JP4037586B2

JP4037586B2 - Immunoassay for human medalacin

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Publication number: JP4037586B2
Application number: JP2000026828A
Authority: JP
Inventors: 英明鈴木; 樹由高橋; 寿史葛城; 洋祐青木
Original assignee: Dainichiseika Color and Chemicals Mfg Co Ltd
Current assignee: Dainichiseika Color and Chemicals Mfg Co Ltd
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2008-01-23
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: JP2001221801A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中のヒトメダラシンを正確に測定するための血液試料の前処理を含むヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼの一種であるメダラシンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じていると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性疾患の増悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性硬化症の患者では増悪する数日前に著増し、寛解に先行して正常化することが認められている。多発性硬化症は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシスの出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行し、多くは、10〜15年の経過で死亡すると云う慢性炎症性の難病であり、原因については、未だ、はっきりとは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種ではないかと考えられている。また、その診断法はなかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によって行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討され、血液中の顆粒球メダラシン活性の測定方法が研究され、簡便に測定できるメダラシンの免疫学的測定方法の開発が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒトメダラシンの免疫学的測定方法において、血液試料を水性媒体で稀釈して測定する際に、顆粒球中に存在するメダラシンを完全に顆粒球の外に放出させるような処理を施すことなく測定を行うとその測定値の再現性が必ずしも良くなく、測定値にばらつきを生じる現象が認められた。従って、血液中のヒトメダラシンを免疫学的に再現性良く定量する測定方法の開発が望まれていたが、本発明は上記事情に鑑みなされたもので、ヒト血液試料に特定の前処理を施すことを含むヒト血液中のヒトメダラシンを再現性良く正確に測定できる免疫学的測定方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ヒト血液試料をヒト血液の浸透圧と異なる特定の浸透圧を有する水性液体で血液を処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシンを免疫学的に測定することにより、血液中のヒトメダラシンを再現性良く正確に測定できることを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
【０００５】
従って、本発明の第一は、ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm/kg・H₂O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H₂O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒト血液試料中のヒトメダラシンを定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００６】
また、本発明の第二は、ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm/kg・H₂O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H₂O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
更に、本発明によれば、抗ヒトメダラシン抗体の少なくとも一つが抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体である血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法を提供することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明において測定されるべきヒト血液試料中のヒトメダラシンの大部分は、血液中に存在する白血球成分の一つである顆粒球の内部に存在しているので、顆粒球を完全に破壊してヒトメダラシンを全て細胞外に放出させてから測定することが正確な測定値を得るための必須要件である。従って、この必須要件が完全に満たされない場合には測定値はバラツキが大きく、再現性の乏しいデータしか得られない。
【０００８】
血液試料中の顆粒球を完全に破壊する方法としては、機械的方法、超音波による方法、凍結融解を繰り返す方法、及び浸透圧の異なる水性液体で処理する方法等が考えられるが、血液と異なる浸透圧を有する水性液体で処理する方法が最も簡便で実用的である。ヒト血液の浸透圧は約 280〜290mOsm/kg・H₂Oの範囲にあるので、 250〜310mOsm/kg・H₂Oの範囲の水性液体では血液中に存在する顆粒球を完全に破壊することは難しい。従って、ヒト血液中の顆粒球の完全な破壊は浸透圧が 250mOsm/kg・H₂O より低い水性液体、又は 310mOsm/kg・H₂O より高い水性液体で血液を稀釈することで達成することができる。このような水性液体としては、水混和性有機溶媒を含んでいてもよい精製水、無機酸塩、有機酸塩、糖類、糖アルコール類、アミノ酸類、及び蛋白質等の水溶性物質からなる溶質の濃度が非常に高い水溶液、又はこれらの溶質の濃度が非常に低い水溶液等の水性液体であり、顆粒球を完全に破壊し得る浸透圧を有する水溶液及び緩衝液などを用いることができる。また、該水性液体の使用量は、血液試料に対して容積単位で50〜10万倍、好ましくは100〜1万倍、特に好ましくは500〜2千倍である。
【０００９】
このようにして得られた顆粒球を完全に破壊したヒト血液試料の水性稀釈液を試料とするヒトメダラシンの免疫学的測定方法は、測定試料を標識化した抗原又は抗体の存在下に抗ヒトメダラシン抗体と接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて測定する検出段階とからなる。免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方法は任意である。
【００１０】
例えば、
▲１▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を捕捉させた後に標識抗体を反応させるサンドイッチ法、
▲２▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第二抗体を反応させる二抗体法、
▲３▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる競合法、
▲４▼測定すべき抗原を含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離により免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法、更に、
▲５▼ビオチン標識抗体に標識アビジンを反応させるビオチン−アビジン法等
を非限定的に用いることができる。
【００１１】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において不溶性担体を用いる場合には、不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００１２】
尚、本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において用いられる抗体類のクラスは任意であるが、IgG クラスの抗体が好適に用いられる。また、抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であるが、モノクローナル抗体が好ましい。それらの形態としては全抗体又は F(ab')₂、Fab 等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。
【００１３】
次に、このようにして捕捉されたヒトメダラシンの標識化免疫複合体を検出段階で測定するための標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが好適である。このような酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質としては、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、^99mＴｃ等を非限定的に挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を用い、発色剤として2,2'−アジノジ[3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、 5−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、 4−アミノアンチピリン、 3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン等、蛍光剤としては 4−ヒドロキシフェニル酢酸、 3−(4−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミノール類、ルシゲニン電荷移動錯体等、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質として 4−ニトロフェニルホスフェート、 4−メチルウムベリフェリルホスフェート、コルチゾール−21−ホスフェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、 2−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、 4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、 3− (2'−スピロアダマンタン)− 4−メトキシ− 4(3''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル)−1,2 −ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることができる。
【００１４】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的方法において使用することができるポリクローナル抗体は、従来公知の方法でヒトメダラシンを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒトメダラシン抗血清の抗体成分として分離精製されたものが好ましい。なかでも例えば、山羊抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体、兎抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体等が好適に用いられる。また、本発明に使用することができるモノクローナル抗体及びその製造方法については、先に出願された特開平11−151085（発明の名称「抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法」）の特許出願明細書に詳細に説明されている。
【００１５】
即ち、本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において使用することのできる抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造される。
【００１６】
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、抗原としてメダラシンを用いて免疫した動物から採取した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させることにより得られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから検索しクローニングにより製造することができる。
【００１７】
上記の抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラシン又はこれを含有する組成物又は細胞を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００１８】
細胞融合の方法は任意でり、限定されるものではないが、例えばダルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在で混合することにより行なうことができる。
細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択する。次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取する。モノクローナル抗体を大量に製造するには、該ハイブリドーマをミエローマ細胞の由来細胞と同種の動物腹腔内に投与し、その腹水中にモノクローナル抗体を蓄積させ、腹水から採取する方法を採ればよい。
【００２０】
培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離は、IgG 精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
このようにして得られた抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体は、いずれもグロブリンクラスはIgG で、サブクラスはIgG₁であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダラシンと特異的に反応する。従って、上記抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法には有用である。
【００２１】
【実施例】
以下、参考例と共に、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等により限定されるものではない。尚、実施例中の％は重量％を意味する。
【００２２】
〔参考例１〕
精製ヒトメダラシンの調製
健常人血液 400mlに、デキストラン（分子量 200,000〜300,000)の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてから、 4〜8 ℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤血球を上清と分離し、この上清を 15,000rpmで遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白血球に1mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、1mM ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）を含むpH7.0 の1Mリン酸カリウム緩衝液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、撹拌下に37℃の温度で20分間インキュベートした後、15秒間超音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕した。更に、37℃の温度で20分間インキュベートしてから、 4℃の温度において 12,000rpmで10分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を50mMＰＫＢ(pH6.0）で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、1MPＫＢ(pH6.0）で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒトメダラシン 1.5mgが得られた。
【００２３】
〔参考例２〕
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造
(1) 抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハイブリドーマの調製
参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、 7週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に50μg/匹の量で投与した。そして、 4週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追加免疫を行ない、 7日後に血中に抗体量が増大したことを確認した後、更に、その 7日後に最終免疫として抗原を腹腔に50μg/匹の量で投与した。一方、20％の牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地中で、マウスミエローマ細胞 P3-X63-Ag8-U1（Ｐ３Ｕ１）を維持培養しておき、最終免疫の 3日後、このマウスから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール4000を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、96穴マイクロプレートに撒いた。細胞融合後、培地を 100μM ヒポキサンチン、 0.4μM アミノプテリン、16μM チミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して、 2〜3 週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
【００２４】
(2) 抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマのスクリーニング
次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でスクリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ用のマイクロプレートに吸着させ、 pH7.4の10mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に 2％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なった後、ハイブリドーマ培養液50μl をこのマイクロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山羊抗マウス IgG−Fc特異抗体の 2μg/mlＰＢＳ溶液 100μl を添加し、37℃で１時間反応させた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.1Mリン酸クエン酸緩衝液 (pH4.6)を 200μl 添加して発色させることにより抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
【００２５】
(3) 抗体産生株のクローニング及びモノクローナル抗体の調製
この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。このハイブリドーマを、それぞれプリスタン投与ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に50％飽和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢＳに溶解させ、3MNaCl含有50mMトリス−塩酸緩衝液 (pH7.8)に対して透析してから、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた後、吸着した抗体を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液 (pH5.0)で溶出し中和して精製することにより3F03、3GO3、2E04、及び1G12からなる 4種類のモノクローナル抗体を得た。
【００２６】
(4) モノクローナル抗体の性質〔ウェスタンブロッティング法〕
モノクローナル抗体に特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblotting ）法を用いて固定した。
先ず、ヒト顆粒球由来メダラシンをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに25mMグリシン、及び20％メタノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が 7V/cm、 2時間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即ち、 2％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗マウス IgG−Fc特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、0.04％ 3,3'-ジアミノベンジジン、及び0.0034％過酸化水素を含むＰＢＳからなる基質溶液を加えて発色させることにより、 4種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確認された。
【００２７】
〔インヒビション・アッセイ法〕
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼを反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法により、いずれの 2つの組み合わせにおいてもビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、 4種のモノクローナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが確認された。
【００２８】
〔実施例１〕
ヒトメダラシン測定用検量線の作成
(1) モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径 6mm）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）10μg/mlを含むＰＢＳ(pH7.4）溶液中に 4℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、 1％ＢＳＡ水溶液に 4℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００２９】
(2) ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の調製
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）1.0mg/mlを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の 10mg/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液 0.1mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.O) でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0mg/mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10mg/mlの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、これに0.1Mジチオスレイトールを含有する 0.1M 酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １mlを添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分が得られた。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、 4℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ44（SEPRACOR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
【００３０】
(3) ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）0,1,10,100,200ng/ml の濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液50μl と 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液350 μl を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.1Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.6) を 400μl ずつ各試験管内に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤として0.1Nシュウ酸水溶液を１mlずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３１】
〔実施例２〕
酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者の血液をそれぞれ採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取して精製水（浸透圧＝0mOsm/kg・H₂O）2ml 中に加えボルテックスミキサーを用いて十分混合して検体溶液とした後、その10μl を試験管に添加し、これに 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4)390μl を加えて希釈した。次に、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に 5回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、第１表に示すように非常に良好な再現性を示すことが確認された。
【００３２】
【表１】

【００３３】
〔比較例１〕
酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者の血液をそれぞれ採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取しＰＢＳ（pH7.4)（浸透圧＝約290mOsm/kg・H₂O）2ml 中に加えて均一に混合して検体溶液とした後、その10μl を試験管に添加し、これに 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4)390μl を加えて希釈した。次に、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に 5回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度の測定値は第２表に示すように再現性が必ずしも良好とはいえないデータを示した。
【００３４】
【表２】

【００３５】
【発明の効果】
以上説明した本発明の構成により、ヒト血液試料中のヒトメダラシン量を再現性よく正確に測定することが可能となり、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の血液診断等への利用の可能性が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１記載の酵素免疫測定方法を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for immunoassay of human medalacin, which includes pretreatment of a blood sample for accurately measuring human medalacin in blood.
[0002]
[Prior art]
Medalacin, a kind of serine protease, is present in granulocytes and the like, and is considered to play an important role in the defense mechanism of the body widely including inflammation, especially the expression of chronic inflammation. Granulocyte medalacin increases in the exacerbations of many chronic inflammatory diseases and normalizes in remission, but it increases markedly several days before exacerbations in patients with multiple sclerosis and may normalize prior to remission It recognized. Multiple sclerosis is characterized by the appearance of localized demyelinating lesions and gliosis in the white matter of the central nervous system, progressing in remission and progression, many of which are chronic inflammations that die over the course of 10-15 years The cause of the disease is not yet clearly understood, but it is thought to be a type of autoimmune disease in which viruses and bacteria stimulate the immune system and antibodies attack their nerve tissue. ing. In addition, the diagnostic method is quite difficult and is currently performed by nuclear magnetic resonance imaging (MRI) or the like, but the method such as MRI uses a very large apparatus and requires measurement skills. However, since it is expensive, development of a method that can diagnose disease, grasp disease state, estimate prognosis, etc. with a simple test has been studied, and a method for measuring granulocyte medalacin activity in blood has been studied and can be easily measured Development of an immunological assay for medalacin has been underway.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the immunoassay method for human medalacin, when the blood sample is diluted with an aqueous medium and measured, it is measured without any treatment that completely releases medalacin present in the granulocytes out of the granulocytes. When the measurement was performed, the reproducibility of the measured values was not always good, and a phenomenon that the measured values varied was observed. Therefore, development of a measurement method for quantifying human medalacin in blood with immunological reproducibility has been desired, but the present invention has been made in view of the above circumstances, and a specific pretreatment is applied to a human blood sample. It is an object of the present invention to provide an immunological measurement method capable of accurately measuring human medaracin in human blood containing
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have completely destroyed white blood cells by treating human blood samples with an aqueous liquid having a specific osmotic pressure different from that of human blood. After that, it was found that human medalacin can be accurately measured with good reproducibility by immunologically measuring human medalacin using an anti-human medalacin antibody, and the present invention has been completed based on these findings. is there.
[0005]
Therefore, the first of the present invention is that a human blood sample is osmotic pressure of 250 mOsm / kg · H ₂ Aqueous liquid lower than O or 310mOsm / kg ・ H ₂ O It relates to a method for immunoassay of human medalacin in blood, characterized by quantifying human medalacin in a human blood sample using an anti-human medalacin antibody after complete destruction of leukocytes by treatment with a higher aqueous liquid. is there.
[0006]
In the second aspect of the present invention, a human blood sample has an osmotic pressure of 250 mOsm / kg · H. ₂ Aqueous liquid lower than O or 310mOsm / kg ・ H ₂ O After treatment with a higher aqueous liquid to completely destroy leukocytes, contact with anti-human medalacin antibody and labeled anti-human medalacin antibody immobilized on an insoluble carrier to form a sandwich complex by antigen-antibody reaction, and human medalacin is deposited on the insoluble carrier. And then quantifying the label in the complex. The present invention relates to an immunoassay method for human medalacin in blood.
Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide an immunological measurement method for human medalacin in blood, wherein at least one of the anti-human medalacin antibodies is an anti-human medalacin monoclonal antibody.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
Most of the human medalacin in the human blood sample to be measured in the present invention is present inside granulocytes, which are one of the white blood cell components present in the blood. It is an indispensable requirement for obtaining an accurate measurement value after measuring all of the substance after it has been released to the outside of the cell. Therefore, when this essential requirement is not completely satisfied, the measured values vary widely and only data with poor reproducibility can be obtained.
[0008]
As a method for completely destroying granulocytes in a blood sample, a mechanical method, an ultrasonic method, a method of repeatedly freezing and thawing, a method of treating with an aqueous liquid having different osmotic pressure, and the like can be considered. The method of treatment with an aqueous liquid having osmotic pressure is the simplest and practical. The osmotic pressure of human blood is about 280-290mOsm / kg ・ H ₂ Since it is in the range of O, 250-310mOsm / kg ・ H ₂ It is difficult to completely destroy granulocytes present in blood with an aqueous liquid in the range of O. Therefore, complete destruction of granulocytes in human blood has an osmotic pressure of 250 mOsm / kg · H. ₂ Aqueous liquid lower than O, or 310mOsm / kg ・ H ₂ This can be achieved by diluting the blood with an aqueous liquid higher than O. Such aqueous liquids include purified water that may contain a water-miscible organic solvent, inorganic acid salts, organic acid salts, sugars, sugar alcohols, amino acids, and solutes composed of water-soluble substances such as proteins. An aqueous solution such as an aqueous solution having a very high concentration or an aqueous solution having a very low concentration of these solutes and having an osmotic pressure capable of completely destroying granulocytes can be used. Moreover, the usage-amount of this aqueous liquid is 50-100,000 times by volume unit with respect to a blood sample, Preferably it is 100-10,000 times, Most preferably, it is 500-2,000 times.
[0009]
The immunoassay method for human medalacin using the aqueous dilution of a human blood sample obtained by completely destroying the granulocytes thus obtained as a sample is an anti-human medalacin antibody in the presence of an antigen or antibody labeled with the measurement sample. And an immunoreaction step of capturing as a labeled immune complex by an antigen-antibody reaction, and a detection step of measuring the generated immune complex using a labeling substance present in the molecule. The method of antigen-antibody reaction that constitutes the immune reaction stage is arbitrary.
[0010]
For example,
(1) Sandwich method in which an antibody bound to an insoluble carrier is captured with an antigen to be measured and then reacted with a labeled antibody;
(2) A two-antibody method in which an antibody derived from a different animal species than an antibody bound to an insoluble carrier is used in the sandwich method, and the resulting sandwich complex is further reacted with a labeled second antibody against the antibody,
(3) A competitive method in which an antibody to be measured is reacted with an antibody bound to an insoluble carrier in the presence of a peroxidase enzyme-labeled antigen.
(4) An aggregation precipitation method in which a labeled antibody that reacts specifically with a sample containing an antigen to be measured is allowed to act on the sample to aggregate and precipitate, and then the labeled substance in the immune complex is detected by separation by centrifugation. Furthermore,
(5) Biotin-avidin method in which labeled avidin is reacted with a biotin-labeled antibody, etc.
Can be used without limitation.
[0011]
When an insoluble carrier is used in the immunoassay method for human medalacin of the present invention, examples of the insoluble carrier include high molecular compounds such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, and polysaccharides. Other examples include glass, metal, magnetic particles, and combinations thereof. The insoluble carrier can be used in various shapes such as a tray shape, a spherical shape, a fiber shape, a rod shape, a disk shape, a container shape, a cell, a microplate, and a test tube. Furthermore, the immobilization method of the antigen or antibody to these insoluble carriers is arbitrary, but a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method or the like can be used.
[0012]
The class of antibodies used in the method for immunological measurement of human medalacin of the present invention is arbitrary, but IgG class antibodies are preferably used. The antibody can be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred. These forms include whole antibodies or F (ab ') ₂ Fragments such as Fab and the like can be used. The origin of the antibody is arbitrary, but an antibody derived from mouse, rat, rabbit, sheep, goat, chicken or the like is preferably used.
[0013]
Next, it is preferable to use an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive substance, or the like as a labeling substance for measuring the labeled immune complex of human medalacin thus captured in the detection stage. Such enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc., fluorescent materials such as fluorescein isocyanate and phycobiliprotein, luminescent materials such as luminols, dioxetanes, acridinium salts, and the like As a substance, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹¹¹ In, ^99m Tc etc. can be mentioned without limitation. When the labeling substance is an enzyme, a substrate, and if necessary, a color former, a fluorescent agent, and a luminescent agent are used for measuring the activity. When peroxidase is used as an enzyme, hydrogen peroxide or the like is used as a substrate, and 2,2′-azinodi [3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid] ammonium salt (ABTS), 5-aminosalicylic acid, o-phenylene as a color former. Diamine, 4-aminoantipyrine, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, etc., fluorescent agents such as 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, etc., luminous agents such as luminols When using alkaline phosphatase as an enzyme, such as lucigenin charge transfer complex, etc. When using β-D-galactosidase as an enzyme, such as 4-nitrophenyl phosphate, 4-methylumbelliferyl phosphate, cortisol-21-phosphate as a substrate Include 2-nitrophenyl-β-D-galactoside, 4-me Tilumberiferyl-β-D-galactoside, 3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4 (3 ″ -β-D-galactosyloxyphenyl) -1,2-dioxetane (AMPGD), etc. Can be used.
[0014]
The polyclonal antibody that can be used in the immunological method for human medalacin of the present invention is preferably one that has been separated and purified as an antibody component of an anti-human medalacin antiserum obtained by immunizing an animal with human medalacin as an antigen by a conventionally known method. . Among them, for example, goat anti-human medalacin-polyclonal antibody and rabbit anti-human medalacin-polyclonal antibody are preferably used. The monoclonal antibody that can be used in the present invention and a method for producing the same are described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-151085 (title of the invention “Anti-human medalacin monoclonal antibody, method for producing the same and immunological method using the same). The measuring method ") is described in detail in the patent application specification.
[0015]
That is, the anti-human medalacin monoclonal antibody that can be used in the immunoassay method for human medalacin of the present invention includes antibody-producing cells and myeloma cells collected from animals immunized with human medalacin extracted from granulocytes isolated from healthy human blood. The hybridoma prepared by cell fusion with the above is cultured on a medium, or is administered into an abdominal cavity of an animal and allowed to grow in ascites, and then collected from the culture or ascites.
[0016]
Hybridomas that produce anti-human medalacin monoclonal antibodies can be obtained by selectively proliferating hybridomas obtained by fusing antibody-producing cells collected from animals immunized with medalacin as an antigen with myeloma cells, and searching and cloning from the hybridomas. Can be manufactured.
[0017]
Examples of the antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, B-lymphocytes and the like obtained from animals immunized with human medalacin or a composition or cells containing the same. Examples of animals to be immunized include mice, rats, rabbits, goats, sheep and horses. Immunization is performed, for example, by administering about 1 μg to 1 mg / dose of human medalacin as it is or with an appropriate adjuvant, once subcutaneously, intramuscularly or intraperitoneally, 1-2 times / month for 1-6 months. Separation of antibody-producing cells is performed by collecting from the immunized animal 2 to 4 days after the final immunization.
As myeloma cells, those derived from mice and rats can be used. The antibody-producing cells and the myeloma cells are preferably derived from the same species.
[0018]
The method of cell fusion is arbitrary and is not limited. For example, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in the presence of a fusion promoter such as polyethylene glycol in a medium such as Darcope modified Eagle medium (DMEM). Can be done.
After cell fusion is completed, the hybridoma is selected by appropriately diluting with DMEM or the like, centrifuging, and suspending and culturing the precipitate in a selective medium such as HAT medium. Subsequently, antibody-producing hybridomas are searched for by the enzyme antibody method using the culture supernatant, and cloning is performed by the limiting dilution method or the like, so that a hybridoma producing an anti-human medalacin monoclonal antibody can be obtained.
[0019]
The antibody-producing hybridoma thus obtained is cultured in a medium or in vivo, and a monoclonal antibody is collected from the culture. In order to produce a large amount of monoclonal antibody, a method may be employed in which the hybridoma is administered into the abdominal cavity of the same animal as the myeloma cell-derived cells, the monoclonal antibody is accumulated in the ascites, and collected from the ascites.
[0020]
Separation of the monoclonal antibody from the culture or ascites can be performed by an ammonium sulfate fractionation method commonly used for IgG purification, chromatography using an anion exchanger, or a column such as protein A or G.
There are four types of anti-human medalacin monoclonal antibodies obtained in this manner, 3F03, 3G03, 2E04, and 1G12, depending on the type of hybridoma that produces them. All of these monoclonal antibodies are IgG in the globulin class and IgG in the subclass. ₁ Each antibody reacts specifically with the antigen human medalacin. Therefore, the above-mentioned anti-human medalacin monoclonal antibody is useful for the immunoassay method for human medalacin of the present invention.
[0021]
【Example】
Hereinafter, examples will be shown together with reference examples to specifically explain the present invention. However, the present invention is not limited to the examples. In addition,% in an Example means weight%.
[0022]
[Reference Example 1]
Preparation of purified human medalacin
Mix 6% physiological saline solution of dextran (molecular weight 200,000-300,000) in a ratio of blood: dextran aqueous solution = 2: 1 to 400 ml of healthy human blood, stir lightly with a glass rod etc., and then at a temperature of 4-8 ° C. After standing for about 1 hour, the precipitated red blood cells were separated from the supernatant, and the supernatant was centrifuged at 15,000 rpm to collect the precipitate to obtain white blood cells. Next, an extraction solution consisting of 1M potassium phosphate buffer (PKB) of pH 7.0 containing 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) and 1 mM p-chloromercurybenzoic acid (PCMB) was added to the leukocytes. After incubating at 37 ° C. for 20 minutes with stirring, the cells were completely disrupted by applying an ultrasonic disrupter for 15 seconds. Incubate for 20 minutes at a temperature of 37 ° C., then centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C., collect the supernatant, dialyze the supernatant against distilled water, The same operation was repeated several times for extraction. The extract was then passed through a CM-Sepharose gel column equilibrated with 50 mM PKB (pH 6.0), washed with the same buffer, and the adsorbate was eluted with 1 MPKB (pH 6.0). The resulting solution was dialyzed overnight against distilled water for desalting, and then concentrated with a collodion membrane to obtain 1.5 mg of purified human medalacin.
[0023]
[Reference Example 2]
Production of anti-human medalacin monoclonal antibody
(1) Preparation of hybridoma by cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells
Human medalacin extracted and purified from human granulocytes in Reference Example 1 was emulsified with Freund's complete adjuvant and administered subcutaneously to 7-week-old BALB / C mice in an amount of 50 μg / mouse. After 4 weeks, this mouse was boosted in the same manner as the first time, and after 7 days, it was confirmed that the amount of antibody increased in the blood. After 7 days, 50 μg of antigen was injected into the peritoneal cavity as the final immunization. The dose was administered per animal. On the other hand, mouse myeloma cells P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) were maintained in DMEM medium supplemented with 20% fetal bovine serum, and spleen cells were collected from these mice 3 days after the final immunization. Then, this was cell-fused with P3U1 using polyethylene glycol 4000 and plated on a 96-well microplate. After cell fusion, the medium is replaced with DMEM (HAT medium) supplemented with 100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, and 16 μM thymidine, and is a fusion of spleen cells and myeloma cells by selective culture for 2-3 weeks. A hybridoma was obtained.
[0024]
(2) Screening of anti-human medalacin antibody-producing hybridomas
Next, the antibody activity in the culture solution of this hybridoma was screened by ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Specifically, human medalacin was adsorbed on a microplate for ELISA, subjected to blocking treatment with a solution of 2% bovine serum albumin (BSA) added to 10 mM phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4, and then hybridoma. Add 50 μl of the culture solution to the microplate and leave it for 1 hour, then remove and wash the hybridoma culture solution, add 100 μl of a 2 μg / ml PBS solution of peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG-Fc specific antibody, The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour. Next, this enzyme-labeled antibody solution was removed and washed, and then 200 μl of 0.1 M phosphate citrate buffer (pH 4.6) containing 0.05% ABTS and 0.0034% hydrogen peroxide was added to cause color development. Antibody-producing hybridomas were selected.
[0025]
(3) Cloning of antibody-producing strains and preparation of monoclonal antibodies
This anti-human medalacin antibody-producing hybridoma culture solution was collected and cloned by limiting dilution to finally obtain four types of single clone hybridomas. The hybridomas were each administered to the peritoneal cavity of pristane-administered BALB / C mice to proliferate, and ascites containing monoclonal antibodies was obtained. Next, 50% saturated ammonium sulfate was added to the obtained ascites to precipitate the antibody, this precipitate was separated and dissolved in PBS, dialyzed against 3M NaCl-containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8). After applying to a protein A-Sepharose CL4B column (Pharmacia), the adsorbed antibody was eluted with 0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer (pH 5.0), neutralized and purified to obtain 3F03, 3GO3, 2E04, and Four monoclonal antibodies consisting of 1G12 were obtained.
[0026]
(4) Properties of monoclonal antibodies [Western blotting method]
Antigen specific for the monoclonal antibody was immobilized using Western blotting.
First, human granulocyte-derived medalacin was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, then a solution containing 25 mM glycine and 20% methanol in an electrolyte buffer, and a voltage gradient from 7 s / cm for 2 hours. The protein was transferred to a nitrocellulose sheet. Next, each lane of the nitrocellulose sheet was separated, one sheet was protein-stained with amide black, and the other was subjected to the following enzyme immunoassay. Specifically, after blocking with 2% BSA / PBS, a mouse anti-human medalacin monoclonal antibody is added as a primary antibody, and a peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG-Fc specific antibody is added as a secondary antibody to react and washed. Four mouse anti-human medalacin monoclonal antibodies recognize human granulocyte-derived medalacin by adding a substrate solution consisting of PBS containing 0.04% 3,3'-diaminobenzidine and 0.0034% hydrogen peroxide. Confirmed to do.
[0027]
[Inhibition assay]
Human medalacin immobilized on an ELISA microplate was reacted with a biotinylated first antibody and an unlabeled second antibody in the presence of avidin, and then reacted with avidinized peroxidase. Inhibition assay, in which the amount of biotinylated antibody reaction is measured by adding color, the biotinylated antibody reaction amount does not change in any of the two combinations. All of the monoclonal antibodies were confirmed to recognize different epitopes (antigen sites).
[0028]
[Example 1]
Creating a calibration curve for measuring human medalacin
(1) Preparation of monoclonal antibody-immobilized beads
After thoroughly washing the polystyrene beads (diameter 6 mm), leave them in PBS (pH 7.4) solution containing 10 μg / ml of mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04) at a temperature of 4 ° C. for one day and then with PBS. After washing, the antibody was immobilized on a 1% BSA aqueous solution at a temperature of 4 ° C. for 1 day to obtain a blocking antibody.
[0029]
(2) Preparation of peroxidase-labeled monoclonal antibody
In a PBS solution containing 1.0 mg / ml of mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04), 0.1 ml of a dimethylformamide solution of N- (m-maleimidobenzoic acid) -N-succinimide ester (MBS) at a concentration of 10 mg / ml was added. The mixture was added and reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Next, this reaction mixture was subjected to gel filtration with a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.O) using a column packed with Sephadex G-25 to separate the maleimidated monoclonal antibody and unreacted MBS.
On the other hand, to a 1.0 mg / ml PBS solution of horseradish peroxidase (HRP) as a peroxidase enzyme, an ethanol solution of N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) at a concentration of 10 mg / ml was added. The reaction was carried out at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Next, this reaction mixture was purified by gel filtration with a 10 mM acetate buffer (pH 4.5) using a column packed with Sephadex G-25, and a fraction containing pyridyl disulfide HRP was collected. In the collodion bag, it was concentrated about 10 times under ice cooling. Next, 1 ml of 0.1 M acetic acid buffered saline (pH 4.5) containing 0.1 M dithiothreitol was added thereto and stirred at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes to introduce pyridyl disulfide groups introduced into the HRP molecule. After the reduction, the reaction mixture was subjected to gel filtration using a column packed with Sephadex G-25 to obtain a fraction containing thiolated HRP.
Next, the maleimidated monoclonal antibody and thiolated HRP were mixed, concentrated to a protein concentration of 4 mg / ml under ice-cooling using a collodion bag, allowed to stand overnight at 4 ° C., and then Ultrogel AcA44 (SEPRACOR) was used. Gel filtration was performed using a packed column to obtain a peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibody.
[0030]
(3) Human medalacin sandwich enzyme immunoassay method
One bead on which mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (3F03) is immobilized, 50 μl of 2% BSA-containing PBS solution containing purified human medalacin (standard) at concentrations of 0,1,10,100,200 ng / ml and 2% BSA 350 μl of PBS solution was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then the solution in the test tube was removed by suction, washed with physiological saline, and then 0.2 μg / HRP-labeled mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04) A test tube was filled with 400 μl of 2% BSA-containing PBS solution containing a concentration of ml and incubated at a temperature of 37 ° C. for 30 minutes. Next, the solution in the test tube is removed by suction, washed with physiological saline, and 400 μl of 0.1 M phosphate citrate buffer (pH 4.6) containing 0.05% ABTS and 0.0034% hydrogen peroxide. After adding to each test tube and incubating for 30 minutes at a temperature of 37 ° C., 1 ml of 0.1N oxalic acid aqueous solution was added as a reaction terminator to stop the enzyme reaction. Next, the absorbance of the solution at a wavelength of 420 nm is measured using a spectrophotometer, and this is plotted against the standard substance concentration, whereby a calibration curve having a good concentration dependency as shown in FIG. 1 is obtained. It was.
[0031]
[Example 2]
Determination of medalacin in clinical samples by enzyme immunoassay
Samples of healthy individuals and multiple sclerosis blood samples collected and cryopreserved were returned to room temperature and thawed, and 10 μl was collected and purified water (osmotic pressure = 0 mOsm / kg · H ₂ O) After adding 2 ml and mixing well with a vortex mixer to make a sample solution, 10 μl thereof was added to a test tube and diluted with 390 μl of 2% BSA-containing PBS (pH 7.4). Next, one bead each immobilized with a mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (3F03) was added to the test tube, incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then the solution in the test tube was removed by suction, followed by physiological saline. Then, 400 μl of 2% BSA-containing PBS solution containing HRP-labeled mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04) at a concentration of 0.2 μg / ml was filled into a test tube and incubated at a temperature of 37 ° C. for 30 minutes. Next, after washing, enzymatic reaction, and stopping the reaction by exactly the same operations as those for creating the calibration curve described above, the absorbance at a wavelength of 420 nm was measured using a spectrophotometer, and the human medalacin concentration was determined from the calibration curve. Asked. In order to examine the reproducibility of this measurement, the measurement operation was performed five times separately from the sample dilution treatment. As a result, the human medalacin concentration in the sample blood showed very good reproducibility as shown in Table 1. confirmed.
[0032]
[Table 1]

[0033]
[Comparative Example 1]
Determination of medalacin in clinical samples by enzyme immunoassay
Samples of healthy and multiple sclerosis blood samples collected and cryopreserved were returned to room temperature and thawed, and 10 μl of the sample was collected in PBS (pH 7.4) (osmotic pressure = about 290 mOsm / kg · H). ₂ O) After adding 2 ml and mixing uniformly to make a sample solution, 10 μl thereof was added to a test tube, and diluted with 390 μl of PBS containing 2% BSA (pH 7.4). Next, one bead each immobilized with a mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (3F03) was added to the test tube, incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then the solution in the test tube was removed by suction, followed by physiological saline. Then, 400 μl of 2% BSA-containing PBS solution containing HRP-labeled mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04) at a concentration of 0.2 μg / ml was filled into a test tube and incubated at a temperature of 37 ° C. for 30 minutes. Next, after washing, enzymatic reaction, and stopping the reaction by exactly the same operations as those for creating the calibration curve described above, the absorbance at a wavelength of 420 nm was measured using a spectrophotometer, and the human medalacin concentration was determined from the calibration curve. Asked. In order to examine the reproducibility of this measurement, the measurement operation was performed five times separately from the sample dilution process. As a result, the measured value of human medalacin concentration in the sample blood was not necessarily reproducible as shown in Table 2. Showed no data.
[0034]
[Table 2]

[0035]
【The invention's effect】
With the configuration of the present invention described above, it is possible to accurately measure the amount of human medalacin in a human blood sample with good reproducibility, and it may be used for blood diagnosis of chronic inflammatory diseases, particularly multiple sclerosis. Be expected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a calibration curve for measuring human medalacin prepared by measuring human medalacin (standard substance) using the enzyme immunoassay method described in Example 1 and plotting the absorbance as a function of antigen concentration.

Claims

A human blood sample is treated with an aqueous liquid with an osmotic pressure lower than 250 mOsm / kg · H ₂ O or with an aqueous liquid higher than 310 mOsm / kg · H ₂ O to completely destroy leukocytes and then use an anti-human medalacin antibody. A method for immunological measurement of human medalacin in blood, comprising quantifying human medalacin in a human blood sample.

Human blood samples were treated with an aqueous liquid with an osmotic pressure lower than 250 mOsm / kg · H ₂ O or with an aqueous liquid higher than 310 mOsm / kg · H ₂ O to completely destroy leukocytes and then immobilized on an insoluble carrier Human medalacin in a human blood sample is obtained by contacting with an anti-human medalacin antibody and a labeled anti-human medalacin antibody to form a sandwich complex by an antigen-antibody reaction to capture human medalacin on an insoluble carrier, and then quantifying the label in the complex. A method for immunological measurement of human medalacin in blood, characterized by quantifying.

The method for immunoassay of human medalacin according to claim 1 or 2, wherein at least one of the anti-human medalacin antibodies is an anti-human medalacin monoclonal antibody.

The method for immunoassay of human medalacin according to claim 1 or 2, wherein the aqueous liquid is purified water and / or a buffer solution which may contain a water-miscible organic solvent.