JP4379644B2

JP4379644B2 - Method for stabilizing firefly luciferin

Info

Publication number: JP4379644B2
Application number: JP05953699A
Authority: JP
Inventors: 進高安; 俊彦井場
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-03-08
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2019-03-08
Also published as: JP2000253899A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はホタルルシフェリンの安定化に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ホタルルシフェリンは、ホタルルシフェラーゼによる発光反応の基質であり、酸素、ATP、およびマグネシウムイオンの存在下に酸化されて発光する。ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンによる発光反応は、ATPがごく微量であっても進行することから、ATPを高感度に検出することができ、特に生物由来のATPの高感度・簡易検出法に利用されている。
【０００３】
細菌検査の分野においては、菌体内のATPをホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンによる発光反応で検出することにより、細菌の有無を培養を必要とせずに迅速かつ高感度に検出可能である。また、食品加工現場においては器具や設備に付着した食材に由来するATPを検出する清浄度検査に利用されている。
【０００４】
ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンの発光反応の別の利用法としては、ホタルルシフェラーゼを標識物質とした微量物質の測定が挙げられる。特に生体内に存在するホルモン等の物質を免疫学的に測定する生物発光酵素免疫測定法では、高感度であることに加えて測定範囲も広いことから、従来の酵素免疫測定法やラジオイムノアッセイに代わるものとして注目されている。
【０００５】
しかしながら、ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンはどちらも不安定な物質である。特にホタルルシフェリンは、ホタルルシフェラーゼの非共存下では溶解後２週間（pH8.0、室温）で活性が40%程度まで低下することが知られている。生物発光酵素免疫測定法では、標識物質であるホタルルシフェラーゼを検出するという反応系の性質から、ホタルルシフェリンを含む試薬にはホタルルシフェラーゼを共存させることができないため、溶液状態でのホタルルシフェリンの安定性が悪いことは大きな問題であった。
【０００６】
一般的に酵素とその基質が共存する状態では、それぞれが単独で存在するよりも安定性が向上することはよく知られた事実である。ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンが共存する場合の安定化技術としては、安定化剤としてポリオールを添加し、pHを5.5から7.4としたホタルルシフェラーゼ・ホタルルシフェリンの水溶液[1]が知られている。しかしながら、ホタルルシフェリン単独の状態でも同様に安定性が向上するかどうかは全く知られていない。
【０００７】
また、ウミホタルルシフェリンをpH6.0以下の溶液で保存する方法[2]も知られているが、ウミホタルルシフェリン（化学式１）とホタルルシフェリン（化学式２）では全く構造が異なるため、そのままホタルルシフェリンに適用できるとは言い難い。
【０００８】
【化１】

【０００９】
【化２】

【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決すべき課題は、新たなホタルルシフェリンの安定化方法と、その方法を用いた安定なホタルルシフェリン溶液の提供である
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題の解決のために検討を行った結果、pH5.5から6.8の溶液中ではホタルルシフェリン単独の場合でも安定性が向上することを見いだした。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、pH5.5から6.8の溶液を調製するために用いられる緩衝液は、前記のpHの範囲で緩衝能を持つものであればどのような緩衝液でも使用できる。具体的には以下の緩衝液を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝液
ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis-Tris)緩衝液
酢酸緩衝液
リン酸水素ナトリウム−クエン酸緩衝液
上にあげた緩衝液の中では、ADA、Bis-Tris、および酢酸緩衝液が好ましい。
【００１３】
本発明において使用する緩衝液成分の濃度に特に制限はなく、その緩衝液成分が通常使用される濃度領域であれば、どのような濃度でもかまわない。緩衝液成分の濃度は使用する緩衝液のpHを考慮した上で適宜決定されるが、発光反応時にはpHを至適である8.0付近に変化させることを考慮すると、あまり濃度の高いものは実用的ではなく、pH5.5から6.8を維持できる最低限の濃度であれば十分である。
【００１４】
【実施例】
実施例１（各種緩衝液成分の検討）
・ホタルルシフェリン溶液の調製
470μM ホタルルシフェリン（シグマ製）、1.25mg/ml DTT、0.13mM EDTA-2Na、0.08% サッカロースを含むpH6.5の溶液を、以下に挙げる緩衝液成分（濃度はすべて20mM）で調製した。
N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝液
ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis-Tris)緩衝液
酢酸緩衝液
リン酸水素ナトリウム−クエン酸緩衝液
トリシン緩衝液（対照品、pH8.0）
・安定性試験
調製したホタルルシフェリン溶液を凍結乾燥し２群に分け、凍結乾燥品の１群はそのまま4℃で保存し、もう１群は精製水で溶解後、25℃で２週間保存した。
・発光反応
保存しておいたホタルルシフェリン溶液に発光試薬（100ng/ml ホタルルシフェラーゼ（シグマ製）、0.2% BSA、0.02% Casein、1mM ATP、8mM 硫酸マグネシウム、0.1mM ピロりん酸カリウムを含む20mMトリシン緩衝液(pH8.0)）を加え、ルミネッセンスリーダーで発光量を測定した。凍結乾燥保存品も精製水で溶解してから発光試薬を加えて、ルミネッセンスリーダーで発光量を測定した。凍結乾燥品の発光量を100%として、同じ緩衝液成分のホタルルシフェリン溶液の残存活性の割合を算出した。
【００１５】
・結果
２週間保存後のホタルルシフェリンの残存活性を表１に示す。対照品のpH8.0のホタルルシフェリン溶液では、凍結乾燥保存品に対して40%の活性しか残っていないのに対して、pH6.5で保存したホタルルシフェリン溶液は50〜80%の活性を維持している。中でもADA、Bis-Tris、酢酸緩衝液中で保存した場合には、70%以上の活性が残っていた。
【００１６】
【表１】

【００１７】
実施例２（至適pHの検討）
・ホタルルシフェリン溶液の調製
470μM ホタルルシフェリン（シグマ製）、1.25mg/ml DTT、0.13mM EDTA-2Na、および0.08% サッカロースを含むホタルルシフェリン溶液を調製した。pHの設定と緩衝液の種類は以下の通り。
pH 緩衝液（濃度は全て20mM）
5.0 酢酸緩衝液
5.7 〃
6.1 ADA緩衝液
6.5 〃
6.7 〃
7.0 〃
7.4 HEPES緩衝液
8.0 トリシン緩衝液
8.2 〃
その他の試薬、操作は実施例１と同一である。
【００１８】
・結果
２週間保存後のホタルルシフェリンの残存活性を図１に示す。pH7.0以下の領域ではpH8.0よりも高い残存基質活性を維持しているが、pH5.5からpH6.8の領域では基質活性が70%以上残っていることがわかる。
【００１９】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明が提供する安定化方法は溶液中のホタルルシフェリンの安定性を向上させ、従来よりも長期間にわたって活性を維持することが可能である。本発明はホタルルシフェラーゼが共存しない状態での安定化方法なので、生物発光酵素免疫測定系において特に有用であると考えられる。
【００２０】
参考文献
[1]WO 9411528
[2]特開平 8-154699
【図面の簡単な説明】
【図１】各種pHにおける25℃、２週間保存後の残存基質活性[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to the stabilization of firefly luciferin.
[0002]
[Prior art]
Firefly luciferin is a substrate for a luminescence reaction by firefly luciferase, and oxidizes in the presence of oxygen, ATP, and magnesium ions to emit light. Since the luminescence reaction with firefly luciferase and firefly luciferin proceeds even with very small amounts of ATP, ATP can be detected with high sensitivity, and is especially used for highly sensitive and simple detection methods of biological ATP. Yes.
[0003]
In the field of bacterial testing, the presence or absence of bacteria can be detected quickly and with high sensitivity without the need for culture by detecting ATP in the cells by a luminescent reaction with firefly luciferase and firefly luciferin. In food processing sites, it is used for cleanliness inspection to detect ATP derived from ingredients attached to equipment and equipment.
[0004]
Another method for using the luminescence reaction between firefly luciferase and firefly luciferin is to measure trace substances using firefly luciferase as a labeling substance. In particular, the bioluminescent enzyme immunoassay that immunologically measures substances such as hormones present in the living body is highly sensitive and has a wide measurement range, so it is suitable for conventional enzyme immunoassay and radioimmunoassay. It is attracting attention as an alternative.
[0005]
However, both firefly luciferase and firefly luciferin are unstable substances. In particular, it is known that the activity of firefly luciferin decreases to about 40% in the absence of firefly luciferase in two weeks after dissolution (pH 8.0, room temperature). In the bioluminescent enzyme immunoassay, because of the nature of the reaction system that detects the firefly luciferase as a labeling substance, firefly luciferin cannot be coexisted in a reagent containing firefly luciferin, so the stability of firefly luciferin in a solution state The bad thing was a big problem.
[0006]
In general, it is a well-known fact that in the state where an enzyme and its substrate coexist, stability is improved as compared to the case where each enzyme exists alone. As a stabilization technique when firefly luciferase and firefly luciferin coexist, an aqueous solution [1] of firefly luciferase / firefly luciferin having a pH of 5.5 to 7.4 with a polyol added as a stabilizer is known. However, it is not known at all whether the stability is improved in the state of firefly luciferin alone.
[0007]
There is also a method of storing Cypridina luciferin in a solution of pH 6.0 or lower [2]. However, Cypridina luciferin (Chemical formula 1) and firefly luciferin (Chemical formula 2) have completely different structures, so they can be applied directly to firefly luciferin. It's hard to say that you can.
[0008]
[Chemical 1]

[0009]
[Chemical formula 2]

[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to provide a new method for stabilizing firefly luciferin and a stable firefly luciferin solution using the method.
[Means for Solving the Problems]
As a result of investigations for solving the above-mentioned problems, the present inventors have found that stability is improved even in the case of firefly luciferin alone in a solution of pH 5.5 to 6.8.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, any buffer can be used as the buffer used for preparing a solution having a pH of 5.5 to 6.8 as long as it has a buffer capacity within the above-mentioned pH range. Specifically, the following buffers can be used, but are not limited thereto.
N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer acetate buffer sodium hydrogen phosphate-citrate buffer Of these buffers, ADA, Bis-Tris, and acetate buffers are preferred.
[0013]
The concentration of the buffer component used in the present invention is not particularly limited, and any concentration may be used as long as the buffer component is a concentration region in which the buffer component is normally used. The concentration of the buffer component is appropriately determined in consideration of the pH of the buffer solution to be used. However, considering that the pH is changed to around 8.0, which is optimal for the luminescence reaction, a solution with a very high concentration is practical. Rather, a minimum concentration that can maintain pH 5.5 to 6.8 is sufficient.
[0014]
【Example】
Example 1 (Examination of various buffer components)
・ Preparation of firefly luciferin solution
A pH 6.5 solution containing 470 μM firefly luciferin (Sigma), 1.25 mg / ml DTT, 0.13 mM EDTA-2Na, 0.08% saccharose was prepared with the following buffer components (all concentrations were 20 mM).
N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer acetate buffer sodium hydrogen phosphate-citrate buffer tricine buffer (Control product, pH 8.0)
Stability test The prepared firefly luciferin solution was freeze-dried and divided into two groups. One group of freeze-dried products was stored at 4 ° C as it was, and the other group was dissolved in purified water and stored at 25 ° C for 2 weeks.
・ Luminous luciferin solution containing 100 ng / ml firefly luciferase (Sigma), 0.2% BSA, 0.02% Casein, 1 mM ATP, 8 mM magnesium sulfate, 0.1 mM potassium pyrophosphate Buffer solution (pH 8.0)) was added, and the amount of luminescence was measured with a luminescence reader. The lyophilized product was also dissolved in purified water, a luminescent reagent was added, and the amount of luminescence was measured with a luminescence reader. The ratio of the remaining activity of the firefly luciferin solution having the same buffer component was calculated with the luminescence amount of the lyophilized product being 100%.
[0015]
Results Table 1 shows the residual activity of firefly luciferin after storage for 2 weeks. The control pH 8.0 firefly luciferin solution retains only 40% activity against lyophilized storage, while the firefly luciferin solution stored at pH 6.5 maintains 50-80% activity. is doing. In particular, when stored in ADA, Bis-Tris, and acetate buffer, 70% or more of the activity remained.
[0016]
[Table 1]

[0017]
Example 2 (Examination of optimum pH)
・ Preparation of firefly luciferin solution
A firefly luciferin solution containing 470 μM firefly luciferin (manufactured by Sigma), 1.25 mg / ml DTT, 0.13 mM EDTA-2Na, and 0.08% saccharose was prepared. The pH settings and buffer types are as follows.
pH buffer solution (all concentrations are 20 mM)
5.0 Acetate buffer
5.7 〃
6.1 ADA buffer
6.5 〃
6.7 〃
7.0 〃
7.4 HEPES buffer
8.0 Tricine buffer
8.2 〃
Other reagents and operations are the same as those in Example 1.
[0018]
Results The residual activity of firefly luciferin after 2 weeks of storage is shown in FIG. It can be seen that the residual substrate activity higher than pH 8.0 is maintained in the region of pH 7.0 or lower, but 70% or more of the substrate activity remains in the region of pH 5.5 to pH 6.8.
[0019]
【The invention's effect】
As described above, the stabilization method provided by the present invention improves the stability of firefly luciferin in a solution and can maintain the activity for a longer period of time than before. Since the present invention is a stabilization method in the absence of firefly luciferase, it is considered to be particularly useful in a bioluminescent enzyme immunoassay system.
[0020]
References
[1] WO 9411528
[2] JP-A 8-154699
[Brief description of the drawings]
[FIG. 1] Residual substrate activity after storage at 25 ° C. for 2 weeks at various pHs

Claims

A method for stabilizing a firefly luciferin solution, comprising no firefly luciferase, using N- (2-acetamido) iminodiacetic acid as a buffer component, and adjusting the pH to 6.1 to 6.7.

A firefly luciferin solution characterized in that it does not contain firefly luciferase, contains N- (2-acetamido) iminodiacetic acid as a buffer component, and has a pH of 6.1 to 6.7.