JP4378529B2 - Biological substance adsorbent and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、生体物質、特にβ2−ミクログロブリンなどのタンパク質を吸着する生体物質吸着剤とその製造方法に関する。 The present invention relates to a biological material adsorbent that adsorbs biological materials, particularly proteins such as β 2 -microglobulin, and a method for producing the same.
現在、我が国には既に20万人弱の慢性腎不全症の患者があり、今後急速に高齢化の進むなか更に患者が増加することは確実である。このように多数の慢性腎不全症患者があるにも拘わらず、根本的治療法はなく、延命を目的とした対症療法の血液透析療法しかないのが現状である。血液透析療法としては、セルロース系天然高分子物質、あるいはポリスルホンやポリメタクリル酸メチルなどの合成高分子物質を素材にした中空糸膜型人工腎臓を使用して患者の血液中に産生、蓄積された尿毒症関連物質などの有害物質を除去するのが一般的である。透析膜壁には直径10〜100nm程度の微細孔が貫通するように作製されており、この孔から有害物質は浸透圧差によって血液側から透析液に移行する。しかし、膜壁の貫通孔の物質透過性には上限があり、通常、膜の性能評価法の上限としてアルブミン(分子量:66000)の透過阻止率が99.5%程度になるように設計されている。しかも、その孔の直径を均一に作製することは技術的に極めて困難であり、ある程度の分布を持つことは避けられない。従って、アルブミンの阻止率を100%にすると低分子領域の物質透過性も低下する。 At present, there are already less than 200,000 patients with chronic renal failure in Japan, and it is certain that the number of patients will increase further as the population ages rapidly. In spite of such a large number of patients with chronic renal failure, there is no fundamental treatment, and there is currently only symptomatic hemodialysis for the purpose of prolonging life. Hemodialysis therapy was produced and accumulated in the patient's blood using a hollow fiber membrane type artificial kidney made of a cellulose-based natural polymer or a synthetic polymer such as polysulfone or polymethyl methacrylate. It is common to remove harmful substances such as uremic substances. The dialysis membrane wall is formed so that fine pores having a diameter of about 10 to 100 nm penetrate, and harmful substances are transferred from the blood side to the dialysate by the osmotic pressure difference. However, there is an upper limit to the material permeability of the through-holes in the membrane wall, and it is usually designed so that the permeation blocking rate of albumin (molecular weight: 66000) is about 99.5% as the upper limit of the membrane performance evaluation method. Yes. Moreover, it is technically very difficult to make the diameters of the holes uniform, and it is inevitable that the holes have a certain degree of distribution. Therefore, when the albumin rejection is 100%, the substance permeability in the low-molecular region also decreases.
一方、透析治療の治療技術などの向上によって患者の延命率が向上し、透析治療年数も延長している。そのために、多くの合併症も認められるようになった。それらのうち、特に殆どの患者に皮膚のアミロイドシス症に関連した掻痒感、骨痛、関節痛、毛根管症候群などの多彩な合併症が認められるようになるが、その原因は患者の血液中のβ2−ミクログロブリン(β2−MG、分子量:12000)が異常産生され、それが体内の各組織に沈着することによるとされている。現在、透析膜の厚さを薄膜化して、この物質の除去率を向上させようという試みもなされているが、薄膜化することによる膜の強度低下、透析液側からの発熱性物質のバックフィルトレーションなどの負の効果もあり、透析膜での患者の血液中のβ2−MGを充分に除去することは限界に達している。 On the other hand, improvement in dialysis treatment techniques has increased the survival rate of patients and extended the dialysis treatment years. As a result, many complications have been observed. Among them, most patients have various complications such as pruritus associated with cutaneous amyloidosis, bone pain, joint pain, and root canal syndrome. It is said that β 2 -microglobulin (β 2 -MG, molecular weight: 12000) in the medium is abnormally produced and deposited in each tissue in the body. At present, attempts have been made to reduce the thickness of the dialysis membrane to improve the removal rate of this substance. However, reducing the thickness of the dialysis membrane reduces the strength of the membrane, and backfilling of pyrogenic substances from the dialysate side. There is also a negative effect such as torsion, and it has reached the limit of sufficiently removing β 2 -MG in the patient's blood with a dialysis membrane.
このように現在の透析膜による治療法では充分に除去できないβ2−MGを何らかの方法で除去しない限り、透析合併症の患者は増加の一途を辿るおそれがある。その対策の一つとして吸着剤によるβ2−MGの除去療法がある。吸着による病因物質の選択的除去法は既に確立した治療法であり、高脂血症、重症筋無力症、高ビリルビン血症などの患者に対してそれぞれ適切な吸着剤を使用することによって優れた臨床成績が得られている。しかし、これらは何れも血液を一旦、有形成分(赤血球、白血球、血小板)と血漿とに分離して、血漿中の病因物質を選択的に吸着除去するプラズマ灌流法(Plasma Perfusion)である。 As described above, patients with dialysis complications may continue to increase unless β 2 -MG, which cannot be sufficiently removed by current dialysis membrane therapy, is removed by some method. One countermeasure is β 2 -MG removal therapy using an adsorbent. The selective removal of etiological agents by adsorption is an established treatment, and it is excellent by using appropriate adsorbents for patients with hyperlipidemia, myasthenia gravis, hyperbilirubinemia, etc. Clinical results have been obtained. However, these are all plasma perfusion methods in which blood is once separated into formed components (red blood cells, white blood cells, platelets) and plasma, and pathogenic substances in plasma are selectively adsorbed and removed.
血液中のβ2−MGを除去するための吸着剤として水酸化リン酸カルシウム(ヒドロキシアパタイト)を使用することについては、特許文献1〜5などに記載されている。これらの特許文献においては様々な形態のヒドロキシアパタイトを使用することによって、β2−MGが除去できることが記載されている。しかしながら、血液中の有用成分(例えばアルブミン)の吸着を抑えながら病因物質であるβ2−MGを選択的に除去するのは困難であった。 The use of calcium hydroxide phosphate (hydroxyapatite) as an adsorbent for removing β 2 -MG in blood is described in Patent Documents 1 to 5. In these patent documents, it is described that β 2 -MG can be removed by using various forms of hydroxyapatite. However, it has been difficult to selectively remove β 2 -MG as a pathogenic substance while suppressing adsorption of useful components (eg, albumin) in blood.
これに対し、特許文献6あるいは非特許文献1に記載されているように炭酸根が導入されてなる水酸化リン酸カルシウムを使用することによって、アルブミンの吸着量を抑制しながらβ2−MGを選択的に吸着させることが可能になった。しかしながら、それでもなお選択性は必ずしも十分ではなかった。 On the other hand, as described in Patent Document 6 or Non-Patent Document 1, by using calcium hydroxide with a carbonate radical introduced therein, β 2 -MG is selectively suppressed while suppressing the amount of albumin adsorbed. It became possible to adsorb to. However, selectivity was not always sufficient.
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、生体物質を選択的に吸着することのできる吸着剤及びその製造方法を提供することを目的とするものである。 The present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide an adsorbent capable of selectively adsorbing a biological substance and a method for producing the same.
上記課題は、亜鉛を2〜20重量%含有するとともに、カルシウムの一部が亜鉛に置換されることによってヒドロキシアパタイトの結晶構造の中に亜鉛が取り込まれた水酸化リン酸カルシウムからなる生体物質吸着剤を提供することによって解決される。このとき、カルシウムと亜鉛の合計モル数に対するリンのモル数の比[(Ca+Zn)/P]が1.3〜1.55であることが好適である。 An object of the present invention is to provide a biomaterial adsorbent comprising calcium hydroxide phosphate containing zinc in an amount of 2 to 20% by weight and having zinc incorporated into the crystal structure of hydroxyapatite by replacing part of the calcium with zinc. It is solved by providing . At this time, it is preferable that the ratio [(Ca + Zn ) / P] of the number of moles of phosphorus to the total number of moles of calcium and zinc is 1.3 to 1.55.
本発明の生体物質吸着剤において、比表面積が80m2/g以上であることが好適である。また、単位重量当たりのβ2−ミクログロブリン吸着量が200μg/g以上であること、単位重量当たりのアルブミン吸着量が30mg/g以下であることが、いずれも好適である。 In the biological material adsorbent of the present invention, it is preferable that the specific surface area is 80 m 2 / g or more. Further, it is preferable that the β 2 -microglobulin adsorption amount per unit weight is 200 μg / g or more, and the albumin adsorption amount per unit weight is 30 mg / g or less.
本発明の生体物質吸着剤の好適な実施態様として、血液又は血漿を浄化するための吸着剤、及びβ2−ミクログロブリン吸着剤が挙げられる。上記生体物質吸着剤を用いた吸着手段を組み込んでなる透析装置も好適な実施態様である。また、上記生体物質吸着剤を充填してなる生体物質分離用カラムも好適な実施態様である。 Preferred embodiments of the biological material adsorbent of the present invention include an adsorbent for purifying blood or plasma, and a β 2 -microglobulin adsorbent. A dialysis apparatus incorporating an adsorbing means using the biological material adsorbent is also a preferred embodiment. A biological material separation column packed with the biological material adsorbent is also a preferred embodiment.
本発明の生体物質吸着剤の好適な製造方法は、カルシウムイオン及び亜鉛イオンを含有する水溶液(A)と、リン酸イオンを含有する水溶液(B)とを混合して、カルシウムの一部が亜鉛に置換されることによってヒドロキシアパタイトの結晶構造の中に亜鉛が取り込まれた水酸化リン酸カルシウムからなる固形分を生成させる方法である。このとき、水溶液(A)がカルシウムの硝酸塩と亜鉛の硝酸塩とを含有することが好適である。水溶液(A)のpHが4.5〜7であることも好適である。また、水溶液(B)のpHが8〜12であることも好適である。 A preferred method for producing the biological material adsorbent of the present invention comprises mixing an aqueous solution (A) containing calcium ions and zinc ions with an aqueous solution (B) containing phosphate ions, and a part of calcium is zinc. This is a method for producing a solid content composed of calcium hydroxide phosphate in which zinc is incorporated into the crystal structure of hydroxyapatite . At this time, it is preferable that the aqueous solution (A) contains calcium nitrate and zinc nitrate. It is also preferable that the pH of the aqueous solution (A) is 4.5-7. Moreover, it is also suitable that pH of aqueous solution (B) is 8-12.
本発明の生体物質吸着剤は、生体適合性に優れており、タンパク質等の生体物質を選択的に吸着することができる。特に、血液又は血漿中の有用タンパク質を吸着することなく、β2−ミクログロブリン等の病因物質を選択的に吸着除去することができ、しかも血液適合性にも優れているので、血液透析療法を受けている患者の血液中に蓄積した病因物質を除去するのに適している。 The biological material adsorbent of the present invention is excellent in biocompatibility, and can selectively adsorb biological materials such as proteins. In particular, it can selectively adsorb and remove pathogenic substances such as β 2 -microglobulin without adsorbing useful proteins in blood or plasma, and also has excellent blood compatibility. It is suitable for removing the pathogenic substances accumulated in the blood of the receiving patient.
本発明の生体物質吸着剤は、カルシウム以外の金属(M)を0.01〜20重量%含有する水酸化リン酸カルシウムからなるものである。水酸化リン酸カルシウムは、ヒドロキシアパタイト構造を有するものであることが好ましく、当該構造を有するものであることはX線回折ピークによって確認できる。ヒドロキシアパタイトは生体適合性、特に血液適合性に優れている。 The biological material adsorbent of the present invention is made of calcium hydroxide phosphate containing 0.01 to 20% by weight of a metal (M) other than calcium. The calcium hydroxide phosphate preferably has a hydroxyapatite structure, and it can be confirmed by an X-ray diffraction peak that it has the structure. Hydroxyapatite is excellent in biocompatibility, particularly blood compatibility.
カルシウム以外の金属(M)を含有することによって、タンパク質等の生体物質を吸着する際の選択性が大きく向上する。特に、血液透析療法を受けている患者の血液中に蓄積した病因物質であるβ2−MGを効率的に吸着しながら、血液中の有用物質であるアルブミンの吸着を抑制することが可能になる。カルシウム以外の金属(M)の存在によって選択性が大きく向上する理由は必ずしも明らかではないが、カルシウムとは異なる金属の存在によって、水酸化リン酸カルシウム粒子の表面の電荷分布が変化して選択性の発現に寄与していることが推定される。 By containing a metal (M) other than calcium, the selectivity when adsorbing biological substances such as proteins is greatly improved. In particular, it is possible to suppress the adsorption of albumin, which is a useful substance in blood, while efficiently adsorbing β 2 -MG, which is a pathogenic substance accumulated in the blood of patients undergoing hemodialysis therapy. . The reason why the selectivity is greatly improved by the presence of a metal (M) other than calcium is not necessarily clear, but the presence of a metal different from calcium changes the charge distribution on the surface of the calcium hydroxide phosphate particles to exhibit the selectivity. It is estimated that it contributes to.
カルシウム以外の金属(M)としては、特に限定されるものではないが、生体に対する安全性、化学反応性、入手のし易さなどを考慮すれば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛、アルミニウム、ケイ素、ゲルマニウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、銀及びタンタルが好適なものとして例示される。なかでも、生体に対する安全性が比較的高く、2価の陽イオンになりやすくてカルシウムと置換されやすい点から、亜鉛が特に好ましい金属として挙げられる。金属(M)として複数種の金属を組み合わせて使用しても構わない。 The metal (M) other than calcium is not particularly limited, but lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium, magnesium are considered in consideration of safety to the living body, chemical reactivity, easy availability, and the like. Strontium, barium, zinc, aluminum, silicon, germanium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zirconium, niobium, molybdenum, silver, and tantalum are preferred examples. Among these, zinc is a particularly preferable metal because it is relatively safe to living bodies and easily becomes a divalent cation and is easily replaced with calcium. A plurality of types of metals may be used in combination as the metal (M).
カルシウム以外の金属(M)の好適な含有量は0.01〜20重量%である。後に説明する実施例に示されているように、β2−MGの吸着量の増大という観点からは、より好適には0.1重量%以上、さらに好適には0.5重量%以上であり、特に好適には2重量%以上である。一方、アルブミンの吸着量の低減という観点からは、金属(M)の含有量はさらに高いほうが好ましく、より好適には3重量%以上であり、さらに好適には4重量%以上である。一方、金属(M)の含有量が20重量%を超えると、ヒドロキシアパタイトの結晶構造の中に金属(M)を取り込むことが困難になる。金属(M)の含有量は、より好適には15重量%以下であり、さらに好適には10重量%以下である。但し、生体物質が吸着されるのは、水酸化リン酸カルシウムの表面であるから、表面にカルシウム以外の金属(M)を偏在させる場合には、金属(M)の含有量が少なくても本発明の効果を効率的に奏する場合もある。 The preferred content of metal (M) other than calcium is 0.01 to 20% by weight. As shown in the examples described later, from the viewpoint of increasing the adsorption amount of β 2 -MG, it is more preferably 0.1% by weight or more, and further preferably 0.5% by weight or more. Particularly preferably, it is 2% by weight or more. On the other hand, from the viewpoint of reducing the amount of albumin adsorbed, the metal (M) content is preferably higher, more preferably 3% by weight or more, and further preferably 4% by weight or more. On the other hand, when the content of the metal (M) exceeds 20% by weight, it becomes difficult to incorporate the metal (M) into the crystal structure of hydroxyapatite. The metal (M) content is more preferably 15% by weight or less, and even more preferably 10% by weight or less. However, since the biological substance is adsorbed on the surface of calcium hydroxide phosphate, when the metal (M) other than calcium is unevenly distributed on the surface, even if the content of the metal (M) is small, In some cases, the effect can be efficiently achieved.
またこのとき、カルシウムと金属(M)の合計モル数に対するリンのモル数の比[(Ca+M)/P]が1.3〜1.55であることが好ましい。ヒドロキシアパタイトを構成する水酸化リン酸カルシウムの理論的な化学式はCa10(PO4)6(OH)2で示され、そのカルシウムとリンのモル比[Ca/P]は1.67である。これに対し、いわゆるカルシウム欠損型の化学組成になることが好ましい。金属(M)の含有量が高いほど、比[(Ca+M)/P]の値が小さくなる傾向が認められ、比[(Ca+M)/P]が小さくなるほど、タンパク質等の吸着の選択性が向上する。比[(Ca+M)/P]はより好適には1.5以下である。一方、比[(Ca+M)/P]が小さすぎる場合には、ヒドロキシアパタイトの結晶構造を維持することが困難になりやすく、比[(Ca+M)/P]はより好適には1.4以上である。 At this time, the ratio [(Ca + M) / P] of the number of moles of phosphorus to the total number of moles of calcium and metal (M) is preferably 1.3 to 1.55. The theoretical chemical formula of calcium hydroxide phosphate constituting hydroxyapatite is represented by Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 , and the molar ratio of calcium to phosphorus [Ca / P] is 1.67. In contrast, a so-called calcium deficient chemical composition is preferred. The higher the metal (M) content, the smaller the value of the ratio [(Ca + M) / P], and the lower the ratio [(Ca + M) / P], the better the selectivity for adsorption of proteins and the like. To do. The ratio [(Ca + M) / P] is more preferably 1.5 or less. On the other hand, if the ratio [(Ca + M) / P] is too small, it is difficult to maintain the crystal structure of hydroxyapatite, and the ratio [(Ca + M) / P] is more preferably 1.4 or more. is there.
以上のように、カルシウム以外の金属(M)の含有量が上昇し、同時に比[(Ca+M)/P]が小さくなることによって、タンパク質等の吸着の選択性が大きく向上した。この効果は、水酸化リン酸カルシウムが金属(M)を含有することによって奏されるものであるとともに、カルシウム欠損型の化学組成になることによっても奏されるものであると考えられる。 As described above, the selectivity for adsorption of proteins and the like was greatly improved by increasing the content of metals (M) other than calcium and simultaneously reducing the ratio [(Ca + M) / P]. This effect is considered to be achieved by the calcium hydroxide phosphate containing a metal (M) and also by having a calcium-deficient chemical composition.
したがって、本発明の生体物質吸着剤の別の態様は、カルシウムのモル数に対するリンのモル数の比[Ca/P]が1.3〜1.55である水酸化リン酸カルシウムからなるものである。すなわち、カルシウム欠損型の化学組成であることによってタンパク質等の吸着の選択性が向上する。比[Ca/P]が小さくなるほど、タンパク質等の吸着の選択性が向上する。比[Ca/P]はより好適には1.5以下である。一方、比[Ca/P]が小さすぎる場合には、ヒドロキシアパタイトの結晶構造を維持することが困難になりやすく、比[Ca/P]はより好適には1.4以上である。 Therefore, another aspect of the biological material adsorbent of the present invention is made of calcium hydroxide phosphate having a ratio of the number of moles of phosphorus to the number of moles of calcium [Ca / P] of 1.3 to 1.55. That is, the selectivity of adsorption of proteins and the like is improved by the chemical composition of the calcium deficient type. As the ratio [Ca / P] decreases, the adsorption selectivity for proteins and the like improves. The ratio [Ca / P] is more preferably 1.5 or less. On the other hand, when the ratio [Ca / P] is too small, it is difficult to maintain the crystal structure of hydroxyapatite, and the ratio [Ca / P] is more preferably 1.4 or more.
以上のように、水酸化リン酸カルシウムがカルシウム以外の金属(M)を含有するか、あるいはカルシウム欠損型の化学組成になることによって、生体物質の吸着の選択性が向上する。これらの態様はいずれも独立に本発明の効果を奏するとともに、両者が相乗的に効果を奏すると考えられる。 As described above, when calcium hydroxide phosphate contains a metal (M) other than calcium or has a calcium-deficient chemical composition, the selectivity for the adsorption of biological substances is improved. All of these aspects are considered to produce the effects of the present invention independently and synergistically.
以上説明したような本発明の水酸化リン酸カルシウムの結晶子径は35nm以下であることが好ましい。本発明においては、金属(M)の含有量が高いほど、比[(Ca+M)/P]の値が小さくなる傾向が認められ、このとき、結晶子径も小さくなっていく傾向が認められている。結晶子径が小さいことも生体物質の吸着の選択性の向上に寄与していると考えられ、この小さい結晶子(一次粒子)が無秩序に凝集した二次粒子を形成するのが好ましいようである。このとき、結晶子径はより好適には30nm以下であり、さらに好適には25nm以下である。また、ヒドロキシアパタイトとしての効果を奏するためには、結晶子径は通常10nm以上である。 As described above, the crystallite diameter of the calcium hydroxide phosphate of the present invention is preferably 35 nm or less. In the present invention, the higher the content of metal (M), the smaller the value of the ratio [(Ca + M) / P] is observed. At this time, the tendency for the crystallite diameter to decrease is also recognized. Yes. The small crystallite size is also considered to contribute to the improvement of the biological material adsorption selectivity, and it seems preferable to form secondary particles in which the small crystallites (primary particles) are randomly aggregated. . At this time, the crystallite diameter is more preferably 30 nm or less, and further preferably 25 nm or less. Moreover, in order to show the effect as hydroxyapatite, the crystallite diameter is usually 10 nm or more.
また、吸着効率を向上させるためには、比表面積が80m2/g以上であることが好ましい。上述のように、結晶子径の小さい水酸化リン酸カルシウム粒子とすることによって比表面積の大きな粒子が容易に得られる。比表面積はより好適には120m2/g以上であり、さらに好適には150m2/g以上である。比表面積は通常500m2/g以下である。 Moreover, in order to improve adsorption efficiency, it is preferable that a specific surface area is 80 m < 2 > / g or more. As described above, particles having a large specific surface area can be easily obtained by using calcium phosphate particles having a small crystallite diameter. The specific surface area is more preferably 120 m 2 / g or more, and even more preferably 150 m 2 / g or more. The specific surface area is usually 500 m 2 / g or less.
本発明の生体物質吸着剤の単位重量当たりのβ2−MG吸着量が200μg/g以上であることが好ましい。本発明の生体物質吸着剤は、従来のヒドロキシアパタイトに比べて多くのβ2−MGを吸着することができる。β2−MG吸着量は、より好適には250μg/g以上であり、さらに好適には300μg/g以上である。本発明の生体物質吸着剤においては、カルシウム以外の金属(M)の含有量が上昇するほど、また、カルシウムの欠損の程度が顕著になるほどβ2−MG吸着量は上昇する傾向が認められた。 It is preferable that the β 2 -MG adsorption amount per unit weight of the biological material adsorbent of the present invention is 200 μg / g or more. The biological material adsorbent of the present invention can adsorb more β 2 -MG than conventional hydroxyapatite. The β 2 -MG adsorption amount is more preferably 250 μg / g or more, and even more preferably 300 μg / g or more. In the biological material adsorbent of the present invention, the amount of β 2 -MG adsorbed tended to increase as the content of metal (M) other than calcium increased, and as the degree of calcium deficiency became more prominent. .
また、本発明の生体物質吸着剤の単位重量当たりのアルブミン吸着量が30mg/g以下であることが好ましい。本発明の生体物質吸着剤は、従来のヒドロキシアパタイトに比べてアルブミンの吸着を抑制することができる。アルブミン吸着量は、より好適には20mg/g以下であり、さらに好適には10mg/g以下である。本発明の生体物質吸着剤においては、カルシウム以外の金属(M)の含有量が上昇するにしたがって、いったんアルブミン吸着量が上昇するが、一定量以上の金属(M)の含有量では、アルブミン吸着量が非常に低い値をとることがわかった。この場合、アルブミンの吸着を抑制しながら効率的にβ2−MGを吸着することができ、高度な選択性を達成することが可能になる。 Moreover, it is preferable that the albumin adsorption amount per unit weight of the biological material adsorbent of the present invention is 30 mg / g or less. The biological material adsorbent of the present invention can suppress the adsorption of albumin as compared with conventional hydroxyapatite. The albumin adsorption amount is more preferably 20 mg / g or less, and even more preferably 10 mg / g or less. In the biomaterial adsorbent of the present invention, the amount of albumin adsorbed once increases as the content of metal (M) other than calcium increases, but when the content of metal (M) exceeds a certain amount, albumin adsorbed The quantity was found to be very low. In this case, β 2 -MG can be efficiently adsorbed while suppressing the adsorption of albumin, and a high degree of selectivity can be achieved.
上記β2−MG吸着量(μg/g)及びアルブミン吸着量(mg/g)は、濃度2.0mg/dLのβ2−MGと濃度3.5g/dLのアルブミンの両方を含有する生理食塩水2mL中で、0.1gの水酸化リン酸カルシウム試料が吸着するβ2−MG及びアルブミンの重量を10倍することによってそれぞれ得られるものである。 The β 2 -MG adsorption amount (μg / g) and the albumin adsorption amount (mg / g) are physiological saline containing both β 2 -MG having a concentration of 2.0 mg / dL and albumin having a concentration of 3.5 g / dL. These were obtained by multiplying the weight of β 2 -MG and albumin adsorbed by 0.1 g of calcium hydroxide phosphate sample in 2 mL of water by 10 times, respectively.
本発明の生体物質吸着剤の製造方法は特に限定されない。好適な方法として、カルシウムイオン及びカルシウム以外の金属(M)のイオンを含有する水溶液(A)と、リン酸イオンを含有する水溶液(B)とを混合して、水酸化リン酸カルシウムからなる固形分を生成させる方法が挙げられる。この方法によれば、カルシウムイオン及びカルシウム以外の金属(M)のイオンの両方を取り込みながらヒドロキシアパタイト型格子構造を有する水酸化リン酸カルシウムを形成することが容易である。 The method for producing the biological material adsorbent of the present invention is not particularly limited. As a preferable method, an aqueous solution (A) containing calcium ions and ions of a metal (M) other than calcium and an aqueous solution (B) containing phosphate ions are mixed to obtain a solid content composed of calcium hydroxide phosphate. The method of generating is mentioned. According to this method, it is easy to form calcium hydroxide phosphate having a hydroxyapatite lattice structure while taking in both calcium ions and ions of metal (M) other than calcium.
水溶液(A)が含有するカルシウム塩は、水に溶解するものであれば特に限定されず、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウムなどを使用することができるが、塩の溶解度や得られる水溶液(A)のpH等を考慮すれば、硝酸カルシウムが好適に使用される。また、水溶液(A)が含有する金属(M)の塩も特に限定されず、硝酸塩、酢酸塩、硫酸塩、塩化物などを使用することができるが、塩の溶解度や得られる水溶液(A)のpH等を考慮すれば、硝酸塩が好適に使用される。すなわち、水溶液(A)がカルシウムの硝酸塩と金属(M)の硝酸塩とを含有することが特に好適である。 The calcium salt contained in the aqueous solution (A) is not particularly limited as long as it dissolves in water, and calcium nitrate, calcium acetate, calcium chloride and the like can be used, but the solubility of the salt and the obtained aqueous solution (A ) Calcium nitrate is preferably used. Further, the salt of the metal (M) contained in the aqueous solution (A) is not particularly limited, and nitrates, acetates, sulfates, chlorides and the like can be used, but the solubility of the salt and the obtained aqueous solution (A) Nitrate is preferably used in consideration of the pH and the like. That is, it is particularly preferable that the aqueous solution (A) contains calcium nitrate and metal (M) nitrate.
水溶液(A)中のカルシウム塩の含有量は0.01〜1mol/Lであることが好ましく、0.1〜0.8mol/Lであることがより好ましい。水溶液(A)中の金属(M)の塩の含有量は0.002〜0.16mol/Lであることが好ましく、0.02mol/L以上であることがより好ましく、0.03mol/L以上であることがさらに好ましい。また、水溶液(A)のpHは4.5〜7であることが好適である。比較的低いpHとすることによって、比表面積の大きい粒子を形成することが容易である。水溶液(A)のpHはより好適には5以上である。また水溶液(A)のpHはより好適には6以下である。ここでのpHは、60℃で測定した値である。 The content of the calcium salt in the aqueous solution (A) is preferably 0.01 to 1 mol / L, and more preferably 0.1 to 0.8 mol / L. The content of the metal (M) salt in the aqueous solution (A) is preferably 0.002 to 0.16 mol / L, more preferably 0.02 mol / L or more, and 0.03 mol / L or more. More preferably. Moreover, it is suitable that pH of aqueous solution (A) is 4.5-7. By making the pH relatively low, it is easy to form particles having a large specific surface area. The pH of the aqueous solution (A) is more preferably 5 or more. The pH of the aqueous solution (A) is more preferably 6 or less. The pH here is a value measured at 60 ° C.
水溶液(B)が含有するリン酸塩は、水に溶解するものであれば特に限定されない。アニオン種はリン酸アニオン(PO4 3−)、リン酸水素アニオン(HPO4 2−)、リン酸二水素アニオン(H2PO4 −)のいずれの形で含まれていても構わない。そのカチオン種も特に限定されず、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などを使用することができるが、生成する水酸化リン酸カルシウム内への金属元素の混入を防止できるアンモニウム塩が好適に使用される。このとき、リン酸(オルトリン酸:H3PO4)とアンモニア水とを混合することによって、アンモニウム塩が溶解した水溶液を調整しても構わない。 The phosphate contained in the aqueous solution (B) is not particularly limited as long as it dissolves in water. The anion species may be contained in any form of phosphate anion (PO 4 3− ), hydrogen phosphate anion (HPO 4 2− ), or dihydrogen phosphate anion (H 2 PO 4 − ). The cation species is not particularly limited, and ammonium salts, sodium salts, potassium salts, and the like can be used. However, ammonium salts that can prevent the mixing of metal elements into the resulting calcium hydroxide phosphate are preferably used. At this time, the aqueous solution in which the ammonium salt is dissolved may be prepared by mixing phosphoric acid (orthophosphoric acid: H 3 PO 4 ) and aqueous ammonia.
水溶液(B)中のリン酸塩の含有量は0.01〜0.5mol/Lであることが好ましい。また、水溶液(B)のpHは8〜12であることが好適である。比較的高いpHとすることによって、比表面積の大きい粒子を形成することが容易である。水溶液(B)のpHはより好適には9以上である。また水溶液(A)のpHはより好適には11以下である。水溶液(B)のpHを調整するために、アンモニアを添加することが好ましい。ここでのpHは、室温で測定した値である。 The phosphate content in the aqueous solution (B) is preferably 0.01 to 0.5 mol / L. Moreover, it is suitable that pH of aqueous solution (B) is 8-12. By setting the pH relatively high, it is easy to form particles having a large specific surface area. The pH of the aqueous solution (B) is more preferably 9 or more. The pH of the aqueous solution (A) is more preferably 11 or less. In order to adjust the pH of the aqueous solution (B), it is preferable to add ammonia. The pH here is a value measured at room temperature.
水溶液(A)と水溶液(B)を混合する方法としては、水溶液(A)の中に水溶液(B)を添加する方法と、水溶液(B)の中に水溶液(A)を添加する方法のいずれも採用できるが、混合操作中のpH変動を抑制するためには水溶液(A)の中に水溶液(B)を添加する方法が望ましい。混合に際しては十分に撹拌しながら徐々に配合するのが好ましい。混合時の温度は15〜100℃であることが好ましい。特に、カルシウム以外の金属(M)の含有量を大きくしたい場合には温度を高くするほうが好ましく、より好適には30℃以上、さらに好適には50℃以上である。発明者らが室温で混合した場合には、金属(M)として亜鉛を導入しようとした際に、1重量%以上の量を含有させることが困難であった。 As a method of mixing the aqueous solution (A) and the aqueous solution (B), either the method of adding the aqueous solution (B) into the aqueous solution (A) or the method of adding the aqueous solution (A) into the aqueous solution (B). However, a method of adding the aqueous solution (B) to the aqueous solution (A) is desirable in order to suppress the pH fluctuation during the mixing operation. In mixing, it is preferable to mix gradually while stirring sufficiently. It is preferable that the temperature at the time of mixing is 15-100 degreeC. In particular, when it is desired to increase the content of metal (M) other than calcium, it is preferable to increase the temperature, more preferably 30 ° C. or higher, and even more preferably 50 ° C. or higher. When the inventors mixed at room temperature, it was difficult to contain 1% by weight or more when zinc was introduced as the metal (M).
水溶液(A)と水溶液(B)とを混合した後の混合液のpHは、通常、4〜12の範囲の値をとるが、低めのpHの値とするほうが、比表面積の大きな、生体物質の吸着の選択性の良好な生体物質吸着剤を得ることができる。したがって、混合液のpHは、より好適には7以下である。ここでのpHは、60℃で測定した値である。 The pH of the mixture after mixing the aqueous solution (A) and the aqueous solution (B) usually takes a value in the range of 4 to 12, but a lower pH value has a larger specific surface area and a biological material. A biological material adsorbent with good adsorption selectivity can be obtained. Therefore, the pH of the mixed solution is more preferably 7 or less. The pH here is a value measured at 60 ° C.
上述のように、水溶液(A)と水溶液(B)とを混合する方法以外にも、カルシウムイオンを含有する水溶液と、リン酸イオンを含有する水溶液とを混合して、水酸化リン酸カルシウムからなる固形分を生成させる操作の途中で、金属(M)のイオンを含有する水溶液(A)を添加する方法も採用できる。この場合、直接生体成分が吸着される表面層のみに金属(M)元素を偏在させた粒子を製造することができる。 As described above, in addition to the method of mixing the aqueous solution (A) and the aqueous solution (B), a solid solution made of calcium hydroxide phosphate by mixing an aqueous solution containing calcium ions and an aqueous solution containing phosphate ions. A method of adding an aqueous solution (A) containing metal (M) ions during the operation of generating a minute can also be employed. In this case, it is possible to produce particles in which the metal (M) element is unevenly distributed only in the surface layer on which the biological component is directly adsorbed.
こうして混合操作が終わった後にも撹拌を継続することによって、生成したヒドロキシアパタイト結晶を熟成することができる。このときの温度としては、混合する際の温度と同程度の温度が採用でき、撹拌時間は通常1〜168時間程度である。得られた固形分は、濾別、遠心分離などの操作によって水溶液から分離され、適宜、洗浄操作や乾燥操作が施される。更に熱処理を施すことによってヒドロキシアパタイト結晶を成長させることもできる。 Thus, the produced hydroxyapatite crystals can be ripened by continuing the stirring even after the mixing operation is completed. As the temperature at this time, a temperature comparable to the temperature at the time of mixing can be adopted, and the stirring time is usually about 1 to 168 hours. The obtained solid content is separated from the aqueous solution by an operation such as filtration or centrifugation, and a washing operation or a drying operation is appropriately performed. Furthermore, a hydroxyapatite crystal can be grown by heat treatment.
本発明の生体物質吸着剤が吸着すべき対象物は生体物質であれば良く、水中に溶解した物質のみならず、ウイルスや細菌を吸着するものであっても良い。生体物質のなかでも、タンパク質が好適に吸着され、比較的分子量の小さいタンパク質、例えば分子量が20000以下の水溶性タンパク質を吸着するのに特に適している。 The object to be adsorbed by the biological material adsorbent of the present invention may be a biological material, and may adsorb not only substances dissolved in water but also viruses and bacteria. Among biological materials, proteins are preferably adsorbed and particularly suitable for adsorbing proteins having a relatively low molecular weight, for example, water-soluble proteins having a molecular weight of 20000 or less.
本発明の生体物質吸着剤の特に好適な用途は、血液又は血漿を浄化するための吸着剤である。血液中の生体物質を直接吸着しても構わないし、一旦血漿を分離してその血漿中の生体物質を吸着しても構わない。本発明の生体物質吸着剤を構成する水酸化リン酸カルシウムは、生体親和性に優れ、血液適合性にも優れているので、このような用途に適している。なかでも、β2−MG吸着剤とすることが特に好適である。本発明の生体物質吸着剤によれば、透析治療を受けている患者の血液中に蓄積するβ2−MGを効率的に除去しながら、アルブミンなどの有用タンパク質の損失を最低限に抑えることができる。これによって、皮膚掻痒症、骨痛、関節痛、毛根管症候群などの透析治療に伴う合併症の発生を抑制できる。 A particularly suitable application of the biological material adsorbent of the present invention is an adsorbent for purifying blood or plasma. The biological material in the blood may be directly adsorbed, or the plasma may be once separated and the biological material in the plasma may be adsorbed. Since the calcium phosphate phosphate constituting the biological material adsorbent of the present invention is excellent in biocompatibility and blood compatibility, it is suitable for such applications. Among these, a β 2 -MG adsorbent is particularly preferable. According to the biological material adsorbent of the present invention, it is possible to minimize loss of useful proteins such as albumin while efficiently removing β 2 -MG accumulated in the blood of a patient undergoing dialysis treatment. it can. As a result, the occurrence of complications associated with dialysis treatment such as cutaneous pruritus, bone pain, joint pain, and root canal syndrome can be suppressed.
血液又は血漿を浄化するための吸着剤として使用する際には、本発明の生体物質吸着剤を用いた吸着手段を組み込んでなる透析装置とすることが好適である。透析装置に組み込むことによって、患者に負担を少なくしながら効率的にβ2−MGなどの病因物質を除去することができる。組み込み方は特に限定されず、カラムなどの容器に充填しても良いし、各種担体に担持させても良い。 When used as an adsorbent for purifying blood or plasma, a dialysis apparatus incorporating an adsorbing means using the biological material adsorbent of the present invention is preferable. By incorporating it into a dialysis machine, it is possible to efficiently remove pathogenic substances such as β 2 -MG while reducing the burden on the patient. The method of incorporation is not particularly limited, and it may be filled in a container such as a column or may be supported on various carriers.
また、本発明の生体物質吸着剤を充填してなる生体物質分離用カラムも、本発明の好適な実施態様である。当該分離用カラムは前述のように透析装置に組み込んで使用することもできるが、アフィニティークロマトグラフィーなどの分析機器に組み込まれる分離用カラムとしても好適に使用される。この場合、特定の低分子量タンパク質に対する高選択的吸着特性を生かして、特にタンパク質の分離用カラムとして好適に使用される。 A biological material separation column packed with the biological material adsorbent of the present invention is also a preferred embodiment of the present invention. Although the separation column can be used by being incorporated in a dialysis apparatus as described above, it is also suitably used as a separation column incorporated in an analytical instrument such as affinity chromatography. In this case, taking advantage of the high selective adsorption property for a specific low molecular weight protein, it is particularly suitably used as a protein separation column.
本発明の生体物質吸着剤の使用形態については粉末状態に限られず、バインダーなどを用いて、本発明の吸着剤をペレット等の形状に加工したものを用いても構わない。また、ビーズ状、棒状、繊維状、不織布状、ワイヤー状、コイル状などの種々の形態に成形されたプラスチック、金属あるいはセラミックス基材などに被覆することも可能である。また、ウイルスや細菌などの吸着特性等も期待されることから、マスク用不織布内に吸着剤としての利用や、換気扇、空気清浄機用のフィルターへの応用、ウイルスや細菌の診断・検査・回収用材料としても有望である。 The usage form of the biological material adsorbent of the present invention is not limited to a powder state, and a material obtained by processing the adsorbent of the present invention into a pellet or the like using a binder or the like may be used. It is also possible to cover plastic, metal, or ceramic substrates formed in various forms such as beads, rods, fibers, nonwovens, wires, and coils. In addition, since adsorption characteristics such as viruses and bacteria are also expected, it can be used as an adsorbent in non-woven fabric for masks, applied to ventilation fans and filters for air purifiers, and diagnoses, inspections and collections of viruses and bacteria. It is also promising as a material for use.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
・水酸化リン酸カルシウムの合成:
本発明に係るリン酸カルシウムセラミックを以下の(1)〜(5)の手順により合成した。
(1)窒素ガスを3.0L/分で30分間流通して溶存酸素と溶存炭酸ガスを除去した200mLの蒸留水に、23gの硝酸カルシウム・4水和物(Ca(NO3)2/4H2O)を投入して撹拌して溶解させ、0.5mol/Lの硝酸カルシウム水溶液を調製した。この水溶液に、硝酸亜鉛の濃度が0〜0.048mol/Lになるように、硝酸亜鉛・6水和物(Zn(NO3)2/6H2O)を溶解させ、9種類の硝酸亜鉛濃度を有する60℃の水溶液をそれぞれ得た。得られた水溶液のpHは、硝酸亜鉛の濃度が0mol/Lのときに6であり、硝酸亜鉛の濃度が0.048mol/Lのときに5であり、その中間の濃度ではそれらの中間的なpHの値を示した。
(2)窒素ガスを3.0L/分で30分間流通して溶存酸素と溶存炭酸ガスを除去した200mLの蒸留水に7.9gのリン酸水素二アンモニウム((NH4)2HPO4)を溶解して0.3mol/Lのリン酸水素二アンモニウム水溶液を調製した。この水溶液に対し、28重量%アンモニア水を添加して、pHが10に調整された室温の水溶液を得た。
(3)送液ポンプを用いて、3.0mL/分の流速で(2)で得られたリン酸塩含有水溶液を、(1)で得られた亜鉛イオン濃度の異なる硝酸カルシウム水溶液に添加して、温度を60℃に保ちながら撹拌して混合した。硝酸亜鉛を0.048mol/L含有するときの混合液のpHは5.4であった。
(4)得られた混合溶液は、60℃で24時間撹拌して熟成した。こうして生成した固形分を遠心分離器で分離し、上澄み液を捨て、蒸留水を加えて撹拌して洗浄した後、再び遠心分離した。この洗浄操作を3回繰り返して行った。
(5)得られた固形分を105℃にて24時間乾燥した。乾燥後、アルミナ製乳鉢で粉砕し得られた粉末を分析及び吸着実験用の試料とした。
・ Synthesis of calcium hydroxide phosphate:
The calcium phosphate ceramic according to the present invention was synthesized by the following procedures (1) to (5).
(1) Nitrogen gas was circulated at 3.0 L / min for 30 minutes, and 200 g of distilled water from which dissolved oxygen and dissolved carbon dioxide gas were removed was added to 23 g of calcium nitrate tetrahydrate (Ca (NO 3 ) 2 / 4H. 2 O) was added and dissolved by stirring to prepare a 0.5 mol / L calcium nitrate aqueous solution. In this aqueous solution, zinc nitrate hexahydrate (Zn (NO 3 ) 2 / 6H 2 O) was dissolved so that the concentration of zinc nitrate was 0 to 0.048 mol / L, and nine types of zinc nitrate concentrations were dissolved. 60 ° C. aqueous solutions having The pH of the obtained aqueous solution is 6 when the concentration of zinc nitrate is 0 mol / L, and is 5 when the concentration of zinc nitrate is 0.048 mol / L. The pH value is shown.
(2) 7.9 g of diammonium hydrogen phosphate ((NH 4 ) 2 HPO 4 ) was added to 200 mL of distilled water from which nitrogen gas was passed at 3.0 L / min for 30 minutes to remove dissolved oxygen and dissolved carbon dioxide gas. It melt | dissolved and 0.3 mol / L diammonium hydrogenphosphate aqueous solution was prepared. To this aqueous solution, 28 wt% aqueous ammonia was added to obtain a room temperature aqueous solution whose pH was adjusted to 10.
(3) Using a liquid feed pump, add the phosphate-containing aqueous solution obtained in (2) at a flow rate of 3.0 mL / min to the aqueous calcium nitrate solution having a different zinc ion concentration obtained in (1). The mixture was stirred and mixed while maintaining the temperature at 60 ° C. The pH of the mixed solution when zinc nitrate was contained at 0.048 mol / L was 5.4.
(4) The obtained mixed solution was aged by stirring at 60 ° C. for 24 hours. The solid content thus produced was separated with a centrifuge, the supernatant liquid was discarded, distilled water was added, stirred and washed, and then centrifuged again. This washing operation was repeated three times.
(5) The obtained solid content was dried at 105 ° C. for 24 hours. After drying, the powder obtained by grinding in an alumina mortar was used as a sample for analysis and adsorption experiments.
以上のようにして得られた9種類の水酸化リン酸カルシウム試料につき、化学組成、結晶子径及び比表面積について表1にまとめて示す。 Table 1 summarizes the chemical composition, crystallite diameter and specific surface area of the nine types of calcium hydroxide phosphate samples obtained as described above.
亜鉛、カルシウム及びリンの含有量は、高周波誘導結合プラズマ(ICP)発光分光分析によって求めた。亜鉛含有量の異なる水酸化リン酸カルシウムについて、X線回折測定した結果を図1に示す。図1からわかるように、X線回折パターンは全てヒドロキシアパタイトに帰属され、回折ピーク幅は、亜鉛含有量の増加に伴い増加した。(002)面の回折に帰属されるピークの半値幅から算出された結晶子径と亜鉛含有量との関係を図2に示す。亜鉛含有量が増加するにつれて、結晶子径は42nmから16nmに低下した。また、比表面積は、島津製作所製「GEMINI2370 Micromeritics」を用いて、液体窒素温度における窒素吸着等温線を測定し、BET法により算出した。亜鉛含有量が増加するにつれて、比表面積は57m2/gから202m2/gに増加した。さらに、透過型電子顕微鏡により水酸化リン酸カルシウム粒子の大きさと形態の観察も行った。その結果を図3に示す。亜鉛含有量が大きくなるにつれて結晶サイズが小さくなっていることがわかる。 The contents of zinc, calcium and phosphorus were determined by high frequency inductively coupled plasma (ICP) emission spectroscopy. FIG. 1 shows the result of X-ray diffraction measurement of calcium hydroxide phosphates having different zinc contents. As can be seen from FIG. 1, all the X-ray diffraction patterns were attributed to hydroxyapatite, and the diffraction peak width increased with increasing zinc content. FIG. 2 shows the relationship between the crystallite diameter calculated from the half width of the peak attributed to diffraction on the (002) plane and the zinc content. As the zinc content increased, the crystallite size decreased from 42 nm to 16 nm. The specific surface area was calculated by BET method by measuring nitrogen adsorption isotherm at liquid nitrogen temperature using “GEMINI2370 Micromeritics” manufactured by Shimadzu Corporation. As the zinc content increased, the specific surface area increased from 57 m 2 / g to 202 m 2 / g. Furthermore, the size and form of the calcium hydroxide phosphate particles were also observed with a transmission electron microscope. The result is shown in FIG. It can be seen that the crystal size decreases as the zinc content increases.
・アルブミン及びβ2−MGの吸着性評価
濃度4.0mg/dLのβ2−MGと濃度7.0g/dLの牛血清アルブミン(BSA)を含有する生理食塩水1mL(液1)と、0.1gの水酸化リン酸カルシウム試料を含有する生理食塩水1mL(液2)を混合して、濃度2.0mg/dLのβ2−MGと、濃度3.5g/dLの牛血清アルブミンと、水酸化リン酸カルシウム試料0.1gとを含有する2mLの混合液を作製した。こうして得られた混合液を37°Cに保持した湯浴中で6時間振とうしてから、孔径0.45μmのセルロースアセテートフィルターに通して水酸化リン酸カルシウムを濾別し、評価用水溶液(6時間)を得た。また、ブランク試験用として、上記(液1)1mLと、水酸化リン酸カルシウム試料を含有しない生理食塩水1mLとを混合して、濃度2.0mg/dLのβ2−MGと、濃度3.5g/dLの牛血清アルブミンを含有する2mLのブランク水溶液(0分)を作製した。こうして得られたブランク水溶液(0分)を37°Cに保持した湯浴中で6時間振とうして、ブランク水溶液(6時間)を得た。こうして得られた評価用水溶液(6時間)及びブランク水溶液(0分)中のβ2−MG及びBSAを定量することによって、それらの吸着量を求めた。
The albumin and beta 2 -MG absorptive rating concentration 4.0 mg / dL of beta 2 -MG and concentration 7.0 g / dL of bovine serum albumin (BSA) containing saline 1 mL (liquid 1), 0 1 mL of physiological saline (Liquid 2) containing 1 g of calcium hydroxide phosphate sample was mixed, β 2 -MG having a concentration of 2.0 mg / dL, bovine serum albumin having a concentration of 3.5 g / dL, and hydroxylated A 2 mL mixed solution containing 0.1 g of calcium phosphate sample was prepared. The mixture thus obtained was shaken in a hot water bath maintained at 37 ° C. for 6 hours, passed through a cellulose acetate filter having a pore diameter of 0.45 μm to separate calcium hydroxide phosphate, and an aqueous solution for evaluation (6 hours). ) Further, for blank test, 1 mL of the above (Liquid 1) and 1 mL of physiological saline not containing a calcium hydroxide phosphate sample were mixed, β 2 -MG having a concentration of 2.0 mg / dL, and a concentration of 3.5 g / A 2 mL blank aqueous solution (0 min) containing dL bovine serum albumin was made. The blank aqueous solution (0 minutes) thus obtained was shaken in a hot water bath maintained at 37 ° C. for 6 hours to obtain a blank aqueous solution (6 hours). By quantifying β 2 -MG and BSA in the aqueous solution for evaluation (6 hours) and the blank aqueous solution (0 minutes) thus obtained, their adsorption amounts were determined.
β2−MGの定量には、三洋化成工業(株)製「グラザイムβ2-Microgloburin - EIA TEST」を用いた。試料の水溶液を、酵素免疫測定法(Enzyme immuno assay;EIA法)により発色させ、波長492nmの吸光度を調べ、検量線からβ2−MG濃度を算出した。β2−MG吸着量は、ブランク水溶液(0分)とブランク水溶液(6時間)との間でβ2−MGの濃度差がないことを確認した後、評価用水溶液(6時間)のβ2−MG濃度と、ブランク水溶液(0分)のβ2−MG濃度の差から求めた。BSAの定量には、和光純薬工業(株)製「アルブミンB−テストワコー」を用いた。試料の水溶液を、ブロムクレゾールグリーン法(Bromcresol green assay;BCG法)により発色させ、波長630nmの吸光度を調べ、検量線からBSA濃度を算出した。BSA吸着量は、ブランク水溶液(0分)とブランク水溶液(6時間)との間でBSAの濃度差がないことを確認した後、評価用水溶液(6時間)のBSA濃度と、ブランク水溶液(0分)のBSA濃度の差から求めた。実験は、同一試料について3回繰り返し(n=3)、平均値および標準偏差を求めた。吸光度の測定には、島津製作所製紫外可視分光光度計「UV-2550」を用いた。 The quantification of the β 2 -MG, Sanyo Chemical Industries, Ltd. "Gurazaimu β 2 -Microgloburin - EIA TEST" was used. The aqueous solution of the sample was developed by an enzyme immunoassay (EIA method), the absorbance at a wavelength of 492 nm was examined, and the β 2 -MG concentration was calculated from a calibration curve. beta 2 -MG adsorption amount, after confirming that there is no density difference of beta 2 -MG between the blank aqueous solution (0 minute) and the blank solution (6 hours), the evaluation solution (6 hours) beta 2 It calculated | required from the difference of -MG density | concentration and (beta) 2- MG density | concentration of blank aqueous solution (0 minute). For determination of BSA, “Albumin B-Test Wako” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. The aqueous solution of the sample was colored by the Bromcresol green assay (BCG method), the absorbance at a wavelength of 630 nm was examined, and the BSA concentration was calculated from the calibration curve. After confirming that there is no difference in BSA concentration between the blank aqueous solution (0 minutes) and the blank aqueous solution (6 hours), the BSA adsorption amount was compared with the BSA concentration of the evaluation aqueous solution (6 hours) and the blank aqueous solution (0 Min) from the difference in BSA concentration. The experiment was repeated three times for the same sample (n = 3), and the average value and standard deviation were determined. For the measurement of absorbance, an ultraviolet-visible spectrophotometer “UV-2550” manufactured by Shimadzu Corporation was used.
また、それぞれのタンパク質溶液中で吸着されて除去されたβ2−MG及びアルブミンの割合をそれぞれの吸着率(%)として求めた。そして、アルブミンの吸着率に対するβ2−MGの吸着率の比を選択性として得た。β2−MG吸着量、β2−MG吸着率、アルブミン吸着量、アルブミン吸着率及び選択性を表2にまとめて示す。また、β2−MG吸着率及びアルブミン吸着率を亜鉛含有量に対してプロットしたグラフを図4に示す。 Further, the ratio of β 2 -MG and albumin that were adsorbed and removed in each protein solution was determined as the respective adsorption rate (%). Then, the ratio of the adsorption rate of β 2 -MG to the adsorption rate of albumin was obtained as selectivity. Table 2 summarizes the β 2 -MG adsorption amount, β 2 -MG adsorption rate, albumin adsorption amount, albumin adsorption rate and selectivity. Moreover, the graph which plotted (beta) 2- MG adsorption rate and albumin adsorption rate with respect to zinc content is shown in FIG.
選択的血液吸着剤に要求される物性は、血液中の有用成分の吸着量が可能な限り微量であり、標的となる病因物質を効率的に除去することである。上記試験では、血液中の数多くの有用物質のうちから、透析膜の評価でも使用されるアルブミンを選んで、病因物質であるβ2−MGとともにその吸着率を評価した。図4から明らかなように、従来のヒドロキシアパタイト(亜鉛含有量0重量%)と比較して、亜鉛を含有する水酸化リン酸カルシウムでは、亜鉛含有量が2重量%までは、アルブミンの吸着率は、わずかに増加するが、2重量%を超えると顕著に低下した。その結果、臨床的には望むべき方向に改善されることが確認された。このわずかなアルブミン吸着率の増加の原因は明らかではないが、透過型電子顕微鏡観察によると、この亜鉛含有量が2重量%付近でのみ、針状と粒状の二種類の形態の異なるアパタイト粒子が確認されたことから、結晶形態の違いの影響があると考えられる。更に、本発明の主目的であるβ2−MGの吸着率は、亜鉛含有量が増加するにしたがって顕著に90%以上にまで向上した。以上のように、理想的な選択的吸着性が発現することが明らかになった。 The physical property required for the selective blood adsorbent is that the amount of adsorption of useful components in the blood is as small as possible, and the target pathogenic substance is efficiently removed. In the above test, albumin used in the evaluation of the dialysis membrane was selected from many useful substances in blood, and its adsorption rate was evaluated together with the pathogenic substance β 2 -MG. As is clear from FIG. 4, compared with conventional hydroxyapatite (zinc content 0 wt%), calcium hydroxide containing zinc has an albumin adsorption rate of up to 2 wt% zinc, Slightly increased, but significantly decreased above 2% by weight. As a result, it was confirmed that clinical improvement was achieved in the desired direction. The cause of this slight increase in albumin adsorption rate is not clear, but according to observation with a transmission electron microscope, only when the zinc content is around 2% by weight, apatite particles with two different forms, acicular and granular, are present. From the confirmation, it is considered that there is an influence of the difference in crystal form. Furthermore, the adsorption rate of β 2 -MG, which is the main object of the present invention, was significantly improved to 90% or more as the zinc content increased. As described above, it was revealed that ideal selective adsorptivity is expressed.
この理由については明らかでないが、ヒドロキシアパタイトの表面に亜鉛イオンがナノレベルで分布することによって、従来のヒドロキシアパタイトと比較してアルブミンと分子末端のカルボシキル基との静電的相互作用が弱まったと考えられる。逆にβ2−MGの吸着に対しては有利に働き、その吸着率が向上するという望ましい結果となった。また、ヒドロキシアパタイトの合成時に亜鉛イオンを添加することにより、生成するアパタイトの結晶子径が小さくなると同時に、比表面積が高くなった。これにより、単位重量当たりの有効吸着面積が増大することによって、β2−MGの吸着能が向上している。また、透過型電子顕微鏡観察によって観察された結晶形態学的な均質性を考えた場合には亜鉛含有量が2重量%以上になる条件が望ましいと考えられる。 Although the reason for this is not clear, it is thought that the electrostatic interaction between albumin and the carboxyl group at the end of the molecule is weakened by the zinc ion distribution on the surface of hydroxyapatite compared to conventional hydroxyapatite. It is done. On the contrary, it was advantageous for the adsorption of β 2 -MG, and the adsorbing rate was improved. Moreover, by adding zinc ions during the synthesis of hydroxyapatite, the crystallite size of the apatite to be produced was reduced and the specific surface area was increased. Thereby, the adsorption capacity of β 2 -MG is improved by increasing the effective adsorption area per unit weight. Further, when considering the crystal morphological homogeneity observed by transmission electron microscope observation, it is considered that the condition that the zinc content is 2% by weight or more is desirable.
前述の特許文献6では、β2−MG吸着量が183μg/g、β2−MG吸着率が40%以下、アルブミン吸着量が7.5mg/g、アルブミン吸着率が10〜20%程度、そして両者の選択性が約1.5倍であった。これに対し、本発明の生体物質吸着剤では、もっとも優秀な結果を与えた試料では、β2−MG吸着量が380μg/g以上、β2−MG吸着率が90%以上、アルブミン吸着量が2mg/g程度、アルブミン吸着率が数%程度、そして両者の選択性は数十倍以上から数百倍であった。これらを対比すれば、吸着特性が大幅に改善されたことが明らかであり、本発明の生体物質吸着剤が極めて有用であることがわかる。 In the above-mentioned Patent Document 6, β 2 -MG adsorption amount is 183 μg / g, β 2 -MG adsorption rate is 40% or less, albumin adsorption amount is 7.5 mg / g, albumin adsorption rate is about 10 to 20%, and The selectivity between the two was about 1.5 times. On the other hand, in the biomaterial adsorbent of the present invention, in the sample that gave the most excellent result, the β 2 -MG adsorption amount was 380 μg / g or more, the β 2 -MG adsorption rate was 90% or more, and the albumin adsorption amount was About 2 mg / g, the albumin adsorption rate was about several percent, and the selectivity of both was several tens to several hundred times. By comparing these, it is clear that the adsorption characteristics are greatly improved, and it can be seen that the biological material adsorbent of the present invention is extremely useful.
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