JP4397182B2

JP4397182B2 - Method for detecting a small amount of nucleic acid

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Publication number: JP4397182B2
Application number: JP2003187163A
Authority: JP
Inventors: 安義森; 昌崇北尾
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2023-06-30
Also published as: JP2005021015A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微量核酸の検出方法に関する。より詳細には、LAMP反応を利用して試料中の極微量な核酸を簡便かつ正確に定量する方法と、そのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
PCRに代表される遺伝子増幅技術の進歩により、生体内の微量核酸の検出が可能になった。特にPCRを定量に用いる場合、増幅産物のチューブ間誤差やサイクル中期以降のプラトー効果の問題を解決する必要がある。このため、内部標準を使用する方法や、既知量の別な核酸を加えて競合的増幅を行い、その増幅産物量比から標的核酸の定量を行う競合的PCRなどが開発されてきた。しかし、これらの方法には測定範囲の狭さや操作の煩雑さといった問題点があった。
【０００３】
最近、デジタルPCRという、極微量核酸を定量するための新しい技術が開発された（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。デジタルPCRは、アナログ的なPCRの特性を直線的なもの、すなわち定量に適したデジタルシグナルに変換することにより、標的核酸の定量と統計解析を行うものである。デジタルPCRでは、被験試料を1/2 copy/wellとなるように希釈して複数のウェルに分注し、PCR増幅を行った後、蛍光プローブを用いて増幅産物中の標的核酸の有無を確認する。理論的には各ウェル内の鋳型標的核酸は０か１かであるため、増幅したウェルの数を計測することにより、サンプル中の鋳型標的核酸を正確に定量することが可能になる。しかしながら、デジタルPCRでは微量核酸を増幅するために、60回程度のPCR反応が必要であり、その間の非特異的増幅を防止するために煩雑な操作が不可欠となる。また、2 copies以上の標的核酸を含むウェルの存在率が無視できないといった問題点もある。
【０００４】
これに対し、複数のチャンネルを備えたキャピラリープレート上で微量の標的核酸と蛍光試薬を含む溶液をPCR増幅し、その蛍光画像を解析することによって、標的核酸の分子数を定量する方法（例えば、特許文献２参照）も開発されている。この方法では、40サイクル程度のPCR反応で検出、定量が可能であるため、非特異的増幅による計数制度の低下はデジタルPCRよりも改善されている。しかしながら、この方法によっても、非特異的増幅の問題を十分に解決できたとはいえない。
【０００５】
一方、本発明者らは、PCR法において不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法であるLAMP法（Loop-mediated isothermal amplification）の開発に成功した（例えば、特許文献３および非特許文献２参照）。LAMP法では、特有のプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。そして、この相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする前記プライマーによる伸長反応により、等温での増幅反応が従来にない高い増幅効率で進行する。また、LAMP法は６つの領域を含む４つのプライマーを用いることで、標的配列に対する特異性がPCRに比較して格段に高いという特徴も有する。
【０００６】
【特許文献１】
特表２００３−５１１００９号公報
【特許文献２】
特開２００１−２６９１９６号公報
【特許文献３】
国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献１】
Bert Vogelstein and Kenneth W. Kinzler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. p9236-9241,(1999)
【非特許文献２】
Notomi, T et al., Nucleic Acids Res. 28(12):e63 (2000)
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、非特異的増幅を防止し、簡便かつ正確に微量核酸を検出・定量する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間（例えば、キャピラリーや薄膜）に極微量の標的核酸を導入すると、当該空間内には標的核酸分子が０か１の微小空間ができることに注目した。そして、この微小空間を核酸検出のための「擬似的微小空間」として利用することにより、微量核酸の効率的な検出・定量が可能になることを見出した。例えば、単一キャピラリー内で極微量の標的核酸をLAMP増幅し、生成する蛍光輝点を計測すれば、非特異的増幅を抑えて、標的核酸の初期量を簡便かつ正確に定量することができる。
【０００９】
すなわち、本発明は、標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成する方法に関する。
前記方法において、標的核酸は16nM以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供されることが望ましい。
【００１０】
本発明はまた、標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内において該標的核酸が16nM以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成し、該微小空間内における増幅産物を検出することにより標的核酸の初期量を定量する方法を提供する。
【００１１】
前記定量方法は、例えば、以下の工程により実施される。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入して、上記標的核酸が16nM以下で存在するような状態で核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００１２】
本発明の定量方法では、反応液を一定速度で送液しながら核酸増幅反応および増幅産物の検出を行うこともできる。これにより標的核酸の初期量が多い場合であっても、限られた単一の空間内に標的核酸が16nM以下で存在するような状態を作り出すことができる。
【００１３】
上記方法は、例えば以下の工程により実施できる。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入し、上記標的核酸が16nM以下で存在するように反応的を一定速度で送液しながら核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００１４】
本発明において、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間としては、例えば、キャピラリーまたは薄膜を挙げることができる。特に、キャピラリーが好ましい。本発明において、キャピラリーの断面積は１μｍ²〜１ｍｍ²、また長さは１〜１００ｍｍであることが望ましい。
【００１５】
本発明においては、核酸分子の運動の自由度を制限するために、反応液にさらに水溶性高分子を加えてもよい。そのような水溶性高分子としては、例えば、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびアガロースを挙げることができる。
本発明において、核酸増幅反応は特にLAMP法を用いて行われることが望ましい。
【００１６】
本発明はまた、本発明の方法に用いられる核酸定量のための装置を提供する。そのような装置としては、例えば、以下の手段を備えた一体型装置を挙げることができる。
核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間からなる容器内に、標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを導入する手段と；
前記容器内で核酸増幅反応を行わせるための手段と；
前記増幅反応によって得られた増幅産物を計測するための手段と；
得られた計測結果を解析して、標的核酸の初期量を定量する手段。
上記装置は、さらに、反応液を一定速度で送液する手段を備えていてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．擬似的微小空間の形成方法
本発明は、標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成する方法に関する。
【００１８】
本発明において「標的核酸」とは、検出すべき核酸分子を意味する。「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、DNA、cDNA、RNA、mRNA、およびPNA等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸および２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
【００１９】
本発明において、「核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間」とは、例えば、キャピラリーや薄膜のように、核酸分子の運度の自由度が実質的に線上、平面内（２次元以下）に限定されている単一の空間を意味する。また、「単一の空間」とは複数ウェルや複数チャネルのような単離された複数空間ではなく、連続した１つの空間を意味する。
【００２０】
この核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に極微量な標的核酸を導入すると、該標的核酸は実質的に単一の核酸分子として当該空間内に局在する。その結果、該単一の空間内に標的核酸を１分子含むかあるいは全く含まない２種類の仮想の微小空間が多数作り出されることになる。すなわち、本発明にかかる「擬似的微小空間」とは、単一の空間内に形成される、標的核酸を１分子含むかあるいは全く含まない仮想の微小空間を意味する。
【００２１】
この状態で核酸増幅反応を行うと、「標的核酸を含む擬似的微小空間」では増幅産物が生成するが、「標的核酸を含まない擬似的微小空間」ではそのような増幅産物は生成しない。核酸分子の運動の自由度は制限されているため、増幅産物は拡散することなく、単一の空間内に「標的核酸の増幅産物を含む擬似的微小空間」と「標的核酸の増幅産物を含まない擬似的微小空間」が形成される。この「擬似的微小空間」は、微量核酸の検出・定量、および変異検出など、核酸検出に好適に利用することができる。
なお、前記擬似的微小空間が区別しうる状態で単一の空間内に形成されるために、標的核酸は単一の空間内に16nM以下の状態で存在することが望ましい。
【００２２】
２．核酸の定量方法
本発明は、本発明の擬似的微小空間を利用した微量核酸の定量方法を提供する。本発明においては、反応液中の標的核酸濃度は極微量に設定されているため、各擬似的微小空間内に存在する鋳型標的核酸分子の数は確率的に１か０である。つまり、検出される「標的核酸を含む擬似的微小空間」の数は、標的核酸の初期量と等しくなる。かくして、各擬似的微小空間における個々の増幅産物を検出することにより、該標的核酸の初期量を定量することができる。
【００２３】
ここで、増幅産物の検出方法は特に限定されず、蛍光測定、蛍光偏光測定、濁度測定、吸光度測定、旋光度測定、屈折率測定、電流測定等を挙げることができる。特に、簡便性の点から蛍光核酸検出試薬を用いた蛍光測定が好ましい。
【００２４】
例えば、本発明の定量方法は、以下の工程により実施される。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入して、上記標的核酸が16nM以下で存在するような状態で核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００２５】
上記方法で用いられる「核酸検出試薬」は特に限定されず、二本鎖DNAと結合して蛍光等を発する色素、いわゆる蛍光インターカレータ等を用いることができる。該蛍光インターカレーターとしては、例えば、エチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、Hoechst33255、YOなどが挙げられ、なかでもHoechst33258が好適である。
【００２６】
本発明の方法で用いられる「プライマー」は、標的核酸の配列に従い、用いられる核酸増幅反応に適したプライマーを適宜調整する。プライマーの設計については、後述する核酸増幅方法において詳述する。また、「基質ヌクレオチド」は、市販のdNTPやその修飾物を用いればよい。
【００２７】
本発明の方法で用いられる「DNAポリメラーゼ」は特に限定されず、市販の核酸増幅に適した耐熱性DNAポリメラーゼを適宜使用することができる。特に、後述するLAMP法を利用して核酸増幅反応を行う場合には、DNAポリメラーゼとして鎖置換型DNAポリメラーゼが用いられる。そのような鎖置換型DNAポリメラーゼとしては、例えば、Bst DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、E. coli DNA ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ29ファージDNAポリメラーゼ、MS-2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造製）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）等を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明の方法では、さらに反応液内における核酸分子の運動の自由度を制限するために、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびアガロース等の水溶性高分子を加えてもよい。
【００２９】
３．キャピラリーチップによる定量法
本発明の好ましい態様の１つとして、キャピラリーチップを用いた定量方法について説明する。本発明で用いられる「キャピラリーチップ」は、例えば数センチ四方の基板内に、単一のキャピラリーを切削することによって作製することができる。図１に、そのようなキャピラリーチップの１例を示す。図１では、２つの試料導入口と１つのドレインを設けているが、試料導入口は、１つであっても、２つ以上であってもよいし、ドレインも１つであっても、２つ以上であってもよい。キャピラリーの断面積は、限定するものではないが、１μｍ²〜１ｍｍ²であることが好ましく、またキャピラリーの長さは１〜１００ｍｍであることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法で用いられるキャピラリーチップを構成する基板としては、ガラス（石英）製、プラスチック（アクリル）製など特に限定されない。但し、導入口やドレインに封（シール）を施す場合、アクリル等のプラスチック製基板を用いる方がガラス製基板よりも接着が容易である。また、プラスチック製チップは低廉という点でも優れている。以上のようなキャピラリーチップは、公知の方法に基づき作製してもよいが、市販のガラス製キャピラリーや電気泳動用チップを用いてもよい。
【００３１】
本発明では、上記キャピラリーに標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製して導入するか、あるいは、これらを別々に順次キャピラリーに導入する。反応液導入後の導入口は、必要であれば、封を施し密封してもよい。封は、例えば市販の96穴PCR用粘着シートやセロハンテープなどのシールを貼ることにより実施できる。シールは透明であれば、加熱による気泡の発生を確認することができるので好ましい。特に、96穴PCR用粘着シートは、剥離が容易で、粘着力があり、加熱にも耐えうるという点で優れている。
【００３２】
増幅反応後、核酸検出試薬により各増幅産物を検出する。蛍光核酸検出試薬を用いた場合、各増幅産物は蛍光輝点として得られるため、その数を計測することにより、標的核酸の初期量を定量することができる。蛍光輝点は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて目視観察できるが、蛍光像を撮影して画像処理することにより計数することが好ましい。
【００３３】
４．核酸増幅反応
本発明の方法で用いられる核酸増幅反応は特に限定されないが、LAMP法が好ましい。LAMP法は増幅効率が高く、短時間で微量の標的核酸を効率よく増幅することができる。しかも、後述するように、6つの領域を含む4つのプライマーを用いることで、標的核酸に対する特異性がPCRに比較して格段に向上しているため、非特異的増幅の問題なく、微量核酸を増幅することができる。
【００３４】
1)LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法の概要
「LAMP法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、2種、4種或いは6種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼおよび基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（65℃前後）でDNAまたはRNAを迅速かつ安価に増幅する方法である。LAMP法の概要については、文献：Notomi, T et al.:Nucleic Acids Res. 28(12):e63(2000)、特許：国際公開WO 00/28082号、あるいは栄研化学(株)ホームページ（http://www.loopamp.eiken.co.jp/）を参照されたい。
【００３５】
LAMP法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を1本鎖に解離させていく。解離した1本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、LAMP法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、DNAの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、微量核酸を効率的に増幅することができる。
【００３６】
2)LAMP法用プライマー
LAMP法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００３７】
インナープライマーとはLAMP法に必須のプライマーであって、鋳型DNAのそれぞれの鎖において、3'側に存在する任意配列X2c、これより5'側の任意配列X1cを選択したとき、該X2cに相補的配列X2と該X1cと同一の配列X1cを3'側から5'側にこの順で含む（X1c＋X2の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のX2は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、X1cは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００３８】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（鋳型の3'側）の任意配列X3cに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー2種（2本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
【００３９】
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記X1（X1c）、X2（X2c）、X3（X3c）の長さは5〜100塩基が好ましく、10〜50塩基がさらに好ましい。
【００４０】
上記インナープライマーおよびアウタープライマーは、2本鎖（FおよびR）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（F1c＋F2、R1c+R2）、アウタープライマー（F3、R3）の各々2種が設計される。
【００４１】
各任意配列は、LAMP法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、F1c配列とF2c配列との間の距離およびR1配列とR1c配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、0〜500塩基、好ましくは0〜100塩基、最も好ましくは10〜70塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、F1c配列およびF2c配列自身並びにR1配列およびR2配列自身を含まない塩基数を示している。
【００４２】
また、ループプライマーとは、LAMP法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその3'末端に含むプライマー2種（2本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはLAMP法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００４３】
3)増幅用鋳型核酸
LAMP法で用いられる増幅用鋳型核酸はDNAであってもRNAであってもよく、組織または細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の5’末端からポリヌクレオチド鎖の5’末端までの領域の配列、および当該標的領域の3'末端からポリヌクレオチド鎖の3’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の5'側および3'側のいずれの領域も、10〜1000塩基、好ましくは30〜500塩基である。
【００４４】
4)反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なpHを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度(Tm)の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Tris-HCl等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。pHは使用するDNAポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばKCl、NaCl、あるいは(NH₄)₂SO₄等が、酵素の活性維持とDNAの融解温度(Tm)調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度(Tm)調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００４５】
5)LAMP反応
LAMP法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（i）（ii）（iii）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は50〜75℃、好ましくは55〜70℃であり、インキュベート時間は1分〜10時間、好ましくは5分〜4時間である。
(i) インナープライマー2種、或いはさらにアウタープライマー2種、或いはさらにループプライマー2種
(ii) 鎖置換型ポリメラーゼ
(iii) 基質ヌクレオチド
【００４６】
５．フロー法を利用した標的核酸の定量方法
本発明の定量方法では、反応液を一定速度で送液しながら核酸増幅反応および増幅産物の検出を行うこともできる。これにより標的核酸の初期量が多い場合であっても、限られた単一の空間内に標的核酸が16nM以下で存在するような状態を作り出すことができる。
【００４７】
上記方法は、例えば以下の工程により実施できる。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入し、上記標的核酸が16nM以下で存在するように反応的を一定速度で送液しながら核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００４８】
反応液の送液は、例えば微量吐出ポンプを利用することにより、一定速度で一定方向に行うことができる。送液速度は特に限定されないが、0.1〜100 nl/secが望ましい。
【００４９】
図４に、フロー法を利用した標的核酸の定量方法の一例を示す。
装置は、1)２つの試料導入口と１つのドレインを有するキャピラリー（直径：300μm）、送液手段としての2)微量吐出ポンプIおよび3)微量吐出ポンプII、4)蛍光検出装置、および5)温度制御のためのラバーヒーターを備える。２つの微量吐出ポンプIおよびIIは、シリコンチューブIおよびIIを介して、それぞれ試料導入口IおよびIIに接続される。蛍光検出装置は、キャピラリーのドレインに近い特定位置に接続される。ラバーヒーターは、キャピラリーの下側に図４Ｂのように配置される。
【００５０】
この装置を鋳型核酸の定量は次のようにして行う。キャピラリー内に、予め基質ヌクレオチド、鎖置換型DNAポリメラーゼ、および蛍光インターカレーターを含むLAMP反応液（表1参照）を満たし、ラバーヒーターで65℃になるよう制御しておく。微量吐出ポンプを用いて、試料導入口Aから前記LAMP反応液を、試料導入口Bより鋳型核酸を、それぞれ一定速度でキャピラリー内に導入しながら、LAMP反応を行わせる。蛍光検出装置で蛍光強度を測定し、鋳型核酸量の定量を行う。
【００５１】
図４Ｃに、9nl中に500分子の鋳型核酸を含む反応液を9nl/secで送液しながらLAMP増幅させた場合における、擬似的微小空間形成の概念図を示す。9nlの擬似的微小空間には、平均1/2分子の鋳型核酸が存在する。したがって、確率的には9nlの微小空間2個に1個の割合で増幅が起きる（すなわち、1秒おきに蛍光ピークが観察される）ことになる。
【００５２】
６．核酸定量装置
本発明はまた、核酸定量のための装置を提供する。該装置は、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間からなる容器内に、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを導入する手段と；前記容器を一定温度に加熱して核酸増幅反応を行わせるための手段と；前記増幅反応によって得られた増幅産物を計測するための手段と；得られた計測結果を解析して、標的核酸の初期量を定量するための手段とを備える。
【００５３】
ここで、容器に標的核酸、核酸検出試薬、プライマー、ポリメラーゼ、および基質ヌクレオチドを導入する手段は、標的核酸、プライマー、ポリメラーゼ、および基質ヌクレオチドをそれぞれを順番に、あるいはこれら全て含む反応液を、一定量自動的に導入する手段である。
【００５４】
また、前記容器を一定温度に加熱して核酸増幅反応を行わせるための手段としては、例えば、装置内に備えられたヒートブロックによって容器を上または下から、好ましくは上下両面から挟んで、増幅反応に適した一定温度に加熱する手段が挙げられる。この手段には、試料を導入口を密封する手段を含みうる。
【００５５】
前記増幅反応によって得られた蛍光輝点等を計測するための手段については、公知の蛍光画像解析手段を利用することができる。本発明の装置には、さらに得られた測定データをコンピューター処理する手段を備えていてもよい。
【００５６】
上記装置は、また反応液を一定速度で送液するための手段を備えていてもよい。そのような手段としては、例えば、微量送液ポンプ（微量吐出ポンプ）を使用することができる。該微量送液ポンプは、試料導入口に直接あるいはシリコンチューブ等のチューブを通して間接的に接続され、容器内に反応液を一定速度で送液する。なお、微量送液ポンプは周知の方法に従って作製してもよいが、市販のもの（例えばテルモ社製 model stc531、武蔵エンジニアリング社製 SMP-III型微量定量吐出装置、メクト社製 model MD-999等）を好適に用いることができる。図４に送液手段を備えた本発明の装置の一例を示す。
【００５７】
７．その他
本発明の方法を利用すれば、効率的な変異検出や、核酸検出における相対的感度を上昇させることが可能になる。すなわち、標的核酸を擬似的な微少空間に入れることによって、それ以外のDNAによる検出阻害効果を軽減することができる。
【００５８】
一般的に、標的配列とよく似た配列（究極的には１塩基のみ違う変異配列）が近傍に存在していると、この類似配列が阻害的にはたらいて、検出感度が低下する。これは、プライマーが、類似配列に弱く結合して効率的に働かなくなるためである。この場合、通常はそのような類似配列を有するDNAを除去して分析を行うが、本発明の方法によれば、擬似的微少空間を形成させるとで類似配列を排除して高感度に検出を行うことが可能になる。
【００５９】
さらに、前述のフロー法を利用した定量方法のように、一定速度で反応液を流しながら増幅反応を行ったり、最終反応溶液を回収するなど、完全分離型微少空間ではできない応用も可能になると考えられる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１：キャピラリー内におけるLAMP反応
１．試験方法
１）キャピラリー
図1に本実施例で利用したチップ型のキャピラリーを示す。材質はアクリルで切削方式で作製した。２種類の試料をキャピラリーに導入できるように、試料導入口は２つ（導入口1および導入口2）作られており、本実施例では、両導入口から同一の試料溶液を導入した。キャピラリー部分の体積は5μlである。したがって、導入した試料の約半分がキャピラリー内で反応する。
【００６２】
２）LAMP反応
所定量の鋳型DNAを含むLAMP反応液を2つの試料導入口から5μlづつキャピラリーに導入した。各導入口とドレインをシールで塞ぎ、65℃に加温したサーマルサイクラーに載せることでLAMP反応を行った。LAMP反応時間は90分とした。実施したLAMP反応の詳細は以下のようである。
【００６３】
鋳型DNA： pBR322にクローニングしたHBV DNA（配列番号１）
primer ：
FIP：5'-CCTACACAGACGCCGCAAAATAGCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3’（配列番号２）
RIP：5'-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTCCATACAACGGGCAAACAG-3’（配列番号３）
F3 ：5'-AAATTCGCAGTCCCCAACC-3’（配列番号４）
R3 ：5'-AGGTCCTTGTAGTTGGT-3’（配列番号５）
【００６４】
【表１】

*) 日立化成工業株式会社製 i-チップDNAキット付属の泳動ゲルを濃度が1/2となるように添加した。
【００６５】
３）検出
増幅後のキャピラリーチップをオリンパス光学工業社製の落射蛍光顕微鏡（BX-FLA）で、Hoechst33258用のフィルター（Ex = 330 - 385 nm、Em = 420 nm）を用いて観察した。蛍光が観察されている部分を輝点とし、キャピラリー内の輝点の数を目視で数えた。このとき、輝点の大きさについては考慮しなかった。つまり、輝点が大きくても小さくても一つと数えた。
【００６６】
２．試験結果
１）局所的増幅の有無
図２に増幅後のキャピラリーの蛍光写真を撮影した結果を示す。鋳型DNA量が少ない場合（図2-A; 10コピー）、局所的な増幅が起きた（黄色い円で囲んだ部分）。また、これより少し鋳型DNA量が多い場合（図2-B; 20コピー）は、輝点の数が多かった。さらに多量の鋳型DNAを含む場合（図2-C; 10⁷コピー）は、キャピラリー全体が蛍光を発した。この結果から、ゲルを詰めたキャピラリー内で、擬似的な微少空間が形成されており、そのような擬似的な微少空間内でLAMP反応が起きていることがわかった。
２）輝点数と初期鋳型DNA数の関係
キャピラリー全体にわたって輝点の数を数え、それを初期鋳型数に対してプロットした結果、直線が得られた（図３）。したがって、キャピラリー内の輝点を計測することによって初期鋳型DNA数を定量できることが確認された。
今回は、初期鋳型DNA数は20分子までしか定量ができなかったが、キャピラリーをさらに細く長くすれば、より多くの鋳型DNAを定量できるようになると考えられた。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、非特異的増幅を抑えて、簡便かつ正確に微量核酸を定量することができる。
【００６８】
【配列表】

【００６９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で用いたチップ型キャピラリーを示す写真である。
【図２】図２は、キャピラリー内でのLAMP反応結果を示す写真である（(A) 鋳型DNA数, 10コピー; (B) 同, 20コピー; (C) 同, 10⁷コピー）図中、黄色い円は、増幅が起きた部分を示す。ただし、(C)は全体で蛍光が起きているので黄色い円を省略した。
【図３】図３は、初期鋳型ＤＮＡ数と輝点の数の関係を示すグラフである。
【図４】図４は、フロー法を利用した標的核酸の定量装置の概要を示す図である。Ａは装置上面図、Ｂは装置側面図を示す。Ｃは装置内における擬似的微小空間形成の概念を示す。
【符号の説明】
1:キャピラリー
2:微量吐出ポンプI
3:微量吐出ポンプII
4:蛍光検出装置
5:ラバーヒーター
6:試料導入口I
7:試料導入口II
8:シリコンチューブI
9:シリコンチューブII
10:ドレイン[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a small amount of nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a method for easily and accurately quantifying a very small amount of nucleic acid in a sample using a LAMP reaction, and an apparatus therefor.
[0002]
[Prior art]
Advances in gene amplification techniques represented by PCR have made it possible to detect minute amounts of nucleic acids in vivo. In particular, when PCR is used for quantification, it is necessary to solve the problem of the amplification product between tubes and the plateau effect after the middle of the cycle. For this reason, a method using an internal standard, a competitive PCR in which competitive amplification is performed by adding a known amount of another nucleic acid, and a target nucleic acid is quantified based on the amplification product amount ratio have been developed. However, these methods have problems such as a narrow measurement range and complicated operation.
[0003]
Recently, a new technique for quantifying extremely small amounts of nucleic acids, called digital PCR, has been developed (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). Digital PCR performs quantitative and statistical analysis of a target nucleic acid by converting the characteristics of analog PCR into a linear signal, that is, a digital signal suitable for quantification. In digital PCR, the test sample is diluted to 1/2 copy / well, dispensed into multiple wells, PCR amplification is performed, and the presence of target nucleic acid in the amplification product is confirmed using a fluorescent probe. To do. Theoretically, the template target nucleic acid in each well is 0 or 1. Therefore, the template target nucleic acid in the sample can be accurately quantified by measuring the number of amplified wells. However, digital PCR requires about 60 PCR reactions in order to amplify a small amount of nucleic acid, and complicated operations are indispensable to prevent non-specific amplification during that time. There is also a problem that the existence rate of wells containing 2 copies or more of target nucleic acid cannot be ignored.
[0004]
In contrast, a method of quantifying the number of target nucleic acid molecules by PCR amplification of a solution containing a small amount of a target nucleic acid and a fluorescent reagent on a capillary plate having a plurality of channels and analyzing the fluorescence image (for example, Patent Document 2) has also been developed. In this method, since detection and quantification are possible with about 40 cycles of PCR reaction, the decrease in counting system due to non-specific amplification is improved over digital PCR. However, it cannot be said that this method has sufficiently solved the problem of non-specific amplification.
[0005]
On the other hand, the present inventors have succeeded in developing a LAMP method (Loop-mediated isothermal amplification), which is a new nucleic acid amplification method that does not require complicated temperature control that is indispensable in the PCR method (for example, Patent Document 3 and Non-patent document 2). In the LAMP method, amplification products having sequences complementary to each other at the upper end of the same strand are generated by using a specific primer and a strand displacement type DNA polymerase. The isothermal amplification reaction proceeds at a high amplification efficiency unprecedented by the extension reaction starting from the loop formed by annealing between the complementary sequences and the extension reaction by the primer that anneals to the loop. In addition, the LAMP method has a feature that specificity to a target sequence is remarkably higher than PCR by using four primers including six regions.
[0006]
[Patent Document 1]
Special table 2003-511209 gazette
[Patent Document 2]
JP 2001-269196 A
[Patent Document 3]
International Publication No. 00/28082 Pamphlet
[Non-Patent Document 1]
Bert Vogelstein and Kenneth W. Kinzler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. P9236-9241, (1999)
[Non-Patent Document 2]
Notomi, T et al., Nucleic Acids Res. 28 (12): e63 (2000)
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for preventing and detecting non-specific amplification and detecting and quantifying a small amount of nucleic acid simply and accurately.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
When the present inventors introduce a very small amount of a target nucleic acid into a single space (for example, a capillary or a thin film) in which the degree of freedom of movement of the nucleic acid molecule is substantially limited to two or less dimensions, We paid attention to the fact that the target nucleic acid molecule has 0 or 1 minute space. Then, it has been found that by utilizing this micro space as a “pseudo micro space” for nucleic acid detection, it is possible to efficiently detect and quantify a small amount of nucleic acid. For example, LAMP amplification of a very small amount of target nucleic acid in a single capillary and measurement of the generated fluorescent bright spot enables non-specific amplification to be suppressed and the initial amount of target nucleic acid to be quantified easily and accurately. .
[0009]
That is, the present invention provides a reaction solution containing a target nucleic acid for a nucleic acid amplification reaction in a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two dimensions or less. The present invention relates to a method for forming a pseudo minute space for detecting a target nucleic acid in a space.
In the method, it is desirable that the target nucleic acid is subjected to a nucleic acid amplification reaction in a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less.
[0010]
The present invention also provides a reaction solution containing a target nucleic acid in a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less in a single space in which the freedom of movement of the nucleic acid molecule is substantially limited to two dimensions or less. It is subjected to a nucleic acid amplification reaction, thereby forming a pseudo microspace for detecting the target nucleic acid in the single space, and quantifying the initial amount of the target nucleic acid by detecting the amplification product in the microspace. Provide a method.
[0011]
The quantification method is performed, for example, by the following steps.
1) preparing a reaction solution containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase;
2) The reaction solution is introduced into a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two dimensions or less, and the nucleic acid amplification reaction is performed in a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less. I do;
3) The initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the bright spot of the obtained amplification product.
[0012]
In the quantification method of the present invention, the nucleic acid amplification reaction and the detection of the amplification product can also be performed while feeding the reaction solution at a constant rate. Thereby, even when the initial amount of the target nucleic acid is large, it is possible to create a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less in a limited single space.
[0013]
The said method can be implemented by the following processes, for example.
1) preparing a reaction solution containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase;
2) The reaction solution is introduced into a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two dimensions or less, and the reaction is performed at a constant rate so that the target nucleic acid is present at 16 nM or less. Perform nucleic acid amplification reaction while feeding liquid;
3) The initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the bright spot of the obtained amplification product.
[0014]
In the present invention, examples of the single space in which the degree of freedom of movement of the nucleic acid molecule is substantially limited to two dimensions or less include a capillary or a thin film. A capillary is particularly preferable. In the present invention, the cross-sectional area of the capillary is 1 μm ² ~ 1mm ² The length is preferably 1 to 100 mm.
[0015]
In the present invention, a water-soluble polymer may be further added to the reaction solution in order to limit the freedom of movement of the nucleic acid molecule. Examples of such water-soluble polymers include polyacrylamide, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, and agarose.
In the present invention, the nucleic acid amplification reaction is particularly preferably performed using the LAMP method.
[0016]
The present invention also provides an apparatus for nucleic acid quantification used in the method of the present invention. As such an apparatus, for example, an integrated apparatus including the following means can be cited.
Means for introducing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase into a container consisting of a single space in which the degree of freedom of movement of the nucleic acid molecule is substantially limited to two dimensions or less;
Means for performing a nucleic acid amplification reaction in the vessel;
Means for measuring the amplification product obtained by the amplification reaction;
Means for analyzing the obtained measurement results and quantifying the initial amount of the target nucleic acid.
The apparatus may further include means for feeding the reaction solution at a constant speed.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Method for forming a pseudo minute space
In the present invention, a reaction solution containing a target nucleic acid is subjected to a nucleic acid amplification reaction in a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two or less dimensions. The present invention relates to a method for forming a pseudo microspace for detecting a target nucleic acid.
[0018]
In the present invention, the “target nucleic acid” means a nucleic acid molecule to be detected. The “nucleic acid” may be natural or artificially synthesized, and includes all of DNA, cDNA, RNA, mRNA, PNA and the like. It also includes both single-stranded nucleic acids and double-stranded nucleic acids. Further, even a nucleotide derivative partially modified or entirely composed of an artificial structure is included in the nucleic acid of the present invention as long as it can form a base pair bond. The term gene (nucleic acid carrying a specific function or information related to life) is also included in nucleic acid. The number of bases constituting the nucleic acid in the present invention is not limited.
[0019]
In the present invention, “a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two dimensions or less” means that the degree of freedom of nucleic acid molecule mobility is substantially, for example, a capillary or a thin film. In other words, it means a single space limited to a line and within a plane (two dimensions or less). In addition, “single space” means one continuous space, not a plurality of isolated spaces such as a plurality of wells or a plurality of channels.
[0020]
When a very small amount of a target nucleic acid is introduced into a single space in which the degree of freedom of movement of the nucleic acid molecule is substantially limited to two or less dimensions, the target nucleic acid is substantially converted into the space as a single nucleic acid molecule. Localized in As a result, a large number of two types of virtual microspaces containing one or no target nucleic acid in the single space are created. That is, the “pseudo microspace” according to the present invention means a virtual microspace that is formed in a single space and that includes one molecule or none of the target nucleic acid.
[0021]
When the nucleic acid amplification reaction is performed in this state, an amplification product is generated in the “pseudo microspace including the target nucleic acid”, but such an amplification product is not generated in the “pseudo microspace not including the target nucleic acid”. Since the degree of freedom of movement of the nucleic acid molecule is limited, the amplification product does not diffuse and includes a “pseudo microspace containing the target nucleic acid amplification product” and “target nucleic acid amplification product” within a single space. No pseudo microspace "is formed. This “pseudo microspace” can be suitably used for nucleic acid detection such as detection and quantification of a small amount of nucleic acid and mutation detection.
In addition, since the pseudo minute space is formed in a single space in a distinguishable state, it is desirable that the target nucleic acid exists in a single space in a state of 16 nM or less.
[0022]
2. Nucleic acid quantification method
The present invention provides a method for quantifying a small amount of nucleic acid using the pseudo microspace of the present invention. In the present invention, since the target nucleic acid concentration in the reaction solution is set to a very small amount, the number of template target nucleic acid molecules present in each pseudo microspace is 1 or 0 stochastically. That is, the number of “pseudo microspaces including the target nucleic acid” detected is equal to the initial amount of the target nucleic acid. Thus, the initial amount of the target nucleic acid can be quantified by detecting individual amplification products in each pseudo-microspace.
[0023]
Here, the detection method of the amplification product is not particularly limited, and examples thereof include fluorescence measurement, fluorescence polarization measurement, turbidity measurement, absorbance measurement, optical rotation measurement, refractive index measurement, and current measurement. In particular, fluorescence measurement using a fluorescent nucleic acid detection reagent is preferable from the viewpoint of simplicity.
[0024]
For example, the quantification method of the present invention is implemented by the following steps.
1) preparing a reaction solution containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase;
2) The reaction solution is introduced into a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two dimensions or less, and the nucleic acid amplification reaction is performed in a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less. I do;
3) The initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the bright spot of the obtained amplification product.
[0025]
The “nucleic acid detection reagent” used in the above method is not particularly limited, and a dye that binds to double-stranded DNA and emits fluorescence, a so-called fluorescent intercalator or the like can be used. Examples of the fluorescent intercalator include ethidium bromide, SYBR GREEN I, Hoechst33255, YO and the like, and Hoechst33258 is particularly preferable.
[0026]
As the “primer” used in the method of the present invention, a primer suitable for the nucleic acid amplification reaction to be used is appropriately adjusted according to the sequence of the target nucleic acid. The primer design will be described in detail in the nucleic acid amplification method described later. As the “substrate nucleotide”, a commercially available dNTP or a modified product thereof may be used.
[0027]
The “DNA polymerase” used in the method of the present invention is not particularly limited, and a commercially available thermostable DNA polymerase suitable for nucleic acid amplification can be appropriately used. In particular, when a nucleic acid amplification reaction is performed using the LAMP method described later, a strand displacement type DNA polymerase is used as the DNA polymerase. Examples of such strand displacement DNA polymerases include Bst DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase (Vent DNA). Polymerase excluding exonuclease activity), DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (DeepVent DNA polymerase excluding exonuclease activity), Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z- Examples include Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), KOD DNA polymerase (Toyobo).
[0028]
In the method of the present invention, a water-soluble polymer such as polyacrylamide, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, and agarose may be added to further limit the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules in the reaction solution. .
[0029]
3. Quantitative method using capillary chip
As a preferred embodiment of the present invention, a quantitative method using a capillary chip will be described. The “capillary chip” used in the present invention can be produced by cutting a single capillary in a substrate of several centimeters, for example. FIG. 1 shows an example of such a capillary chip. In FIG. 1, two sample inlets and one drain are provided, but the number of sample inlets may be one, two or more, and there may be one drain, There may be two or more. The cross-sectional area of the capillary is not limited, but 1 μm ² ~ 1mm ² It is preferable that the length of the capillary is 1 to 100 mm.
[0030]
The substrate constituting the capillary chip used in the method of the present invention is not particularly limited, such as glass (quartz) or plastic (acrylic). However, when sealing (sealing) the inlet and the drain, the use of a plastic substrate such as acrylic is easier to bond than the glass substrate. Plastic chips are also excellent in that they are inexpensive. The capillary chip as described above may be produced based on a known method, but a commercially available glass capillary or electrophoresis chip may be used.
[0031]
In the present invention, a reaction liquid containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase is prepared and introduced into the capillary, or these are separately introduced into the capillary sequentially. The inlet after introduction of the reaction solution may be sealed by sealing if necessary. Sealing can be carried out by applying a seal such as a commercially available 96-hole PCR adhesive sheet or cellophane tape. If the seal is transparent, it is preferable because the generation of bubbles due to heating can be confirmed. In particular, the 96-hole PCR adhesive sheet is excellent in that it can be easily peeled off, has adhesive strength, and can withstand heating.
[0032]
After the amplification reaction, each amplification product is detected with a nucleic acid detection reagent. When a fluorescent nucleic acid detection reagent is used, each amplification product is obtained as a fluorescent bright spot. Therefore, the initial amount of the target nucleic acid can be quantified by measuring the number of the fluorescent products. The fluorescent bright spot can be visually observed using, for example, a fluorescent microscope, but it is preferable to count the fluorescent image by taking a fluorescent image and processing the image.
[0033]
4). Nucleic acid amplification reaction
The nucleic acid amplification reaction used in the method of the present invention is not particularly limited, but the LAMP method is preferred. The LAMP method has high amplification efficiency and can efficiently amplify a small amount of target nucleic acid in a short time. Moreover, as will be described later, the use of four primers including six regions significantly improves the specificity for the target nucleic acid compared to PCR. Can be amplified.
[0034]
1) Overview of LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method
The “LAMP method” is a nucleic acid amplification method developed by the present inventors, and includes two, four, or six specific primers, which are an inner primer pair or an outer primer pair and a loop primer pair. In this method, DNA or RNA is rapidly and inexpensively amplified under isothermal conditions (around 65 ° C.) using a strand displacement polymerase and a substrate nucleotide. For an overview of the LAMP method, refer to: Notomi, T et al .: Nucleic Acids Res. 28 (12): e63 (2000), Patent: International Publication WO 00/28082, or Eiken Chemical Co., Ltd. website (http Please refer to http://www.loopamp.eiken.co.jp/).
[0035]
In the LAMP method, sequences complementary to each other are generated on the same strand of the amplified product, and these are annealed to form a hairpin-like loop, and an elongation reaction by the polymerase starting from the loop occurs. At the same time, a strand displacement type extension reaction occurs from the primer annealed in the loop, and the extension product is dissociated into single strands. Since the dissociated single strand also has a complementary sequence at the end, this reaction occurs repeatedly. Thus, in the LAMP method, the extension reaction and the amplification reaction proceed simultaneously at a plurality of positions on the same strand of the amplified product, so that DNA amplification is achieved under super-exponential and isothermal conditions, and a small amount of nucleic acid is efficiently used. Can be amplified.
[0036]
2) Primer for LAMP method
In the LAMP method, specific primers called inner primer, outer primer and loop primer are used.
[0037]
The inner primer is an essential primer for the LAMP method. When an arbitrary sequence X2c present on the 3 ′ side and an arbitrary sequence X1c on the 5 ′ side are selected in each strand of the template DNA, the inner primer is complementary to the X2c. A primer containing the target sequence X2 and the same sequence X1c as X1c from the 3 ′ side to the 5 ′ side in this order (having the structure of X1c + X2). Functionally speaking, X2 on the inner primer is the part that specifically anneals to the template to give the starting point for complementary strand synthesis, and X1c is the complementary sequence for the amplification (extension) product to form a loop. give. This loop becomes the starting point for new complementary strand synthesis.
[0038]
Outer primer has two complementary sequences to the arbitrary sequence X3c outside the inner primer (3 'side of the template) and one that can anneal to it (one for each complementary to the double strand) ).
[0039]
In order to facilitate annealing of the primer to the template nucleic acid, the length of the above X1 (X1c), X2 (X2c), and X3 (X3c) is preferably 5 to 100 bases, more preferably 10 to 50 bases.
[0040]
The inner primer and outer primer are necessary for each of the double strands (F and R), and two types of inner primer (F1c + F2, R1c + R2) and outer primer (F3, R3) are designed.
[0041]
Each arbitrary sequence is preferably selected so that the amplification product obtained by the LAMP method preferentially causes intramolecular annealing rather than intermolecular annealing to form a terminal hairpin structure. For example, in order to preferentially cause intramolecular annealing, it is important to consider the distance between the F1c and F2c sequences and the distance between the R1 and R1c sequences when selecting an arbitrary sequence. . Specifically, it is preferable to select such that both sequences exist via a distance of 0 to 500 bases, preferably 0 to 100 bases, and most preferably 10 to 70 bases. Here, the numerical values indicate the number of bases not including the F1c sequence and the F2c sequence itself, and the R1 sequence and the R2 sequence itself, respectively.
[0042]
The loop primer refers to a base sequence complementary to the sequence in the loop at the 3 'end when complementary sequences generated on the same strand of the amplified product by the LAMP method anneal to each other to form a loop. Two types of primers (one for each complementary to the double strand). The outer primer and loop primer are not essential for the LAMP method, but if they are present, the amplification (extension) reaction proceeds more efficiently.
[0043]
3) Template nucleic acid for amplification
The template nucleic acid for amplification used in the LAMP method may be DNA or RNA, and can be prepared from a biological sample such as tissue or cell by a known method or by a chemical synthesis method. In this case, the template polynucleotide is prepared so that sequences of appropriate length (referred to as double-sided sequences) exist on both sides of the region to be amplified (referred to as target region). Bilateral sequence means the sequence of the region from the 5 ′ end of the target region to the 5 ′ end of the polynucleotide chain, and the sequence of the region from the 3 ′ end of the target region to the 3 ′ end of the polynucleotide chain . The length of the double-sided sequence is 10 to 1000 bases, preferably 30 to 500 bases in both the 5 ′ side and 3 ′ side regions of the target region.
[0044]
4) Reaction conditions
A series of reactions consist of a buffer that gives a suitable pH for the enzyme reaction, salts necessary for maintaining the catalytic activity of the enzyme and annealing, an enzyme protecting agent, and a melting temperature (Tm) adjusting agent as necessary. It is preferable to carry out in the coexistence of the above. As the buffering agent, a neutral to weakly alkaline buffering agent such as Tris-HCl is used. The pH may be adjusted according to the DNA polymerase used. Examples of salts include KCl, NaCl, or (NH _Four ) ₂ SO _Four And the like are appropriately added for maintaining the enzyme activity and adjusting the melting temperature (Tm) of the DNA. As an enzyme protective agent, bovine serum albumin or saccharide is used. As the melting temperature (Tm) adjusting agent, betaine, proline, dimethyl sulfoxide, or formamide can be generally used.
[0045]
5) LAMP reaction
In the reaction in the LAMP method, the following components (i), (ii), and (iii) are added to the template nucleic acid, and the inner primer forms a stable base pair bond with a complementary sequence on the template nucleic acid. It is possible to proceed by incubating at a temperature at which the strand displacement polymerase can maintain the enzyme activity. The incubation temperature is 50 to 75 ° C, preferably 55 to 70 ° C, and the incubation time is 1 minute to 10 hours, preferably 5 minutes to 4 hours.
(i) 2 types of inner primer, or 2 types of outer primer, or 2 types of loop primer
(ii) Strand displacement polymerase
(iii) Substrate nucleotide
[0046]
5). Quantification method of target nucleic acid using flow method
In the quantification method of the present invention, the nucleic acid amplification reaction and the detection of the amplification product can also be performed while feeding the reaction solution at a constant rate. Thereby, even when the initial amount of the target nucleic acid is large, it is possible to create a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less in a limited single space.
[0047]
The said method can be implemented by the following processes, for example.
1) preparing a reaction solution containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase;
2) The reaction solution is introduced into a single space in which the degree of freedom of movement of nucleic acid molecules is substantially limited to two dimensions or less, and the reaction is performed at a constant rate so that the target nucleic acid is present at 16 nM or less. Perform nucleic acid amplification reaction while feeding liquid;
3) The initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the bright spot of the obtained amplification product.
[0048]
The reaction liquid can be fed in a constant direction at a constant speed by using, for example, a micro discharge pump. The liquid feeding speed is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100 nl / sec.
[0049]
FIG. 4 shows an example of a target nucleic acid quantification method using the flow method.
The apparatus includes 1) a capillary having two sample inlets and one drain (diameter: 300 μm), 2) a micro discharge pump I and 3) a micro discharge pump II, 4) a fluorescence detection apparatus, and 5 ) Equipped with a rubber heater for temperature control. Two micro discharge pumps I and II are connected to sample inlets I and II through silicon tubes I and II, respectively. The fluorescence detection device is connected to a specific position near the drain of the capillary. The rubber heater is arranged on the lower side of the capillary as shown in FIG. 4B.
[0050]
This apparatus is used for quantification of template nucleic acid as follows. The capillary is previously filled with a LAMP reaction solution (see Table 1) containing a substrate nucleotide, a strand displacement DNA polymerase, and a fluorescent intercalator, and is controlled to 65 ° C. with a rubber heater. A LAMP reaction is performed while introducing the LAMP reaction solution from the sample introduction port A and the template nucleic acid into the capillary at a constant rate using a micro discharge pump. The fluorescence intensity is measured with a fluorescence detector, and the amount of template nucleic acid is quantified.
[0051]
FIG. 4C shows a conceptual diagram of pseudo microspace formation when LAMP amplification is performed while a reaction solution containing 500 template nucleic acids in 9 nl is fed at 9 nl / sec. In 9nl pseudo-microspace, there are an average of 1/2 molecules of template nucleic acid. Therefore, the amplification occurs at a rate of one in two minute spaces of 9nl (that is, a fluorescence peak is observed every second).
[0052]
6). Nucleic acid quantification equipment
The present invention also provides an apparatus for nucleic acid quantification. The apparatus includes means for introducing a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase into a container consisting of a single space in which the degree of freedom of movement of the nucleic acid molecule is substantially limited to two dimensions or less; Means for heating the container to a constant temperature to perform a nucleic acid amplification reaction; means for measuring an amplification product obtained by the amplification reaction; and analyzing the obtained measurement result to analyze the target nucleic acid Means for quantifying the initial amount.
[0053]
Here, the means for introducing the target nucleic acid, the nucleic acid detection reagent, the primer, the polymerase, and the substrate nucleotide into the container is a constant reaction solution containing the target nucleic acid, the primer, the polymerase, and the substrate nucleotide in order or all of them. It is a means to automatically introduce the quantity.
[0054]
In addition, as a means for heating the container to a certain temperature to perform the nucleic acid amplification reaction, for example, the container is sandwiched from above or below by a heat block provided in the apparatus, preferably from both the upper and lower sides, and amplified. Means for heating to a constant temperature suitable for the reaction can be mentioned. This means may include means for sealing the sample inlet.
[0055]
As a means for measuring the fluorescence luminescent spot and the like obtained by the amplification reaction, a known fluorescence image analysis means can be used. The apparatus of the present invention may further include means for computer processing the obtained measurement data.
[0056]
The apparatus may further include means for feeding the reaction solution at a constant speed. As such means, for example, a micro liquid feed pump (micro discharge pump) can be used. The micro liquid feed pump is connected directly to the sample inlet or indirectly through a tube such as a silicon tube, and feeds the reaction liquid into the container at a constant speed. The micro liquid feed pump may be manufactured according to a well-known method, but a commercially available one (for example, model stc531 manufactured by Terumo, SMP-III type micro quantitative dispensing device manufactured by Musashi Engineering, model MD-999 manufactured by Mect, etc.) ) Can be suitably used. FIG. 4 shows an example of the apparatus of the present invention provided with a liquid feeding means.
[0057]
7). Other
By using the method of the present invention, it is possible to increase the relative sensitivity in efficient mutation detection and nucleic acid detection. That is, by putting the target nucleic acid in a pseudo minute space, the detection inhibition effect by other DNA can be reduced.
[0058]
In general, if a sequence that is very similar to the target sequence (ultimately, a mutant sequence that differs by only one base) is present in the vicinity, this similar sequence acts as an inhibitor and decreases the detection sensitivity. This is because the primer binds weakly to similar sequences and does not work efficiently. In this case, the analysis is usually carried out by removing DNA having such a similar sequence, but according to the method of the present invention, detection of a highly sensitive detection can be performed by eliminating the similar sequence by forming a pseudo minute space. It becomes possible to do.
[0059]
Furthermore, as in the quantitative method using the flow method described above, it is possible to perform applications that cannot be performed in a completely separated micro-space, such as performing an amplification reaction while flowing the reaction solution at a constant rate, or collecting the final reaction solution. It is done.
[0060]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
[0061]
Example 1: LAMP reaction in a capillary
1. Test method
1) Capillary
FIG. 1 shows a chip-type capillary used in this example. The material was made of acrylic with a cutting method. Two sample introduction ports (introduction port 1 and introduction port 2) are formed so that two types of samples can be introduced into the capillary. In this example, the same sample solution was introduced from both the introduction ports. The volume of the capillary part is 5 μl. Therefore, about half of the introduced sample reacts in the capillary.
[0062]
2) LAMP reaction
A LAMP reaction solution containing a predetermined amount of template DNA was introduced into the capillary by 5 μl from two sample introduction ports. Each inlet and drain were sealed with a seal and placed on a thermal cycler heated to 65 ° C. to perform LAMP reaction. The LAMP reaction time was 90 minutes. The details of the LAMP reaction performed are as follows.
[0063]
Template DNA: HBV DNA cloned into pBR322 (SEQ ID NO: 1)
primer:
FIP: 5'-CCTACACAGACGCCGCAAAATAGCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3 '(SEQ ID NO: 2)
RIP: 5'-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTCCATACAACGGGCAAACAG-3 '(SEQ ID NO: 3)
F3: 5′-AAATTCGCAGTCCCCAACC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
R3: 5′-AGGTCCTTGTAGTTGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
[0064]
[Table 1]

*) The electrophoresis gel attached to the i-chip DNA kit manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd. was added so that the concentration became 1/2.
[0065]
3) Detection
The capillary chip after amplification was observed with an epifluorescence microscope (BX-FLA) manufactured by Olympus Optical Co., Ltd., using a filter for Hoechst33258 (Ex = 330-385 nm, Em = 420 nm). The portion where the fluorescence was observed was taken as a bright spot, and the number of bright spots in the capillary was visually counted. At this time, the size of the bright spot was not considered. In other words, it was counted as one whether the bright spot was large or small.
[0066]
2. Test results
1) Presence or absence of local amplification
FIG. 2 shows the result of taking a fluorescence photograph of the capillary after amplification. When the amount of template DNA was small (Fig. 2-A; 10 copies), local amplification occurred (the part surrounded by a yellow circle). In addition, when the amount of template DNA was slightly higher (FIG. 2-B; 20 copies), the number of bright spots was large. In case of containing a large amount of template DNA (Fig. 2-C; 10 ⁷ In the copy), the entire capillary emitted fluorescence. From this result, it was found that a pseudo minute space was formed in the capillary filled with the gel, and the LAMP reaction occurred in such a pseudo minute space.
2) Relationship between the number of bright spots and the number of initial template DNA
As a result of counting the number of bright spots over the entire capillary and plotting it against the initial number of templates, a straight line was obtained (FIG. 3). Therefore, it was confirmed that the number of initial template DNAs could be quantified by measuring the bright spot in the capillary.
This time, the initial number of template DNAs could only be quantified up to 20 molecules, but it was thought that more template DNA could be quantified if the capillary was made thinner and longer.
[0067]
【The invention's effect】
According to the present invention, a small amount of nucleic acid can be quantified simply and accurately while suppressing non-specific amplification.
[0068]
[Sequence Listing]

[0069]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 2-description of artificial sequence: primer
SEQ ID NO: 3-description of artificial sequence: primer
SEQ ID NO: 4-description of artificial sequence: primer
SEQ ID NO: 5-description of artificial sequence: primer
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing a chip-type capillary used in Example 1. FIG.
FIG. 2 is a photograph showing the results of LAMP reaction in a capillary ((A) Template DNA number, 10 copies; (B) Same, 20 copies; (C) Same, 10 ⁷ Copy) In the figure, the yellow circle indicates the part where amplification occurred. However, in (C), since the fluorescence occurs as a whole, the yellow circle is omitted.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the number of initial template DNAs and the number of bright spots.
FIG. 4 is a diagram showing an outline of a target nucleic acid quantification apparatus using a flow method. A is a top view of the apparatus, and B is a side view of the apparatus. C shows the concept of forming a pseudo minute space in the apparatus.
[Explanation of symbols]
1: Capillary
2: Micro discharge pump I
3: Micro discharge pump II
4: Fluorescence detection device
5: Rubber heater
6: Sample inlet I
7: Sample inlet II
8: Silicon tube I
9: Silicon tube II
10: Drain

Claims

The reaction solution containing the target nucleic acid is subjected to a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method in such a state that the target nucleic acid is present at 16 nM or less in the capillary. How to form.

The reaction solution containing the target nucleic acid is subjected to a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method in such a state that the target nucleic acid is present at 16 nM or less in the capillary. And the initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the amplification product in the microspace.

The method of claim 2 , comprising the following steps:
1) preparing a reaction solution containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase;
2) The reaction solution is introduced into a capillary, and a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method is performed in a state where the target nucleic acid is present at 16 nM or less;
3) The initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the bright spot of the obtained amplification product.

The method according to claim 2 or 3 , wherein the nucleic acid amplification reaction and detection of the amplification product are performed by the LAMP method while feeding the reaction solution at a constant rate.

The method of claim 4 , comprising the following steps:
1) preparing a reaction solution containing a target nucleic acid, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase;
2) The reaction solution is introduced into a capillary, and a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method is performed while feeding the reaction at a constant rate so that the target nucleic acid is present at 16 nM or less;
3) The initial amount of the target nucleic acid is quantified by detecting the bright spot of the obtained amplification product.

Sectional area 1 [mu] m ² ~ 1 mm ² of the capillary, a length 1 to 100 mm, The method according to any one of claims 1-5.

The method according to any one of claims 1 to 6 , further comprising adding a water-soluble polymer to the reaction solution.

The method according to claim 7 , wherein the water-soluble polymer is any one or more selected from the group consisting of polyacrylamide, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, and agarose.

An apparatus for nucleic acid quantification comprising:
Means for introducing a target nucleic acid of 16 nM or less, a nucleic acid detection reagent, a substrate nucleotide, a primer, and a DNA polymerase into the capillary;
Means for performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method in the capillary;
Means for measuring the amplification product obtained by the amplification reaction;
An integrated apparatus comprising: means for analyzing the obtained measurement result and quantifying the initial amount of the target nucleic acid.

The apparatus according to claim 9 , further comprising means for feeding the reaction solution at a constant speed.