JP4394570B2

JP4394570B2 - 抗癌活性を有するＨｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡワクチン

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Publication number: JP4394570B2
Application number: JP2004521272A
Authority: JP
Inventors: リ、ジョン・ユブ; キム、ドン−ヒョン; チュン、イオンソク; チャン、スン−ユン; リ、キュン−チュル; カン、チャン−イル
Original assignee: ビロメド・カンパニー・リミテッド
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2023-07-15
Also published as: US20060074038A1; US20100210714A1; US8445268B2; EP1539971A1; EP1539971A4; KR20040007252A; WO2004007734A1; CN1668750A; JP2005533103A; AU2003281001A1; KR100555211B1; EP1539971B1; HK1080894A1; CN100547075C

Description

本発明は、抗癌活性を有するヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトおよびそれを有効成分とする、癌の予防および治療のためのＤＮＡワクチンに関する。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕまたはｅｒｂＢ−２遺伝子は、成長因子受容体のＩ型群に属する膜貫通タンパク質である（Akiyama, T., et al., Science 232: 1644-1646, 1986）。前記遺伝子の増幅はそれからコーディングされる１８５ｋＤａ受容体のチロシンキナーゼの過発現を誘発する。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質は様々な形態のヒト腺癌、特に乳房癌や卵巣癌において増幅および過発現することが明らかにされている。前記過発現は、乳房癌患者の短期再発および低い生存率と関連性があり（Slamon, D. J., et al., Science 235: 177-182, 1987）、これは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過発現がヒトの癌発病において重要な役割を担うことを暗示する。また、いくつかの証拠が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の病因および臨床的浸透過程におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの直接的な役割を支持している（Kobayashi, H., et al., Cancer Res. 60: 5228-5236, 2000）。たとえば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の治療のために使用されているヒト化抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕモノクローナル抗体であるハーセプチン（Herceptin）は、相当進行した乳房癌患者において臨床的な治療効果を示すことが立証されている（Ewer, M. S. et al., Semin. Oncol. 26: 96, 1999）。さらに、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体およびＴ細胞が乳房癌および卵巣癌患者から検出されている。したがって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子はＨｅｒ−２／ｎｅｕの過発現に関連するヒトの癌に特異的な治療用ワクチンを開発するための優れた標的として使用され得る。

ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子は細胞内領域でチロシンキナーゼ活性を有し、その過発現自体が細胞の非正常な分裂を促進するため、チロシンキナーゼ活性を抑制するために細胞内キナーゼドメインに突然変異を導入するか、細胞外領域または細胞内ドメインを欠く、短縮された（truncated）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドを製作してＨｅｒ−２／ｎｅｕの発癌可能性を除去しようとする数多くの試みがあった（Wei, W. Z., et al., Int. J. Cancer 81: 748-754, 1999）。

裸のプラスミドは、癌関連抗原をコーディングする癌ワクチンの開発のための魅力的な候補ベクターである。これらの生産は割合に容易であり、かつその投与も安全である。これらはタンパク質でもなく、ウイルス性皮膜もないため、裸の核酸は一般的にワクチンの臨床的効果を阻害できる中和抗体反応を誘発しない。前臨床癌モデルにおいて、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Chen, Y., et al., Cancer Res. 58: 1965-1971, 1998）またはヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Pilon, S. A., et al., J. Immunol. 167: 3201-3206, 2001）遺伝子をコーディングするＤＮＡワクチンはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する腫瘍細胞に対する予防効果を誘導する。

このように多くの実験からＤＮＡワクチン接種によってＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する成功的な予防効果が報告されているが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドのみを用いて成功的な治療効果を収めた例はまだ報告されていない。これは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドの抗原性発現前は遅滞期（lag time）を伴うため抗腫瘍免疫原性が遅く現れる反面、哺乳動物腫瘍は相対的に速く成長するためである。したがって、一部のＨｅｒ−２／ｎｅｕ治療用ワクチン実験は、ＤＮＡとサイトカイン−分泌腫瘍細胞の組合せ（Chen, S. A., et al., Clin Cancer Res. 6: 4381-4388, 2000）または樹状細胞の利用（Chen, Y., Gene Ther. 8: 316-323, 2001）に基づいて行われている。

ＤＮＡワクチンは大量生産、安全性および便利性などを含めで多くの利点を有するため（Gurunathan, S. et al., Annu. Immunol. 18:927-974, 2001）、本発明者らは、癌の予防および治療のためのＤＮＡワクチンとして有用できる優れた抗癌活性を有するＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを開発するために努力した。

Akiyama, T.ら著、Science 232: 1644-1646, 1986年発行 Slamon, D. J. ら著、Science 235: 177-182, 1987年発行 Kobayashi, H. ら著、「Cancer Res.」60版、2000年発行、p5228-5236 Ewer, M. S.ら著、「Semin. Oncol.」26版、1999年発行、p96 Wei, W. Z.ら著、「Int. J. Cancer」81版、、1999年発行、p748-754 Chen, Y.ら著、「Cancer Res.」58版、1998年発行、p1965-1971 Pilon, S. A.ら著、「J. Immunol.」167版、2001年発行、p3201-3206 Chen, S. A.ら著、「Clin Cancer Res.」6版、2000年発行、p4381-4388 Chen, Y.ら著、「Gene Ther.」8版、2001年発行、p316-323 Gurunathan, S.ら著、「Annu. Immunol.」18版、2001年発行、p927-974

したがって、本発明の目的は、優れた抗癌活性を有するヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを提供することである。
本発明の他の目的は、前記プラスミドコンストラクトおよび薬剤学的に許容可能な担体を有効成分とする、癌の予防および／または治療用ＤＮＡワクチン組成物を提供することである。
本発明のまた他の目的は、有効量の前記ＤＮＡワクチンを投与する段階を含む、癌を予防および／または治療するための方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、短縮された（truncated）ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子をｐＴＶ２またはｐＣＫベクターに挿入して製造される、抗癌活性を有するＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを提供する。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まず、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ全長をコーディングするプラスミドは該プラスミドＤＮＡが導入された細胞の生理機能に悪影響を及ぼし得るため、本発明は細胞質キナーゼドメイン（細胞内ドメイン）が除去された、短縮Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子をコーディングするＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを提供する。この短縮ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子はＨｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通および細胞外ドメインを含む配列番号：２の塩基配列を有し、外来遺伝子を非常に高い効率で発現するｐＴＶ２ベクター（Lee, S. W. et. al., J. Virol. 72: 8430-8436, 1998）に挿入される。

本発明はまた、配列番号：２のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の膜貫通ドメインをさらに除去して配列番号：３の塩基配列を有する短縮ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子をコーディングするＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを提供するが、膜貫通領域の除去によってタンパク質が細胞外に分泌される。

さらに、本発明は、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の信号ペプチド配列がヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）Ｉ型ｇｐ１６０の効率的な発現と分泌を容易にすると知られているヘルペスシンプレックスＩ型糖タンパク質Ｄ信号（ｇＤ）配列に取り替えられたＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを提供する（Bermam, P. W. et al., J. Virol. 63: 3489-3498, 1989）。

本発明の好ましい実施態様においては、ｐＴＶ２ベクター由来の４つのＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクト（ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_ＥＣＤ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}およびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}）はＨｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通および細胞外ドメインをコーディングするか（ｐＮｅｕ_ＴＭおよびｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインのみをコーディングするように（ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}）製造される（図１のＡ参照）。ｐＮｅｕ_ＴＭまたはｐＮｅｕ_ＥＣＤが固有のＨｅｒ−２／ｎｅｕ信号ペプチド配列をコーディングする反面、ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}およびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の信号ペプチド配列はヘルペスシンプレックスウイルスＩ型の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の信号ペプチド配列に置換される。

固有の信号ペプチド配列をコーディングするｐＮｅｕ_ＴＭまたはｐＮｅｕ_ＥＣＤの注射は強いＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体反応を誘導する反面、ヘルペスシンプレックスウイルスＩ型糖タンパク質Ｄの信号配列をコーディングするｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}は弱いＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体反応を示す（図２および３参照）。しかし、すべてのｐＮｅｕコンストラクトは類似する水準の強いＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的なＣＴＬ反応を誘導する（図４参照）。これらのコンストラクトは、マウスにおいてＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体の量における実質的な差異が親縁性Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−発現腫瘍であるＨｅｒ２−ＣＴ２６に対する予防または治療的免疫原性に影響を及ぼすかどうかを評価するのに使用され得る。

本発明は、ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_ＥＣＤ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の筋肉内（i.m.）注射が少量のＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞に対して完璧な保護効果を誘導できることを示す（図５参照）。また、ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の予防的抗腫瘍効果は最大量の腫瘍細胞を皮下（s.c.）または静脈（i.v.）に注射した場合にも変わらない（図６参照）。この結果は、抗体反応を誘発しない強いＨｅｒ−２／ｎｅｕＣＴＬ反応が予防モデルにおいて強いＣＴＬおよび抗体反応の協同作用と同様に効果的であることを暗示する。しかし、治療モデルにおいて多量の腫瘍細胞を予め注射する場合、強いＣＴＬおよび抗体反応を示すマウス群のみで著しく向上した生存率を示す（図７参照）。

本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトはＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞質キナーゼドメイン（細胞内ドメイン）を欠く、短縮Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドを製作することによって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの発癌可能性を除去するという長所を有する。したがって、これは細胞内ドメイン中のチロシンキナーゼによって引起され得る正常な細胞の偶発転移と、悪性腫瘍に誘導する非正常な成長信号が伝達するリスクを除去する。さらに、本発明の短縮Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、ＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）ファミリーのメンバー間で高度に保存されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインに対する自己免疫原性の危険を避けることを可能にする。短縮Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをコーディングするプラスミドは少なくとも全Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをコーディングするプラスミドと同様に効果的であると報告されている（Chen, Y. et al., Cancer Res. 58: 1965-1971, 1998）。また、本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトはＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体反応および治療的抗腫瘍効果の両方を誘導する。

このような結果は、予防モデルまたは治療モデルにおいてのＤＮＡ免疫接種によるＣＴＬおよび抗体反応のＨｅｒ−２／ｎｅｕ−発現腫瘍に対する相対的な役割を立証する。ＤＮＡ免疫接種によって抗体反応なしでの強いＣＴＬ活性化はＨｅｒ−２／ｎｅｕ−発現腫瘍攻撃に対する十分な予防的効果をもたらすが、前記２つの免疫反応をともに最大化できるＤＮＡワクチンが治療モデルにおいて最も効果的である。

臨床において本発明のワクチンの効果を増大させるために、本発明はさらにｐＴＶ２の代わりに、より効率的なベクターであるｐＣＫベクターを用いて製造したＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを提供してＨｅｒ−２／ｎｅｕの発現水準を増加させる。

ｐＣＫベクターはｐＴＶ２に比べてさらに強力なＣＭＶプロモーターおよびより小さいサイズ（約３ｋｂ）を有するため、高濃度のｐＣＫプラスミドを用いて標的抗原を効率よく発現させ得る。

ｐＣＫプラスミドコンストラクトを製造するために、固有のＨｅｒ−２／ｎｅｕ信号ペプチド配列と強い抗腫瘍活性を有するｐＮｅｕ_ＴＭおよびｐＮｅｕ_ＥＣＤから得られた短縮Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ切片を各々ｐＣＫベクターに挿入する。

本発明の他の好ましい実施態様において、本発明はＨｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通および細胞外ドメイン（ｐＣＫ_ＴＭ）またはＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメイン（ｐＣＫ_ＥＣＤ）のみをコーディングするｐＣＫベクターに基づく２つのＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミド（ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤ）を提供する。

ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤを用いての免疫接種は強い抗体反応およびＣＴＬ反応を誘導する（図８および９参照）。ｐＣＫ_ＴＭまたはｐＣＫ_ＥＣＤの免疫接種によって誘導される免疫性の程度はｐＮｅｕコンストラクトから観察されたものと類似するか、またはそれより少し高かった。ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤの筋肉内接種は予め免疫接種されたモデルにおいて皮下腫瘍の成長および転移を完璧に抑制し、治療モデルにおいて腫瘍の成長を遮断する（図１０および１１参照）。

本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクト、ｐＮｅｕ_ＴＭ、ｐＮｅｕ_ＥＣＤ、ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤは、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２００２年６月２６日付で韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）（住所：〒１２０−０９１、大韓民国ソウル西大門区弘濟１洞ＹｕｒｉｍＢ／Ｄ３６１−２２１）に各々ＫＣＣＭ−１０３９３、ＫＣＣＭ−１０３９４、ＫＣＣＭ−１０３３９５およびＫＣＣＭ−１０３９６の寄託番号として寄託された。

ｐＣＫ_ＴＭ発現短縮されたＨｅｒ−２／ｎｅｕは体液性および細胞性免疫を誘発するにおいてより効果的であり、ｐＣＫ_ＴＭの治療的抗腫瘍活性はｐＣＫ_ＥＣＤより少し優れているため、サイトカイン遺伝子とともにｐＣＫ_ＴＭ免疫接種を施すことが好ましい。

したがって、本発明は、腫瘍患者においてＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する免疫耐性を克服するのに役立つ免疫増強剤（adjuvant）としてのサイトカインの使用を含む。

このような目的で、本発明は６つのサイトカイン；ＩＬ−１２（Alfonso, L. C. et al., Science 263: 235-237, 1994），ＩＬ−１５（Min, W. et al., Vaccine 20: 1466-1474, 2002），ＩＬ−１８（Hanlon, L. et al., J. Virol. 75: 8424-8433, 2001），Ｅｔａ−１，Ｆｌｔ３Ｌ（Mwangi, W. et al., J. Immunol. 169: 3837-3846, 2002）およびＧＭ−ＣＳＦ（Lee, A. H. et al., Vaccine 17: 473-479, 1999）を選択する。抗原−提示細胞（ＡＰＣ）の増殖および活性化を誘導するＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌは、ＡＰＣｓ類似樹状細胞への伝達効率を増加させ、体液性および細胞性免疫を含む免疫反応を促進することと期待される。ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１８およびＥｔａ−１は典型的なＴ_Ｈ１ skewingサイトカインであって、癌免疫に重要な細胞−媒介免疫反応を誘導することと期待される。

本発明は、各々のサイトカイン遺伝子をｐＣＫベクターに挿入して製造したｐＣＫ−ＩＬ１２，ｐＣＫ−ＩＬ１５，ｐＣＫ−ＩＬ１８，ｐＣＫ−Ｅｔａ１，ｐＣＫ−Ｆｌｔ３ＬおよびｐＣＫ−ＧＭＣＳＦコンストラクトを提供する。サイトカイン遺伝子免疫増強剤を組合せた効果は抗体生産およびＣＴＬ反応面においてはｐＣＫ_ＴＭから観察されたものと類似するが（図１２参照）、各々のｐＣＫ−サイトカイン、特にｐＣＫ−ＧＭＣＳＦとｐＣＫ_ＴＭの同時注射は予防および治療モデルにおいて抗腫瘍効果を増加させる（図１３および１４参照）。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡ免疫接種において、サイトカイン免疫増強剤活性を増加させるために、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質と各々のサイトカインが独立して翻訳されるバイシストロニック（bicistronic）プラスミドｐＣＫ_ＴＭ−ＧＭＣＳＦ，ｐＣＫ_ＴＭ−Ｆｌｔ３Ｌ，ｐＣＫ_ＴＭ−Ｅｔａ１，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１２，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１５，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８およびｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ２３を製作して提供する。本発明のバイシストロニックプラスミドの免疫接種はまた腫瘍成長および転移を抑制する（図１５および１６参照）。ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８を除いたバイシストロニックプラスミドの抗腫瘍活性は２つの個別的なプラスミドを同時に注射する場合と類似する。ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８の抗腫瘍活性はｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ−ＩＬ１８を同時に注射する場合よりも遥かに高い。

前記結果は、本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトが癌に対して予防的であるだけでなく、治療的なワクチンを提供することを示す。したがって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡワクチンは腫瘍手術後の転移を抑制する治療ワクチンとして、または遺伝的高危険性を有する人々に対する予防ワクチンとして有用である。

本発明はまた他の実施態様によって、癌を予防および治療するために用いられるＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチン組成物を提供する。

本発明のワクチン組成物は本発明のヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトおよび薬剤学的に許容可能な担体を含む。前記ワクチン組成物は、本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトによって誘導される抗原による感染に対して防御効果（予防ワクチンとして使用）を提供できる。また、本発明のワクチン組成物は、本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトによって誘導される抗原による感染の治療に使用され得る（治療ワクチンとして使用）。

本発明のヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトを有効成分として含有するワクチン組成物の製造は該当分野の当業者に公知である。このようなワクチンは一般的に注射可能な液体溶液または懸濁液状に製造されるか；注射前に液体に溶解または懸濁させるのに適当な固形の形態で製造され得る。前記助剤はエマルジョン化されるか、リポソーム中に封入されたタンパク質であり得る。活性免疫性成分は主に薬剤学的に許容可能であり、活性成分と融和し得る担体と混合される。「薬剤学的に許容可能な担体」とは、投与された患者においてアレルギー反応または副作用を誘発しない担体を意味する。適当な薬剤学的に許容可能な担体としては、たとえば、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、または同等物およびこれらの混合物である。さらに、必要に応じて、前記ワクチンは、ワクチンの効果を向上できる湿潤剤またはエマルジョン化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはアジュバントのような微量の補助成分を含み得る。効果的なアジュバントの例としては、これらに限定されないが、アルミニウムヒドロキシド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称す）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称す）、およびＲＩＢＩであるが、これは細菌から抽出された３つの成分であるモノホスホリル脂質Ａ、トレハロスジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が２％スクアレン／ツイーン８０エマルジョンに含まれているものである。アジュバントの他の例としては、ＤＤＡ（dimethyldioctadecylammonium bromide）、フロイント完全および不完全アジュバント（Freund’s completeおよびincomplete adjuvants）およびQuilAを含む。さらに、リンフォカイン（e.g., IFN-g, IL-2およびIL-12）のような免疫調節成分またはポリＩ：Ｃのような合成ＩＦＮ−ｇ誘導体がここに記述されたアジュバントとともに使用され得る。

本発明のワクチン組成物は注射によって、たとえば、皮下または筋肉内に注射されて非経口的に投与され得る。他の投与方式に適当な付加的な剤形として、座薬および、ある場合には、経口剤形またはエアロゾルとして分散に適当な剤形を含む。経口剤形の場合、アジュバントを用いたＴ−細胞亜集団の操作、抗原パッケージングまたは様々な剤形に対する個別的サイトカインの付加は最適化された免疫反応とともに経口ワクチンの効果を向上させる結果をもたらす。座薬のためには、典型的な結合剤および担体が含まれ得るが、たとえば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、このような座薬は０．５〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。経口剤形は通常用いられる賦形剤、たとえば、医薬的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉ステアリン酸マグネシウム、サッカリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび同等物を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放出性剤形または粉末剤の形態を取り得、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含み得る。

本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトは中性または塩の形態でワクチン組成物中に剤形化され得る。薬剤学的に許容可能な塩は酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基に形成）を含むが、これらは、たとえば、塩酸またはリン酸のような無機酸とともに形成されるか、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸およびその同等物のような有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基と形成された塩はまた無機塩基、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄水酸化物から、または有機塩基、たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインおよびその同等物から誘導され得る。

ワクチン組成物は投薬剤形に好適な方法で投与するか、予防および／または治療効果を示し得る程度の量で投与する。投与される量は抗体を生産し得る患者の免疫システムの能力を含む治療される患者および目的とする保護または治療の程度によって決定される。適当な投薬の範囲は約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で１回免疫接種当り約数百マイクログラムの有効成分である。初期投与および追加接種のための適切な構成はまた異なり得るが、初期投与に次いで連続的な接種または他の投与が伴われることが普通である。投与が要求される有効成分の正確な量は開業医の判断によって決定され、各患者によって特異的であり得る。本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトの治療学的有効量が、特に、投与スケジュール、投与された抗原の単位投与量によって決定され、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトが他の治療学的製剤とともに投与される場合は受容者の免疫状態および健康、および特定のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドコンストラクトの治療学的活性によって決定されるということは該当分野の当業者には自明な事実である。

前記組成物は単一投与スケジュール、または好ましくは重複投与スケジュールによって与えられ得る。重複投与スケジュールは免疫接種の初期過程が１〜１０回の個別的な投与量から成り得、次いで免疫反応の保持及び増強に要求される連続的な時間間隔、たとえば、１〜４ヶ月目に他の投与量が与えられ、必要に応じて、数ヶ月後に後続投与し得る。定期的な追加接種を１〜５年間隔で、普通は３年間隔で行うことが目的とする水準の保護免疫性を保持するために好ましい。

免疫接種方法は数年間免疫反応を刺激するために免疫増強剤を使用することを含むが、このような免疫増強剤は該当分野の当業者によく知られている。ある免疫増強剤は抗原の作用方式に影響を及ぼす。たとえば、免疫反応はタンパク質抗原が明礬（alum）によって沈澱する場合に増加する。また、抗原のエマルジョン化は抗原の作用期間を延長させる。

一実施態様において、免疫増強剤の効果はリン酸塩緩衝生理食塩水中の約０．０５〜０．１％溶液で使用される明礬のような製剤の使用によって達成される。また、抗原は約０．２５％溶液として使用される糖の合成重合体（Carbopol. R（商標））との混合物として製造される。免疫増強剤の効果はまた各々約７０〜１０１℃の温度範囲で３０秒〜２分間の熱処理によるワクチン中の抗原の凝集によって達成し得る。アルブミンにペプシン処理された抗体（Ｆａｂ）、C. parvumのような細菌細胞またはエンドトキシンまたはグラム−陰性細菌のリポ多糖成分の混合物、マンナイドモノ−オレエート（mannide mono-oleate, Aracel A）のような生理学的に許容可能なオイル賦形剤中のエマルジョンまたは遮断代替剤として用いられる２０％パーフルオロカーボン（Fluosol-DA. R^TM）溶液とのエマルジョンによる再活性化によって凝集が起こり得る。

様々な多糖免疫増強剤を使用し得る。たとえば、マウスの抗体反応において様々な肺炎球菌多糖免疫増強剤の使用が開示されている。最適の反応を誘導しながら抑制効果を示さない投与量は指針に従って使用する。脱アセチル化されたキチンを含むキチンおよびキトサンのような多糖質のポリアミン多様体が特に好ましい。

本発明に使用し得る他の免疫増強剤としてＢＣＧがある。ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin, Mycobacteriumの薬毒化菌株）およびＢＣＧ−細胞壁骨格（ＣＷＳ）は本発明において免疫増強剤として使用し得る。ＢＣＧはその免疫刺激特性のため重要な臨床的道具である。ＢＣＧは細網内皮系（reticulo-endothelial system）を刺激し、ナチュラルキラー細胞を活性化させ、造血幹細胞の増殖を増加させる。ＢＣＧの細胞壁抽出物は優れた免疫増強剤活性を有することが立証されている。本発明の典型的な実施態様において、牛型結核菌（Mycobacterium bovis）ＢＣＧ細胞は当分野に公知の方法に従って培養し、収穫する。牛型結核菌ＢＣＧの他に、非病原性細菌、たとえば、サルモネラ（Salmonella sp.）、シュードモナス（Pseudomans sp.）、大腸菌（Eschericia sp.）などのワクチンを本発明で使用し得る。

以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。

参照例１：細胞株と実験動物
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを発現するヒト乳房癌腫ＳＫ−ＢＲ３細胞株（ＡＴＣＣＨＴＢ−３０）とラットの結腸腺癌腫細胞株であるＣＴ２６（ＡＴＣＣＣＲＬ−２６３９）はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）から入手した。ヒト乳房癌細胞株ＳＫ−ＢＲ３細胞は１０％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS, GIBCO, Gaithersburg, MD）と１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Bio Whittaker, Walkersvile, MD）で培養した。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを発現する移入細胞Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞株はヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕをコードするｃＤＮＡ（NCBI:M11730）をＣＴ２６細胞に形質導入して製造した。Ｈｅｒ２−ＣＴ２６とＣＴ２６細胞は１０％熱不活性化ウシ胎児血清と１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＩＭＤＭ（BioWhittaker）培地で培養した。

５週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスはチャールズ・リバー社（大阪、日本）から購入して昼／夜１２時間の周期で２２℃、相対湿度５５％を保ちながら飼育し、飼料と水は自由に摂取させた。マウスは使用前までソウル大学（Korea）の実験動物センターで飼育し、全実験期間中無菌分離機（Techniplast, Buguggiate, Italy）で保持した。

参照例２：筋肉注射のためのＤＮＡプラスミドの分離
プラスミドｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_ＥＣＤ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}，ｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}，ｐＣＫ_ＴＭ，ｐＣＫ_ＥＣＤ，および対照群ベクターｐＴＶ２とｐＣＫで各々形質転換された大腸菌ＤＨ５α（Escherichia coli strain DH5α）をＬＢ液体培地（Difco, Detroit, MI）で培養した。培養した大腸菌形質転換体からエンドフリーキアゲンプラスミド−ギガキット（Endofree Qiagen Plamid-Giga Kits, Qiagen, Chatsworth, CA）を用いるアルカリ溶解方法によって、製造社の指針に従ってプラスミドＤＮＡを大量分離した。このように分離したＤＮＡを沈澱させた後、滅菌ＰＢＳ（Bio Whittaker）に２ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、免疫接種スケジュールに従って使用時まで−２０℃で保管した。

参照例３：フローサイトメトリー分析（Flow Cytometry, FACS）
血清がＨｅｒ−２／ｎｅｕ表面タンパク質に特異的に反応するかどうかを調査するために、ＳＫ−ＢＲ３、Ｈｅｒ２−ＣＴ２６およびＣＴ２６細胞をセルスクレーパー（cell scraper, Nunc, Naperville, IL）を用いて培養フラスコから遊離させ回収した。回収した細胞を２％ウシ胎児血清および０．１％アジ化ナトリウムを含有するＲＰＭＩ１６４０培地からなるＦＡＣＳ緩衝溶液で洗浄した。分析当り約２×１０^５個の細胞を血清または対照群抗体の連続希釈溶液とともに４℃で３０分間反応させた。培養した細胞をさらに同じＦＡＣＳ緩衝溶液で３回洗浄した後、マウスＩｇＧに特異的なＦＩＴＣ−接合ヤギモノクローナル抗体（Sigma）と４℃で３０分間反応させて染色した。染色された細胞を２回洗浄した後、同じＦＡＣＳ緩衝溶液に再懸濁した。死んだ細胞をデータから排除するために、細胞懸濁液に１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Sigma）を入れて分析前に３０秒間培養した。ヨウ化プロピジウム染色によって陰性と判定された細胞のみを分離し、さらに腫瘍細胞に対する結合分析に用いた。フローサイトメトリー分析はPAS IIIiフローサイトメトリー分析器（Partec GmbH, Munster, Germany）を用いて行った。

参照例４：抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体に対する共焦点走査顕微鏡（Confocal microscopy）分析
約１×１０^４個のＳＫ−ＢＲ３細胞を１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたＬａｂ−Ｔｅｋチャンバカバーガラス（Nunc, Napervile, IL）で３日間培養した。この細胞を４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ緩衝溶液で室温で１０分間処理して固定し、ＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、１％ヤギγ−グロブリンを含有するＤＭＥＭ培地で４℃で１時間遮断した。遮断溶液中で１：５０で希釈されたマウス血清を前記溶液に添加し、４℃で８時間培養した後、洗浄し、Ｒ−フィコエリスリン−接合ヤギ抗マウス免疫グロブリン２次抗体（Southern Biotech, Birmingham, AL）と室温で３０分間反応させた。スライドをゲル／マウント培地（Gel/Mount media, Fisher）に載せた後、共焦点走査顕微鏡（Leica TCS-SP laser scanning microscopy）で観察した。

参照例５：ＤＮＡ免疫接種方法
簡略に説明すれば、各々のマウスに滅菌ＰＢＳ１００μｌに溶解したプラスミドＤＮＡ１００μｇを前脛骨筋内に筋肉注射した。注射部位はブピバカイン−ＨＣｌ（bupivacaine-HCl, ASTRA, Westborough, MA）で予め処理した。治療用ワクチンに対する毎日の免疫化のために、ブピバカイン−ＨＣｌを一番目の免疫化の直前に１回のみ前処理した。血清は定められた時間に眼窩の後部の叢（retro-orbital plexus）から取って抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体が存在するかどうかを測定した。

参照例６：クロム−放出分析
免疫されたマウスから脾臓を切り出して得られた脾臓細胞をマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）処理されたＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞と６日間培養し、４時間^５１Ｃｒ−放出分析でＣＴ２６またはＨｅｒ２−ＣＴ２６標的細胞の溶解に対して分析した。

２×１０^６個のＨｅｒ２−ＣＴ２６またはＣＴ２６腫瘍標的細胞を２００μＣｉのＮａ^５１ＣｒＯ_４（NEN Research Products, Boston, MA）を含む生理食塩水２００μｌで３７℃で９０分間培養して^５１Ｃｒで標識した。残存の遊離^５１ＣｒはＲＰＭＩ１６４０培地で４回洗浄して除去した。丸底マイクロタイタープレート（round-bottom microtiter plate）のウェルで段階別に希釈したエフェクター細胞と^５１Ｃｒで標識された１０，０００個の標的細胞を１０％ウシ胎児血清を含有する２００μｌＲＰＭＩ１６４０培地で混合した。前記プレートを３７℃で４時間培養した。培養後、前記プレートを遠心分離し、各ウェルから１００μｌずつの培養薬を取ってγ‐シンチレーションカウンター（Packard, Minaxi Auto Gamma 5000 Series）で分析した。溶解率を下記反応式１によって計算した：
＜反応式１＞
特異的溶解率（％）＝100×［(cpm_実験群−cpm_{自然溶解群}）／（cpm_{最大溶解群}−cpm_{自然溶解群})］

ｃｐｍ_{最大溶解群}値は、^５１Ｃｒ−標識標的細胞を含むウェルに５％トリトン−Ｘ（Sigma）１０μｌを加えて決定した。各集団は二度繰返して試験した。この際、ｃｐｍ_{自然溶解群}値は脾臓細胞やトリトン−Ｘを加えず、同量の培地のみを加えて決定した。

参照例７：腫瘍攻撃
滅菌ＰＢＳに懸濁したＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞をわき腹に皮下注射するか、静脈注射してマウスを接種した。各腫瘍の３次元的サイズをカリパス（caliper）を用いて測定し、体積を下記反応式２によって計算した：
＜反応式２＞
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（幅×長さ×厚さ）ｍｍ^３×π／６

触診で腫瘍を発見するために一週間に２回ずつ動物を観察した。甚だしい痛み、呼吸困難または運動障害の症状を示すマウスは犠牲させた。

実施例１：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドの製作
ｐＴＶ２およびｐＴＶ２−ｇＤｓ（Lee, S. W. et al., J. Virol. 72:8430-8436, 1998）およびｐＣＫ（Lee Y., et. al., Biochem Biophys Res Commun. 272:230-235, 2000; Deposit Accession No: KCCM-10179）を発現ベクターとして使用した。ｐＴＶ２−ｇＤｓはヘルペスシンプレックスウイルスＩ型糖タンパク質Ｄの信号配列が発現ベクターｐＴＶ２にクローニングされた発現ベクターである。全ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子（配列番号：１）をコーディングするｃＤＮＡをｐＲＣ／ＣＭＶ骨格（Invitrogen, San Diego, CA）に挿入して全長のＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミド（９．６Ｋｂ）を製造した。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞内および膜貫通ドメインを含まず、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメインのみをコーディングするプラスミドｐＮｅｕ_ＥＣＤは、ＮＦ６（配列番号：４）およびＮＳＲ１（配列番号：５）のプライマー対を用いて全長のＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドのＰＣＲを行って得られ、これをｐＴＶ２のＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に挿入してクローニングした。同様に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外および膜貫通ドメインをコーディングするプラスミドｐＮｅｕ_ＴＭは、ＮＦ５（配列番号：６）およびＮＲＭ２（配列番号：７）のプライマー対を用いて全長のＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドのＰＣＲを行って得られ、これをｐＴＶ２のＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位にクローニングして製造した（図１）。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞内および膜貫通ドメインを含まず、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメインのみをコーディングするプラスミドｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}は、ＮＳＦ２（配列番号：８）およびＮＳＲ１（配列番号：５）のプライマー対を用いて全長のＨｅｒ−２／ｎｅｕのＰＣＲを行って得られ、これをｐＴＶ２−ｇＤｓのＡｓｃＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位にクローニングして製造した。これと同様に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外および膜貫通ドメインをコーディングするプラスミドｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}は、ＮＦ３（配列番号：９）およびＮＲＭ２（配列番号：７）のプライマー対を用いて全長のＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドのＰＣＲを行って得られ、これをｐＴＶ２−ｇＤｓのＡｓｃＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位にクローニングして製造した。前記プラスミドｐＣＫ_ＥＣＤおよびｐＣＫ_ＴＭは、ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_ＴＭから得られた短縮されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子切片を各々ｐＣＫベクターのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制限酵素部位に挿入して製造した。ＰＣＲは９４℃で２分；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒および６８℃で３．５分；および７２℃で７分間行った。

このようにして製造された４つのＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミド（ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_ＥＣＤ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}，およびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}）は、各々Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通および細胞外ドメインをコーディングするか（ｐＮｅｕ_ＴＭおよびｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインのみをコーディングする（ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}）（図１Ａ）。ｐＮｅｕ_ＴＭまたはｐＮｅｕ_ＥＣＤは固有のＨｅｒ−２／ｎｅｕ信号ペプチド配列をコーディングする反面、ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の信号ペプチド配列はヘルペスシンプレックスウイルスＩ型の糖タンパク質Ｄの信号ペプチド配列に取り替えられた。

実施例２：ｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種による抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の誘導
様々なｐＮｅｕプラスミドコンストラクトが抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体を誘導できるかどうかを次のような方法で実験した。

参照例１で製造した各々のマウスに予め計画された免疫接種スケジュールに従って参照例２で製造したプラスミドＤＮＡ１００μｇを３回筋肉注射した（図１Ｂ）。各群のうち一部のマウスは犠牲させ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬの溶菌機能を測定した。残りのマウスはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌細胞を投与して抗癌免疫程度を測定した。一次注射前と３次免疫接種一週間後マウスから血清を得、血清中に存在する抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の力価を乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３細胞と結合する程度をフローサイトメトリー（flow cytometry）で測定して計算した。ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}，ｐＮｅｕ_ＥＣＤまたはｐＮｅｕ_ＥＣＤ−_ｇＤｓで免疫接種されたすべてのマウスのＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な血清ＩｇＧの力価を測定し、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに結合力のない対照群抗体の場合と比較してＳＫ−ＢＲ３細胞に対する結合親和力の平均蛍光強度の移動が現れる血清の最大希釈倍数で示した。

前記表１に示したように、測定したＩｇＧの力価はｐＮｅｕ_ＥＣＤ＞ｐＮｅｕ_ＴＭ＞ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}＞ｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}＝ｐＴＶ２の順であった。予想の通り、プラスミドＤＮＡを接種する前のマウスから得られた血清は抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ結合活性を示さなかった。また、対照群ベクターであるｐＴＶ２を接種したマウスから得られた血清の場合にも１：５０の希釈倍率で抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体が検出されなかった。しかし、ｐＮｅｕ_ＴＭまたはｐＮｅｕ_ＥＣＤの免疫接種は高いＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＩｇＧ力価を示し（図２のＡ）、１：８００で希釈された血清試料は平均蛍光強度において幅広い移動を示した（図２のＢおよびＣ）。これとは対照的に、ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の免疫接種は非常に低いか、検出されない程度のＩｇＧ力価を示し、１：５０で希釈された血清試料は区分しにくいほどの非常に低い平均蛍光強度の移動のみを示した（図２のＤおよびＥ）。

プラスミドｐＣＫ_ＴＭまたはｐＣＫ_{ＥＣＤ−ｇＤＳ}で免疫接種されたマウスにおいてＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体の存在を共焦点走査顕微鏡で確認した。ｐＮｅｕ_ＴＭで免疫接種されたマウス血清（図３のＢ）はｐＴＶ２（図３のＡ）またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}（図３のＣ）で免疫接種されたマウス血清からは検出されない、ＳＫ−ＢＲ３細胞表面で抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の明確な位置を立証し、これは図２に示す抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体の力価と一致するものである。

実施例３：ｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種によるＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＣＴＬの誘導
ｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種によって免疫化されたマウスにおいてＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体反応の高さと低さ（図２）を立証するために、同じマウスで誘導されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＣＴＬ反応を次のような方法で評価した。

血清中のＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＩｇＧの力価を測定したマウスから３次免疫接種後２週間後に脾臓細胞を得た。脾臓細胞をマイトマイシンＣで処理したヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する同一種起源のラット移入細胞であるＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞と６日間一緒に培養した後、４時間^５１Ｃｒ−放出実験を通じてＣＴ２６またはＨｅｒ２−ＣＴ２６標的細胞の細胞溶解程度を測定した。

その結果、ｐＮｅｕ_ＴＭ（図４のＢ）、ｐＮｅｕ_ＥＣＤ（図４のＣ）、ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}（図４のＤ）またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}（図４のＥ）で免疫接種されたマウスから得られた脾臓細胞はｐＴＶ２（図４のＡ）で免疫接種された対照群マウスの脾臓細胞では示されないＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞のＣＴＬ依存的な溶解を示し、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＣＴＬ反応の相対的な強度はｐＮｅｕ_ＴＭ＞ｐＮｅｕ_ＥＣＤ＞ｐＮｅｕ_ＴＭ−_ｇＤｓ＞ｐＮｅｕ_ＥＣＤ−_ｇＤｓ＞ｐＴＶ２の順であった。ｐＮｅｕコンストラクトのいずれか一つで免疫化されたマウスから得た脾臓細胞によるＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な細胞溶解度は他のｐＮｅｕコンストラクトを接種した場合に相応し、エフェクター細胞：標的細胞（effector:target, E:T）の比率５０：１で８０〜９０％、１０：１で６０〜７０％のＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な細胞溶解度を示した（図３のＢ〜Ｅ）。しかし、いずれのマウス群の脾臓細胞でもＣＴ２６細胞のＣＴＬ−依存的な溶解は観察されなかった。

すなわち、すべてのＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現するプラスミドは強いＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＣＴＬ反応を誘導し、このような反応は信号ペプチド配列に関係なく現れた。しかし、これらは信号ペプチド配列によって実質的に異なるＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体反応を誘導した。専ら固有の信号ペプチド配列を有するｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_ＴＭのみが高いＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的なＩｇＧ力価を示した（図２）。これらの信号ペプチド配列をウイルス性信号配列に取り替えた結果、ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}は低い水準の抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体を、ｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}は非常に低い水準の抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体を形成した。

実施例４：Ｎｅｕコンストラクトの免疫接種による腫瘍成長の阻害
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを発現する同一種起源のマウス腫瘍細胞株であるＨｅｒ２−ＣＴ２６に対する抗癌免疫効果を下記のように測定した。

まず、マウスに皮下注射または静脈注射を通じて各々皮下腫瘍形成または肺転移が誘発される程度を決定するために、実験を通じて注射される最適の癌細胞数を決定し、その結果、５×１０^４個以上のＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞を皮下注射または静脈注射した場合、皮下癌または肺転移腫瘍が形成されることを示した。長い生存期間がＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡの抗腫瘍活性を区分するのに有利であるので、皮下注射または静脈注射によって注入される細胞の数を５×１０^４個と決定した。各マウスに予め設定された免疫接種スケジュールに従って３回にわたって１００μｇずつのプラスミドＤＮＡを筋肉注射し（図１Ｂ）、プラスミドＤＮＡの３次接種が終了してから１．５週間後、各マウスに５×１０^４個のＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞を皮下注射または静脈注射で投与した。

その結果、皮下腫瘍モデルにおいて対照群ベクターであるｐＴＶ２を接種したすべてのマウスにおいて明らかに腫瘍が形成された（図５のＡ）。反面、ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}，ｐＮｅｕ_ＥＣＤまたはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を接種した群のすべてのマウスでは癌細胞の皮下注射後にも６０日間癌の形成が完全に抑制された。癌転移モデルの場合、ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}，ｐＮｅｕ_ＥＣＤまたはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を接種した群のすべてのマウスは癌細胞静脈注射後生存していた（図５のＢ）。しかし、癌転移モデルにおいてｐＴＶ２のみを接種した７匹のマウスのうち５匹（５７％）が死滅し、ＰＢＳのみを接種したマウスの場合にはすべてのマウスが死滅した。

実施例５：Ｎｅｕ _ＥＣＤとｐＮｅｕ _{ＥＣＤ−ｇＤｓ} による抗癌免疫効果比較
実施例２〜４は、互いに異なるｐＮｅｕプラスミドで免疫化されたマウスにおいてＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体力価は相反する結果を示すが、ＣＴＬ反応は互いに類似することを立証した。また、ｐＮｅｕ_ＴＭ，ｐＮｅｕ_ＥＣＤ，ｐＮｅｕ_{ＴＭ−ｇＤｓ}，またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}で免疫化された各群のすべてのマウスは５×１０^４皮下注射腫瘍試験感染を克服した。皮下注射または静脈注射によってマウスに注入された腫瘍細胞の数が免疫化されたマウスにおいて腫瘍を誘導するにはあまりにも少なかったため、互いに異なるｐＮｅｕコンストラクトによって誘導された免疫反応における相異による抗腫瘍効果を区別することが難しかった。そこで、本実験では、Ｈｅｒ２−ＣＴ２６の抑制のためのＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体およびＣＴＬ反応の相対的な重要性を評価するために、一番目の腫瘍実験に使用された腫瘍細胞の数よりも皮下注射する腫瘍細胞の数を１００倍（５×１０^６個／マウス）増加させ、静脈注射する腫瘍細胞の数を４０倍（２×１０^６個／マウス）増加させた。静脈注射は静脈に投与された癌細胞数が過度な場合、血管閉鎖が起こるおそれがあるので、細胞の数を２×１０^６個以上は使用することができなかった。比較のため、４つの互いに異なるＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現プラスミドのうちＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体力価において最も大差を示すｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を選定した。マウスは同一な免疫接種スケジュール（図１ｂ）に従ってプラスミドＤＮＡ１００μｇを３回筋肉注射で接種し、プラスミドＤＮＡを３次注射してから１０日後、各マウスにＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞を５×１０^６個皮下注射するか、２×１０^６個静脈注射した。

皮下注射モデルにおいて、ｐＴＶ２を注射した８匹のすべてのマウスにおいて腫瘍が発生し、皮下注射による試験感染後１９日が経過する前に平均腫瘍体積が２０００ｍｍ^３以上となった（図６のＡ）。ｐＮｅｕ_ＥＣＤを接種した８匹のマウスの平均腫瘍体積は２３日目に８２．２ｍｍ^３であり、ｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を接種した８匹のマウスの場合には６７．９ｍｍ^３であった。ｐＮｅｕ_ＥＣＤ（p=2.9900e-8, the Student's-t test）またはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}（p=2.8400e-8, the Student's-t test）を接種したマウスにおいては腫瘍成長が顕著に抑制された反面、前記プラスミドで免疫化した２群の平均腫瘍体積の差異は統計的に有意性を示さなかった（p=0.8684, the Student's-t test）。癌転移モデルの場合、４０日までｐＮｅｕ_ＥＣＤを接種したマウスにおいては８匹のすべて（１００％）において、ｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を接種したマウスにおいては８匹のうち７匹（８８％）において肺転移が抑制された（図６のＢ）。ｐＴＶ２を免疫接種したすべてのマウスは肺転移を克服しなかった。すなわち、ｐＴＶ２に比べてｐＮｅｕ_ＥＣＤ（p<0.0001, MANTEL-HAENSZEL TEST）またはＰＮＥＵ<SUB>ＥＣＤ−ｇＤｓ（p<0.0001, MANTEL-HAENSZEL TEST）処理によって生存率が顕著に延長されたが、ＰＮＥＵ<SUB>ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}との間には有意義な差を示さなかった（p=03173, Mantel-Haenszel test）。

実施例６：治療モデルにおけるｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種の効果
予防モデル腫瘍実験を免疫化されたマウスに腫瘍細胞を試験感染させて行った。治療モデルにおいてｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の抗腫瘍効果を比較するために、マウスをまず腫瘍細胞で試験感染させた後、プラスミドＤＮＡを筋肉注射で投与した。６週齢のマウスに１×１０^５個または５×１０^５個のＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞を静脈注射した後、４群に分けた。腫瘍細胞を接種してから１時間後、各々のマウスにｐＮｅｕ_ＥＣＤまたはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ} １００μｇをまず筋肉注射し、同じプラスミドＤＮＡを４日間毎日筋肉注射で接種した。

図５および６に示す結果は、１×１０^５個の腫瘍細胞を接種した場合、ｐＮｅｕ_ＥＣＤまたはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を接種したすべてのマウスが肺転移を克服し、４０日間生存したことを示す（図７のＡ）。しかし、ｐＴＶ２のみを接種した８匹のマウスのうち５匹（６３％）とＰＢＳのみを接種したすべてのマウス（１００％）は肺転移で死滅した。ｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}がｐＴＶ２に比べて有意義な程度に生存率を増加させたが（p=0.0085, Mantel-Haenszel test）、ｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}との間には有意義な差がなかった。

反面、接種する腫瘍細胞の数を５倍増加させた場合（５×１０^５個）、ｐＮｅｕ_ＥＣＤを接種したマウスのみが、ｐＴＶ２を接種したマウスに比べて統計的に有意義な程度に生存率が増加した（p=0.0237, Mantel-Haenszel test、図７のＢ）。しかし、ｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}を接種したマウスはｐＴＶ２を接種したマウスに比べて有意義な程度に増加した生存率を示さなかった（p=0.4628,Mantel-Haenszel test）。それにも拘わらず、ｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}の抗腫瘍免疫性の間に有意義な差がないという事実は予防実験モデルの結果と一致した（p=0.4263, Mantel-Haenszel test）。

要約すれば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡワクチンの治療効果を予め接種した腫瘍細胞の数を変えて評価した。マウスを少量の転移性腫瘍細胞で処理した場合は、ｐＮｅｕ_ＥＣＤとｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤｓ}とも生存期間を顕著に延長させ、これらの抗腫瘍免疫性の間には有意義な差を示さなかった。しかし、多量の腫瘍細胞を使用した場合は、ｐＮｅｕ_ＥＣＤのみが生存率を向上させた。

実施例７：ｐＮｅｕコンストラクトおよびｐＣＫコンストラクトによって誘導される免疫反応の比較分析
ワクチンの臨床的効能を増強させるために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡプラスミドベクターをｐＴＶ２よりも強力なプロモーター活性を有するｐＣＫベクターをもって製作した。ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_ＴＭから得られた短縮Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ切片をｐＣＫベクターのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制限酵素部位に挿入した。これから、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外および膜貫通ドメインを発現するｐＣＫ_ＴＭおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメインを発現するｐＣＫ_ＥＣＤを製作した。

ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤの免疫原性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをｐＣＫ_ＴＭ，ｐＣＫ_ＥＣＤ，ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_ＴＭで免疫接種した後、各々のプラスミドＤＮＡを３次筋肉注射し、１０日後血清および脾臓を免疫化されたマウスから分離した。ＳＫ−ＢＲ３細胞を４００倍に希釈した血清とともに培養した後、ＦＩＴＣ−接合ヤギ抗−マウスＩｇＧと結合させた。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体反応の評価はフローサイトメトリー分析機を用いた終点滴定（end-point titration）によって行った。図８に示す結果は、ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤを用いたマウスの免疫接種がｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種と同様なＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的なＩｇＧ抗体反応を誘導することを示すものであって、非彩色および彩色ヒストグラムは各々対照群抗体および希釈された血清を示す。

また、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的なＣＴＬ活性を標準^５１Ｃｒ−放出分析によってＨｅｒ２−ＣＴ２６に対して分析した。ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤを用いたマウスの免疫接種もまた強いＣＴＬ反応を誘導した（図９）。ｐＣＫコンストラクトの免疫接種によって誘導されたＣＴＬ反応はｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種によって誘導されたＣＴＬ反応よりも少し高かった。

実施例８：ｐＣＫ _ＴＭおよびｐＣＫ _ＥＣＤの抗腫瘍活性
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのｐＣＫコンストラクトの抗腫瘍効果を決定するために、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに１００μｇのＰＢＳ，ｐＣＫ，ｐＣＫ_ＥＣＤまたはｐＣＫ_ＴＭを２週間隔で３回ずつ筋肉注射して免疫接種した。最終の免疫接種後前記マウスに１×１０^６Ｈｅｒ２−ＣＴ２６を皮下注射または静脈注射によって試験感染させた。Ｈｅｒ２−ＣＴ２６の皮下注射によって誘導された成長した固形腫瘍の３次元的サイズをカリパスを用いて測定した。生存したマウスの数を毎日数え、その結果を処理群当りの生存したマウスの百分率で示した。

Ｈｅｒ２−ＣＴ２６の皮下注射によって誘導された固形腫瘍の成長はｐＣＫ_ＴＭまたはｐＣＫ_ＥＣＤで免疫接種されたマウスにおいて完璧に抑制された（図１０のＡ）。肺転移モデルにおいて、ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤは生存期間を延長させたが、これは肺転移を強力に抑制したことを示す（図１０のＢ）。結論的に、Ｈｅｒ２−ＣＴ２６試験感染に対する防御的免疫性はまたｐＣＫ_ＴＭまたはｐＣＫ_ＥＣＤを用いた免疫接種によって獲得され得る。

ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤの治療効果を調査するために、２×１０^５Ｈｅｒ２−ＣＴ２６を静脈注射で試験感染してから１時間後マウスを１００μｇのＰＢＳ，ｐＣＫ，ｐＣＫ_ＥＣＤまたはｐＣＫ_ＴＭで筋肉内に免疫接種した。生存したマウスの数を毎日数え、その結果を処理群当りの生存したマウスの百分率で示した。ｐＣＫ_ＴＭまたはｐＣＫ_ＥＣＤの後接種（Post-vaccination）は転移性コロニーの成長に対する防御に効果的であり、肺転移による死亡を抑制すると確認された（図１１）。したがって、ｐＮｅｕコンストラクトの予防的抗腫瘍効果はｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤによって保持された。また、予め接種した腫瘍細胞に対する予防的免疫性を評価するための治療モデルにおいて、ｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ_ＥＣＤは生存率を相当延長させた。ｐＣＫ_ＴＭの治療学的抗腫瘍活性がｐＣＫ_ＥＣＤの活性よりも少し高かったため、ｐＣＫ_ＴＭをサイトカイン遺伝子と併用するＨｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡワクチンのためのモデルとして選抜した。

実施例９：ｐＣＫ _ＴＭおよび様々なサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導された免疫反応および抗腫瘍活性
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡ免疫接種において分子的免疫増強剤としてサイトカイン遺伝子を用いるために、６つのサイトカイン遺伝子を含むｐＣＫベクター、ｐＣＫ−ＧＭＣＳＦ，ｐＣＫ−ＩＬ１２，ｐＣＫ−ＩＬ１５，ｐＣＫ−ＩＬ１８，ｐＣＫ−Ｅｔａ１およびｐＣＫ−Ｆｌｔ３Ｌを下記のように製作した。抗原提示細胞の増殖および活性化を促進するＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌは、樹状細胞のような専門的な抗原提示細胞への伝達効率を向上させ、免疫反応を増加させることと期待される。ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１８およびＥｔａ−１は代表的なＴ_Ｈ１ skewingサイトカインであって、癌免疫性に非常に重要な細胞−媒介性免疫反応を誘導することと期待される。

Ｅｔａ−１（配列番号：１０），ＩＬ−１８（配列番号：１１），ＩＬ−１５（配列番号：１２）およびＦｌｔ３Ｌ（配列番号：１３）遺伝子は、特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（SUPERSCRIPT（商標）II RT, GIBCO BRL）によって製造社の指針に従ってＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から得られたｍＲＮＡから増幅させた（Ｅｔａ−１，配列番号：１４のＥＦ１および配列番号：１５のＥＲ１；ＩＬ−１８，配列番号：１６の１８Ｆ１および配列番号：１７の１８Ｒ１；ＩＬ−１５，配列番号：１８の１５Ｆ１および配列番号：１９の１５Ｒ１；およびＦｌｔ３Ｌ，配列番号：２０のＦＦ１および配列番号：２１のＦＲ１）。クローニングされたサイトカイン遺伝子をｐＣＫに挿入してｐＣＫ−Ｅｔａ１，ｐＣＫ−ＩＬ１８，ｐＣＫ−ＩＬ１５およびｐＣＫ−Ｆｌｔ３Ｌを製造した。ｐＣＫ−ＧＭＣＳＦおよびｐＣＫ−ＩＬ１２はｐＴＶ２−ＧＭＣＳＦ（Cho, J. H. et al., Vaccine 17: 1136-1144, 1999）およびｐＴＶ２−ＩＬ１２（Ha, S. J. et al., Nat. Biotechnol. 20: 381-386, 2002）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ切片の各々をｐＣＫベクターに挿入して製作した。

抗体生産およびＣＴＬ反応において免疫増強剤としてのサイトカイン遺伝子の効果を分析するために、マウスにｐＣＫ_ＴＭと各々のｐＣＫ−サイトカインを筋肉内に注射した（図１２Ａ）。最終の免疫接種をしてから３週間後、抗体滴定はＨｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体生産を決定するためのフローサイトメトリー分析およびＣＴＬ反応を測定するための^５１Ｃｒ−放出分析によって行った。

前記表２に示したように、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的な抗体は、サイトカインの存在有無に関らずｐＣＫ_ＴＭの免疫接種によって十分生産されたが、サイトカイン遺伝子プラスミドが併用投与された群の間には有意義な差がなかった（図１２Ｂ）。

表３は、図１２Ｂから観察されたＣＴＬ反応を要約して示したものである。表３に示したように、標的溶解の百分率はｐＣＫ_ＴＭとｐＣＫ−Ｅｔａ１またはｐＣＫ−Ｆｌｔ３Ｌの免疫接種によって少し増加したが、ｐＣＫ_ＴＭとｐＣＫ−ＩＬ１８またはｐＣＫ−ＧＭＣＳＦの免疫接種によっては少し減少した。標的細胞としてＣＴ２６を用いた非特異的細胞溶解はすべてのマウスから観察されなかった。

実施例１０：ｐＣＫ _ＴＭおよびサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される抗腫瘍活性
ｐＣＫ_ＴＭおよびサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される抗腫瘍活性を決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて予防および治療実験を行った。図１３Ａおよび１４Ａに示すように、ｐＣＫ_ＴＭと各々のサイトカインプラスミドで免疫接種する前と後にＢＡＬＢ／ｃマウスをＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞で試験感染させた。１００μｇのｐＣＫ_ＴＭおよび１００μｇの各々のｐＣＫ−サイトカインプラスミドをＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉注射によって併用投与した。前記マウスを２次免疫接種し、３週間後１×１０^６Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞で静脈注射または皮下注射によって試験感染させた。腫瘍成長は一週間に２回カリパスで測定し、体積は各マウスに対して測定した。

皮下腫瘍の成長は、ｐＣＫ_ＴＭおよびサイトカインプラスミド、特にｐＣＫ−ＧＭＣＳＦ，ｐＣＫ−Ｅｔａ１およびｐＣＫ−ＩＬ１５の同時−免疫接種によって抑制された（図１３Ｂ）。静脈注射によって試験感染したＨｅｒ２−ＣＴ２６の転移はｐＣＫ_ＴＭおよびｐＣＫ−ＧＭＣＳＦの同時−免疫接種によって抑制された（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。

２×１０^５Ｈｅｒ２−ＣＴ２６の静脈注射による試験感染後マウスを１００μｇのｐＣＫ_ＴＭおよび各々のｐＣＫ−サイトカインプラスミドで筋肉内に免疫接種した。生存したマウスの数を毎日数え、その結果を処理群当りの生存したマウスの百分率で示した。ｐＣＫ_ＴＭとｐＣＫ−Ｅｔａ１を除いたｐＣＫ−サイトカインプラスミドの同時−免疫接種はｐＣＫ_ＴＭのみを免疫接種した場合よりも増加した生存率を示した（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。

したがって、ｐＣＫ_ＴＭの予防的抗腫瘍活性は腫瘍成長モデルおよび転移モデルのすべてにおいてｐＣＫ−ＧＭＣＳＦのような特定なサイトカインプラスミドの併用投与によって促進されることが分かる。

実施例１１：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびサイトカインを発現するバイシストロニックプラスミドの製作
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＤＮＡ免疫接種の抗腫瘍活性を増加させるために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質および各々のサイトカインが独立して転写されるバイシストロニック（bicistronic）プラスミドｐＣＫ_ＴＭ−ＧＭＣＳＦ，ｐＣＫ_ＴＭ−Ｆｌｔ３Ｌ，ｐＣＫ_ＴＭ−Ｅｔａ１，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１２，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１５，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８およびｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ２３を製作した。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子およびサイトカイン遺伝子間の脳心筋炎ウイルス（encephalomyocarditis virus, EMCV）由来の内部リボソーム結合部位（internal ribosomal entry site, IRES）はＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質およびサイトカインの同時発現を可能にする（図１５Ａ）。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびサイトカインタンパク質を同時発現するバイシストロニックプラスミドを製造するために、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｆｌｔ３Ｌ，ＩＬ−１５，ＩＬ−１８およびＥｔａ−１遺伝子を実施例９に記載された特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した後、ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＲＥＳのＥＭＣＶＩＲＥＳの下流部位に挿入した。配列番号：２２の塩基配列を有するＥＭＣＶのＩＲＥＳはｐＣＫ−ＩＬ１２から由来するものである。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３（Belladonna, M. L., et al., J. Immunol. 168: 5448-5454, 2002）のためには、ＩＲＥＳを、ｐＣＫ−ＩＬ１２を鋳型とし、配列番号：２３のＩＲＥＳ−Ｆ１および配列番号：２４のＩＲＥＳ−Ｒ１プライマー対を用いたＰＣＲによって増幅し、増幅された産物をｐＣＫ_ＴＭのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入してｐＣＫ_ＴＭ−ＩＲＥＳを製作した。

実施例１２：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびサイトカインを発現するバイシストロニックプラスミドによって誘導される抗腫瘍効果
ｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドの予防的抗腫瘍活性を評価するために、マウスを７つのｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドの各々（ｐＣＫ_ＴＭ−ＧＭＣＳＦ，ｐＣＫ_ＴＭ−Ｆｌｔ３Ｌ，ｐＣＫ_ＴＭ−Ｅｔａ１，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１２，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１５，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８およびｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ２３）で図１５Ｂに示す免疫接種スケジュールに従って免疫化した。

ｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインコンストラクトの筋肉内接種はｐＣＫのみ接種された場合よりも皮下に移植された腫瘍の成長をより完全に抑制した（図１５Ｃ）。特に、ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８，ｐ0ＣＫ_ＴＭ−ＧＭＣＳＦ，ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１２およびｐＣＫ_ＴＭ−Ｆｌｔ３Ｌは腫瘍成長の抑制において顕著な効果を示した。腫瘍転移モデルにおいて、ｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８はマウスを肺転移から完璧に保護した（図１５Ｄ）。他のバイシストロニックプラスミドの抗−転移効果はｐＣＫ_ＴＭの場合と同様であった。予め注入されたＨｅｒ２−ＣＴ２６の転移に対する防御は図１４Ａに示すスケジュールに従って治療モデルにおいて分析された。ｐＣＫ_ＴＭ−ＧＭＣＳＦおよびｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８の免疫接種は生存率を延長させた（図１６のＡおよびＢ）。結論的に、ｐＣＫ_ＴＭ−ＧＭＣＳＦおよびｐＣＫ_ＴＭ−ＩＬ１８は予防および治療モデルにおいて腫瘍抑制効果を顕著に増加させると確認した。

各々組換えヒトｐＮｅｕプラスミドコンストラクトの製造過程およびそれを用いたマウスの免疫スケジュールを示す。ＥＣＤ：細胞外ドメインＴＭ：膜貫通ドメインＩＣＤ：細胞内ドメイン各々組換えヒトｐＮｅｕプラスミドコンストラクトの製造過程およびそれを用いたマウスの免疫スケジュールを示す。ＥＣＤ：細胞外ドメインＴＭ：膜貫通ドメインＩＣＤ：細胞内ドメインｐＴＶ２（Ａ），ｐＮｅｕ_ＴＭ（Ｂ），ｐＮｅｕ_ＥＣＤ（Ｃ），ｐＮｅｕ_ＴＭ−_ｇＤｓ（Ｄ）およびｐＮｅｕ_ＥＣＤ−_ｇＤｓ（Ｅ）で各々免疫接種された各マウス群における基質蛍光強度の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。非彩色ＦＡＣＳヒストグラム：対照群抗体彩色ＦＡＣＳヒストグラム：抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ｐＴＶ２（Ａ），ｐＮｅｕ_ＴＭ（Ｂ）およびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤＳ}（Ｃ）で各々免疫接種されたマウス血清における抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の共焦点走査顕微鏡分析を示す。ｐＴＶ２（Ａ），ｐＮｅｕ_ＴＭ（Ｂ），ｐＮｅｕ_ＥＣＤ（Ｃ），ｐＮｅｕ_ＴＭ−ｇＤｓ（Ｄ）およびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤＳ}（Ｅ）各々での免疫接種によって誘導された細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応に対する^５１Ｃｒ−放出分析を示す。ｐＮｅｕコンストラクトの免疫接種によって誘導された予防的抗腫瘍免疫原性を示す。Ａ：Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞を皮下注射した動物モデルにおける腫瘍サイズＢ：Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞を静脈注射した動物モデルにおける生存率ｐＮｅｕ_ＥＣＤおよびｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤＳ}での免疫接種によって誘導された予防的抗腫瘍免疫原性の比較を示す。Ａ：Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞を皮下注射した動物モデルにおける腫瘍サイズＢ：Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞を静脈注射した動物モデルにおける生存率ｐＮｅｕ_ＥＣＤまたはｐＮｅｕ_{ＥＣＤ−ｇＤＳ}での免疫接種によって誘導された治療効果を示す。Ａ：１×１０^５Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞Ｂ：５×１０^５Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞ＰＢＳ（Ａ），ｐＮｅｕ_ＥＣＤ（Ｂ），ｐＮｅｕ_ＴＭ（Ｃ），ｐＣＫ_ＥＣＤ（Ｄ）およびｐＣＫ_ＴＭ（Ｅ）によって各々免疫接種された各マウス群における基質蛍光強度の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。ＰＢＳ（Ａ），ｐＮｅｕ_ＥＣＤ（Ｂ），ｐＮｅｕ_ＴＭ（Ｃ），ｐＣＫ_ＥＣＤ（Ｄ）およびｐＣＫ_ＴＭ（Ｅ）各々での免疫接種によって誘導されたＣＴＬ反応を比較するための^５１Ｃｒ−放出分析を示す。ｐＣＫ_ＥＣＤおよびｐＣＫ_ＴＭでの免疫接種によって誘導された予防的抗腫瘍免疫原性を示す。Ａ：Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞を皮下注射した動物モデルにおける腫瘍サイズＢ：Ｈｅｒ２−ＣＴ２６細胞を静脈注射した動物モデルにおける生存率ｐＣＫ_ＥＣＤおよびｐＣＫ_ＴＭでの免疫接種によって誘導される治療効果；ｐＣＫ_ＴＭとサイトカインプラスミドの併用投与免疫接種スケジュールおよびそれらから誘導されたＣＴＬ反応を比較するための^５１Ｃｒ−放出分析を示す。ｐＣＫ_ＴＭとサイトカインプラスミドの併用投与免疫接種スケジュールおよびそれらから誘導されたＣＴＬ反応を比較するための^５１Ｃｒ−放出分析を示す。ｐＣＫ_ＴＭとサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される予防的抗癌活性であって、図１３Ａは免疫接種スケジュールを示す。ｐＣＫ_ＴＭとサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される予防的抗癌活性であって、図１３ＢはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞の皮下注射モデルにおける腫瘍サイズ（括弧は処理群当りの腫瘍が生じないマウスの百分率を意味する）を示す。ｐＣＫ_ＴＭとサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される予防的抗癌活性であって、図１３ＣはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞の静脈注射モデルにおける生存率（括弧は処理群当りの生存したマウスの百分率を意味する）を示す。ｐＣＫ_ＴＭとサイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される予防的抗癌活性であって、図１３ＤはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞の静脈注射モデルにおける生存率（括弧は処理群当りの生存したマウスの百分率を意味する）を示す。ｐＣＫ_ＴＭとｐＣＫ−サイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される治療効果であって、図１４Ａは免疫接種スケジュールを示す。ｐＣＫ_ＴＭとｐＣＫ−サイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される治療効果であって、図１４ＢはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞にｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドを静脈注射したモデルにおける生存率（括弧は処理群当りの生存したマウスの百分率を意味する）を示す。ｐＣＫ_ＴＭとｐＣＫ−サイトカインプラスミドの併用投与によって誘導される治療効果であって、図１４ＣはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞にｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドを静脈注射したモデルにおける生存率（括弧は処理群当りの生存したマウスの百分率を意味する）を示す。ｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドによって誘導される予防的抗腫瘍効果であって、図１５Ａはバイシストロニック（bicistronic）プラスミドの製造過程を示す。ｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドによって誘導される予防的抗腫瘍効果であって、図１５Ｂは免疫接種スケジュールを示す。ｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドによって誘導される予防的抗腫瘍効果であって、図１５ＣはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞の皮下注射モデルにおける腫瘍サイズ（括弧は処理群当りの腫瘍が生じないマウスの百分率を意味する）を示す。ｐＣＫ_ＴＭ−サイトカインプラスミドによって誘導される予防的抗腫瘍効果であって、図１５ＤはＨｅｒ２−ＣＴ２６細胞の静脈注射モデルにおける生存率（括弧は処理群当りの生存したマウスの百分率を意味する）を示す。バイシストロニックプラスミドによって誘導される癌治療効果を示す。

Claims

ｐＴＶ２またはｐＣＫベクターに、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の信号ペプチド、細胞外ドメイン、及び膜貫通ドメインからなるタンパク質をコーディングする配列番号：２の塩基配列により表されるＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子及び顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）遺伝子を、これら遺伝子の間に内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を挟んでバイシストロニックに挿入して製造されたＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドコンストラクトを含む癌治療剤。
前記Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドコンストラクトが、ｐＮｅｕ_ＴＭ（ＫＣＣＭ−１０３９３）またはｐＣＫ_ＴＭ（ＫＣＣＭ−１０３９６）ベクターにGM-CSF遺伝子を挿入して製造されたものであることを特徴とする請求項１記載の癌治療剤。
請求項１記載のプラスミドコンストラクトを有効成分とし、薬剤学的に許容可能な担体を含む、癌を治療するためのＤＮＡワクチン。