JP2009229714A - Chart for resolution evaluation of coherent raman microscope, its manufacturing method, light source device for coherent raman microscope, and method of adjusting coherent raman microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートおよびその製造方法、コヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置、並びに、コヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法に関するものである。 The present invention relates to a resolution evaluation chart for a coherent Raman microscope, a manufacturing method thereof, a light source device for a coherent Raman microscope, and a method for adjusting a coherent Raman microscope.
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されている。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。 The technology of the optical microscope is old, and various types of microscopes have been developed. In recent years, more advanced microscope systems have been developed due to advances in peripheral technologies such as laser technology and electronic image technology.
このような背景の中、様々な分光過程を用いた高機能な顕微鏡が提案され、試料の形状のみならず、試料に含まれている分子の同定や構造解析が可能となっている。その中でも、生体試料や工業材料を染色せずに、それらの光応答を観測することにより、構造を解析するラマン分光法が存在し、顕微鏡分野への応用が期待されている(例えば、特許文献1参照)。 In such a background, a highly functional microscope using various spectroscopic processes has been proposed, and not only the shape of the sample but also the identification and structural analysis of the molecules contained in the sample are possible. Among them, there is a Raman spectroscopic method for analyzing the structure by observing the optical response of a biological sample or industrial material without staining it, and application to the microscope field is expected (for example, patent documents). 1).
ラマン分光とは、ラマン効果と呼ばれている一種の非線型光学効果を基礎にしている。強いフォトンフラックスで光が分子や原子に散乱されると、分子の量子状態が変化して、それらの系全体のエネルギーが変化する。そのとき、変化したエネルギー分が散乱された光子に移行し、結果として入射した光と異なる波長の光が発生する。このような現象をラマン散乱と言う。このラマン散乱には、(1)非共鳴ラマン散乱、(2)真正共鳴ラマン散乱、(3)前期共鳴ラマン散乱、(4)コヒーレント・ラマン散乱がある。以下、これらのラマン散乱について、図5および図6を参照して、さらに詳細に説明する。 Raman spectroscopy is based on a kind of nonlinear optical effect called the Raman effect. When light is scattered by molecules and atoms with a strong photon flux, the quantum state of the molecules changes and the energy of the entire system changes. At that time, the changed energy shifts to scattered photons, and as a result, light having a wavelength different from that of the incident light is generated. Such a phenomenon is called Raman scattering. The Raman scattering includes (1) non-resonant Raman scattering, (2) genuine resonance Raman scattering, (3) pre-resonance Raman scattering, and (4) coherent Raman scattering. Hereinafter, these Raman scattering will be described in more detail with reference to FIGS. 5 and 6.
図5(a)は、非共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。非共鳴ラマン散乱は、原子および分子の立場からみると、2次の摂動論で説明できる。すなわち、図5(a)に示すように、S(imaginary)と言う仮想的な量子準位を仮定した一種の2光子過程である。この2光子励起過程では、最低電子状態で、かつ最低振動回転準位、すなわち基底状態S0にあった分子は、例えば、非常に強いレーザ光で、一度、仮想的な量子準位S(imaginary)に励起され、その後、最低電子状態の高い振動回転準位(V2)に脱励起する。結果的には、図5(a)から明らかなように、入射した光が、原子または分子に、(Ei−E0)の光子エネルギーを与え、非共鳴ラマン散乱後は、光はその分、光子エネルギーを損失して、見かけ上、光の波長がλ1であったのが、長波長のλ2に変化して散乱される。一般に、非共鳴ラマン散乱を含む仮想的な量子準位を前提とした2光子過程は、極めて遷移確率が小さく、この過程を誘発するためには、フェムト秒オーダの超短パルスレーザを必要とする場合もある。 FIG. 5A is an energy diagram illustrating non-resonant Raman scattering. Non-resonant Raman scattering can be explained by second-order perturbation theory from the viewpoint of atoms and molecules. That is, as shown in FIG. 5A, this is a kind of two-photon process assuming a virtual quantum level called S (imaginary). In this two-photon excitation process, a molecule that is in the lowest electronic state and in the lowest vibrational rotational level, that is, in the ground state S0, is, for example, once with a very strong laser beam and a virtual quantum level S (imaginary). And then de-excited to the high vibrational rotation level (V2) of the lowest electronic state. As a result, as is clear from FIG. 5A, the incident light gives the photon energy of (Ei-E0) to the atom or molecule, and after non-resonant Raman scattering, the light is equivalent to the photon. Energy is lost, and the apparent wavelength of light is λ1, but is changed to a longer wavelength of λ2 and scattered. In general, a two-photon process based on a virtual quantum level including non-resonant Raman scattering has a very low transition probability, and an ultrashort pulse laser on the order of femtoseconds is required to induce this process. In some cases.
図5(b)は、真正共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。真正共鳴ラマン散乱は、非共鳴ラマン散乱が特殊な条件を満たす場合の散乱過程で、図5(a)に示すように、S(imaginary)が、実在する第1電子励起状態S1に一致した場合である。この場合は、基底状態S0の分子が、実在する第1電子励起状態S1に励起され、その後、最低電子状態の高い振動回転準位(V2)に脱励起する過程に対応する。見かけ上、図1(b)に示すように、あたかもS0→S1励起後、λ2という蛍光を発光する過程と一致する。この真正共鳴ラマン散乱は、実在する量子状態を利用するので、極めて散乱確率が高く、非共鳴ラマン散乱と比較すると格段に強い光強度でラマン散乱を発現できる。 FIG. 5B is an energy diagram for explaining the true resonance Raman scattering. Authentic resonance Raman scattering is a scattering process when non-resonance Raman scattering satisfies special conditions, and when S (imaginary) matches the actual first electronically excited state S1, as shown in FIG. It is. This case corresponds to a process in which a molecule in the ground state S0 is excited to the actual first electronic excited state S1 and then deexcited to the vibrational rotational level (V2) having the lowest electronic state. Apparently, as shown in FIG. 1 (b), it is as if the fluorescence of λ2 is emitted after excitation of S0 → S1. Since this genuine resonance Raman scattering uses an existing quantum state, the scattering probability is extremely high, and Raman scattering can be expressed with a much stronger light intensity than non-resonance Raman scattering.
図5(c)は、前期共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。前期共鳴ラマン散乱は、真正共鳴ラマン散乱と非共鳴ラマン散乱との中間の性質をもつ。すなわち、第1電子励起状態S1の近傍にS(imaginary)が存在する場合である。 FIG. 5C is an energy diagram illustrating the pre-resonance Raman scattering. Pre-resonance Raman scattering has an intermediate property between genuine resonance Raman scattering and non-resonance Raman scattering. That is, S (imaginary) exists in the vicinity of the first electronically excited state S1.
図6は、コヒーレント・ラマン散乱を説明する図で、図6(a)はコヒーレント・アンチストークスラマン散乱(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering;CARS)のエネルギーダイアグラム、図6(b)はコヒーレント・ストークスラマン散乱(Coherent Stokes Raman Scattering;CSRS)のエネルギーダイアグラムである。コヒーレント・ラマン散乱(Coherent Raman Scattering)は、時間領域で振動ダイナミクスを研究する手段の一つで、実験および理論の両側面から様々な研究が行われている。 6A and 6B are diagrams illustrating coherent Raman scattering. FIG. 6A is an energy diagram of Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS), and FIG. 6B is a coherent Stokes Raman. It is an energy diagram of scattering (Coherent Stokes Raman Scattering; CSRS). Coherent Raman Scattering is one of the means to study vibrational dynamics in the time domain, and various studies have been conducted from both experimental and theoretical sides.
このコヒーレント・ラマン散乱は、三次の非線形光学過程の一つで、一般に角振動数の異なる二つのレーザ光(ω1光、ω2光)を用いる。はじめに分子と相互作用するω1光およびω2光のレーザ光は、ポンプ光およびストークス光とも呼ばれる。これら二つの入射光の角振動数差が、試料分子の持つ振動モードの角振動数Ωと一致すると、多数の試料分子の振動モードが共鳴的に、かつ位相を揃えて、すなわちコヒーレントに励振される。発生した振動分極は、位相緩和時間の間持続しているので、その間にプローブ光であるもう一つのω1光と分子が相互作用することにより、三次の非線形分極に由来する分極波としてコヒーレント・ラマン散乱光を取り出すことができる。 This coherent Raman scattering is one of third-order nonlinear optical processes, and generally uses two laser beams (ω1 light and ω2 light) having different angular frequencies. First, the laser light of ω1 light and ω2 light that interacts with molecules is also called pump light and Stokes light. When the angular frequency difference between these two incident lights matches the angular frequency Ω of the vibration mode of the sample molecule, the vibration modes of many sample molecules are excited in resonance and in phase, that is, coherently. The The generated vibrational polarization lasts for the phase relaxation time, so that another ω1 light, which is the probe light, interacts with the molecule in the meantime to generate coherent Raman as a polarization wave derived from the third-order nonlinear polarization. Scattered light can be extracted.
すなわち、ポンプ光およびストークス光と、プローブ光との間の遅延時間を変化させることにより、分子振動の位相緩和時間に関する情報を得ることができる。特に、図6(a)に示すように、振動数が+Ω大きくなったラマン散乱光は、CARSと呼ばれる。また、図6(b)に示すように、振動数が−Ω小さくなったラマン散乱光は、CSRSと呼ばれる。特に、CARSの場合は、励起光より短波長側で信号光を検出するので、自家蛍光によるバックグラウンド等の影響を受けにくく、良好なS/Nで信号光を検出できることから、近年では、分光分析型顕微鏡等に幅広く適用され始めている。 That is, information on the phase relaxation time of molecular vibration can be obtained by changing the delay time between the pump light and Stokes light and the probe light. In particular, as shown in FIG. 6A, Raman scattered light whose frequency is increased by + Ω is called CARS. In addition, as shown in FIG. 6B, the Raman scattered light whose frequency is reduced by −Ω is called CSRS. In particular, in the case of CARS, since signal light is detected at a shorter wavelength side than excitation light, it is not easily affected by the background due to autofluorescence, and signal light can be detected with good S / N. Widely applied to analytical microscopes.
このように、CARS過程は、非線形光学過程であるため、レーザ光、すなわちポンプ光(プローブ光)およびストークス光が強く集光された特定の微小3次元部分からのみ信号光が発生する。その結果、共焦点顕微鏡のようにピンホールを導入する必要がなく、走査型レーザ顕微鏡にCARS過程を導入することにより、本質的に高い三次元空間分解能を実現することができる。しかも、無染色で生物試料を観察できることから、その商品化が強く期待できる。 As described above, since the CARS process is a nonlinear optical process, signal light is generated only from a specific minute three-dimensional portion where laser light, that is, pump light (probe light) and Stokes light are strongly condensed. As a result, it is not necessary to introduce a pinhole unlike a confocal microscope, and by introducing a CARS process in a scanning laser microscope, an essentially high three-dimensional spatial resolution can be realized. Moreover, since a biological sample can be observed without staining, the commercialization thereof can be strongly expected.
ところで、通常の光学顕微鏡では、例えば、蛍光顕微鏡や透過型明視野顕微鏡のように、照明光と信号光とが比例する。しかも、複数の波長の光を精度良く同じ空間に集光する必要もないので、顕微鏡の組み立て・調整、および観察時の微調整も煩雑ではなく、ユーザフレンドリの顕微鏡システムを提供できた。加えて、空間形状が精度良くキャリブレーションされたテストチャート(顕微鏡解像度チャート)がある。したがって、この顕微鏡解像度チャートを観察しながら光学調整を行うことにより、結像性能の最適化が可能となる。具体的には、図7(a)に示すように、顕微鏡解像度チャート100に形成された波長オーダの細線パターンを観察して、図7(b)に示すように、画像計測することにより、コントラス伝達関数や2次元点像分布関数を定量的に評価できる。これらの評価物理量を最適化するように、顕微鏡対物レンズの選定、光軸調整、検出器の調整、ステージ走査機構のチェックといった綿密なシステム調整(顕微鏡調整)が簡単にできる。
By the way, in a normal optical microscope, for example, illumination light and signal light are proportional to each other as in a fluorescence microscope or a transmission type bright field microscope. In addition, since it is not necessary to condense light of a plurality of wavelengths in the same space with high accuracy, assembly and adjustment of the microscope and fine adjustment during observation are not complicated, and a user-friendly microscope system can be provided. In addition, there is a test chart (microscope resolution chart) whose space shape is accurately calibrated. Therefore, it is possible to optimize the imaging performance by performing optical adjustment while observing the microscope resolution chart. Specifically, as shown in FIG. 7A, the fine line pattern of the wavelength order formed on the
しかしながら、コヒーレント・ラマン過程を用いた顕微鏡法では、状況を異にする。確かに、上述したように、コヒーレント・ラマン過程を用いた顕微鏡、特に、CARS顕微鏡は、通常の光学顕微鏡にない優れた機能を有しているが、これを実現するためのシステム調整には難しい面がある。その主な理由としては、コヒーレント・ラマン過程は、2色の光源を用いた3次の非線形光学効果を用いているからである。すなわち、ポンプ光強度P1、ストークス光強度P2とすると、得られるラマン散乱信号すなわち信号強度Iは、下記の(1)式で与えられる。 However, microscopy using the coherent Raman process is different. Certainly, as described above, a microscope using a coherent Raman process, in particular, a CARS microscope has an excellent function that an ordinary optical microscope does not have, but it is difficult to adjust the system to realize this. There is a face. The main reason is that the coherent Raman process uses a third-order nonlinear optical effect using two-color light sources. That is, assuming that the pump light intensity P 1 and the Stokes light intensity P 2 are obtained, the obtained Raman scattering signal, that is, the signal intensity I is given by the following equation (1).
また、最新のより進んだCARS過程を用いた顕微鏡法では、2色の光ではなく、3色の光を用いる、より精密な計測法も研究されつつある。図6において、基底状態から励起するω1の照明光(ポンプ光)と励起振動準位から励起するω1の照明光は、同じ波長の光(プローブ光)を用いていることから、結果的にポンプ光とプローブ光が同じになり、2色の光源となる。しかし、ポンプ光とプローブ波長は異なっても良い。すなわち、プローブ光の波長をω1′とすると、波長ω1′を可変として任意の振動準位に共鳴させ、これによる様々な振動準位が混在する中、特定の振動準位に起因するCARS散乱光を検出する方法である。この様な計測法は、マルチプレックスアンチコヒーレントラマン顕微鏡法と言う。この場合、効率的にCARS散乱光を得るためには、3色の光を完全に同軸で光学調整する必要ある。 In addition, in the microscope method using the latest and more advanced CARS process, a more precise measurement method using three colors of light instead of two colors of light is being studied. In FIG. 6, the ω1 illumination light (pump light) excited from the ground state and the ω1 illumination light excited from the excitation vibration level use light of the same wavelength (probe light). The light and the probe light become the same and become a two-color light source. However, the pump light and the probe wavelength may be different. That is, assuming that the wavelength of the probe light is ω1 ′, the wavelength ω1 ′ is made variable to resonate with an arbitrary vibration level, and among the various vibration levels due to this, CARS scattered light caused by a specific vibration level It is a method of detecting. Such a measurement method is called multiplex anticoherent Raman microscopy. In this case, in order to obtain CARS scattered light efficiently, it is necessary to optically adjust the three colors of light completely coaxially.
(1)式から明らかなように、ラマン散乱の信号強度Iは、コヒーレント・ラマン散乱過程が非線形効果のために、試料集光面におけるポンプ光の強度のべき乗とストークス光の強度との積に比例している。したがって、ポンプ光およびストークス光の空間的および時間的領域におけるオーバーラップの状態、またポンプ光およびストークス光の強度によって、ラマン散乱信号の発生条件が大きく変化することになる。より詳しくは、試料集光面近傍で発生する信号空間分布が大きく変化することになる。このため、場合によっては、結像性能が大きく劣化する。例えば、基本的には、ポンプ光およびストークス光は、3次元的に重複していないとラマン信号が得られないため、S/Nが極度に悪くなるだけではなく、点像分布関数が広がり、空間分解能が極端に劣化する。また、ポンプ光およびストークス光の強度調整を誤っても、終状態が飽和して、点像分布関数が大きく変化し、空
間分解能が悪くなる。マルチプレックスCARS顕微鏡法においては、より顕著に調整条件に反映する。
As apparent from the equation (1), the signal intensity I of Raman scattering is the product of the power of the pump light intensity and the intensity of the Stokes light on the sample focusing surface due to the nonlinear effect of the coherent Raman scattering process. It is proportional. Therefore, the generation condition of the Raman scattering signal greatly varies depending on the overlap state of the pump light and the Stokes light in the spatial and temporal regions and the intensity of the pump light and the Stokes light. More specifically, the signal space distribution generated in the vicinity of the sample condensing surface changes greatly. For this reason, in some cases, the imaging performance is greatly degraded. For example, basically, since the pump signal and the Stokes light are not three-dimensionally overlapped, a Raman signal cannot be obtained. Therefore, not only the S / N is extremely deteriorated, but also the point spread function is widened. Spatial resolution is extremely degraded. Further, even if the intensity adjustment of the pump light and Stokes light is mistaken, the final state is saturated, the point spread function is greatly changed, and the spatial resolution is deteriorated. In multiplex CARS microscopy, this is reflected more remarkably in the adjustment conditions.
以上のことから明らかなように、CARS顕微鏡の場合は、通常の顕微鏡よりも、はるかに正確で慎重なシステム調整が要求される。そこで、従来、CARS顕微鏡では、直径200nm程度のポリスチレンビーズの像を基板上に展開し、それを観察することでシステム調整を行っていた。 As is clear from the above, the CARS microscope requires much more accurate and careful system adjustment than a normal microscope. Therefore, conventionally, in the CARS microscope, the system adjustment was performed by developing an image of polystyrene beads having a diameter of about 200 nm on a substrate and observing the image.
しかしながら、この従来の調整法では、以下の理由から、厳密な定量評価は不可能である。
(1)基本的には、ポリスチレンビーズを単分散して、孤立したビーズ像を計測するので、顕微鏡性能として最も重要な2点分解能やコントラスト伝達関数など計測できない。
(2)ポリスチレンビーズの径は遠心分離機等で選別されているものの、最大で20%程度のバラツキがある。
However, with this conventional adjustment method, strict quantitative evaluation is impossible for the following reasons.
(1) Basically, since polystyrene beads are monodispersed and an isolated bead image is measured, the most important two-point resolution and contrast transfer function cannot be measured as microscope performance.
(2) Although the diameter of the polystyrene beads is selected by a centrifuge or the like, there is a variation of about 20% at the maximum.
これは、ひとえに、簡便に入手できるCARS顕微鏡対応の解像度評価用チャートが存在していないことに起因する。すなわち、ラマン活性物質を、波長オーダより微細な高い空間制御精度で、2次元または3次元配列した標準サンプルが存在しないことによる。このことが、CARS顕微鏡システムとしての結像性能評価の作業や、これを基にした調整を不確実で非能率なものにしていた。 This is due to the fact that there is no chart for resolution evaluation that is easily available for CARS microscopes. That is, there is no standard sample in which a Raman active substance is two-dimensionally or three-dimensionally arranged with a high spatial control accuracy finer than the wavelength order. This has made the work of evaluating the imaging performance as a CARS microscope system and the adjustment based on it uncertain and inefficient.
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の第1の目的は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価できる解像度評価用チャートを提供することにある。 Accordingly, a first object of the present invention made in view of such a point is to provide a resolution evaluation chart capable of objectively and quantitatively evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope.
さらに、本発明の第2の目的は、上記の解像度評価用チャートを簡単に製造できる製造方法を提供することにある。 Furthermore, the second object of the present invention is to provide a manufacturing method capable of easily manufacturing the above-mentioned resolution evaluation chart.
さらに、本発明の第3の目的は、コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いるのに最適な光源装置を提供することにある。 A third object of the present invention is to provide a light source device that is optimal for use in a coherent Raman microscope.
さらに、本発明の第4の目的は、コヒーレント・ラマン顕微鏡を容易に最適化できる調整法を提供することにある。 A fourth object of the present invention is to provide an adjustment method that can easily optimize a coherent Raman microscope.
上記第1の目的を達成する請求項1に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートであって、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
該基板上に二次元的に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
を有することを特徴とするものである。
The invention according to
A substrate that is optically smooth with respect to illumination light and that does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation;
A Raman active layer that is formed two-dimensionally on the substrate, has a vibration spectrum different from that of the substrate, and includes a Raman active material that does not emit fluorescence in response to illumination light excitation;
It is characterized by having.
さらに、上記第1の目的を達成する請求項2に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートであって、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
該基板上に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
該ラマン活性層上に二次元的に形成され、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層と、
を有することを特徴とするものである。
Furthermore, the invention according to
A substrate that is optically smooth with respect to illumination light and that does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation;
A Raman active layer formed on the substrate and having a vibration spectrum different from that of the substrate and including a Raman active material that does not emit fluorescence in response to illumination light excitation;
A mask layer that is two-dimensionally formed on the Raman active layer, has a vibration spectrum different from that of the Raman active material, does not emit fluorescence in response to excitation of illumination light, and reflects or absorbs illumination light;
It is characterized by having.
請求項3に係る発明は、請求項1または2に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記ラマン活性物質は、有機物からなることを特徴とするものである。
The invention according to
The Raman active substance is composed of an organic substance.
請求項4に係る発明は、請求項3に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記ラマン活性物質は、ポンプ光およびストークス光の照明光の振動数差に共鳴する振動準位を有する化学基を含むことを特徴とするものである。
The invention according to claim 4 is the resolution evaluation chart of the coherent Raman microscope according to
The Raman-active substance includes a chemical group having a vibration level that resonates with a difference in frequency between illumination light of pump light and Stokes light.
請求項5に係る発明は、請求項4に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記化学基は、CH基であることを特徴とするものである。
The invention according to claim 5 is the resolution evaluation chart of the coherent Raman microscope according to claim 4,
The chemical group is a CH group.
請求項6に係る発明は、請求項5に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記ラマン活性物質は、ポリエチレンを含むことを特徴とするものである。
The invention according to claim 6 is the resolution evaluation chart of the coherent Raman microscope according to claim 5,
The Raman-active substance includes polyethylene.
さらに、上記第2の目的を達成する請求項7に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートを製造するにあたり、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
前記基板上に形成された前記ラマン活性層を二次元的に除去してラマン活性層の二次元パターンを形成するパターン形成工程と、
を含むことを特徴とするものである。
Furthermore, the invention according to claim 7 that achieves the second object is to produce a resolution evaluation chart used for evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope.
On a substrate that is optically smooth with respect to illumination light and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation, a Raman active substance that has a vibration spectrum different from that of the substrate and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation. A Raman active layer forming step of forming a Raman active layer including;
A pattern forming step of forming the two-dimensional pattern of the Raman active layer by two-dimensionally removing the Raman active layer formed on the substrate;
It is characterized by including.
さらに、上記第2の目的を達成する請求項8に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートを製造するにあたり、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
前記基板上に形成された前記ラマン活性層上に、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層を二次元的に形成するマスク層形成工程と、
を含むことを特徴とするものである。
Furthermore, the invention according to claim 8 that achieves the second object described above is to produce a resolution evaluation chart used for evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope.
On a substrate that is optically smooth with respect to illumination light and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation, a Raman active substance that has a vibration spectrum different from that of the substrate and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation. A Raman active layer forming step of forming a Raman active layer including;
On the Raman active layer formed on the substrate, a mask layer that has a vibration spectrum different from that of the Raman active material, does not emit fluorescence in response to excitation of illumination light, and reflects or absorbs illumination light. A mask layer forming step to form two-dimensionally;
It is characterized by including.
請求項9に係る発明は、請求項7または8に記載の解像度評価用チャートの製造方法において、
前記ラマン活性層形成工程は、有機物からなるラマン活性物質を、スピンコート法またはディップコート法により前記基板上に展開して、前記ラマン活性層を形成することを特徴とするものである。
The invention according to claim 9 is the method for producing a chart for resolution evaluation according to claim 7 or 8,
The Raman active layer forming step is characterized in that a Raman active material made of an organic substance is spread on the substrate by a spin coating method or a dip coating method to form the Raman active layer.
請求項10に係る発明は、請求項7に記載の解像度評価用チャートの製造方法において、
前記パターン形成工程は、前記ラマン活性層の二次元パターンを、ナノインプリンティング法により形成することを特徴とするものである。
The invention according to
The pattern forming step is characterized in that a two-dimensional pattern of the Raman active layer is formed by a nanoimprinting method.
請求項11に係る発明は、請求項8に記載の解像度評価用チャートの製造方法において、
前記マスク層形成工程は、前記マスク層を蒸着法により形成することを特徴とするものである。
The invention according to
The mask layer forming step is characterized in that the mask layer is formed by a vapor deposition method.
さらに、上記第3の目的を達成する請求項12に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いる光源装置であって、
レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を入射して、該レーザ光とともに、該レーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射する有機結晶を含むレーザ媒質と、
を有することを特徴とするものである。
Furthermore, the invention according to claim 12 for achieving the third object is a light source device used for a coherent Raman microscope,
A laser light source for emitting laser light;
A laser medium including an organic crystal that emits Raman light that is incident on the laser light from the laser light source and emits Raman light shifted to a longer wavelength side than the laser light together with the laser light;
It is characterized by having.
請求項13に係る発明は、請求項12に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記レーザ媒質からの出射光路中に、1次ラマン光よりも長波長の高次ラマン光成分を除去する分光分散素子を設けたことを特徴とするものである。
The invention according to claim 13 is the light source device for the coherent Raman microscope according to
A spectral dispersion element that removes a high-order Raman light component having a wavelength longer than that of the primary Raman light is provided in an optical path from the laser medium.
請求項14に係る発明は、請求項13に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記分光分散素子は、多層膜フィルタまたは回折格子からなることを特徴とするものである。
The invention according to claim 14 is the light source device for a coherent Raman microscope according to claim 13,
The spectral dispersion element is composed of a multilayer filter or a diffraction grating.
請求項15に係る発明は、請求項12〜14のいずれか一項に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記有機結晶は、CH基を含むことを特徴とするものである。
The invention according to claim 15 is the light source device for a coherent Raman microscope according to any one of
The organic crystal includes a CH group.
請求項16に係る発明は、請求項15に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記有機結晶は、ポリエチレンを含むことを特徴とするものである。
The invention according to claim 16 is the light source device for a coherent Raman microscope according to claim 15,
The organic crystal includes polyethylene.
さらに、上記第4の目的を達成する請求項17に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡を調整するにあたり、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の解像度評価用チャートを用い、該解像度評価用チャートの顕微鏡画像を撮影して得られるコントラスト伝達関数のコントラスト比が最大となるように調整することを特徴とするものである。
Furthermore, the invention according to claim 17 that achieves the fourth object is to adjust a coherent Raman microscope.
Using the resolution evaluation chart according to any one of
請求項18に係る発明は、請求項17に記載コヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法において、
前記解像度評価用チャートを顕微鏡観察するための光源装置として、請求項12〜16のいずれか一項に記載の光源装置を用いることを特徴とするものである。
The invention according to claim 18 is the adjustment method of the coherent Raman microscope according to claim 17,
The light source device according to any one of
本発明の解像度評価用チャートによれば、照明光に対して、ラマン活性物質を含むラマン活性層の2次元パターンを有するので、この解像度評価用チャートの画像をコヒーレント・ラマン顕微鏡で撮影することにより、該コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価することが可能となる。 According to the resolution evaluation chart of the present invention, the illumination active light has a two-dimensional pattern of a Raman active layer containing a Raman active substance. Therefore, by taking an image of the resolution evaluation chart with a coherent Raman microscope. The imaging performance of the coherent Raman microscope can be objectively and quantitatively evaluated.
本発明の解像度評価用チャートの製造方法によれば、基板上に、ラマン活性物質を含むラマン活性層を形成した後、該ラマン活性層を2次元的に除去してラマン活性層の2次元パターンを形成するか、あるいは、基板上にラマン活性層を形成した後、該ラマン活性層上にマスク層を2次元的に形成してラマン活性層の2次元パターンを形成するので、解像度評価用チャートを簡単に製造できる。 According to the method for manufacturing a resolution evaluation chart of the present invention, after forming a Raman active layer containing a Raman active material on a substrate, the Raman active layer is removed two-dimensionally to obtain a two-dimensional pattern of the Raman active layer. Or after forming a Raman active layer on the substrate, a mask layer is two-dimensionally formed on the Raman active layer to form a two-dimensional pattern of the Raman active layer. Can be easily manufactured.
本発明のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置によれば、有機結晶を含むレーザ媒質を有し、該レーザ媒質にレーザ光を入射させることにより、入射レーザ光とともに、該レーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射するので、コヒーレント・ラマン顕微鏡に最適な光源装置を提供することが可能となる。 According to the light source device for a coherent Raman microscope of the present invention, a laser medium including an organic crystal is included, and the laser beam is incident on the laser medium, so that the incident laser beam and the longer wavelength side of the laser beam are incident. Since the shifted Raman light is emitted, it is possible to provide an optimum light source device for the coherent Raman microscope.
本発明のコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法によれば、ラマン活性物質を含むラマン活性層の2次元パターンを有する解像度評価用チャートを用い、その顕微鏡画像を撮影してコントラスト比が最大となるように調整するので、コヒーレント・ラマン顕微鏡を容易に最適化することが可能となる。 According to the method for adjusting a coherent Raman microscope of the present invention, a resolution evaluation chart having a two-dimensional pattern of a Raman active layer containing a Raman active substance is used, and the contrast ratio is maximized by photographing the microscope image. Because of the adjustment, the coherent Raman microscope can be easily optimized.
(実施の形態の概要)
先ず、本発明の実施の形態の概要について説明する。本発明者らは、ラマン過程を用いた顕微鏡の結像性能を正確に定量評価可能な標準の解像評価用チャートを考案できれば、これを撮影して顕微鏡画像を解析することにより、コヒーレント・ラマン顕微鏡の性能を最適化できる調整法が可能ではないかと考えた。
(Outline of the embodiment)
First, an outline of an embodiment of the present invention will be described. If the present inventors can devise a standard resolution evaluation chart that can accurately and quantitatively evaluate the imaging performance of a microscope using a Raman process, the coherent Raman analysis is performed by photographing this and analyzing the microscope image. We thought that an adjustment method that can optimize the performance of the microscope is possible.
そのため、本発明者らは、先ず、コヒーレント・ラマン顕微鏡の標準の解像度評価用チャートを開発した。この解像度評価用チャートは、基本的には、基板上に、ラマン活性物質を含むラマン活性層を2次元展開し、その後、2次元の微細パターンを形成してなる。近年では、生体試料が多くなり、CH、OH、HN、COOH等の化学基が重要な観察対象となりつつある。このため、解像度評価用チャートの一例としては、ラマン活性物質として有機薄膜を選択し、この有機薄膜を、例えばガラス基板やシリコン基板上にコートする。 Therefore, the inventors first developed a standard resolution evaluation chart for a coherent Raman microscope. This resolution evaluation chart is basically formed by two-dimensionally developing a Raman active layer containing a Raman active substance on a substrate and then forming a two-dimensional fine pattern. In recent years, the number of biological samples has increased, and chemical groups such as CH, OH, HN, and COOH are becoming important observation targets. For this reason, as an example of the resolution evaluation chart, an organic thin film is selected as the Raman active substance, and this organic thin film is coated on, for example, a glass substrate or a silicon substrate.
有機薄膜は、一例として薄膜化し易いPMMA(メタクリル酸メチル)を選択すれば、生体分子に特有なCH、COOHが豊富に含まれているので好ましい。また、PMMAは、酢酸エチルなどの化学溶媒や加熱により、容易に溶解させることが可能であり、スピンコート法によりナノメータオーダの均一な厚さの薄膜を2次元展開できる。加えて、可視光領域より長波長側で蛍光が全く出ないので、ラマン分光を行う際、高いS/Nが期待できる。これは、可視光の波長に対して十分無視でき得る値であり、例えば、深さ方向の分解能評価には最適となる。 As an organic thin film, for example, if PMMA (methyl methacrylate) which is easy to be thinned is selected, it is preferable because CH and COOH unique to biomolecules are contained abundantly. Moreover, PMMA can be easily dissolved by a chemical solvent such as ethyl acetate or heating, and a thin film having a uniform thickness of nanometer order can be developed two-dimensionally by a spin coating method. In addition, since no fluorescence is emitted on the longer wavelength side than the visible light region, a high S / N can be expected when performing Raman spectroscopy. This is a value that can be sufficiently ignored with respect to the wavelength of visible light, and is optimal for evaluation of resolution in the depth direction, for example.
また、薄膜形成に関しては、ディップコート法も適応できる。ディップコート法は、融解した有機材料(媒質)に基板を浸して一定速度で引き上げることにより、基板と媒質の間に作用する表面張力によって、基板表面に一定の厚みで媒質を均一に吸着させるもので、その厚みは、基板の引き上げ速度でコントロールすることができる。 For thin film formation, a dip coating method can also be applied. In the dip coating method, the substrate is immersed in a molten organic material (medium) and pulled up at a constant speed, so that the medium is uniformly adsorbed on the substrate surface with a constant thickness by the surface tension acting between the substrate and the medium. The thickness can be controlled by the pulling speed of the substrate.
スピンコート法もディップコート法も、市販の装置が販売されているので、簡便に、有機薄膜を形成することができる。また、スバッタ法により真空層中で、基板にラマン活性物質を蒸着させて薄膜を形成することもできる。スパッタ法の場合、ラマン活性物質は、有機物に限らず、無機物、半導体、金属であっても、基板上に2次元展開できる利点がある。 Since both commercially available spin coating methods and dip coating methods are available, an organic thin film can be easily formed. Alternatively, a thin film can be formed by depositing a Raman active material on a substrate in a vacuum layer by a sputtering method. In the case of the sputtering method, the Raman active material is not limited to an organic material, and even if it is an inorganic material, a semiconductor, or a metal, there is an advantage that it can be developed two-dimensionally on the substrate.
基板に平面展開して形成したラマン活性物質を含むラマン活性層は、例えば、微細な2次元パターンに加工する。この加工法としては、電子ビーム法やリソグラフィー法を適用でき、何れも数10ナノメータレベルのラインおよびスペースからなる細線群のエッチングパターンを描画することができる。この作製精度は、電子顕微鏡で確認できるので、較正が簡単にできる。 A Raman active layer containing a Raman active material formed by planar development on a substrate is processed into a fine two-dimensional pattern, for example. As this processing method, an electron beam method or a lithography method can be applied, and in any case, an etching pattern of a thin line group composed of lines and spaces of several tens of nanometers can be drawn. Since this production accuracy can be confirmed with an electron microscope, calibration can be easily performed.
このようにして形成した細線群は、通常の光学顕微鏡における回折限界以下のサイズであるので、この細線群の顕微鏡画像を撮影すれば、得られた細線群のコントラストは、顕微鏡単体の光学性能を決定するコントラスト伝達関数となる。したがって、これを評価すれば、顕微鏡単体の結像性能が分かるので、コントラスト伝達関数が与えるコントラスト比が最大になるように顕微鏡システムを調整することができる。具体的には、ポンプ光およびストークス光の励起強度の調整、ポンプ光およびストークス光の光軸調整、光学フィルタの選択調整によるノイズの低減、検出器(例えば、光電子増倍管)の感度調整、顕微鏡対物レンズの調整等を、コントラスト伝達関数を用いて客観的に評価しながら調整することができる。 Since the thin line group formed in this way is a size smaller than the diffraction limit in a normal optical microscope, if a microscopic image of this thin line group is taken, the contrast of the obtained thin line group is the optical performance of the microscope alone. The contrast transfer function to be determined. Therefore, if this is evaluated, the imaging performance of the microscope alone can be understood, so that the microscope system can be adjusted so that the contrast ratio given by the contrast transfer function is maximized. Specifically, adjustment of excitation intensity of pump light and Stokes light, optical axis adjustment of pump light and Stokes light, noise reduction by selective adjustment of optical filter, sensitivity adjustment of detector (for example, photomultiplier tube), Adjustment of the microscope objective lens and the like can be adjusted while objectively evaluating the contrast transfer function.
したがって、上記のようにして作製した解像度評価用チャートを用いることにより、調整者の主観的な評価に頼らず、標準化された作業として、誰もが、簡便にコヒーレント・ラマン顕微鏡を最適化することができる。 Therefore, by using the resolution evaluation chart prepared as described above, everyone can easily optimize the coherent Raman microscope as a standardized operation without relying on the subjective evaluation of the adjuster. Can do.
なお、2次元の微細パターンの作製に関しては、上記の電子ビーム法やリソグラフィー法のほか、ナノインプリンティング法を適用することもできる。ナノインプリンティング法は、予め作製した2次元の微細パターンの鋳型を、熱溶融性の薄膜層(ラマン活性層)に押し付けることにより、パターンニングする方法である。この方法によれば、簡便にパターンニングできるので、解像度評価用チャートを大量に廉価で供給できる。 In addition to the electron beam method and the lithography method described above, a nanoimprinting method can also be applied to the production of a two-dimensional fine pattern. The nanoimprinting method is a patterning method by pressing a two-dimensional fine pattern template prepared in advance against a heat-meltable thin film layer (Raman active layer). According to this method, since patterning can be performed easily, a large number of resolution evaluation charts can be supplied at low cost.
また、ラマン活性層を直接加工するのではなく、ラマン活性層の上に、金属性の薄膜を蒸着して微細パターンを形成することも可能である。例えば、ラマン活性層の上に、吸収率の高いクロムや反射率の高い金薄膜をコートしても良い。この場合、金属薄膜でマスクされた領域のラマン活性層には照明光が到達しないので、この領域からはラマン信号は検出されない。 Further, instead of directly processing the Raman active layer, it is also possible to form a fine pattern by depositing a metallic thin film on the Raman active layer. For example, chromium having a high absorptance or gold thin film having a high reflectance may be coated on the Raman active layer. In this case, since the illumination light does not reach the Raman active layer in the area masked with the metal thin film, no Raman signal is detected from this area.
本発明は、さらに、コヒーレント・ラマン顕微鏡に好適な光源装置を提供する。コヒーレント・ラマン顕微鏡では、ポンプ光に対して、検出する化学基の振動周波数だけ相対的にシフトしたラマン散乱光を発生させる。通常は、近赤外のフェムト秒:チタン(Ti)サファイアレーザを用い、その基本波を直接ストークス光として用い、その一部を分岐して光パラメトリック発振器(OPO:Optical Parametric Oscillator)等の非線形波長変換光学システムにより波長変換してポンプ光を生成する。この方法は、ポンプ光の波長を可変できることから、あらゆる固有振動数をもつ化学基に対応できるが、大掛かりで、極めて高度な光学調整が求められる。 The present invention further provides a light source device suitable for a coherent Raman microscope. The coherent Raman microscope generates Raman scattered light that is shifted relative to the pump light by the vibration frequency of the chemical group to be detected. Usually, a near-infrared femtosecond: titanium (Ti) sapphire laser is used, its fundamental wave is directly used as Stokes light, and a part of it is branched to a nonlinear wavelength such as an optical parametric oscillator (OPO). Wavelength conversion is performed by a conversion optical system to generate pump light. Since this method can change the wavelength of the pump light, it can cope with chemical groups having any natural frequency, but requires a large scale and extremely high optical adjustment.
そこで、本発明者らは、鋭意検討したところ、例えば、代表的な化学基に着目すれば、簡単に安定してポンプ光(プローブ光)およびストークス光を発生できることを見出した。例えば、生体試料に豊富に含まれるCH基に対して顕微鏡調整を行うことを想定した場合は、同様にCH基を含む有機結晶を用いてラマンレーザユニットを作製し、このユニットで波長変換される光を用いる。 Accordingly, the present inventors have conducted extensive studies and found that, for example, if attention is paid to a representative chemical group, pump light (probe light) and Stokes light can be generated easily and stably. For example, when it is assumed that a microscope adjustment is performed on CH groups that are abundantly contained in a biological sample, a Raman laser unit is similarly produced using an organic crystal containing CH groups, and the wavelength is converted by this unit. Use light.
例えば、結晶性のポリエチレンを用いた場合、化学結合基はCH基のみなので、入射レーザ光に対して、2900カイザーほど長波長側にシフトした極めて強いラマンレーザ光が発生する。同時に、その高次倍音波も発生するが、この高次倍音波をフィルタでカットすれば、極めて単色性の高い高強度のレーザ光を発生することができる。したがって、この入射レーザ光とラマンレーザ光を、コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いれば、OPOを用いて波長チューニングすることなく、簡単に、CH化学基に対するポンプ光(プローブ光)とストークス光を発生することができる。しかも、ラマンレーザ光は、基本的に、励起レーザ光と完全に同期して発生するので、コヒーレント・ラマン顕微鏡に特有な、発生パルスのタイミング調整といった作業も簡略化できる。 For example, when crystalline polyethylene is used, since the chemical bond group is only CH group, an extremely strong Raman laser beam shifted to the long wavelength side by about 2900 Kaiser is generated with respect to the incident laser beam. At the same time, the higher-order harmonic waves are also generated. If this higher-order harmonic wave is cut by a filter, high-intensity laser light with extremely high monochromaticity can be generated. Therefore, if this incident laser light and Raman laser light are used in a coherent Raman microscope, pump light (probe light) and Stokes light for a CH chemical group can be easily generated without wavelength tuning using OPO. it can. In addition, since the Raman laser light is basically generated in complete synchronization with the excitation laser light, operations such as timing adjustment of generated pulses, which are peculiar to the coherent Raman microscope, can be simplified.
このラマンレーザユニットをコヒーレント・ラマン顕微鏡の光源装置として導入すれば、有機物を含む生体試料の観察に活用することができる。さらに、顕微鏡の調整時に、上述したPMMAのような有機薄膜をラマン活性層に含む解像度評価用チャートを用いた場合は、光源装置からのポンプ光およびストークス光の振動数差と試料の振動数とが完全にマッチして、非常に強いラマン信号が得られるので、特に効果的である。また、ラマン活性層がポリエチレンの薄膜からなる解像度評価用チャートを用いた場合は、CH振動によるS/Nが極めて高いラマン信号を得ることができる。したがって、上記の解像度評価用チャートおよび光源装置を用いてコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整を行えば、コヒーレント・ラマン顕微鏡を容易に最適化することができる。また、このような解像度評価用チャートおよび光源装置を、コヒーレント・ラマン顕微鏡の生産ラインに導入すれば、標準化された検査法を実現することができる。 If this Raman laser unit is introduced as a light source device of a coherent Raman microscope, it can be utilized for observation of a biological sample containing organic matter. Furthermore, when using the resolution evaluation chart including the organic thin film such as PMMA described above in the Raman active layer at the time of adjusting the microscope, the difference in the frequency of the pump light and Stokes light from the light source device and the frequency of the sample Are particularly effective since they are perfectly matched and a very strong Raman signal is obtained. In addition, when a resolution evaluation chart in which the Raman active layer is made of a polyethylene thin film is used, a Raman signal having an extremely high S / N ratio due to CH vibration can be obtained. Therefore, the coherent Raman microscope can be easily optimized by adjusting the coherent Raman microscope using the resolution evaluation chart and the light source device. If such a resolution evaluation chart and light source device are introduced into a production line of a coherent Raman microscope, a standardized inspection method can be realized.
以下、具体的な実施の形態について、図を参照して説明する。 Hereinafter, specific embodiments will be described with reference to the drawings.
(第1実施の形態)
図1は、本発明の第1実施の形態に係る解像度評価用チャートを示すもので、図1(a)は拡大平面図、図1(b)は要部断面図である。この解像度評価用チャート10は、コヒーレント・ラマン顕微鏡で用いる照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板11上に、該基板11とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層12の二次元パターンを形成したものである。
(First embodiment)
1A and 1B show a resolution evaluation chart according to the first embodiment of the present invention. FIG. 1A is an enlarged plan view, and FIG. This
図1は、ラマン活性層12の二次元パターンとして、ライン幅5μmのラマン活性層12を5μm間隔(スペース)で形成した5μmパターン部13aと、ライン幅3μmのラマン活性層12を3μm間隔で形成した3μmパターン部13bと、ライン幅1μmのラマン活性層12を1μm間隔で形成した1μmパターン部13cと、ライン幅500nmのラマン活性層12を500nm間隔で形成した500nmパターン部13dと、ライン幅250nmのラマン活性層12を250nm間隔で形成した250nmパターン部13eと、ライン幅100nmのラマン活性層12を100nm間隔で形成した100nmパターン部13fと、ライン幅50nmのラマン活性層12を50nm間隔で形成した50nmパターン部13gとを、各ラマン活性層12のラインが平行となるように形成した場合を示している。なお、各パターン部におけるライン幅および間隔は、模式的に示している。
FIG. 1 shows a two-dimensional pattern of the Raman
基板11は、例えば、コヒーレント・ラマン顕微鏡が一般的に使用する照明光の波長λに対して、深さ方向の分解能(縦分解能)に影響を与えない精度である、λ/20程度の精度(例えば、1μmの波長の照明光を用いた場合は、50nmの精度)で光学研磨したガラス基板を用いる。また、ラマン活性層12は、図2に示すようなCH基を含むPMMAをラマン活性物質として用い、このPMMAをスピンコート法により基板11上にコートした後、ナノインプリンティングして形成する。
The
ここで、PMMAは、100℃程度で容易に溶融するので、加工し易く、簡単に製膜できる。また、基板11の面精度も、一般の光学理論によれば、集光した2次元点像分布関数の形状が大幅に崩れないλ/4程度の平滑性を十分に上回っている。したがって、スピンコートのスピード条件を、例えば、10000rpm〜1000rpmの間として、溶解したPMMAをコーティングすれば、ガラス基板上にPMMA膜を10nm単位で精度良く形成することができる。これにより、例えば、市販の装置を用いて、図1(a)に示したように、50nmパターン部13gを含むラマン活性層12の2次元パターンを形成することができる。
Here, since PMMA easily melts at about 100 ° C., it is easy to process and can be easily formed into a film. Further, the surface accuracy of the
特に、ナノインプリンティング法によりラマン活性層12の2次元パターンを形成する場合、ナノインプリンティング法は、導電体でも絶縁体でも、パターンニングできるので、光学顕微鏡としては十分な形状精度をもつ、コントラスト伝達関数の解像度評価用チャート10を得ることができる。
In particular, when a two-dimensional pattern of the Raman
したがって、この解像度評価用チャート10を、コヒーレント・ラマン顕微鏡で撮影して、撮影されたラマン活性層12の2次元パターンのコントラストを波動光学的に解析すれば、2点分解能、点像分布関数、ディストーション等を定量的に知ることができる。また、コントラスト伝達関数から、ポンプ光(プローブ光)とストークス光との光軸のアライメント状況も把握できる。特に、ナノインプリンティング法によりラマン活性層12の2次元パターンを形成する場合は、限られた一点(点領域:100nmのサイズ)のみを残して、周りの有機材料を取り除くことができるので、2次元点像分布関数を直接測定することができる。すなわち、点領域は、照明光の集光サイズが小さいので、ラマン信号で2次元マップした像は、直接、2次元点像分布関数に対応する。
Accordingly, if this
(第2実施の形態)
図3は、本発明の第2実施の形態に係る解像度評価用チャートを示すもので、図3(a)は拡大平面図、図3(b)は要部断面図である。この解像度評価用チャート20は、コヒーレント・ラマン顕微鏡で用いる照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板21上に、該基板21とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層22を形成し、さらに、このラマン活性層22上に、ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層23の2次元パターンを形成したものである。
(Second Embodiment)
3A and 3B show a resolution evaluation chart according to the second embodiment of the present invention. FIG. 3A is an enlarged plan view and FIG. This
基板21は、図1に示した基板11と同様に、例えば、コヒーレント・ラマン顕微鏡が一般的に使用する照明光の波長λに対して、深さ方向の分解能(縦分解能)に影響を与えない精度である、λ/20程度の精度で光学研磨したガラス基板を用いる。また、ラマン活性層22は、PMMAをラマン活性物質として用い、このPMMAをスピンコート法により基板21上に展開して形成する。
The
本実施の形態は、ラマン活性層22を直接加工して2次元パターンを形成するのではなく、ラマン活性層22上に、マスク層23として、例えば、吸収率の高いクロムや反射率の高い金薄膜の2次元パターンを蒸着により形成して、間接的にラマン活性層22の2次元パターンを形成する。
In the present embodiment, the Raman
図3は、ラマン活性層22およびマスク層23の2次元パターンとして、ライン幅5μmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した5μmパターン部24aと、ライン幅3μmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した3μmパターン部24bと、ライン幅1μmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した1μmパターン部24cと、ライン幅500nmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した500nmパターン部24dと、ライン幅250nmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した250nmパターン部24eと、ライン幅100nmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した100nmパターン部24fと、ライン幅50nmのラマン活性層22およびマスク層23を交互に形成した50nmパターン部24gとを、各ラマン活性層22およびマスク層23のラインが平行となるように形成した場合を示している。なお、各パターン部におけるライン幅および間隔は、図1の場合と同様に、模式的に示している。
FIG. 3 shows a two-dimensional pattern of the Raman
したがって、この解像度評価用チャート20を、コヒーレント・ラマン顕微鏡で撮影して、撮影されたラマン活性層22の2次元パターンのコントラストを波動光学的に解析すれば、第1実施の形態の解像度評価用チャート10を用いた場合と同様に、2点分解能、点像分布関数、ディストーション等を定量的に知ることができる。
Therefore, if this
(第3実施の形態)
図4は、本発明の第3実施の形態に係る光源装置を用いるコヒーレント・ラマン顕微鏡の概略構成を示す図である。このコヒーレント・ラマン顕微鏡は、光源装置31から出射する照明光を、反射ミラー32、ビームスプリッタ33および顕微鏡対物レンズ34を経て、試料ステージ35に保持された試料36に集光する。試料36からの散乱光は、顕微鏡対物レンズ34およびビームスプリッタ33を経て照明光カットフィルタ37に入射させ、ここで照明光の波長成分をカットした後、分光器38によりCARS光を取り出して光電子増倍管39で受光する。なお、試料36に集光する照明光は、試料ステージ35または図示しない走査光学系により走査されるようになっている。
(Third embodiment)
FIG. 4 is a diagram showing a schematic configuration of a coherent Raman microscope using the light source device according to the third embodiment of the present invention. In this coherent Raman microscope, the illumination light emitted from the
本実施の形態に係る光源装置31は、パルスレーザ光源41と、このパルスレーザ光源41からのパルスレーザ光を入射して、入射光のパルスレーザ光、および該パルスレーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射する有機結晶を含むレーザ媒質42と、レーザ媒質42からの1次ラマン光よりも長波長の高次ラマン光成分を除去する分光分散素子43とを有する。
The
パルスレーザ光源41は、例えば、尖頭値の高い近赤外のフェムト秒パルスを出射するチタン・サファイアレーザを用いる。レーザ媒質42は、例えば、結晶化度が高いC−PET(結晶化ポリエチレンテレフタレート)を用いる。また、分光分散素子43は、ハイパスフィルタまたは回折格子を用いる。
The pulse
このように、レーザ媒質42としてC−PETを用いれば、C−PETには、CH鎖が空間的に規則性をもって配列されているので、誘導ラマン光が生成し易い。例えば、cm単位のC−PETブロックの端面を鏡面研磨して、チタン・サファイアレーザからなるパルスレーザ光源41から出射される尖頭値の高い近赤外のフェムト秒パルスを入射させると、CH振動に対応する高次倍音を含み、2900カイザー分、周波数が長波長側にシフトした強烈なコヒーレント光が誘導放出される。したがって、このレーザ媒質42から出射する入射パルス光を含む1次ストークスラマン光を分光分散素子43で取り出せば、光源装置31から、それぞれ単色性に優れたポンプ光(プローブ光)およびストークス光を出射することができ、CH基観察に優れた顕微鏡光源として機能させることができる。当然のことながら、マルチプレックスCARS顕微鏡法に対しても、同様の効果を得ることができる。
In this way, when C-PET is used as the
(第4実施の形態)
本発明の第4実施の形態は、図4に示したコヒーレント・ラマン顕微鏡において、試料36に代えて、図1または図3に示した解像度評価用チャートを試料ステージ35にセットして、顕微鏡を調整する。ここで、解像度評価用チャートは、ラマン活性層がポリエチレンを含むものを用いる。
(Fourth embodiment)
In the fourth embodiment of the present invention, the resolution evaluation chart shown in FIG. 1 or FIG. 3 is set on the
本実施の形態に係る調整法によれば、ポリエチレンを含むラマン活性層を有する解像度評価用チャートを用いるので、解像度評価用チャートから得られるラマン信号はCH振動からのものであり、かつ、光源装置31もCH振動しか励起できない照明光を出射するので、非常に高いS/Nおよび精度で、顕微鏡の調整作業が可能となる。 According to the adjustment method according to the present embodiment, since the resolution evaluation chart having the Raman active layer containing polyethylene is used, the Raman signal obtained from the resolution evaluation chart is from CH vibration, and the light source device Since 31 also emits illumination light that can only excite CH vibrations, the microscope can be adjusted with very high S / N and accuracy.
したがって、本実施の形態に係る調整法は、現在、生物用のコヒーレント・ラマン顕微鏡の用途が、脂肪滴の観察など、CH振動観察に特化したものが多いことから、極めて有用性が高く、現実的な組み合わせである。 Therefore, the adjustment method according to the present embodiment is very useful because the application of the coherent Raman microscope for living organisms is specialized in CH vibration observation such as observation of lipid droplets. It is a realistic combination.
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、発明の趣旨を逸脱しない範囲で、種々の変形または変更が可能である。 The present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications or changes can be made without departing from the spirit of the invention.
10,20 解像度評価用チャート
11,21 基板
12,22 ラマン活性層
13a,24a 5μmパターン部
13b,24b 3μmパターン部
13c,24c 1μmパターン部
13d,24d 500nmパターン部
13e,24e 250nmパターン部
13f,24f 100nmパターン部
13g,24g 50nmパターン部
23 マスク層
31 光源装置
32 反射ミラー
33 ビームスプリッタ
34 顕微鏡対物レンズ
35 試料ステージ
36 試料
37 照明光カットフィルタ
38 分光器
39 光電子増倍管
41 パルスレーザ光源
42 レーザ媒質
43 分光分散素子
10, 20
Claims (18)
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
該基板上に二次元的に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
を有することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。 A resolution evaluation chart used for evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope,
A substrate that is optically smooth with respect to illumination light and that does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation;
A Raman active layer that is formed two-dimensionally on the substrate, has a vibration spectrum different from that of the substrate, and includes a Raman active material that does not emit fluorescence in response to illumination light excitation;
A chart for evaluating the resolution of a coherent Raman microscope, comprising:
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
該基板上に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
該ラマン活性層上に二次元的に形成され、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層と、
を有することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。 A resolution evaluation chart used for evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope,
A substrate that is optically smooth with respect to illumination light and that does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation;
A Raman active layer formed on the substrate and having a vibration spectrum different from that of the substrate and including a Raman active material that does not emit fluorescence in response to illumination light excitation;
A mask layer that is two-dimensionally formed on the Raman active layer, has a vibration spectrum different from that of the Raman active material, does not emit fluorescence in response to excitation of illumination light, and reflects or absorbs illumination light;
A chart for evaluating the resolution of a coherent Raman microscope, comprising:
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
前記基板上に形成された前記ラマン活性層を二次元的に除去してラマン活性層の二次元パターンを形成するパターン形成工程と、
を含むことを特徴とする解像度評価用チャートの製造方法。 In producing a resolution evaluation chart used for evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope,
On a substrate that is optically smooth with respect to illumination light and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation, a Raman active substance that has a vibration spectrum different from that of the substrate and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation. A Raman active layer forming step of forming a Raman active layer including;
A pattern forming step of forming the two-dimensional pattern of the Raman active layer by two-dimensionally removing the Raman active layer formed on the substrate;
The manufacturing method of the chart for resolution evaluation characterized by including these.
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
前記基板上に形成された前記ラマン活性層上に、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層を二次元的に形成するマスク層形成工程と、
を含むことを特徴とする解像度評価用チャートの製造方法。 In producing a resolution evaluation chart used for evaluating the imaging performance of a coherent Raman microscope,
On a substrate that is optically smooth with respect to illumination light and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation, a Raman active substance that has a vibration spectrum different from that of the substrate and does not emit fluorescence with respect to illumination light excitation. A Raman active layer forming step of forming a Raman active layer including;
On the Raman active layer formed on the substrate, a mask layer that has a vibration spectrum different from that of the Raman active material, does not emit fluorescence in response to excitation of illumination light, and reflects or absorbs illumination light. A mask layer forming step to form two-dimensionally;
The manufacturing method of the chart for resolution evaluation characterized by including these.
レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を入射して、該レーザ光とともに、該レーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射する有機結晶を含むレーザ媒質と、
を有することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置。 A light source device used for a coherent Raman microscope,
A laser light source for emitting laser light;
A laser medium including an organic crystal that emits Raman light that is incident on the laser light from the laser light source and emits Raman light shifted to a longer wavelength side than the laser light together with the laser light;
A light source device for a coherent Raman microscope, comprising:
請求項1〜6のいずれか一項に記載の解像度評価用チャートを用い、該解像度評価用チャートの顕微鏡画像を撮影して得られるコントラスト伝達関数のコントラスト比が最大となるように調整することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法。 In adjusting the coherent Raman microscope,
Using the resolution evaluation chart according to any one of claims 1 to 6, adjusting the contrast ratio of a contrast transfer function obtained by photographing a microscope image of the resolution evaluation chart to be maximum. Adjustment method of the characteristic coherent Raman microscope.
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