n) (g + h), there is an invalid zero signal. In this way, the fluorescence signal data from S (1) to S (M) is stored in the line memory (110) from the first address to the last address.
[0053]
In this way, the fluorescence correlation function at one measurement point can be obtained from the fluorescence signal data from S (1) to S (M) measured during the observation period T. Specifically, the data in the line memory (110) is once transferred to the memory in the computer (101) via the I / O board (112). As a result, a total of M (g + h) digital data exists in the memory in the computer (101). If the data group is given an array name D (I), D (1) to D (M (g + h)) are used as specific data, and the firefly correlation function G (τ) ^* Used to calculate In this case, since the fluorescence data exists intermittently in S (n), τ also takes a discrete value and takes only a value that is an integral multiple of (g + h) corresponding to the laser repetition interval. If the integer indicator is written as k, k takes an integer from 1 to M. Therefore, G (k) when performing numerical calculation in the computer (101) ^* Is given as a discrete array group. According to Equation 4, if the integral calculation given by Equation 6 below is performed, the fluorescence correlation function G (k) within the observation period ^* Can be obtained at each observation point. Here, since the integral of Equation 4 becomes a discontinuous function, it shifts to the sum form.
[0054]
[Formula 6]

[0055]
Equation 6 is obtained by omitting an unnecessary integration time zone in the calculation method. Therefore, in principle, the correlation function can be calculated without passing through the line selector (108). Also, when looking at the storage state of the memory in FIG. _open Since the zero value is stored in the line memory (110) in the interval of, the double sum calculation considering the integration interval is not necessarily performed as shown in Equation 6, but simplified as shown in Equation 7 below. The calculated operation may be used.
[0056]
[Expression 7]

[0057]
According to Equation 7, since the sum operation is performed once, the arithmetic processing is simple, and the design of the arithmetic algorithm and hardware can be simplified.
[0058]
In principle, the above-described fluorescence correlation method of the present invention can be applied to the system illustrated in FIG. 2 as long as the memory address where the data of the pulse train S (n) of the fluorescence signal can be associated. it can.
[0059]
As described above, according to the fluorescence correlation method of the present invention, the fluorescence correlation function is obtained by excluding the data component in the interval where there is no fluorescence signal component between the intermittent fluorescence signals. Components can be removed. Therefore, by measuring the fluorescence correlation function caused only by fluorescence molecule fluctuations and analyzing the obtained fluorescence correlation function, each physical quantity such as the moving speed, viscosity, and number of molecules of the fluorescent molecule from the sample (103) is increased. It can be determined with accuracy. Furthermore, a two-dimensional image of the sample (103) can be formed in a multifaceted manner by rearranging two-dimensionally on the memory of the computer (110). That is, the fluorescence correlation method of the present invention can realize excellent fluorescence analysis by fluorescence correlation measurement even when a pulse light source is used as an excitation light source.
[0060]
[Example 2]
FIG. 10 is a schematic view showing an example of a double resonance absorption microscope. The double resonance absorption microscope exemplified in FIG. 10 is the same as the double resonance absorption microscope disclosed in Japanese Patent Application No. 2000-82930 using a double resonance absorption process and a transient Raman scattering process. In this case, the Nd: YAG laser (1) is a light source of pump light and probe light, that is, a pulse light source. Similarly to the above, the fluorescence correlation function caused only by the fluorescence molecule fluctuation is obtained by the fluorescence correlation method of the present invention. Measure and achieve excellent fluorescence analysis.
[0061]
Of course, the same effect can be realized in a double resonance absorption microscope using only the double resonance absorption process.
[0062]
Therefore, if the fluorescence correlation method of the present invention is used in a double resonance absorption microscope having a pulse light source as a pump and erase light or probe light source, the super-resolution characteristic of the double resonance absorption microscope is realized ( For example, spatial resolution can be imaged at several tens of nm), and various physical quantities can be analyzed and two-dimensional mapped using a fluorescence correlation function.
[0063]
The double resonance absorption microscope of FIG. 10 will be described below.
[0064]
First, the fundamental wave of the Nd: YAG laser (1) is wavelength-converted by the KDP crystal (2) to oscillate high-order harmonics such as 532 nm, 355 nm, and 266 nm. These light is further converted into sample molecules to be observed by an optical parametric generator (5). ₀ → S ₁ Excitable wavelength λ ₁ This is used as pump light.
[0065]
Further, a part of the second harmonic is taken out by the half mirror (3), is incident on another optical parametric generator (6) through the half mirror (4), and the sample molecule is S ₁ → S ₂ Excitable wavelength λ ₂ Or T ₁ → T ₂ Excitation wavelength λ _Three This is used as singlet probe light or triplet probe light. These probe lights are optically delayed by the delay optical system (7) in order to obtain an appropriate time difference from the pulse pump light. The time difference can be easily adjusted by the parallel movement of the prism (71) mounted on the delay optical system (7). Specifically, the wavelength λ is caused by the optical delay due to the optical path adjustment of the delay optical system (7) as the irradiation time adjusting means. ₂ The singlet probe light of the first electron excited state S in which the sample molecule is in a singlet state after being irradiated with the pump light. ₁ To triplet level T ₁ Is irradiated to reach the sample surface before the transition to _Three The triplet probe light of the first electron excited state S in which the sample molecule is in a singlet state after being irradiated with the pump light. ₁ To triplet level T ₁ Irradiation to reach the sample surface after transition to.
[0066]
The probe light whose irradiation time is adjusted in this way is incident on the dichroic mirror (11) via the polarizer (9) and the oscillating mirror (10) on the optical path, and the pump light is the polarizer on the optical path. The light enters the dichroic mirror (11) via (8). Both lights have the same optical path by the dichroic mirror (11). Polarizers (8) and (9) as polarization state varying means can freely rotate the polarization planes of pump light and probe light.
[0067]
Further, in this embodiment, the irradiation areas can be partially overlapped on the light condensing surface by adjusting the optical path of the probe light with respect to the pump light by the vibrating mirror (10) as the overlapping means. Of course, it is possible to superimpose all parts of the irradiation areas of both lights. However, in order to improve the planar resolution, it is desirable to superimpose only a part and narrow the overlapping area.
[0068]
Thus, the pump light and the probe light whose irradiation area and irradiation time are adjusted are shaped by the relay lens (12), are incident on the half mirror (13), pass through the objective lens (14), and on the sample (15). Focused on The sample (15) is placed on the sample scanning stage (16).
[0069]
If singlet probe light is irradiated after pump light irradiation, singlet transient Raman scattered light is generated from the sample (15), and triplet transient Raman scattering is generated when triplet probe light is irradiated. Light is generated from the sample (15).
[0070]
These transient Raman scattered light passes through the half mirror (13), is reflected by the half mirror (17), and enters the detection optical system. The detection optical system in this embodiment is composed of a polarizer (18), a lens (19), a pinhole (20), a lens (21), a transmissive diffracted photon (22), and an ICCD camera (23). . In this case, the transient Raman scattered light is condensed at the center of the pinhole (20) by the lens (19) through the polarizer (18), and further through the transmission diffraction grating (22) by the lens (21). It is incident on a high-sensitivity ICCD camera (23) using the photoelectric conversion principle. The pinhole (20) functions as a spatial filter, and can increase the S / N ratio of the measurement by cutting, for example, fluorescence emitted from other than the sample (15) from the optical system. Further, since the transmissive diffracted photon (22) functions as a spectrum meter, not only the measurement of transient Raman scattered light but also the time response to the Raman spectrum and laser irradiation can be measured. Analysis of the composition becomes possible. Furthermore, the spatial orientation information of the composition of the sample (15) can be obtained by relatively changing the polarization planes of the pump light and the probe light by the polarizers (8) and (9).
[0071]
As described above, the double resonance absorption microscope exemplified in FIG. 10 realizes a high-resolution analysis type super-resolution microscope having extremely excellent plane resolution and three-dimensional resolution by measuring transient Raman scattered light. Further, by using the above-described fluorescence correlation method of the present invention, further various fluorescence analyzes can be performed.
[0072]
The double resonance absorption microscope using the transient Raman scattering process detects transient Raman scattered light from the region where the sample pump light and erase light overlap, but the sample pump light and erase light overlap. The signal that can be detected from the region is not limited to transient Raman scattered light, but other molecules may emit fluorescence from the second electron excited state. It goes without saying that the fluorescence correlation method of the present invention can also be used in a double resonance absorption microscope that detects the optical response from the overlapping region of both lights in this way.
[0073]
Of course, the present invention is not limited to the above examples, and various modes are possible for details.
[0074]
【The invention's effect】
As described above in detail, the invention of this application provides a new fluorescence correlation method capable of accurately measuring a fluorescence correlation function based only on a fluorescence phenomenon even when a pulse light source is used.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating a conventional fluorescence correlation method.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a typical example of a system for performing fluorescence correlation analysis using a conventional fluorescence correlation method.
FIG. 3 is a diagram illustrating a time relationship between pump light and a fluorescence signal in a measurement system using a pulse laser as an excitation light source.
FIG. 4 is a diagram illustrating a time relationship between pump light / erase light and a fluorescence signal in a double resonance absorption microscope.
FIG. 5 is a diagram for explaining the principle of the fluorescence correlation method of the present invention.
FIG. 6 is another diagram for explaining the principle of the fluorescence correlation method of the present invention.
FIG. 7 is still another diagram for explaining the principle of the fluorescence correlation method of the present invention.
FIG. 8 is a block schematic diagram showing an example of a fluorescence correlation measurement system that realizes the fluorescence correlation method of the present invention.
9 is a diagram illustrating a time chart when fluorescence signals of S (n) th to S (n + 1) th pulse train for each laser shot in the fluorescence correlation measurement system of FIG. 8 are input to the line memory (110). It is.
FIG. 10 is a schematic view showing an example of a double resonance absorption microscope.
[Explanation of symbols]
101 computer
102 pulse laser
103 samples
104 divider
105 Gate & Delay Generator
106 Detector
107 preamplifier
108 Line selector
109 A / D converter
110 line memory
111 counter
112 I / O board
113 display
114 video printer
201 continuous wave laser
202 Observation sample solution
203 Lens
204 Beam split mirror
205 lenses
206 pinhole
207 Detector
208 preamplifier
209 Analog to digital converter
210 computer
1 Nd: YAG laser
2 KDP crystal
3,4 Half mirror
5,6 Optical parametric generator
7 Delay optics
71 prism
8,9 Polarizer
10 Swing mirror
11 Dichroic mirror
12 Relay lens
13 Half mirror
14 Objective lens
15 samples
16 Sample scanning stage
17 Reflection mirror
18 Polarizer
19, 21 lens
20 pinhole
22 Transmission type diffractive photons
23 ICCD camera

Claims

While focusing the pulsed excitation light on the sample based on the reference clock at a fixed period, the position of the pulsed excitation light is relatively controlled with respect to the sample to detect the fluorescence signal at each operation position. A fluorescence correlation method for performing fluorescence correlation analysis by obtaining a fluorescence correlation function based on the detected signal data, and having the same period as the pulse excitation light in the detected signal data and corresponding to the time width of the fluorescence signal pulse in the period In accordance with the gate pulse in which the time zone during which the gate pulse is at the first level and the other time zone is at the second level, the signal data in the time zone in which the gate pulse is at the first level is valid data, and the time at the second level. A fluorescence correlation method, wherein the band signal data is removed from the calculation of the fluorescence correlation function as invalid data to obtain a fluorescence correlation function .

As the pulsed excitation light, pump light having an excitation light wavelength λ ₁ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronic excited state, and the sample molecule in the first electronic excited state to the second electronic excited state or higher excited state. Using the excitation light of wavelength λ ₂ to be excited, the irradiation region of the pump light and the erase light is partially overlapped, and the emission region when the sample molecule in the first electron excited state is deexcited to the ground state is partially suppressed The fluorescence correlation method according to claim 1 , wherein the pump light and the erase light are condensed on the sample so that

As the pulse excitation light, pump light having a wavelength λ ₁ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronic excited state and the sample molecule in the first electronic excited state to the second electronic excited state or a higher excited state. Generated from the area where the pump light and erase light of the sample overlap by using the erase light of wavelength λ ₂ and partially overlapping the irradiation area of the pump light and erase light and condensing the pump light and erase light on the sample 2. The fluorescence correlation method according to claim 1, wherein a fluorescence signal composed of transient Raman scattered light is detected .

As the pulse excitation light, pump light having a wavelength λ ₁ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronic excited state in the singlet state, and the second electron excited state in the singlet state of the sample molecule in the first electronic excited state. Alternatively , the probe light of wavelength λ ₂ that is excited to a higher excited state is used, and the irradiation area of the pump light and the probe light is partially or entirely overlapped to collect the pump light and the probe light on the sample. 2. The fluorescence correlation method according to claim 1, wherein a fluorescence signal comprising transient Raman scattered light generated from a region where pump light and probe light overlap is detected .

As the pulse excitation light, pump light having a wavelength λ ₁ that excites the sample molecule from the ground state to the first electronic excited state of the singlet state, and from the first electronic excited state to the triplet level that has lower energy than that. Using the probe light of wavelength λ ₃ that excites the transitioned sample molecule to an excited triplet level higher than its triplet level, the pump light and the irradiation region of the probe light are partially or entirely overlapped, and the pump light 2. The fluorescence correlation method according to claim 1 , further comprising: condensing the probe light on the sample and detecting a fluorescence signal composed of transient Raman scattered light generated from a region where the pump light and the probe light of the sample overlap.