JP4384064B2

JP4384064B2 - Fluorescence detection device using intensity-modulated laser light

Info

Publication number: JP4384064B2
Application number: JP2005037399A
Authority: JP
Inventors: 憲明木村; 恭二土井; 孝佳弓井; 卓史吉田
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2005-02-15
Filing date: 2005-02-15
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2025-02-15
Also published as: JP2006226698A

Description

本発明は、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射するとともに、この照射による測定対象物から蛍光信号を受け、この信号について信号処理を行なう、強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に関する。特に、医療、生物分野で用いられるフローサイトメータ等のような細胞やＤＮＡやＲＮＡ等の測定対象物の識別を蛍光色素の発する蛍光を用いて行なって測定対象物の分析等を短時間に行なう分析装置に適用される蛍光検出装置に関する。 The present invention relates to a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light that irradiates a measurement object with intensity-modulated laser light, receives a fluorescence signal from the measurement object by the irradiation, and performs signal processing on the signal. In particular, cells such as flow cytometers used in the medical and biological fields, and measurement objects such as DNA and RNA are identified using fluorescence emitted from a fluorescent dye, and analysis of the measurement object is performed in a short time. The present invention relates to a fluorescence detection apparatus applied to an analysis apparatus.

医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を含む混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してフローセルを形成する。このフローセル中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定するものである。
このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においてはより多くの測定対象物を短時間に蛍光の情報から特定することが要求されている。 A flow cytometer used in the medical and biological fields incorporates a fluorescence detection device that receives fluorescence from a fluorescent dye of a measurement object by irradiating laser light and identifies the type of the measurement object. .
Specifically, a flow cytometer labels a turbid liquid containing biological materials such as cells, DNA, RNA, enzymes, proteins, etc. with a fluorescent reagent, and applies pressure to flow in a pipeline at a speed of about 10 m / sec. A measurement object is poured into the sheath liquid to form a flow cell. By irradiating the measurement object in the flow cell with laser light, the fluorescence emitted from the fluorescent dye attached to the measurement object is received, and the measurement object is specified by identifying this fluorescence as a label.
With this flow cytometer, for example, the intracellular relative amounts of intracellular DNA, RNA, enzymes, proteins, etc. can be measured, and their functions can be analyzed in a short time. In addition, a cell sorter or the like that identifies specific types of cells and chromosomes by fluorescence and selects and collects only the identified cells and chromosomes in a live state is used.
In the use of this, it is required to specify more measurement objects from the fluorescence information in a short time.

下記非特許文献１では、例えば４８８ｎｍ、５９５ｎｍ、６３３ｎｍ等の波長帯域の異なる複数のレーザ光を照射して、各レーザ光によって蛍光色素から発する波長帯域の異なる複数の蛍光をバンドパスフィルタを用いて分離して光電子倍増管（ＰＭＴ）で検出するフローサイトメータが開示されている。
これにより、複数の蛍光試薬（蛍光色素）からの蛍光を識別して複数の測定対象物の種類を同時に特定することが可能となるとされている。 In the following Non-Patent Document 1, for example, a plurality of laser beams having different wavelength bands such as 488 nm, 595 nm, and 633 nm are irradiated, and a plurality of fluorescences having different wavelength bands emitted from the fluorescent dye by each laser beam are used using a bandpass filter. A flow cytometer that is separated and detected by a photomultiplier tube (PMT) is disclosed.
Thereby, it is supposed that the fluorescence from a plurality of fluorescent reagents (fluorescent dyes) can be identified and the types of a plurality of measurement objects can be specified simultaneously.

http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Fluorochrome_Absorption.shtml（２００５年１月２３日検索）http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Fluorochrome_Absorption.shtml (searched January 23, 2005)

しかし、蛍光試薬から発する蛍光の波長帯域は略４００〜８００ｎｍ等と比較的帯域幅が広いものの、可視光波長帯域で３〜４程度の波長帯域の蛍光しか識別可能なラベルとして有効に用いることができない。複数の蛍光試薬を組み合わせて識別できる蛍光の数を増やそうとしても限界がある。
また、識別可能な蛍光の数を増やすために、蛍光の波長とともに、検出される蛍光の強度を用いて、識別可能な蛍光の数を増加させることもできる。しかし、この場合においても、蛍光の強度を用いたときの識別可能数は２〜５程度であり、上述した３〜４程度の波長帯域における識別可能数とともに組み合わせても、蛍光の識別可能数は、せいぜい２０程度である。
このため、このようなフローサイトメータを用いても、極めて多数の測定対象物について短時間に特定して分析を行なうことが難しい、といった問題があった。 However, although the wavelength band of the fluorescence emitted from the fluorescent reagent is relatively wide such as about 400 to 800 nm, it can be effectively used as a label that can identify only the fluorescence of the wavelength band of about 3 to 4 in the visible light wavelength band. Can not. There is a limit to increasing the number of fluorescent light that can be identified by combining a plurality of fluorescent reagents.
Further, in order to increase the number of identifiable fluorescence, the number of identifiable fluorescence can be increased by using the detected fluorescence intensity together with the fluorescence wavelength. However, even in this case, the discriminable number when using the fluorescence intensity is about 2 to 5, and even when combined with the discriminable number in the wavelength band of about 3 to 4 described above, the discriminable number of fluorescence is It is about 20 at most.
For this reason, even if such a flow cytometer is used, there is a problem that it is difficult to specify and analyze an extremely large number of measurement objects in a short time.

例えば、ＤＮＡ等の生体物質をフローサイトメータで分析する場合、この生体物質に予め蛍光試薬により蛍光色素が付着される。そして、この生体物質は、後述するマイクロビーズに付着された蛍光色素と異なる蛍光色素でラベル化され、表面にカルボキシル基等の特異な構造体の設けられた、直径５〜２０μｍのマイクロビーズを含む液体に混ぜられる。上記カルボキシル基等の構造体は、ある既知の構造の生体物質に作用して結合（カップリング）する。したがって、マイクロビーズからの蛍光と生体物質の蛍光とを同時に検出した場合、生体物質は、マイクロビーズの構造体と結合していることがわかる。これにより、生体物質の特性を分析することができる。しかし、多種多様なカップリング用の構造体を備える多種のマイクロビーズを用意して生体物質の特性を短時間に分析するには、極めて多種類の蛍光色素が必要となる。しかし、同時に識別可能な蛍光試薬の種類が少ないことから一度に多種類のマイクロビーズを用いて短時間に効率よく生体物質を測定することができない。 For example, when a biological material such as DNA is analyzed with a flow cytometer, a fluorescent dye is previously attached to the biological material with a fluorescent reagent. This biological material includes microbeads having a diameter of 5 to 20 μm, which are labeled with a fluorescent dye different from the fluorescent dye attached to the microbeads described later, and have a specific structure such as a carboxyl group on the surface. Mixed in liquid. The structure such as the carboxyl group acts on (couples) a biological material having a certain known structure. Therefore, when the fluorescence from the microbead and the fluorescence of the biological material are detected at the same time, it can be seen that the biological material is bound to the structure of the microbead. Thereby, the characteristic of a biological substance can be analyzed. However, in order to prepare a variety of microbeads having a wide variety of coupling structures and analyze the characteristics of biological materials in a short time, a very wide variety of fluorescent dyes are required. However, since there are few types of fluorescent reagents that can be identified at the same time, it is impossible to measure biological materials efficiently in a short time using many types of microbeads.

また、測定対象物に照射して蛍光を測定する測定点を管路の長手方向に複数設け、各測定点にて照射されるレーザ光が互いに干渉しないようにする方法も考えられる。しかし、この場合、レーザ光や受光部を測定点の数に応じて多数設ける必要がある。また、フローセルを形成する管路も長くなるので管路を流れるシース液の流路抵抗は大きくなり、シース液に与えるべき圧力も大きくなる。このため、装置が大型化するといった問題があった。 Further, a method of providing a plurality of measurement points for irradiating the measurement object and measuring fluorescence in the longitudinal direction of the pipe so that the laser beams irradiated at each measurement point do not interfere with each other is also conceivable. However, in this case, it is necessary to provide a large number of laser beams and light receiving units according to the number of measurement points. Moreover, since the pipe line forming the flow cell becomes long, the flow resistance of the sheath liquid flowing through the pipe line is increased, and the pressure to be applied to the sheath liquid is also increased. For this reason, there existed a problem that an apparatus enlarged.

そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物からの蛍光信号を受信して信号処理を行う際、この信号処理により多数のマイクロビーズ等から発する蛍光の種類を識別することができ、特に短時間で効率よく蛍光信号を識別する蛍光検出装置、例えば、フローサイトメータに好適に用いられる蛍光検出装置を提供することを目的とする。 Therefore, in order to solve the above problem, the present invention performs signal processing by receiving a fluorescence signal from a measurement object by irradiating the measurement object with laser light. An object of the present invention is to provide a fluorescence detection device that can identify the type of fluorescence emitted from beads and the like, and that particularly efficiently identifies a fluorescence signal in a short time, for example, a fluorescence detection device suitably used for a flow cytometer. .

上記目的を達成するために、本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う検出装置を提供する。
この蛍光検出装置は、測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、を有し、前記光源制御部は、１ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された符号化系列信号をパルス制御信号として用い、かつ前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオンの時間が、前記レーザ光の前記時間変調の１周期よりも長くなるように、前記レーザ光の出射のオン/オフを設定して制御し、前記処理部は、前記蛍光緩和時間を算出するとともに、前記受光部で出力された受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの蛍光を識別することを特徴とする。 In order to achieve the above object, the present invention provides a detection device that receives fluorescence emitted from a measurement object by irradiating the measurement object with laser light, and performs signal processing of the fluorescence signal obtained at this time.
The fluorescence detection apparatus includes a laser light source unit that emits a laser beam that irradiates a measurement target, a light receiving unit that outputs a fluorescence signal of fluorescence emitted from the measurement target irradiated with the laser beam, and a laser beam emitted from the laser light source unit. In order to time-modulate the intensity of the laser beam, a light source control unit that generates a modulation signal of a predetermined frequency, and a fluorescence signal output from the light-receiving unit by irradiating the measurement object with the time-modulated laser beam A processing unit that calculates a fluorescence relaxation time of the fluorescence of the measurement object using the modulation signal, and the light source control unit encodes a 1-bit signal value with a predetermined length and is orthogonal to each other An encoded sequence signal selected from a plurality of encoded sequence signals to be used as a pulse control signal, and the on-time of the emission of the laser beam from the laser light source unit is the time modulation of the laser beam. The laser light emission on / off is set and controlled so as to be longer than the period, and the processing unit calculates the fluorescence relaxation time, and from the light reception signal output from the light reception unit, Fluorescence from a measurement object is identified using an encoded sequence signal .

前記蛍光検出装置において、前記処理部は、前記蛍光信号の前記変調信号に対する位相遅れを求めることにより、前記蛍光緩和時間を算出することが好ましい。
また、前記複数の符号化系列信号は、１つの符号化系列信号をビット方向にシフトして構成されたものであり、このシフトによって符号化系列信号が互いに直交するように構成されていることが好ましい。 In the fluorescence detection device, it is preferable that the processing unit calculates the fluorescence relaxation time by obtaining a phase delay of the fluorescence signal with respect to the modulation signal.
The plurality of encoded sequence signals are configured by shifting one encoded sequence signal in the bit direction, and the encoded sequence signals are configured to be orthogonal to each other by this shift. preferable.

また、前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン／オフを、互いに直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、前記処理部は、前記受光部において複数のレーザ光からの光信号が重なって出力された蛍光信号から、レーザ光の出射に用いた符号化系列信号を用いて、各レーザ光の照射により測定対象物が発する蛍光の蛍光信号をそれぞれ分離することが好ましい。 The laser light source unit includes a plurality of laser light sources that emit a plurality of laser beams, and the light source control unit is configured to turn on / off the emission of the laser beams from the plurality of laser light sources orthogonal to each other. The processing unit controls the encoded sequence signal used for emission of the laser light from the fluorescence signal output by overlapping the optical signals from the plurality of laser beams in the light receiving unit. It is preferable to separate the fluorescence signals of the fluorescence emitted from the measurement object by irradiation with each laser beam.

また、前記測定対象物は、レーザ光の照射により蛍光を発する蛍光色素を備え、前記光源制御部は、前記符号化系列信号の前記ビット方向のシフト量と前記符号化系列信号の時間分解幅との積が、レーザ光で前記測定対象物が照射される時間より十分短くなるように設定して前記符号化系列信号を生成することが好ましい。 The measurement object includes a fluorescent dye that emits fluorescence when irradiated with laser light, and the light source control unit includes a shift amount in the bit direction of the encoded sequence signal and a time resolution width of the encoded sequence signal. Is preferably set to be sufficiently shorter than the time during which the measurement object is irradiated with laser light to generate the encoded sequence signal.

本発明は、マイクロビーズ等を測定対象物とし、この測定対象物に所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光の蛍光緩和時間を求める。この蛍光緩和時間は、蛍光色素の種類によって異なっているため、この蛍光緩和時間を用いて、蛍光の種類、さらには測定対象物の種類を識別することができる。すなわち、従来、蛍光の識別に用いられる蛍光の波長及び蛍光の強度のほかに、蛍光緩和時間を蛍光の識別のために用いることができるので、識別可能な蛍光の数は増大する。特に多数の蛍光色素を用いて短時間に測定対象物を効率良く特定するフローサイトメータにとっては有効である。
また、複数のレーザ光を用いる場合、レーザ光毎に互いに直交する符号化系列信号をレーザ光のパルス制御信号として用いることで、受光した蛍光信号がどのレーザ光の照射に拠るものかを特定することができる。これにより、短時間に測定対象物を効率良く特定することができる。 In the present invention, a microbead or the like is used as a measurement object, and the measurement object is irradiated with laser light whose intensity is modulated at a predetermined frequency, and the fluorescence relaxation time of fluorescence emitted at that time is obtained. Since this fluorescence relaxation time varies depending on the type of fluorescent dye, the type of fluorescence and further the type of measurement object can be identified using this fluorescence relaxation time. That is, conventionally, in addition to the fluorescence wavelength and fluorescence intensity used for fluorescence identification, the fluorescence relaxation time can be used for fluorescence identification, so the number of distinguishable fluorescence increases. This is particularly effective for a flow cytometer that efficiently specifies a measurement object in a short time using a large number of fluorescent dyes.
In addition, when using a plurality of laser beams, an encoded series signal orthogonal to each other is used as a pulse control signal for the laser beam, thereby identifying which laser beam the received fluorescence signal is based on. be able to. Thereby, a measuring object can be specified efficiently in a short time.

以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とするマイクロビーズ等の試料１２に照射し、試料１２中に設けられた蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果をから試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on a flow cytometer that suitably uses the fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light of the present invention.
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
The flow cytometer 10 irradiates a sample 12 such as a microbead to be measured with a laser beam, detects a fluorescent fluorescence signal emitted from a fluorescent dye provided in the sample 12, and performs signal processing on the signal processing device 20 And an analysis device (computer) 80 for analyzing the measurement object in the sample 12 from the processing result obtained by the signal processing device 20.

信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させるとともに、レーザ光の出射のオン／オフを制御する制御部、及び試料１２からの蛍光信号を識別する信号処理部を含んだ制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。 The signal processing device 20 includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, and a control unit that modulates the intensity of laser light from the laser light source unit 22 at a predetermined frequency and controls on / off of laser light emission. And a control / processing unit 28 including a signal processing unit for identifying a fluorescent signal from the sample 12, and a conduit 30 for forming the flow cell by flowing the sample 12 in a sheath liquid forming a high-speed flow. Have.
A recovery container 32 is provided at the outlet of the conduit 30. In the flow cytometer 10, a cell sorter for separating a biological material such as a specific cell in the sample 12 is arranged within a short time by irradiation with laser light, and is configured to be separated into separate collection containers. You can also.

レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ₁＝４０５ｎｍ、λ₂＝５３３ｎｍおよびλ₃＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点を形成する。 The laser light source unit 22 is a portion that emits three laser beams having different wavelengths, for example, laser beams having λ ₁ = 405 nm, λ ₂ = 533 nm, and λ ₃ = 650 nm. A lens system is provided so that the laser beam is focused at a predetermined position in the pipe line 30, and a measurement point of the sample 12 is formed at this focusing position.

図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、強度変調し、かつ符号化変調したレーザ光を出射する部分である。
レーザ光源部２２は、主に赤色のレーザ光Ｒを強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射するＲ光源２２ｒ、緑色のレーザ光Ｇを強度が一定のＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射するＧ光源２２ｇおよび青色のレーザ光Ｂを、強度が一定のＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射するＢ光源２２ｂと、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ₁、２３ａ₂と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのぞれぞれを駆動するレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂに分配するパワースプリッタ３５と、を有して構成される。 FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the configuration of the laser light source unit 22.
The laser light source unit 22 is a portion that has a wavelength in the visible light band of 350 nm to 800 nm, emits intensity-modulated, and code-modulated laser light.
The laser light source unit 22 mainly emits red laser light R as CW (continuous wave) laser light having a constant intensity, and emits the CW laser light intermittently while modulating the intensity of the CW laser light at a predetermined frequency. R light source 22r, green laser light G is emitted as CW laser light having a constant intensity, and G light source 22g and blue laser light are emitted intermittently while modulating the intensity of this CW laser light at a predetermined frequency. B is emitted as CW laser light having a constant intensity, and the intensity of the CW laser light is modulated at a predetermined frequency, and the B light source 22b that emits intermittently and the laser light in a specific wavelength band are transmitted. , dichroic mirrors 23a _1, 23a ₂ for reflecting the laser beam of the other wavelength bands, a lens system 23c for focusing the laser beam R, a laser beam consisting of G and B to the measurement point in the conduit 30, R A laser driver 34r, 34g and 34b for driving each of the source 22r, the G light source 22g and the B light source 22b, and a power splitter 35 for distributing the supplied signal to the laser drivers 34r, 34g and 34b. Configured.

これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
ダイクロイックミラー２３ａ₁は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ₂は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点の試料１２を照射する照射光となる。 For example, a semiconductor laser is used as a light source for emitting these laser beams.
The laser beam has an output of about 5 to 100 mW, for example. On the other hand, the frequency (modulation frequency) for modulating the intensity of the laser light is slightly longer than the fluorescence relaxation time, for example, 10 to 50 MHz.
The dichroic mirror 23a ₁ is a mirror that transmits the laser beam R and reflects the laser beam G, and the dichroic mirror 23a ₂ is a mirror that transmits the laser beams R and G and reflects the laser beam B.
With this configuration, the laser beams R, G, and B are combined to become irradiation light that irradiates the sample 12 at the measurement point.

レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、制御・処理部２８に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射の強度及び出射のオン／オフが制御されるように構成される。ここで、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの各々は、後述するように変調信号、パルス変調信号によって、所定の周波数で強度が変調され、かつ出射のオン／オフが制御される。 The laser drivers 34r, 34g, and 34b are connected to the control / processing unit 28 and configured to control the intensity of emission of the laser beams R, G, and B and the on / off of the emission. Here, as will be described later, the intensity of each of the laser beams R, G, and B is modulated at a predetermined frequency by a modulation signal and a pulse modulation signal, and emission on / off is controlled.

Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質やマイクロビーズ等の試料１２に付着されており、試料１２が測定対象物として管路３０を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
図３は、レーザ光の発振波長と、このレーザ光によって蛍光色素の発する蛍光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。例えば、Ｂ光源から出射する波長λ_１１のレーザ光の照射により、異なる３つの蛍光色素によって中心波長をλ_１２とする蛍光、中心波長をλ_１３とする蛍光、および中心波長をλ_１4とする蛍光の３種類の光を発する。同様に、Ｇ光源から出射する波長λ_２１のレーザ光の照射により２種類の蛍光（λ_２２，λ_２３）を発する。また、Ｂ光源から出射する波長λ_３１のレーザ光の照射により１種類の蛍光（λ_３２）を発する。 The R light source 22r, the G light source 22g, and the B light source 22b oscillate in a predetermined wavelength band so that the laser lights R, G, and B excite the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band. The fluorescent dye excited by the laser beams R, G, and B is attached to a sample 12 such as a biological material or microbead to be measured, and when the sample 12 passes through the conduit 30 as an object to be measured, the measurement point The laser beam R, G and B are irradiated to emit fluorescence at a specific wavelength.
FIG. 3 is a diagram schematically showing the oscillation wavelength of the laser beam and the spectral intensity distribution of the fluorescence emitted from the fluorescent dye by the laser beam. For example, by irradiation with a laser beam having a wavelength λ ₁₁ emitted from a B light source, fluorescence having a central wavelength λ ₁₂ , fluorescence having a central wavelength λ _13, and fluorescence having a central wavelength λ ₁₄ by three different fluorescent dyes The three types of light are emitted. Similarly, two types of fluorescence (λ ₂₂ , λ ₂₃ ) are emitted by irradiation with laser light having a wavelength λ ₂₁ emitted from the G light source. Further, one kind of fluorescence (λ ₃₂ ) is emitted by irradiation with laser light having a wavelength λ ₃₁ emitted from the B light source.

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。 The light receiving unit 24 is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe 30 interposed therebetween, and the sample 12 passes through the measurement point when the laser beam is scattered forward by the sample 12 passing through the measurement point. A photoelectric converter that outputs a detection signal to that effect. The signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control / processing unit 28, and is used as a trigger signal for notifying the timing at which the sample 12 passes the measurement point in the pipe 30.

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。 On the other hand, the light receiving unit 26 is arranged in a direction perpendicular to the emitting direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the pipe 30. And a photoelectric converter that receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
FIG. 4 is a schematic configuration diagram illustrating a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26.

図４に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２と、バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。 4 includes a lens system 26a that focuses a fluorescent signal from the sample 12, dichroic mirrors 26b ₁ and 26b ₂ , band pass filters 26c _{1 to} 26c _3, and a photoelectric converter such as a photomultiplier tube. 27a-27c.
The lens system 26a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c.
The dichroic mirrors 26b ₁ and 26b ₂ are mirrors that reflect fluorescence in a wavelength band within a predetermined range and transmit the other fluorescence. The reflection wavelength band and the transmission wavelength band of the dichroic mirrors 26b ₁ and 26b ₂ are set so as to be filtered by the band-pass filters 26c _{1 to} 26c ₃ and to capture fluorescence of a predetermined wavelength band by the photoelectric converters 27a to 27c. .

バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、図２に示す蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されており、例えばＢ光源から出射した波長λ_１１のレーザ光の照射によって発する波長λ_１３を中心とする一定の波長幅の帯域である。この場合、図３に示すようにＧ光源から出射した波長λ_２１のレーザ光の照射によって発する波長λ_２２を中心とする蛍光は波長λ_１３の近傍に中心波長を持つため、波長λ_１３を中心とする蛍光とともにバンドパスフィルタを透過する。しかし、波長λ_２１を中心波長とする蛍光と波長λ_１３を中心波長とする蛍光とは、後述する符号化系列信号（図７中のコード１〜３）で変調された信号情報を持った蛍光として光電変換器２７ａ〜２７ｃで受信されるので、この受光されて生成される蛍光信号から後述する信号処理を行うことにより、どのレーザ光により発する蛍光信号であるかを識別することができる。 The band-pass filters 26c _{1 to} 26c ₃ are filters that are provided in front of the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c and transmit only fluorescence in a predetermined wavelength band. The wavelength band of the transmitted fluorescence is set corresponding to the wavelength band of the fluorescence emitted by the fluorescent dye shown in FIG. 2, for example, centering on the wavelength λ ₁₃ emitted by the irradiation of the laser beam having the wavelength λ ₁₁ emitted from the B light source. Is a band of a certain wavelength width. Central this case, since the fluorescence centered at wavelength lambda ₂₂ that emits the irradiation of laser light having a wavelength lambda ₂₁ emitted from the G light source as shown in FIG. 3 having a center wavelength in the vicinity of the wavelength lambda _13, the wavelength lambda ₁₃ Is transmitted through the band pass filter together with the fluorescence. However, the fluorescence having the wavelength λ ₂₁ as the central wavelength and the fluorescence having the wavelength λ ₁₃ as the central wavelength are fluorescence having signal information modulated by an encoded sequence signal (codes 1 to 3 in FIG. 7) described later. Are received by the photoelectric converters 27a to 27c, and by performing signal processing to be described later from the received and generated fluorescence signals, it is possible to identify which laser beam emits the fluorescence signal.

光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は信号情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部２８に供給される。 The photoelectric converters 27a to 27c are sensors that include, for example, a sensor including a photomultiplier tube, and convert light received by the photoelectric surface into an electrical signal. Here, since the received fluorescence is received as an optical signal having signal information, the output electric signal is a fluorescence signal having signal information. The fluorescence signal is amplified by an amplifier and supplied to the control / processing unit 28.

制御・処理部２８は、図５に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のパワースプリッタ３５に供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。 As shown in FIG. 5, the control / processing unit 28 includes a signal generation unit 40, a signal processing unit 42, and a controller 44. The signal generation unit 40 and the controller 44 form a light source control unit that generates a modulation signal having a predetermined frequency.
The signal generator 40 is a part that generates a modulation signal for modulating (amplitude modulation) the intensity of the laser light at a predetermined frequency.
Specifically, the signal generation unit 40 includes an oscillator 46, a power splitter 48, and amplifiers 50 and 52, and supplies the generated modulation signal to the power splitter 35 of the laser light source unit 22, and the signal processing unit 42. It is a part to supply to. The reason why the modulation signal is supplied to the signal processing unit 42 is that it is used as a reference signal for detecting the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c, as will be described later. The modulation signal is a sine wave signal having a predetermined frequency and is set to a frequency in the range of 10 to 50 MHz.

信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射によりマイクロビーズが発する蛍光の位相遅れに関する情報を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ〜５４ｃと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ５６と、この変調信号を参照信号として増幅された蛍光信号と合成するＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃと、を有して構成される。 The signal processing unit 42 is a part that extracts information on the phase delay of the fluorescence emitted from the microbeads by the irradiation of the laser light, using the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c. The signal processing unit 42 amplifies the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c, and the modulated signal which is a sine wave signal supplied from the signal generation unit 40 to each of the amplified fluorescence signals. And a power splitter 56 that distributes the signal and IQ mixers 58a to 58c that combine the modulated signal with the fluorescence signal amplified using the modulated signal as a reference signal.

ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃは、光電変換器２７ａ〜２７ｃから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成する装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃのそれぞれは、図６に示すように、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。
コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂを符号化系列信号を用いてレーザ光の出射のオン／オフを制御し、さらに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。 The IQ mixers 58a to 58c are devices that synthesize the fluorescence signals supplied from the photoelectric converters 27a to 27c using the modulation signal supplied from the signal generation unit 40 as a reference signal. Specifically, as shown in FIG. 6, each of the IQ mixers 58a to 58c multiplies the reference signal by the fluorescence signal (RF signal) to calculate a processing signal including the cos component and the high frequency component of the fluorescence signal. At the same time, a signal obtained by shifting the phase of the reference signal by 90 degrees is multiplied by the fluorescence signal to calculate a processing signal including a sin component and a high frequency component of the fluorescence signal. The processing signal including the cos component and the processing signal including the sin component are supplied to the controller 44.
The controller 44 controls the signal generation unit 40 to generate a sine wave signal having a predetermined frequency, and causes the laser drivers 34r, 34g, and 34b of the laser light source unit 22 to emit laser light using the encoded series signal. This is a part that controls on / off and further obtains the cos component and the sin component of the fluorescence signal by removing the high frequency component from the processing signal including the cos component and the sin component of the fluorescence signal obtained by the signal processing unit 42. .

具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
より具体的には、システム制御器６０は、レーザ光の強度変調のために、発振器４６の発振周波数を定める。さらに、システム制御器６０は、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂにレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号を生成する。このパルス制御信号は、互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された１つの符号化系列信号によって作られたものである。この符号化系列信号は、１ビットの信号値で構成され、所定の符号長さのビット数で符号化されている。
以下、符号化系列信号について説明する。 Specifically, the controller 44 gives an instruction for controlling the operation of each part, and also manages a system controller 60 that manages all operations of the flow cytometer 10, a cos component calculated by the signal processing unit 42, sin A low-pass filter 62 that removes the high-frequency component from the processing signal in which the high-frequency component is added to the component, an amplifier 64 that amplifies the processing signal of the cos component and sin component from which the high-frequency component has been removed, and A that samples the amplified processing signal / D converter 66.
More specifically, the system controller 60 determines the oscillation frequency of the oscillator 46 for intensity modulation of the laser light. Further, the system controller 60 generates a pulse control signal for controlling on / off of laser light emission to the laser drivers 34r, 34g, and 34b. This pulse control signal is generated by one encoded sequence signal selected from a plurality of encoded sequence signals orthogonal to each other. This encoded sequence signal is composed of a 1-bit signal value and is encoded with the number of bits having a predetermined code length.
Hereinafter, the encoded sequence signal will be described.

コントローラ４４は、系列符号Ｃ＝｛ａ_０，ａ_１，ａ_２，………，ａ_Ｎ−１｝（Ｎは自然数で符号長さを表す）を用いて基準となる符号化系列信号を生成するとともに、さらにこの系列符号Ｃをｑ1ビット、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔ_ｑ１・ｃ（Ｔ_ｑ１は、ビット方向にｑ1ビット、ビットシフトする作用素である）を用いて符号化系列信号を生成する。ここで、系列符号Ｔ_ｑ１・Ｃは、{ａ_ｑ１，ａ_ｑ１＋１，ａ_ｑ１＋２，………，ａ_{ｑ１＋Ｎ−１}｝である。さらに、系列符号Ｃをｑ２ビット（例えば、ｑ２＝２×ｑ１）、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔ_ｑ２・Ｃを用いて符号化系列信号を生成する。
この符号化系列信号を生成するために用いられる系列符号Ｃ，Ｔ_ｑ１・Ｃ，Ｔ_ｑ２・Ｃは、互いに直交する特性を有するので、生成される符号化系列信号も互いに直交する。 The controller 44 generates a reference encoded sequence signal using a sequence code C = {a ₀ , a ₁ , a ₂ ,..., A _N−1 } (N is a natural number and represents a code length). In addition, a sequence code T _q1 · c (T _q1 is an operator that bit-shifts q1 bits in the bit direction) obtained by further shifting this sequence code C by q1 bits in the bit direction is used. Is generated. Here, the sequence code T _q1 · C is {a _q1 , a _{q1 + 1} , a _{q1 + 2} ,..., A _{q1 + N−1} }. Further, a coded sequence signal is generated using a sequence code T _q2 · C obtained by shifting the sequence code C by q2 bits (eg, q2 = 2 × q1) and bit-shifting in the bit direction.
Since the sequence codes C, T _q1 · C and T _q2 · C used to generate the encoded sequence signal have characteristics orthogonal to each other, the generated encoded sequence signals are also orthogonal to each other.

系列符号Ｃの一例として、下記に示すように、例えば係数ｈ_ｊと（ｊ＝１〜８の整数）および初期値ａ_ｋ（ｋは０〜７の整数）とを用いて符号化されるＰＮ系列（Pseudrandom Noise系列)が挙げられる。このＰＮ系列は、例えば下記式（１）により定義することができる。式（１）では次数を８次としている。ここで、Ｎは上記系列符号の符号長さであり、例えばＮ＝２５５（＝２⁸−１）ビットとされる。 As an example of the sequence code C, as shown below, for example, a PN encoded using a coefficient h _j and (j is an integer from 1 to 8) and an initial value a _k (k is an integer from 0 to 7). Series (Pseudrandom Noise series). This PN sequence can be defined by the following formula (1), for example. In equation (1), the order is 8th. Here, N is the code length of the above-described sequence code, for example, N = 255 (= 2 ⁸ −1) bits.

系列符号ＣがＰＮ系列符号である場合、符号長さがＮの巡回符号となるので、ａ_N＝ａ₀，ａ_N+1＝ａ₁，………となる。また、系列符号Ｃと同じ符号長さＮの別の系列符号をＣ’＝｛ｂ₀，ｂ₁，ｂ₂，………,ｂ_N-1｝}とし、上記作用素Ｔ_ｑを系列符号Ｃ’作用させた系列符号Ｔ_ｑ・Ｃ’＝｛ｂ_q，ｂ_q+1，ｂ_q+2，………,ｂ_q+N-1｝}として、系列符号ＣとＣ’との間の相互相関関数Ｒ_cc'(q)を下記式（２）のように定義する。ここで、Ｎ_Aは系列符号における項a_iと項b_q+iの（ｉは０以上Ｎ−１以下の整数）一致する数であり、Ｎ_Dは系列符号における項a_iと項b_q+iの不一致の数である。また、Ｎ_AとＮ_Dの和は符号長さＮとなる（Ｎ_A＋Ｎ_D＝Ｎ）。ここで、iとｑ＋iはｍｏｄ（Ｎ）で考える。 When the sequence code C is a PN sequence code, it is a cyclic code with a code length of N, so a _N = a ₀ , a _{N + 1} = a ₁ ,... Further, another sequence code having the same code length N as that of the sequence code C is C ′ = {b ₀ , b ₁ , b ₂ ,..., B _N−1} }, and the operator T _q is represented by the sequence code C. As an acted sequence code T _q · C ′ = {b _q , b _{q + 1} , b _{q + 2} ,..., B _{q + N−1}} }, the sequence code between C and C ′ The cross-correlation function R _{cc ′} (q) is defined as the following formula (2). Here, N _A is a number in which the term a _i and the term b _{q + i in} the sequence code coincide (i is an integer of 0 or more and N−1 or less), and N _D is the term a _i and the term b _q in the sequence code. _{+ i} is the number of mismatches. The sum of N _A and N _D is the code length N (N _A + N _D = N). Here, i and q + i are considered as mod (N).

上記ＰＮ系列において２つの系列符号を項毎にｍｏｄ（２）で加算した結果はもとのＰＮ系列を巡回シフトしたＰＮ系列になる性質があり、ＰＮ系列の値が０となる個数は値が１となる個数より１つだけ少ないので、Ｎ_A−Ｎ_D＝−１となる。これより、ＰＮ系列において下記式（３）および（４）に示す値を示す。 In the above PN sequence, the result of adding two sequence codes by mod (2) for each term has a property of becoming a PN sequence obtained by cyclically shifting the original PN sequence, and the number of PN sequence values of 0 has a value. Since it is one less than the number of 1s, N _A −N _D = −1. Thus, the values shown in the following formulas (3) and (4) in the PN sequence are shown.

上記式（３）よりビットシフト量が０、すなわちｑ＝０の場合、式（３）に示すようにＲ_ｃｃ’（ｑ）の値は１となり、自己相関性を有する。一方、ビットシフト量が０でない、すなわちｑ＞０の場合、式（４）に示すようにＲ_ｃｃ’（ｑ）は−（１／Ｎ）となる。ここで符号長さＮを大きくすることにより、Ｒ_ｃｃ’（ｑ）（ｑ＞０）の値は０に近づく。
すなわち、系列符号ＣとＣ’は自己相関性を持ち、かつ直交性を有するといえる。 From the above equation (3), when the bit shift amount is 0, that is, q = 0, the value of R _{cc ′} (q) is 1, as shown in equation (3), and has autocorrelation. On the other hand, when the bit shift amount is not 0, that is, q> 0, R _{cc ′} (q) is − (1 / N) as shown in Expression (4). Here, by increasing the code length N, the value of R _{cc ′} (q) (q> 0) approaches zero.
That is, it can be said that the sequence codes C and C ′ have autocorrelation and orthogonality.

このような自己相関性および直交性を有する系列符号を用いて、値が０と値１の２値からなる符号化系列信号を生成する。
図７（ａ）は、生成される符号化系列信号の一例を示している。コード１の符号化系列信号は、符号長さＮ＝２５５ビットの信号であり、符号長さＮと時間分解幅Δｔとの積は、図７（ａ）中の時刻０〜ｔ_３の時間となる。この信号において値が１のときレーザ光を出射し、値が０のときレーザ光を出射しないようにして断続的にレーザ光源の出射のオン／オフが制御される。 Using such a sequence code having autocorrelation and orthogonality, a coded sequence signal composed of binary values of 0 and 1 is generated.
Fig.7 (a) has shown an example of the encoding sequence signal produced | generated. The encoded sequence signal of code 1 is a signal having a code length N = 255 bits, and the product of the code length N and the time resolution width Δt is the time at time 0 to t ₃ in FIG. Become. In this signal, when the value is 1, the laser light is emitted, and when the value is 0, the laser light source is intermittently controlled on / off so as not to emit the laser light.

ここで、コード２の符号化系列信号の時刻０における信号は、コード１の時刻ｔ_１における信号に対応しており、コード２の時刻０以降の信号が、コード１の時刻ｔ_１以降の信号に対応して生成されている。同様に、コード３の符号化系列信号の時刻０における信号は、コード１の時刻ｔ_２(例えば、ｔ_２＝２×ｔ_１）における信号に対応しており、コード３の時刻０以降の信号が、コード１の時刻ｔ_２以降の信号に対応して生成されている。
光源制御部２８ａは、これらの信号を巡回的に繰り返し生成し、コード１はレーザドライバ３４ｒに、コード２はレーザドライバ３４ｇに、コード３はレーザドライバ３４ｂにパルス制御信号として供給されるように構成されている。 Here, the signal at time 0 of the encoded sequence signal of code 2 corresponds to the signal at time t ₁ of code 1, and the signal after time 0 of code 2 is the signal after time t _{1 of} code 1. It is generated corresponding to. Similarly, the signal at time 0 of the encoded sequence signal of code 3 corresponds to the signal at time t _{2 of} code 1 (for example, t ₂ = 2 × t ₁ ), and the signal after time 0 of code 3 Is generated corresponding to the signal after time t _{2 of the} code 1.
The light source controller 28a cyclically generates these signals, and the code 1 is supplied to the laser driver 34r, the code 2 is supplied to the laser driver 34g, and the code 3 is supplied as a pulse control signal to the laser driver 34b. Has been.

なお、本発明における符号化系列信号は上記ＰＮ系列の系列符号を用いて生成されるが、本発明における自己相関性および直交性を有する符号化系列信号の生成は、上記方法に限定されず、自己相関性および直交性を有する符号化系列信号を生成する限りにおいてどのような方法を用いてもよい。 Although the encoded sequence signal in the present invention is generated using the sequence code of the PN sequence, the generation of the encoded sequence signal having autocorrelation and orthogonality in the present invention is not limited to the above method. Any method may be used as long as an encoded sequence signal having autocorrelation and orthogonality is generated.

図７（ｂ）は、符号化系列信号によるパルス変調と、レーザ光の周波数による強度変調との関係を示している。パルス変調によりレーザ光がオン状態の場合、レーザ光は少なくともオン状態の時間に比べて短い周期で強度が振動するように変調されている。 FIG. 7B shows the relationship between pulse modulation by the encoded sequence signal and intensity modulation by the frequency of the laser beam. When the laser beam is in the on state by pulse modulation, the laser beam is modulated so that the intensity oscillates at a cycle shorter than at least the time in the on state.

コントローラ４４のシステム制御器６０は、図７（ａ）に示すような系列符号を用いて符号化系列信号を生成し、各レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂにレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号として供給する。 The system controller 60 of the controller 44 generates a coded sequence signal using a sequence code as shown in FIG. 7A, and controls on / off of laser light emission to each laser driver 34r, 34g, 34b. Supplied as a pulse control signal.

なお、コントローラ４４のＡ／Ｄ変換器６６におけるサンプリングは、後述するように符号化系列信号と蛍光信号との相関関数を効率良く演算するために、サンプリングの時間分解幅（サンプリング間隔）を、符号化系列信号の時間分解幅に揃えられるのが好ましい。例えば符号化系列信号の時間分解幅が０．５マイクロ秒であれば蛍光信号のサンプリングの時間分解幅も０．５マイクロ秒あるいはその整数分の１とするのが好ましい。 Note that the sampling in the A / D converter 66 of the controller 44 is performed by setting the sampling time resolution width (sampling interval) in order to efficiently calculate the correlation function between the encoded sequence signal and the fluorescent signal, as will be described later. It is preferable that the time-resolved widths of the digitized sequence signals are aligned. For example, if the time resolution width of the encoded sequence signal is 0.5 microseconds, it is preferable that the time resolution width of the sampling of the fluorescent signal is also 0.5 microseconds or an integer thereof.

分析装置８０は、蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求め、さらに、この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求めるとともに、受光部２６から出力された蛍光信号は、どのレーザ光の照射によるものかを、特定する部分である。分析装置８０は、本発明における蛍光緩和時間（蛍光緩和時定数）を算出する処理部を形成し、コンピュータにより構成される。 The analyzer 80 obtains the phase delay angle of the fluorescence with respect to the laser light, and further obtains the fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) from the phase delay angle, and the fluorescence signal output from the light receiving unit 26 indicates which laser light. This is a part for specifying whether the irradiation is caused by irradiation. The analyzer 80 forms a processing unit for calculating the fluorescence relaxation time (fluorescence relaxation time constant) in the present invention, and is configured by a computer.

蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号には、符号化系列信号の情報が含まれているので、分析装置８０では、この処理信号に対して、まず、符号化系列信号の自己相関性及び直交性を用いて、符号化識別変換を行い、各レーザ光毎の蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値を抽出する。このｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値を用いて蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求める。この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求め、蛍光色素を識別することにより、試料１２の種類を特定する。
さらに、上記符号化識別変換において用いられた符号化系列信号を知ることにより、蛍光信号がどのレーザ光の照射によるものかを、特定する。 Since the processing signal including the cos component and the sin component of the fluorescence signal includes information of the encoded sequence signal, the analysis apparatus 80 first performs autocorrelation of the encoded sequence signal with respect to this processed signal. Then, encoding discrimination conversion is performed using the orthogonality, and the values of the cos component and the sin component of the fluorescence signal for each laser beam are extracted. Using the values of the cos component and the sin component, the phase delay angle of the fluorescence with respect to the laser light is obtained. The type of the sample 12 is specified by obtaining the fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) from this phase delay angle and identifying the fluorescent dye.
Further, by knowing the coded sequence signal used in the coding discrimination conversion, it is specified which laser beam the fluorescent signal is caused by.

なお、求められた位相ずれ角度は、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数に依存しており、例えば１次緩和過程で表した場合、ｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分は、下記式（５），（６）で表される。 The obtained phase shift angle depends on the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted by the fluorescent dye. For example, when expressed in the first order relaxation process, the cos component and the sin component are expressed by the following formulas (5), ( 6).

ここで、θは位相ずれ角度であり、ωはレーザ光の変調周波数であり、τは蛍光緩和時定数である。蛍光緩和時定数τは、図８に示すように初期蛍光強度をＩ₀とすると、この時点から蛍光強度がＩ₀／ｅ（ｅは自然対数の底、ｅ≒２．７１８２８）となる時点までの時間をいう。

Here, θ is a phase shift angle, ω is a modulation frequency of laser light, and τ is a fluorescence relaxation time constant. As shown in FIG. 8, when the initial fluorescence intensity is I ₀ , the fluorescence relaxation time constant τ is from this point to the point where the fluorescence intensity becomes I ₀ / e (e is the base of natural logarithm, e≈2.771828). Of time.

蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の比ｔａｎ（θ）から位相ずれ角度θを求め、この位相ずれ角度θを用いて、上記式（５）、（６）から、蛍光緩和時定数τを求めることができる。
この蛍光緩和時定数τは、上述したように、蛍光色素の種類によって変わるものであり、また、２種類の蛍光色素の比率を変えて混合すると、比率に応じてみかけの蛍光緩和時定数τも変わる。このため、蛍光緩和時定数τを求めることで、２つの蛍光色素の比率を特定することができる。
このように、蛍光検出用マイクロビーズに、強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を検出することにより、発する蛍光の種類を識別することができ、これによりマイクロビーズ等の試料１２の種類を特定することができる。 The phase shift angle θ is obtained from the ratio tan (θ) of the cos component and the sin component of the fluorescence signal, and the fluorescence relaxation time constant τ is obtained from the above equations (5) and (6) using this phase shift angle θ. Can do.
As described above, the fluorescence relaxation time constant τ varies depending on the type of the fluorescent dye. When the ratio of the two types of fluorescent dye is changed and mixed, the apparent fluorescence relaxation time constant τ also varies depending on the ratio. change. For this reason, the ratio of two fluorescent dyes can be specified by obtaining the fluorescence relaxation time constant τ.
In this way, by irradiating the fluorescence detection microbead with the intensity-modulated laser light and detecting the fluorescence emitted at that time, the type of the emitted fluorescence can be identified. The type can be specified.

試料１２中の蛍光色素から発する蛍光の信号は、システム制御器６０で生成された既知の符号化系列信号に従って変調された（出射を制御した）レーザ光による蛍光信号である。このため、この蛍光信号もシステム制御器６０で生成された符号化系列信号に従って光強度が変調した信号となっている。したがって、システム制御器６０で生成された入力信号であるコード（符号化系列信号）と応答信号である蛍光信号とを同期させて相関関数を調べることにより、蛍光信号がどのコードによって変調されたレーザ光による蛍光信号を含んでいるかを知ることができる。すなわち、システム制御器６０で生成されたコードと蛍光信号との相関関数を演算し、蛍光信号と高い相関値を持つコードがある場合、蛍光信号は、このコード（符号化系列信号）によって変調されたレーザ光による蛍光信号として含んでいるといえる。一方、相関が極めて低いか、無相関を示すコードは、このコードによって変調されたレーザ光による蛍光信号として含んでいないといえる。したがって、レーザ光源毎に異なるコードで変調したレーザ光を出射させることで、受光した蛍光がどのレーザ光により発したものであるかを知ることができる。
分析装置８０は、入力信号であるコードと応答信号である蛍光信号との相関関数を、巡回するコードの周期にしたがって繰り返し平均化処理することにより、安定した値として求める。求めた値によって、受光した蛍光がどのレーザ光により蛍光したものであるかを特定する。また、各光電変換器２７ａ〜２７ｃが受光する光の波長帯域もわかっているので、蛍光の種類も特定することができる。
こうして、蛍光信号から、試料１２中の蛍光色素がどのレーザ光の照射によりどの波長帯域で放射した蛍光の信号を含んでいるかを識別し、特定することができる。 The fluorescence signal emitted from the fluorescent dye in the sample 12 is a fluorescence signal by a laser beam modulated (controlled for emission) in accordance with a known encoded sequence signal generated by the system controller 60. For this reason, this fluorescence signal is also a signal whose light intensity is modulated in accordance with the encoded sequence signal generated by the system controller 60. Therefore, the code in which the fluorescence signal is modulated by checking the correlation function by synchronizing the code (encoded sequence signal) that is the input signal generated by the system controller 60 and the fluorescence signal that is the response signal. It is possible to know whether or not a fluorescent signal by light is included. That is, when a correlation function between the code generated by the system controller 60 and the fluorescence signal is calculated and there is a code having a high correlation value with the fluorescence signal, the fluorescence signal is modulated by this code (encoded sequence signal). It can be said that it is included as a fluorescence signal by the laser beam. On the other hand, it can be said that a code having a very low correlation or non-correlation is not included as a fluorescence signal by a laser beam modulated by this code. Accordingly, by emitting laser light modulated with a different code for each laser light source, it is possible to know by which laser light the received fluorescence is emitted.
The analysis device 80 obtains a stable value by repeatedly averaging the correlation function between the code as the input signal and the fluorescence signal as the response signal according to the cycle of the circulating code. Based on the obtained value, it is specified by which laser beam the received fluorescence is emitted. Moreover, since the wavelength band of the light received by each of the photoelectric converters 27a to 27c is also known, the type of fluorescence can be specified.
In this way, it is possible to identify and specify from the fluorescent signal which fluorescent dye in the sample 12 contains the fluorescent signal emitted in which wavelength band by which laser light irradiation.

分析装置８０は、上述したように、蛍光色素の発する蛍光緩和時定数と、蛍光信号がどのレーザ光によるものかの情報とを用いて、マイクロビーズ等の試料１２に設けられた蛍光色素を特定して、管路３０を通過する試料１２の種類等を特定することができる。
マイクロビースの場合、マイクロビーズの蛍光色素に対応させて、例えば、所定のＤＮＡ断片を設けているので、蛍光色素を特定することで、マイクロビーズのＤＮＡ断片の種類を知ることができる。これにより、マイクロビースの蛍光とともに被検体のＤＮＡ断片に設けられた蛍光を同時に計測した場合、マイクロビーズの特定のＤＮＡ断片に被検体のＤＮＡ断片が作用して結合したものと判断する。このようにして、被検体のＤＮＡ断片がどのマイクロビーズに結合するかを分析することができる。
こうして、分析装置８０は試料１２中の生体物質の種類のヒストグラムや各種特性を短時間に求める。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。 As described above, the analyzer 80 identifies the fluorescent dye provided on the sample 12 such as microbeads using the fluorescence relaxation time constant emitted by the fluorescent dye and the information on which laser beam the fluorescent signal is from. Thus, the type of the sample 12 passing through the pipe line 30 can be specified.
In the case of microbeads, for example, since a predetermined DNA fragment is provided corresponding to the fluorescent dye of the microbead, the type of the DNA fragment of the microbead can be known by specifying the fluorescent dye. Thereby, when the fluorescence provided to the DNA fragment of the subject is measured together with the fluorescence of the microbead, it is determined that the DNA fragment of the subject acts and binds to the specific DNA fragment of the microbead. In this way, it is possible to analyze to which microbead the DNA fragment of the analyte binds.
In this way, the analyzer 80 obtains a histogram of the types of biological materials in the sample 12 and various characteristics in a short time.
The flow cytometer 10 is configured as described above.

このようなフローサイトメータ１０の信号処理装置２０は、まず、コントローラ４４からの指示により、所定の周波数の信号を発信器４６に発生させ、この信号がアンプ５０により増幅されて、レーザ光源部２２及び信号処理部４２に供給される。
この状態で、試料１２が管路３０を流れ、フローが形成される。フローは、例えば１００μｍの流路径に１〜１０ｍ／秒の流速を有する。また、試料１２としてマイクロビーズを用いる場合、マイクロビーズの球径は数μｍ〜３０μｍである。
測定点でレーザ光による照射が成されると、受光部２４で試料１２の通過を検出する検出信号がコントローラ４４にトリガ信号として出力される。
コントローラ４４では、この検出信号をトリガ信号とし、このトリガ信号に同期して、自己相関性を有し、かつ他の符号化系列信号と直交性を有する符号化系列信号を生成し、これを巡回的に繰り返し生成する。この符号化系列信号は、レーザ光源部２２からのレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号として用いるために、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂに供給される。
レーザ光源部２２では、このパルス制御信号に従って各レーザ光の出射のオン／オフが制御され、符号化系列信号によってパルス変調した信号情報を備えるレーザ光が生成される。このレーザ光は測定点を通過する試料１２中の蛍光色素を励起させるために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が発する。ここで発する蛍光は、受光部２６にて受光される。出射がオン状態のレーザ光は、所定の周波数で強度が変調している。
このようなレーザ光で照射されて発する蛍光色素からの蛍光は、位相遅れ角度を持って所定の周波数で強度変調するとともに、レーザ光のオン／オフに応じて、レーザ光に励起して発する蛍光もオン／オフの信号となっている。 The signal processing device 20 of the flow cytometer 10 first generates a signal of a predetermined frequency in the transmitter 46 according to an instruction from the controller 44, and the signal is amplified by the amplifier 50, and the laser light source unit 22. And supplied to the signal processing unit 42.
In this state, the sample 12 flows through the conduit 30 and a flow is formed. The flow has, for example, a flow rate of 1 to 10 m / sec over a channel diameter of 100 μm. When microbeads are used as the sample 12, the sphere diameter of the microbeads is several μm to 30 μm.
When the laser beam is irradiated at the measurement point, a detection signal for detecting the passage of the sample 12 by the light receiving unit 24 is output to the controller 44 as a trigger signal.
The controller 44 uses this detection signal as a trigger signal, generates an encoded sequence signal having autocorrelation and orthogonality with other encoded sequence signals in synchronization with the trigger signal, and cyclically generates the encoded sequence signal. Generate repeatedly. This encoded series signal is supplied to laser drivers 34r, 34g, and 34b for use as a pulse control signal for controlling on / off of laser light emission from the laser light source section 22.
The laser light source unit 22 controls on / off of emission of each laser beam according to the pulse control signal, and generates a laser beam including signal information pulse-modulated by the encoded sequence signal. This laser light is used to excite the fluorescent dye in the sample 12 passing through the measurement point, and the fluorescent dye is emitted by the irradiation of the laser light. The fluorescence emitted here is received by the light receiving unit 26. The intensity of the laser beam whose emission is on is modulated at a predetermined frequency.
The fluorescence emitted from the fluorescent dye emitted by the laser light is intensity-modulated at a predetermined frequency with a phase delay angle, and is emitted by being excited by the laser light according to the on / off state of the laser light. Is also an on / off signal.

このようにして、受光部２４による試料１２の通過の検出から変調されたレーザ光を照射するまでの時間は極めて短く、試料１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、所定の周波数で振幅変調しつつ、巡回的に繰り返す符号化系列信号によってオン／オフが制御されたレーザ光が試料１２に照射される。
ここで、レーザ光の変調周波数は、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
また、符号化系列信号は、約１μ秒の時間分解幅、例えば１μ秒の時間分解幅で生成される場合、符号長さＮが７ビットの符号化変調信号とすると、７μ秒(＝１．０×７)を１周期として符号化系列信号が繰り返し巡回して生成される。この繰り返し生成される符号化系列信号に基づいてレーザ光が変調される。したがって、試料１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、レーザ光は、７μ秒を１周期とする符号化系列信号が数回〜数１０回巡回される。 In this way, the time from the detection of the passage of the sample 12 by the light receiving unit 24 to the irradiation of the modulated laser light is extremely short, and it is predetermined within a few μ to several tens of μsec when the sample 12 passes the measurement point. The sample 12 is irradiated with laser light that is on / off controlled by a cyclically encoded sequence signal that is amplitude-modulated at a frequency of.
Here, the modulation frequency of the laser light is, for example, 10 to 50 MHz.
In addition, when the encoded sequence signal is generated with a time resolution width of about 1 μsec, for example, a time resolution width of 1 μsec, assuming that the encoded modulation signal has a code length N of 7 bits, 7 μsec (= 1. An encoded sequence signal is generated by cyclically repeating 0 × 7) as one period. The laser beam is modulated based on the repetitively generated encoded sequence signal. Therefore, during several μ to several tens of microseconds when the sample 12 passes through the measurement point, the encoded series signal having one cycle of 7 μsec is circulated several times to several tens of times.

受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで受光されて出力される蛍光信号は、アンプ５４ａ〜５４ｃで増幅され、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃにより、信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号と合成される。
ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃでは、正弦波信号である変調信号（参照信号）と蛍光信号を乗算した合成信号が生成されるとともに、正弦波信号である変調信号（参照信号）に対して位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号を乗算して合成した信号が生成される。
次に、生成された２つの合成信号は、コントローラ４４のローパスフィルタ６２に送られ、高周波成分が除去されて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号が取り出される。
この蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号は増幅され、Ａ／Ｄ変換され、分析装置８０に送られる。Ａ／Ｄ変換は、受光部２４からのトリガ信号のタイミングで同期が取られ、符号化系列信号の時間分解幅Δｔと同じ時間分解幅で、蛍光信号のサンプリングが行われる。サンプリングは例えば１６ビットのサンプリング（０〜±３２７６７の階調のサンプリング）である。なお、蛍光信号は、符号化系列信号によってパルス変調されたレーザ光によって発するものであるため、この蛍光信号から得られるサンプリングされたデータは、符号化系列信号の情報が含まれている。 The fluorescence signals received and output by the photoelectric converters 27a to 27c of the light receiving unit 26 are amplified by the amplifiers 54a to 54c and modulated as sine wave signals supplied from the signal generation unit 40 by the IQ mixers 58a to 58c. Synthesized with the signal.
The IQ mixers 58a to 58c generate a composite signal obtained by multiplying the modulation signal (reference signal) that is a sine wave signal and the fluorescence signal, and have a phase of 90 degrees with respect to the modulation signal (reference signal) that is a sine wave signal. A signal synthesized by multiplying the shifted signal and the fluorescence signal is generated.
Next, the two synthesized signals generated are sent to the low-pass filter 62 of the controller 44, the high frequency components are removed, and the cos component and sin component signals of the fluorescence signal are extracted.
The cos component and sin component signal of this fluorescence signal are amplified, A / D converted, and sent to the analyzer 80. The A / D conversion is synchronized at the timing of the trigger signal from the light receiving unit 24, and the fluorescence signal is sampled with the same time resolution width as the time resolution width Δt of the encoded sequence signal. The sampling is, for example, 16-bit sampling (sampling with a gradation of 0 to ± 32767). Since the fluorescence signal is emitted by laser light that is pulse-modulated by the encoded sequence signal, the sampled data obtained from the fluorescence signal includes information on the encoded sequence signal.

例えば、ｉ番目（ｉ＝１〜３の自然数）のレーザ光源部２２から出射される時間変調したレーザ光の強度振幅Ａ_i（ｔ）を下記式（７）のように定め（ｐ_i（ｔ）はＰＮ符号化変調信号による時間変調成分、ωは変調周波数）、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃに供給される参照信号（変調信号）Ａ_０（ｔ）を下記式（８）で定める。このとき、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃで用いられる、正弦波信号である変調信号（参照信号）に対して位相を９０度シフトさせた信号Ａ_９０（ｔ）は下記式（９）のように定まる。一方、蛍光信号の振幅を下記式（１０）で定めると、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃで合成されて得られる合成信号は下記式（１１）のように表される。この２つの合成信号のうち高次成分はローパスフィルタ６２を用いて除去され、この後、Ａ／Ｄ変換されデジタル信号が生成される。 For example, the intensity amplitude A _i (t) of the time-modulated laser light emitted from the i-th (i = 1 to 3 natural number) laser light source unit 22 is defined as in the following equation (7) (p _i (t ) Is a time modulation component based on a PN encoded modulation signal, ω is a modulation frequency), and a reference signal (modulation signal) A ₀ (t) supplied to the IQ mixers 58a to 58c is defined by the following equation (8). At this time, a signal A ₉₀ (t) whose phase is shifted by 90 degrees with respect to the modulation signal (reference signal), which is a sine wave signal, used in the IQ mixers 58a to 58c is determined as the following equation (9). On the other hand, when the amplitude of the fluorescence signal is defined by the following formula (10), the synthesized signal obtained by synthesizing by the IQ mixers 58a to 58c is represented by the following formula (11). Higher order components of these two synthesized signals are removed using the low-pass filter 62, and then A / D converted to generate a digital signal.

レーザ光の時間変調に用いた符号化系列信号は自己相関性を有し、他の符号化系列信号に対して直交性を有するので、符号化系列信号とＡ／Ｄ変換されたデジタル信号との間の相関関数を算出することで、レーザ光毎に上記デジタル信号を分解する符号化識別変換が行われる。すなわち、符号化識別変換により、式（１１）における１／２・ｒ_i・ｃｏｓ（θ_i）及び１／２・ｒ_i・ｓｉｎ（θ_i）が得られる。ここでθ_iは、ｉ番目のレーザ光源部２２から出射されるレーザ光により発する蛍光の、レーザ光に対する位相遅れ角度を表す。したがって、１／２・ｒ_i・ｃｏｓ（θ_i）及び１／２・ｒ_i・ｓｉｎ（θ_i）の値を用いてｔａｎ(θ_i)を求めることができる。このｔａｎ(θ_i)の値と上述した式（１）及び（２）とを用いて、蛍光緩和時定数τが求められる。 The encoded sequence signal used for the time modulation of the laser light has autocorrelation and orthogonality to other encoded sequence signals, so that the encoded sequence signal and the A / D converted digital signal By calculating the correlation function between them, coding discrimination conversion for decomposing the digital signal is performed for each laser beam. In other words, ½ · r _i · cos (θ _i ) and ½ · r _i · sin (θ _i ) in Equation (11) are obtained by the coding discrimination conversion. Here, θ _i represents the phase delay angle of the fluorescence emitted by the laser beam emitted from the i-th laser light source unit 22 with respect to the laser beam. Therefore, tan (θ _i ) can be obtained by using the values of ½ · r _i · cos (θ _i ) and ½ · r _i · sin (θ _i ). The fluorescence relaxation time constant τ is obtained using the value of tan (θ _i ) and the above-described equations (1) and (2).

この蛍光緩和時定数τは、蛍光色素によって異なるので、マイクロビーズ等の試料１２の種類が異なる（試料１２に付着している生体物質の種類が異なる）ものには異なる種類の蛍光色素を用いることで、蛍光色素の種類を特定することができる。これにより、試料１２の種類を特定することができる。したがって、試料１２の発する蛍光から、試料１２の種類を特定する。これとともに、所定の蛍光色素を設けた生体物質の発する蛍光を検出する場合、生体物質がどの種類の試料１２に設けられた構造体に結合するか否かを特定することができ、さらに分析することができる。
特に、異なる２種類の蛍光色素を異なる比率で混合すると、この比率に応じてみかけの蛍光緩和時定数τも変化する。このため、混合する比率を変えることで極めて多数の蛍光緩和時定数を設定することができる。したがって、マイクロビーズの種類毎に異なる蛍光緩和時定数を有する蛍光色素を用いることで、発する蛍光が識別可能なマイクロビーズの種類を多数設定することができる。 Since this fluorescence relaxation time constant τ differs depending on the fluorescent dye, different types of fluorescent dyes should be used for different types of sample 12 such as microbeads (different types of biological materials attached to sample 12). Thus, the type of fluorescent dye can be specified. Thereby, the kind of sample 12 can be specified. Therefore, the type of the sample 12 is specified from the fluorescence emitted by the sample 12. At the same time, when detecting fluorescence emitted from a biological material provided with a predetermined fluorescent dye, it is possible to specify which type of sample 12 is attached to the biological material and whether or not the biological material binds to the structure. be able to.
In particular, when two different types of fluorescent dyes are mixed at different ratios, the apparent fluorescence relaxation time constant τ also changes according to this ratio. For this reason, an extremely large number of fluorescence relaxation time constants can be set by changing the mixing ratio. Therefore, by using fluorescent dyes having different fluorescence relaxation time constants for each type of microbeads, it is possible to set a large number of types of microbeads that can distinguish emitted fluorescence.

さらに、上述した符号化識別変換を行う際に、自己相関性を有する符号化系列信号を知ることができるので、蛍光信号がどのレーザ光によるものかを特定することができる。従来においては、レーザ光を変調して信号情報を含ませることは行わないので、どのレーザ光の励起による蛍光であるかを特定することができない。
このように本発明では、同一の波長で放射する蛍光であっても、励起に用いるレーザ光の符号化系列信号を変えることで、異なる蛍光信号として受光することができるので、直交性を有する符号化系列信号を多数用いることで、蛍光色素の励起に用いられる多数のレーザ光を短時間のうちに特定することができる。したがって、蛍光の波長帯域が近接する多数の蛍光色素であっても、たとえ多数のレーザ光を合成して一度に照射しても、照射するレーザ光の信号情報が蛍光に含まれ、この信号情報が受光信号の中で識別できる限りにおいて、試料中に付着する蛍光色素を特定することができる。 Furthermore, since the encoded sequence signal having autocorrelation can be known when performing the above-described encoding identification conversion, it is possible to specify which laser beam the fluorescent signal is from. Conventionally, since laser light is not modulated to include signal information, it is impossible to specify which laser light is excited by fluorescence.
As described above, in the present invention, even fluorescence emitted at the same wavelength can be received as different fluorescence signals by changing the coded sequence signal of the laser light used for excitation, so that codes having orthogonality are used. By using a large number of signal sequences, a large number of laser beams used for excitation of the fluorescent dye can be identified in a short time. Therefore, even if it is a large number of fluorescent dyes with close fluorescence wavelength bands, even if a large number of laser beams are combined and irradiated at once, the signal information of the irradiated laser light is included in the fluorescence. Can be identified as long as it can be identified in the received light signal.

このように本発明では、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数を算出することで、識別可能な蛍光色素の種類を増大させることができる。特に、蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を予め定めて混合する比率を定めて用いることにより、２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有するようにすることができ、識別可能な蛍光色素が極めて多数に増大する。２種類の蛍光色素の例として、１つの種類は、Cascade Blue,Cascade Yellow, Alexa Fluor405, DAPI, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin, Hydroxycoumarin, Marine Blue, Pacific Blue, PyMPOの中から選択される蛍光色素であり、他の種類は、Q-Dot（Quantum Dot社製商品名）、Evic-Tag（Evident Technology社製商品名）の中から選ばれる半導体量子蛍光色素であることが好ましい。前者の蛍光色素は、後者の蛍光色素に比べて蛍光緩和時定数が短い。この２種類の蛍光色素の混合する比率を変えることで、蛍光緩和時定数を大きく変化させることができる。例えば、Q-Dotは、２０〜４０ナノ秒の蛍光緩和時定数を有する。 Thus, in the present invention, the types of fluorescent dyes that can be identified can be increased by calculating the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted by the fluorescent dye. In particular, it is possible to have a fluorescence relaxation time constant different from any of the two types of fluorescence relaxation time constants by using a predetermined ratio of mixing two types of fluorescent dyes having different fluorescence relaxation time constants. , The number of distinguishable fluorescent dyes increases to a very large number. As an example of two types of fluorescent dyes, one type is a fluorescent dye selected from Cascade Blue, Cascade Yellow, Alexa Fluor 405, DAPI, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin, Hydroxycoumarin, Marine Blue, Pacific Blue, PyMPO, and others Is preferably a semiconductor quantum fluorescent dye selected from Q-Dot (trade name, manufactured by Quantum Dot) and Evic-Tag (trade name, manufactured by Evident Technology). The former fluorescent dye has a shorter fluorescence relaxation time constant than the latter fluorescent dye. By changing the mixing ratio of the two types of fluorescent dyes, the fluorescence relaxation time constant can be greatly changed. For example, Q-Dot has a fluorescence relaxation time constant of 20 to 40 nanoseconds.

以上、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。 As described above, the fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention has been described in detail. However, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various improvements and modifications can be made without departing from the gist of the present invention. Of course it is also good.

本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。It is a schematic block diagram of the flow cytometer using the fluorescence detection apparatus by the intensity-modulated laser beam of the present invention. 本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。It is a schematic block diagram which shows an example of the laser light source part used for the fluorescence detection apparatus by the intensity | strength-modulated laser beam of this invention. 図２に示すレーザ光源部から出射されるレーザ光と蛍光色素の発する光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the spectrum intensity distribution of the laser beam radiate | emitted from the laser light source part shown in FIG. 2, and the light which a fluorescent dye emits. 本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。It is a schematic block diagram which shows an example of the light-receiving part used for the fluorescence detection apparatus by the intensity | strength-modulated laser beam of this invention. 本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。It is a schematic block diagram which shows an example of the control and processing part used for the fluorescence detection apparatus by the intensity | strength-modulated laser beam of this invention. 図５に示す制御・処理部のＩＱミキサを説明する図である。It is a figure explaining the IQ mixer of the control and processing part shown in FIG. （ａ）及び（ｂ）は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置で生成される各信号の例を示す図である。(A) And (b) is a figure which shows the example of each signal produced | generated with the fluorescence detection apparatus by the intensity | strength-modulated laser beam of this invention. 蛍光色素が発する光の蛍光強度の特性を説明する図である。It is a figure explaining the characteristic of the fluorescence intensity of the light which a fluorescent pigment emits.

Explanation of symbols

１０フローサイトメータ
１２試料
２０信号処理装置
２２レーザ光源部
２２ｒＲ光源
２２ｇＧ光源
２２ｂＢ光源
２３ａ₁，２３ａ₂，２６ｂ₁，２６ｂ₂ ダイクロイックミラー
２３ｃ．２６ａレンズ系
２４，２６受光部
２６ｃ₁，２６ｃ₂，２６ｃ_３バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ光電センサ
２８制御・処理部
３０管路
３２回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂレーザドライバ
３５，４８，５６パワースプリッタ
４０信号生成部４０
４２信号処理部
４４コントローラ
４６発信器
５０，５２，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４アンプ
５８ａ，５８ｂ，５８ｃＩＱミキサ
６２ローパスフィルタ
６６Ａ／Ｄ変換器
８０分析装置
10 flow cytometer 12 sample 20 signal processor 22 laser light source unit 22r R light source 22 g G light 22b B light source _{_{_{23a 1, 23a 2, 26b 1}}} , 26b 2 dichroic mirrors 23c. 26a Lens system 24, 26 Light receiving unit 26c ₁ , 26c ₂ , 26c ₃ band pass filter 27a-27c Photoelectric sensor 28 Control / processing unit 30 Pipe line 32 Collection container 34r, 34g, 34b Laser driver 35, 48, 56 Power splitter 40 Signal generator 40
42 signal processing unit 44 controller 46 transmitter 50, 52, 54a, 54b, 54c, 64 amplifier 58a, 58b, 58c IQ mixer 62 low-pass filter 66 A / D converter 80 analyzer

Claims

A fluorescence detection device that receives fluorescence emitted from a measurement object by irradiating the measurement object with laser light, and performs signal processing of a fluorescence signal obtained at this time,
A laser light source unit for emitting laser light to be irradiated on the measurement object;
A light receiving unit that outputs a fluorescence signal of fluorescence emitted from a measurement object irradiated with laser light;
A light source control unit that generates a modulation signal of a predetermined frequency in order to temporally modulate the intensity of the laser light emitted from the laser light source unit;
From the fluorescence signal outputted by the light receiving portion by irradiating a laser beam temporal modulation in measurement counterparts, anda processor for calculating the fluorescence relaxation time of fluorescence measurement object by using the modulated signal ,
The light source control unit uses a coded sequence signal selected from a plurality of coded sequence signals in which a 1-bit signal value is coded with a predetermined length and is orthogonal to each other as a pulse control signal, and the laser The laser light emission on / off is set and controlled so that the on time of the laser light emission from the light source unit is longer than one period of the time modulation of the laser light;
The processing unit calculates the fluorescence relaxation time, and uses the encoded sequence signal to identify fluorescence from the measurement object from the light reception signal output from the light receiving unit, and performs intensity modulation. Fluorescence detection device using laser light.

The fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to claim 1, wherein the processing unit calculates the fluorescence relaxation time by obtaining a phase delay of the fluorescence signal with respect to the modulation signal.

Wherein the plurality of coded sequence signal is at the one encoding sequence signal that is configured to shift the bit direction, or claim 1 coded sequence signal is configured to be perpendicular to each other by the shift 2. A fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to 2 .

The laser light source unit includes a plurality of laser light sources that emit a plurality of laser beams,
The light source control unit controls on / off of emission of laser light from a plurality of laser light sources using the plurality of encoded sequence signals orthogonal to each other,
The processing unit uses a coded sequence signal used for emitting laser light from a fluorescence signal output by overlapping optical signals from a plurality of laser beams in the light receiving unit, and measures the measurement target by irradiating each laser beam. 4. A fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to claim 1, wherein fluorescence signals emitted by an object are separated from each other.