JP4377602B2

JP4377602B2 - Method for producing conjugate of colloidal gold and antibody

Info

Publication number: JP4377602B2
Application number: JP2003084341A
Authority: JP
Inventors: 智成南澤
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2023-03-26
Also published as: JP2004294157A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金コロイドと抗体の結合体を製造する方法、該方法により作製される結合体を使用する免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫測定法等において、試料中のウイルス等の抗原を視覚的に検出するため、抗体が結合した金コロイド結合体が利用されている。従来、金コロイドと抗体との結合体の調製はｐＨ７〜１０程度の中性から弱アルカリ状態で行われていた（例えば、非特許文献１参照）。しかし、従来の方法で作成した金コロイド−抗体結合体を使用して、免疫測定法により前記抗体の抗原の検出を行うと、十分な感度が得られないという問題があった。この原因として金コロイドと抗体の結合効率が悪いという点が推測された。
【０００３】
【非特許文献１】
イムノゴールド法、横田貞記、藤森修編、ソフトサイエンス社発行、平成４年４月２０日、ｐ．３６−４３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率よく結合された金コロイドと抗体との結合体を製造する方法及び抗体により抗原の検出を感度良く行える免疫測定方法、を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、金コロイド溶液のｐＨを酸性に調整し、その後抗体溶液と混合することを特徴とする、金コロイドと抗体の結合体を製造する方法により解決されることが見出された。
上記方法は、ｐＨが４．２〜６．７の範囲内であることが特に好ましい。
また、本発明は、上記抗体が抗インフルエンザウイルス抗体である、上記方法に関する。また本発明は、上記抗インフルエンザウイルス抗体が抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体である、上記方法に関する。
また、上記課題は、上記方法により金コロイドと抗体の結合体を製造し、これを使用した免疫測定方法により解決される。
従来の方法で作成した金コロイド−抗体結合体を使用して、免疫測定法により前記抗体の抗原の検出を行うと、十分な感度が得られないのに対し、本発明の方法により、金コロイド−抗体結合体を高い効率で製造することができる。また、本発明の方法により製造される金コロイドと抗体との結合体を免疫測定法において使用することにより、感度の高い測定を行うことができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下本発明の方法を説明する。
（金コロイド溶液）
本発明の方法は、金コロイド溶液と抗体溶液とを混合して金コロイドと抗体の結合体を作製する方法において、金コロイド溶液を、弱酸性、好ましくは４．２〜６．７に調製することを特徴とする。
例えば、金コロイド溶液は通常、ｐＨ３．５〜４．５程度の酸性溶液で販売されているので、これに緩衝液、例えばクエン酸緩衝液、燐酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を加えて、室温において、弱酸性、好ましくは４．２〜６．７、より好ましくは５．７〜６．７、さらに好ましくは６．２〜６．７に調製する。上記ｐＨの範囲内では、金コロイドと抗インフルエンザウイルス抗体の結合効率がより高くなるため好ましい。使用する金コロイド溶液の濃度は特に限定されないが、例えば塩化金酸として０．０１（w/v）％程度である。金コロイド溶液を作製する溶媒は、水であることが好ましい。
【０００７】
（抗体溶液）
本発明の方法において、金コロイドと結合させて結合体を作成する抗体としては、抗インフルエンザウイルス抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＥＢＶ抗体、抗ＮＬＶノーウォーク様ウイルス抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ロタウイルス抗体、抗パルボウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体等の抗ウイルス抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗溶連菌抗体、抗百日咳菌抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗レプトスピラ抗体、抗トレポネーマ・パリダム抗体、抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体、抗ボレリア抗体、抗炭疽菌抗体、抗ＭＲＳＡ抗原、抗大腸菌抗体、抗サルモネラ抗体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体等の抗細菌抗体、抗マイコプラズマ脂質抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗体、抗ＲＦ抗体、あるいは、ヒト繊毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、ベロトキシン等の細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬などに対する抗体、または、病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。抗インフルエンザウイルス抗体としては、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が挙げられる。これらの中で、抗インフルエンザウイルス抗体、特に抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体と金コロイドの結合体との結合体の作成の効率が従来の方法よりも非常に良好となるため、好ましい。
【０００８】
抗体の濃度は、抗体の種類等により適宜決定することができる。例えば、公知の方法により作製した抗インフルエンザウイルス抗体は、適当な濃度、好ましくは５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬになるように調製する。使用する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など、どのような抗体であってもよい。このとき使用する溶媒は特に限定しないが、例えばホウ酸ナトリウム溶液で透析してもよい。
【０００９】
（金コロイド溶液と抗体溶液の結合）
弱酸性に調製した金コロイド溶液に、上述した抗体溶液を加える。例えば、抗インフルエンザウイルス抗体を使用した場合、抗体の最終濃度が１〜１０μｇ／ｍＬとなるような量の抗インフルエンザウイルス抗体を加えることが好ましい。１μｇ／ｍＬ以下であると感度不足となり、また１０μｇ／ｍＬ以上であると、抗体が架橋し合い金コロイドが凝集する場合がある。また金コロイドに結合しなかった抗体が残った場合、抗体が結合した金コロイドと抗原の取り合い（競合）してしまい感度低下の原因となる。
上記方法により、金コロイド溶液と抗体溶液の結合体の溶液が得られる。この溶液から金コロイド溶液と抗体溶液の結合体を例えば以下のようにして単離することができる。
【００１０】
溶液を一定時間置いた後、ブロッキング剤としてＢＳＡ等を添加し、穏やかに攪拌した後、全量を遠心管に移し、遠心する。遠心後、上清を吸引廃棄し、沈殿している抗体結合金コロイドを得ることができる。この抗体結合金コロイドに緩衝液を加え、浮遊させて、フロースルーアッセイ法等の免疫測定法に使用することができる。
【００１１】
（免疫測定法）
免疫測定法とは、免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を免疫学的手法により検出または定量する分析方法の総称として用いられる。具体的には、免疫拡散法、酵素免疫測定法等種々の方法が実用化されている。このような免疫測定法の中で、フロースルーアッセイ方法は、ラテラルフロー式、タンジェンシャルフロー式等と並ぶメンブランを使用したイムノクロマトグラフィー法の１種であり、操作が簡便で一般的な検査の場に普及している。本発明の方法により製造される金コロイドと抗体との結合体は、フロースルーアッセイ方法のような簡易式の免疫測定法において非常に有用である。
フロースルーアッセイ方法による免疫測定方法についての詳細は、例えば“Guide to Diagnostic Rapid Test Device Components", 2^nd edition, published by Schleicher & Schuell company, January 2000, Edited by Lisa Vickers, p6-8、及び特公平７−３４０１６号（ハイブリテックの特許）に記載されている。
本発明の結合方法により作製された金コロイドと抗体との結合体は、上記免疫測定法において標識化抗体として使用すると、高い結合効率で結合体が生成しているため、低濃度の抗原を感度良く検出することができる。
【００１２】
【実施例】
[実施例１]
１．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）は、３７℃でインキュベーター中で維持し、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いた。ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したたＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からアフィニティークロマトグラフィー法によってＩｇＧを精製した（クローン名９Ｄ１２）。
【００１３】
２．金コロイドのｐＨによる抗体の結合効率
以下のようにして、ｐＨによる金コロイドと抗体の結合効率を調べた。
Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原（ＮＰ：Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、インフルエンザウイルスの核タンパク）を３μｇ／ｍＬになるように調整し、９６穴プレートに１００μＬ／穴づつ入れ、４℃で１７時間静置した。１７時間後、プレートに吸着しなかった余分なＢ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を除去、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳ（−）ｐＨ７．０で洗浄しＢＳＡ，ＰＢＳを含む緩衝液０．５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳ（−）ｐＨ７．０でブロッキングを行った。ブロッキングは４℃で１７時間静置することにより行った。
【００１４】
９ｍＬの金コロイド液に１００ｍＭのクエン酸緩衝液、燐酸緩衝液、又はホウ酸緩衝液のいずれかの液１ｍＬ加え、表１に示される各ｐＨに調整した金コロイド溶液を調製した。次に、１００μｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体２００μＬ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）を混ぜ合わせ、５分間室温で放置した。５分後、ブロッキング剤としてＢＳＡを最終濃度が１％となるような量において添加し、１０分間穏やかに撹拌した。１０分後、遠心管に移し、７３００ｒｐｍにて３０分間の遠心を行い、遠心上清を一定間隔で希釈したものを、上記光源を吸着させたプレートに入れた。
また、測定吸光度から抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の量を波長２８０ｎｍにおける吸光度からもとめ、一定間隔で希釈したものを、上述したように抗原を吸着させたプレートに入れた。
【００１５】
上記遠心上清サンプルまたは検量線作成のための抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の希釈液１００μＬをプレートに入れた後、３７℃で、３０分間反応を行った。３０分後、未反応物を除去、洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を２０００倍に希釈し１００μＬづつ各穴に入れ、３７℃で、３０分間反応させた。３０分後、未反応物を除去、洗浄した。次に基質液ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）を１００μＬづつ各穴に入れ、３７℃で、１５分間反応させた。１５分後、０．６Ｍ硫酸を１００μＬづつ各穴に入れ、反応を停止した。反応停止後、吸光光度計にて４５０ｎｍ，６３０ｎｍの吸光を測定した。
【００１６】
検量線作成のためにアッセイを行った抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の各希釈での吸光度を横軸に、また各希釈での抗体量を縦軸に取り検量線を作成した。
作成した検量線から金コロイド溶液に抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を感作した後の、遠心上清に存在する抗体量を求めた。感作する時の抗体の最終濃度（初期抗体量）が２．０μｇ／ｍＬであることから、２．０μｇ／ｍＬから未感作抗体量（遠心上清サンプル中の抗体量）を引くことで金コロイドに結合した抗体量を算定した。
その結果、表１に示すように従来の方法（ｐＨ９．２）に比べ、本発明の方法（ｐＨ４．２〜６．７）により、約１．３〜約２．３倍の抗体量が金コロイドに結合した。
【００１７】
表１

【００１８】
[実施例２]
フロースルー型デバイスを用いた、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出
▲１▼固相デバイスの作成
図１のようなデバイス装置のアダプターホールＡを通して、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（クローン名Ａ３）を１２μＬ塗布し、４５℃、４０分間乾燥器で乾燥させた。クローンの製作と精製は実施例１で示した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製と同一の方法で行なった。
▲２▼抗体結合金コロイドの作成
９ｍＬの金コロイド溶液に１００ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．７、６．２）、１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．７），１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）をそれぞれ１ｍＬ加えた。次に、１００μｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体２００μＬ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）を混ぜ合わせ、５分間室温で放置した。５分後、ブロッキング剤として１０％ＢＳＡを１ｍＬ添加し、１０分間穏やかに撹拌した。１０分後、遠心管に移し、７３００ｒｐｍにて３０分間の遠心を行い、遠心後上清を吸引除去し沈渣を１％ＢＳＡ＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）０．９ｍＬで浮遊させた。
【００１９】
▲３▼サンプル
Ｂ型インフルエンザウイルスの希釈系列を５％ＢＳＡ＋４．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋０．１ｍｇ／ｍＬＨＢＲ１＋１５０ｍＭＮａＣｌ含むリン酸緩衝Ｂｆ（サンプル希釈液）で調製した。
▲４▼評価
サンプル５００μＬにＰＢＳ（−）で１０倍希釈した抗体結合金コロイド液を１２５μＬ加え混合し１０分間静置した。１０分後０．２２μｍろ過し、デバイスへ５００μＬ滴下した。液が全てメンブランへ吸収された後アダプターを外しシグナルの有無を判定した。
▲５▼判定結果

【００２０】
【発明の効果】
本発明の方法により、金コロイドと抗体との結合を効率よく行うことができ、インフルエンザウイルスの検出を感度良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で用いたフロースルー型デバイスの平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’切断端面図である。
【符号の説明】
Ａ：穴
ａ：アダプター
ｂ：シート状担体[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a conjugate of colloidal gold and an antibody, and an immunoassay method using the conjugate produced by the method.
[0002]
[Prior art]
In an immunoassay or the like, a colloidal gold conjugate bound with an antibody is used to visually detect an antigen such as a virus in a sample. Conventionally, the preparation of a conjugate of colloidal gold and an antibody has been performed in a neutral to weakly alkaline state with a pH of about 7 to 10 (see, for example, Non-Patent Document 1). However, when the colloidal gold-antibody conjugate prepared by the conventional method is used to detect the antigen of the antibody by immunoassay, there is a problem that sufficient sensitivity cannot be obtained. This was presumed to be due to the poor binding efficiency between the colloidal gold and the antibody.
[0003]
[Non-Patent Document 1]
Immunogold method, edited by Sadaki Yokota, Osamu Fujimori, published by Soft Science, April 20, 1992, p. 36-43
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for producing a conjugate of a colloidal gold colloid and an antibody that are efficiently bound, and an immunoassay method that can detect an antigen with high sensitivity using the antibody.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
It has been found that the above-mentioned problems are solved by a method for producing a gold colloid-antibody conjugate characterized by adjusting the pH of a colloidal gold solution to an acid and then mixing with the antibody solution.
In the above method, the pH is particularly preferably in the range of 4.2 to 6.7.
The present invention also relates to the above method, wherein the antibody is an anti-influenza virus antibody. The present invention also relates to the above method, wherein the anti-influenza virus antibody is an anti-influenza B virus antibody.
Moreover, the said subject is solved by the immunoassay method which manufactures the conjugate | bonded_body of a gold colloid and an antibody with the said method, and uses this.
When the antigen of the antibody is detected by immunoassay using a colloidal gold-antibody conjugate prepared by a conventional method, sufficient sensitivity cannot be obtained. -Antibody conjugates can be produced with high efficiency. Further, by using a conjugate of a colloidal gold and an antibody produced by the method of the present invention in an immunoassay, highly sensitive measurement can be performed.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method of the present invention will be described below.
(Gold colloid solution)
In the method of the present invention, a colloidal gold solution and an antibody solution are mixed to produce a conjugate of colloidal gold and an antibody. The colloidal gold solution is prepared to be weakly acidic, preferably 4.2 to 6.7. It is characterized by that.
For example, a colloidal gold solution is usually sold as an acidic solution having a pH of about 3.5 to 4.5, so a buffer solution such as a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, etc. is added to the solution. It is weakly acidic at room temperature, preferably 4.2 to 6.7, more preferably 5.7 to 6.7, and even more preferably 6.2 to 6.7. Within the above pH range, the gold colloid and the anti-influenza virus antibody have a higher binding efficiency, which is preferable. Although the density | concentration of the gold colloid solution to be used is not specifically limited, For example, it is about 0.01 (w / v)% as chloroauric acid. The solvent for preparing the colloidal gold solution is preferably water.
[0007]
(Antibody solution)
In the method of the present invention, anti-influenza virus antibody, anti-adenovirus antibody, anti-RS virus antibody, anti-HAV antibody, anti-HBc antibody, anti- HCV antibody, anti-HIV can be used as an antibody that forms a conjugate by binding with gold colloid. Antibodies, anti-EBV antibodies, anti-NLV norwalk-like virus antibodies , anti-HBe antibodies, anti-HBs antibodies, anti-adenovirus antibodies, anti-rotavirus antibodies, anti-parvovirus antibodies, anti-RS virus antibodies , anti- virus antibodies, anti-chlamydia Trachomatis antibody, anti-streptococcus antibody, anti-pertussis antibody, anti-helicobacter pylori antibody, anti-leptospira antibody, anti-treponema paridum antibody, anti-toxoplasma gondii antibody, anti-borrelia antibody, anti-anthrax antibody, anti-MRSA antigen , anti-Escherichia coli Antibody, anti-Salmonella antibody, anti-staphylococcal antibody, anti-campyloba Tar antibody, anti-Clostridium perfringens antibody, antibacterial antibody, such Kochoen Vibrio antibody, anti-mycoplasma lipid antibody, anti-human transferrin antibody, anti-human albumin antibody, anti-human immunoglobulin antibody, anti-microglobulin antibody, anti-CRP antibody, anti Troponin antibody, anti-HCG antibody, anti-Chlamydia trachomatis antibody, anti-streptolysin O antibody, anti-Helicobacter pylori antibody, anti-β-glucan antibody , anti- RF antibody, peptide hormones such as human cilia gonadotropin, steroid hormones, etc. steroids, physiologically active amines such as epinephrine and morphine, vitamins such as vitamin B, pro Stan prostaglandins, antibiotics such as tetracycline, toxins bacterial such as verotoxin is produced, various tumor markers, for agricultural chemicals Antibody or disease Nonlimiting examples include nucleotides complementary to nucleic acid components derived from the original microorganism. Examples of anti-influenza virus antibodies include anti-influenza A virus antibodies and anti-influenza B virus antibodies. Among these, the efficiency of producing a conjugate of an anti-influenza virus antibody, particularly a conjugate of an anti-influenza B virus antibody and a colloidal gold is preferable because it is much better than the conventional method.
[0008]
The concentration of the antibody can be appropriately determined depending on the type of antibody. For example, the anti-influenza virus antibody produced by a known method is prepared to have an appropriate concentration, preferably 50 to 200 μg / mL, preferably 100 μg / mL. The antibody used may be any antibody such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Although the solvent used at this time is not specifically limited, For example, you may dialyze with a sodium borate solution.
[0009]
(Bonding of gold colloid solution and antibody solution)
The antibody solution described above is added to a colloidal gold solution prepared to be weakly acidic. For example, when an anti-influenza virus antibody is used, it is preferable to add an anti-influenza virus antibody in such an amount that the final concentration of the antibody is 1 to 10 μg / mL. If it is 1 μg / mL or less, the sensitivity is insufficient, and if it is 10 μg / mL or more, the antibody may be cross-linked and the colloidal gold may be aggregated. Further, when an antibody that does not bind to the colloidal gold remains, the colloidal gold colloid to which the antibody is bound and the antigen collide (compete), causing a decrease in sensitivity.
By the above method, a solution of a conjugate of a gold colloid solution and an antibody solution is obtained. The conjugate of the colloidal gold solution and the antibody solution can be isolated from this solution, for example, as follows.
[0010]
After leaving the solution for a certain time, BSA or the like is added as a blocking agent, and after gently stirring, the entire amount is transferred to a centrifuge tube and centrifuged. After centrifugation, the supernatant is aspirated and discarded, and the precipitated antibody-bound gold colloid can be obtained. A buffer solution can be added to the antibody-bound gold colloid, suspended, and used for immunoassay methods such as flow-through assay.
[0011]
(Immunoassay)
An immunoassay is a general term for analysis methods that detect or quantify an analyte in a sample by an immunological technique using the specificity of an immune reaction. Specifically, various methods such as an immunodiffusion method and an enzyme immunoassay method have been put into practical use. Among such immunoassays, the flow-through assay method is one of immunochromatography methods using membranes along with the lateral flow method, the tangential flow method, etc. Is popular. The conjugate of colloidal gold and antibody produced by the method of the present invention is very useful in a simple immunoassay method such as a flow-through assay method.
For more information about the immunoassay method according to the flow-through assay method, such as "Guide to Diagnostic Rapid Test Device Components ", 2 nd edition, published by Schleicher & Schuell company, January 2000, Edited by Lisa Vickers, p6-8, and especially fair 7-34016 (Hybrtech patent).
The conjugate of colloidal gold and antibody prepared by the binding method of the present invention produces a conjugate with high binding efficiency when used as a labeled antibody in the immunoassay described above, so that a low concentration of antigen is sensitive. It can be detected well.
[0012]
【Example】
[Example 1]
1. Preparation and purification of anti-influenza B virus NP monoclonal antibody (mouse) Immunized with purified influenza B virus antigen and excised from a BALB / c mouse maintained for a certain period of time, the method of Keller et al., Nature (Kohler et al., Nature) , Vol.256, p495-497 (1975)) and fused with mouse myeloma cells (P3 × 63). The obtained fused cells (hybridomas) were maintained in an incubator at 37 ° C., and influenza B virus NP antigen solid phase plates were used. The cells were purified (monocloned) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA. The obtained cell line was intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by affinity chromatography (clone name 9D12).
[0013]
2. Binding efficiency of antibody due to pH of colloidal gold The binding efficiency of colloidal gold and antibody due to pH was examined as follows.
Influenza B virus NP antigen (NP: Nucleoprotein, nucleoprotein of influenza virus) was adjusted to 3 μg / mL, and 100 μL / well was placed in a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 17 hours. After 17 hours, excess influenza B virus NP antigen not adsorbed on the plate was removed, washed with PBS (−) pH 7.0 containing 0.05% Tween 20 and washed with BSA, PBS containing buffer 0.5% BSA, Blocking was performed with PBS (−) pH 7.0 containing 0.05% Tween20. Blocking was performed by leaving at 4 ° C. for 17 hours.
[0014]
1 mL of any of 100 mM citrate buffer, phosphate buffer, or borate buffer was added to 9 mL of gold colloid solution to prepare gold colloid solutions adjusted to each pH shown in Table 1. Next, 200 μL of anti-influenza B virus NP antibody adjusted to 100 μg / mL (final concentration 2 μg / mL) was mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, BSA as a blocking agent was added in an amount to give a final concentration of 1% and gently stirred for 10 minutes. After 10 minutes, the mixture was transferred to a centrifuge tube, centrifuged at 7300 rpm for 30 minutes, and the centrifuged supernatant diluted at regular intervals was placed in a plate on which the light source was adsorbed.
Further, the amount of anti-influenza B virus NP monoclonal antibody was determined from the absorbance at a wavelength of 280 nm from the measured absorbance, and diluted at regular intervals, and placed in the plate on which the antigen was adsorbed as described above.
[0015]
The centrifugal supernatant sample or 100 μL of a diluted solution of anti-influenza B virus NP monoclonal antibody for preparing a calibration curve was put on a plate, and then reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, unreacted substances were removed and washed. Next, a peroxidase-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody (manufactured by ZYMED LABORATORIES) was diluted 2000 times, placed in 100 μL aliquots, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, unreacted substances were removed and washed. Next, 100 μL of the substrate solution TMB (tetramethylbenzidine) was added to each well and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. After 15 minutes, 100 μL of 0.6 M sulfuric acid was added to each well to stop the reaction. After stopping the reaction, absorbance at 450 nm and 630 nm was measured with an absorptiometer.
[0016]
A calibration curve was prepared by taking the absorbance at each dilution of the anti-influenza B virus NP monoclonal antibody assayed for preparing a calibration curve on the horizontal axis and the amount of antibody at each dilution on the vertical axis.
The amount of antibody present in the centrifugal supernatant after sensitizing the anti-type B influenza virus NP monoclonal antibody to the gold colloid solution from the prepared calibration curve was determined. Since the final antibody concentration (initial antibody amount) at the time of sensitization is 2.0 μg / mL, subtract the amount of unsensitized antibody (the amount of antibody in the centrifugal supernatant sample) from 2.0 μg / mL. The amount of antibody bound to the gold colloid was calculated.
As a result, as shown in Table 1, compared to the conventional method (pH 9.2), the method (pH 4.2 to 6.7) of the present invention produced about 1.3 to 2.3 times the amount of antibody as gold. Bound to colloid.
[0017]
Table 1

[0018]
[Example 2]
Detection of influenza B virus using a flow-through device (1) Preparation of solid-phase device 12 μL of anti-influenza B virus monoclonal antibody (clone name A3) was applied through adapter hole A of the device shown in FIG. And dried in a dryer at 45 ° C. for 40 minutes. Production and purification of the clones were performed in the same manner as the production and purification of the anti-influenza B virus NP monoclonal antibody (mouse) shown in Example 1.
(2) Preparation of antibody-bound gold colloid To 9 mL of gold colloid solution, 100 mM Na citrate buffer (pH 5.7, 6.2), 100 mM Na phosphate buffer (pH 6.7), 100 mM borate buffer (pH 9) .2) was added to each 1 mL. Next, 200 μL of anti-influenza B virus NP antibody adjusted to 100 μg / mL (final concentration 2 μg / mL) was mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, 1 mL of 10% BSA was added as a blocking agent, and gently stirred for 10 minutes. After 10 minutes, the mixture was transferred to a centrifuge tube, centrifuged at 7300 rpm for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed by suction, and the sediment was suspended in 0.9 mL of Tris-HCl buffer (pH 8.6) containing 1% BSA + 150 mM NaCl +.
[0019]
(3) A dilution series of sample B influenza virus was prepared with phosphate buffer Bf (sample diluent) containing 5% BSA + 4.5% Triton X-100 + 0.1 mg / mL HBR1 + 150 mM NaCl.
(4) 125 μL of antibody-bound gold colloid solution diluted 10-fold with PBS (−) was added to 500 μL of the evaluation sample, mixed and allowed to stand for 10 minutes. Ten minutes later, 0.22 μm was filtered, and 500 μL was dropped onto the device. After all the liquid was absorbed into the membrane, the adapter was removed and the presence or absence of a signal was determined.
(5) Judgment result

[0020]
【The invention's effect】
By the method of the present invention, the gold colloid and the antibody can be efficiently bound, and the influenza virus can be detected with high sensitivity.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view of a flow-through device used in an example.
2 is a cross-sectional end view taken along the line II ′ of FIG.
[Explanation of symbols]
A: Hole a: Adapter b: Sheet carrier

Claims

A method for producing a conjugate of a colloidal gold and an antibody, wherein the pH of the colloidal gold solution is adjusted to be acidic and then mixed with the antibody solution.

The method of claim 1, wherein the pH is in the range of 4.2 to 6.7.

The antibody is an antiviral antibody, an antibacterial antibody, or a peptide hormone, steroid, bioactive amines, vitamins, prostaglandins, antibiotics, bacteria-produced toxins, tumor markers, antibodies against pesticides, or The method according to claim 1 or 2, which is any nucleotide complementary to a nucleic acid component derived from a pathogenic microorganism.

The anti-viral antibodies is an anti-influenza virus antibodies The method of claim 3.

The method according to claim 4 , wherein the anti-influenza virus antibody is an anti-type B influenza virus antibody.

An immunoassay method comprising producing a conjugate of a colloidal gold and an antibody by the method according to any one of claims 1 to 5 , and using the conjugate.