JP4422291B2

JP4422291B2 - Immunological assay for human medalacin

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Publication number: JP4422291B2
Application number: JP2000121587A
Authority: JP
Inventors: 洋祐青木; 英明鈴木; 樹由高橋; 寿史葛城
Original assignee: Dainichiseika Color and Chemicals Mfg Co Ltd
Current assignee: Dainichiseika Color and Chemicals Mfg Co Ltd
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2010-02-24
Anticipated expiration: 2020-04-21
Also published as: JP2001305141A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものであり、さらに詳しくは、血液中のヒトメダラシンの含有量を正確に測定するための血液試料の前処理を含む免疫学的測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼの一種であるメダラシンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じていると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性疾患の増悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性硬化症の患者では増悪する数日前に著増し、寛解に先行して正常化することが認められている。多発性硬化症は、中枢神経系の白質における限局性の脱髄巣とグリオーシスの出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行し、多くは、10年〜15年の経過で死亡すると云う慢性炎症性の難病である。多発性硬化症の原因については、未だ、はっきりとは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種ではないかと考えられている。また、その診断法はなかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によって行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討された結果、血液中の顆粒球メダラシン活性の測定方法が研究され、簡便に測定できる免疫学的測定方法の開発が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、血液中のメダラシン含有量の免疫学的測定方法において、血液試料を水性媒体で稀釈して測定する際に、顆粒球中に存在するメダラシンを完全に顆粒球の外に放出させるような処理を施すことなく測定を行うとその測定値の再現性が必ずしも良くなく、測定値にばらつきを生じる現象が認められた。従って、血液中のヒトメダラシンを免疫学的に再現性良く測定する測定方法の開発が望まれていたが、本発明は、上記事情に鑑みヒト血液試料に特定の前処理を施すことを含むヒト血液試料中のヒトメダラシンを再現性良く正確に測定できる免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒト血液試料を、ヒト血液の浸透圧と異なる特定のより浸透圧を有する水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシンを免疫学的に測定することにより、血液中のヒトメダラシンを再現性良く正確に測定できることを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
【０００５】
即ち、本発明の第一は、ヒト血液試料を、溶血剤を含有する水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシンを定量することを特徴とする血液試料中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００６】
また、本発明の第二は、ヒト血液試料を、溶血剤を含有する水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を定量することにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシンを定量することを特徴とするヒト血液試料中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において測定されるべきヒト血液試料中のヒトメダラシンの大部分は、血液中に存在する白血球成分の一つである顆粒球の内部に存在しているので、顆粒球を完全に破壊してヒトメダラシンを全て細胞外に放出させてから測定することが正確な測定値を得るための必須要件である。従って、この必須要件が完全に満たされない場合には測定値はバラツキが大きく、再現性の乏しいデータしか得られないという難点が生ずる。
【０００８】
血液試料中の顆粒球を完全に破壊する方法としては、機械的方法、超音波による方法、凍結融解を繰り返す方法、浸透圧の異なる水性液体で処理する方法、及び酵素類、補体等で細胞膜を破壊する方法等を挙げることができるが、本発明者らの広範な検討の結果、これらの方法に比較してさらに測定精度が高く、比較的簡便に実施できる実用的方法として、細胞膜を穏和な条件で破壊することができる薬剤である溶血剤を含有する水性液体で血液試料を処理する方法に着目したものである。
【０００９】
溶血剤としては、高級脂肪酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩等の陰イオン性界面活性剤、アルキルピリジニウム塩、アルキルトリメチルアンモニウム塩等の陽イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤、アルキルベタイン等の両性界面活性剤、サポニン、レシチン、コール酸等の天然界面活性物質、ヘビ毒、ハチ毒、プロテアーゼ等の酵素類、補体等の生体成分等がその具体例として非限定的に挙げられる。このような溶血剤は、0.0001重量％〜10重量％、好ましくは 0.001重量％〜 5重量％、特に好ましくは 0.005重量％〜１重量％の水性液体として用いることができる。水性液体の媒体としては、水又は水と混和する有機溶媒との混合媒体等を挙げることができる。また、該水性液体の使用量は、血液試料に対して容積単位で５０倍〜１０万倍、好ましくは１００倍〜１万倍、特に好ましくは５００倍〜２千倍である。
【００１０】
このようにして得られた顆粒球を完全に破壊したヒト血液試料の水性稀釈液を試料とするヒトメダラシンの免疫学的測定方法は、測定試料を標識化した抗原又は抗体の存在下に抗ヒトメダラシン抗体と接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて測定する検出段階とからなる。
【００１１】
前段の免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方法は任意である。
例えば、
▲１▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を捕捉させた後に標識化抗体を反応させる抗体−抗原−抗体からなるサンドイッチ錯体を形成させるサンドイッチ法、
▲２▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第二抗体を反応させる二抗体法、
▲３▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を標識化抗原（例えばペルオキシダーゼ酵素により標識）の存在下で反応させる競合法、
▲４▼測定すべき抗原を含有する試料にこれらと特異的に反応する標識化抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法、更に、
▲５▼ビオチン標識化抗体に標識化アビジンを反応させるビオチン−アビジン法等を非限定的に用いることができる。
【００１２】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において不溶性担体を用いる場合には、不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々のものを採用することができる。
【００１３】
また、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
なお、本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において用いられる抗体類のクラスは任意であるが、IgG クラスの抗体が好適に用いられる。抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれをも使うことも可能であるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、その形態としては全抗体又はF(ab')₂ 、Fab 等の断片を用いることができる。抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。
【００１４】
次いで、このようにして捕捉されたヒトメダラシンの標識化免疫複合体を検出段階で測定するための標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが好適である。このような酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質としては ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、 ¹¹¹Ｉｎ、 ^99mＴｃ等を非限定的に挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を用い、発色剤として2,2'−アジノジ[3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ)、5−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、4−アミノアンチピリン、3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン等、蛍光剤としては 4−ヒドロキシフェニル酢酸、 3−(4−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミノール類、ルシゲニン電荷移動錯体（例えば、国際公開公報ＷＯ００／０９６２６号参照。）等を用いることができる。また、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質として4−ニトロフェニルホスフェート、4−メチルウムベリフェリルホスフェート、コルチゾール−21−ホスフェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、2−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、3−(2'−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4(3''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル)−1,2−ジオキセタン(ＡＭＰＧＤ)等を用いることができる。
【００１５】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に使用することができるポリクローナル抗体は、従来公知の方法でヒトメダラシンを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒトメダラシン抗血清の抗体成分として分離精製されたものを用いることができる。なかでも例えば、山羊抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体、兎抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体等が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体及びその製造方法については、先に出願された特開平11−151085公報に詳細に説明されている。
【００１６】
本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に使用することのできる抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により作製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。即ち、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、いわゆる細胞融合により得られるものであり、抗原としてヒトメダラシンを用いて免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させることにより得られたハイブリドーマを選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索しクローニングにより目的とするモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを製造することができる。
【００１７】
抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラシン又はこれを含有する組成物又は細胞を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に約１μｇ／回〜１ｍｇ／回を１回／月〜２回／月、１ケ月間〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２日後〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。
【００１８】
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
細胞融合の方法は任意であるが、例えばダルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。
細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、得られた沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択する。次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを利用してモノクローナル抗体を製造するには、該ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を該培養物から採取する。モノクローナル抗体を大量に製造するには、該ハイブリドーマをミエローマ細胞の由来細胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中にモノクローナル抗体を蓄積させ、腹水から採取する方法を採取することが好ましい。
培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離は、IgG 精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００２０】
上記の如くして得られた抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体は、いずれもグロブリンクラスは IgGで、サブクラスは IgG₁ であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダラシンと特異的に反応し、ヒトメダラシンの免疫学的測定方法には有用である。
【００２１】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも本発明は実施例等に限定されるものではない。尚、実施例中の％は重量％を意味する。
【００２２】
〔参考例１〕
精製ヒトメダラシンの調製
健常人血液 400mlに、デキストラン（分子量 200,000〜300,000 ）の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてから、４℃〜８℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤血球を上清と分離し、この上清を 15,000rpmで遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白血球に1mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、1mM ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）を含む pH7.0の1Mリン酸カリウム緩衝液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、撹拌下に37℃の温度で20分間インキュベートした後、15秒間超音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕し、更に、37℃の温度で20分間インキュベートしてから、４℃の温度において 12,000rpmで10分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を 50mM ＰＫＢ (pH6.0)で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、 1M ＰＫＢ (pH6.0)で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒトメダラシン 1.5mgが得られた。
【００２３】
〔参考例２〕
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の調製
(1)抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハイブリドーマの作製
参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に50μg/匹の量で投与した。そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大したことを確認した後、更に、その７日後に最終免疫として抗原を腹腔に50μg/匹の量で投与した。一方、20％の牛胎児血清を添加したダルコッペ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地中で、マウスミエローマ細胞 P3-X63-Ag8-U1（Ｐ３Ｕ１）を維持培養しておき、最終免疫の３日後、このマウスから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール4000を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、96穴マイクロプレートに撒いた。細胞融合後、培地を 100μM ヒポキサンチン、 0.4μM アミノプテリン、16μM チミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して、２〜３週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
【００２４】
(2)抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマのスクリーニング
次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でスクリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ用のマイクロプレートに吸着させ、pH7.4 の10mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に２％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なった後、ハイブリドーマ培養液50μl をこのマイクロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体の 2μg/mlＰＢＳ溶液 100μl を添加し、37℃で１時間反応させた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む 0.1M リン酸クエン酸緩衝液(pH4.6) を 200μl 添加して発色させることにより抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
【００２５】
(3)抗体産生株のクローニング及びモノクローナル抗体の作製
この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。このハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に50％飽和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢＳに溶解させ、3M NaCl 含有50mMトリス−塩酸緩衝液 (pH7.8)に対して透析してから、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた後、吸着した抗体を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液 (pH5.0)で溶出し中和して精製することにより3F03、3GO3、2E04、及び1G12からなる４種類のモノクローナル抗体を得た。
【００２６】
(4)モノクローナル抗体の性質
〔ウェスタンブロッティング法〕
モノクローナル抗体に特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblotting ）法を用いて固定した。
先ず、ヒト顆粒球由来メダラシンをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに25mMグリシン、及び20％メタノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が７Ｖ／cm、２時間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即ち、２％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、0.04％ 3,3'-ジアミノベンジジン、及び0.0034％過酸化水素を含むＰＢＳからなる基質溶液を加えて発色させることにより、４種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確認された。
【００２７】
〔インヒビション・アッセイ法〕
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼを反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクローナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが確認された。
【００２８】
〔実施例１〕
ヒトメダラシン測定用検量線の作成
(1)モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径６mm）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）10μg/mlを含むＰＢＳ (pH7.4)溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００２９】
(2)ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の調製
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）1.0mg/mlを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の10mg/ml の濃度のジメチルホルムアミド溶液 0.1mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.O)でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼとしてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0mg/mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10 mg／mlの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液 (pH4.5)でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10倍に濃縮する。次に、これに 0.1M ジチオスレイトールを含有する 0.1M 酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １mlを添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分が得られた。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４mg/ml の蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ44（SEPRACOR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
【００３０】
(3)ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）0, 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 200ng/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液50μl と、ＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 350μl とを加え37℃の温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄する。次に、試験管内に 0.015％ 3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液 250μl、及び 0.0034％過酸化水素を含む 0.1M リン酸クエン酸緩衝液 (pH4.5)を 250μlずつ各試験管内に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤として1N硫酸を500mlずつ加えて酵素反応を停止させてから、分光光度計を用いて450nm の波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示されるような濃度依存性の良好な検量線が得られた。
【００３１】
〔実施例２〕
酵素免疫測定方法による臨床検体中のヒトメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取して0.01％のドデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含有する精製水２ml中に加えボルテックスミキサーを用いて十分混合して検体溶液とし、その10μl を試験管に添加する。次いで、これに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ (pH7.4)40μl を加えて希釈した後、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個及びＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）0.2 μg/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 350μl を添加して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行った後、分光光度計を用いて 450nmの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に５回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、第１表に示すように非常に良好な再現性を示すことが確認された。
【００３２】
【表１】

【００３３】
〔比較例１〕
酵素免疫測定方法による臨床検体中のヒトメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取してＰＢＳ (pH7.4)２ml中に加え均一に混合して検体溶液とし、その10μl を試験管に添加し、これに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4) 40μl を加えて希釈した。次に、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビーズ１個及びＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 350μl を添加して37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて 450nmの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に５回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度の測定値は第２表に示すように再現性が良好とは云えないデータを示した。
【００３４】
【表２】

【００３５】
【発明の効果】
以上説明したような発明の構成をとることにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシン量を再現性よく正確に測定することが可能となり、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の血液診断等への利用に寄与するところが大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１記載の酵素免疫測定方法を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immunological measurement method for human medalacin in blood, and more specifically, relates to an immunological measurement method including pretreatment of a blood sample for accurately measuring the content of human medalacin in blood. Is.
[0002]
[Prior art]
Medalacin, a kind of serine protease, is present in granulocytes and the like, and is considered to play an important role in the defense mechanism of the body widely including inflammation, especially the expression of chronic inflammation. Granulocyte medalacin increases in the exacerbations of many chronic inflammatory diseases and normalizes in remission, but it increases markedly several days before exacerbations in patients with multiple sclerosis and may normalize prior to remission It recognized. Multiple sclerosis is characterized by the appearance of localized demyelinating foci and gliosis in the white matter of the central nervous system, progressing with repeated remissions and worsening, many chronically dying after 10 to 15 years It is an inflammatory intractable disease. Although the cause of multiple sclerosis has not been clearly clarified yet, it is thought that it is a type of autoimmune disease in which viruses and bacteria stimulate the immune system and antibodies attack their nerve tissue. Yes. In addition, the diagnostic method is quite difficult and is currently performed by nuclear magnetic resonance imaging (MRI) or the like, but the method such as MRI uses a very large apparatus and requires measurement skills. However, as a result of investigating the development of a method capable of diagnosing disease, grasping disease state, estimating prognosis, etc. with a simple test, a method for measuring granulocyte medalacin activity in blood has been studied and simplified Development of immunological measurement methods that can be measured is underway.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the method of immunological measurement of medalacin content in blood, when the blood sample is diluted with an aqueous medium and measured, the medalacin present in the granulocytes is completely released out of the granulocytes. When measurement was carried out without applying reproducibility, the reproducibility of the measurement values was not necessarily good, and a phenomenon in which the measurement values varied was observed. Therefore, development of a measurement method for measuring human medalacin in blood with immunological reproducibility has been desired. In view of the above circumstances, the present invention is directed to human blood including subjecting a human blood sample to a specific pretreatment. An object of the present invention is to provide an immunological measurement method capable of accurately measuring human medalacin in a sample with good reproducibility.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, as a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have processed human blood samples with an aqueous liquid having a specific osmotic pressure different from the osmotic pressure of human blood to completely remove leukocytes. After the destruction, it was found that human medalacin can be accurately measured with high reproducibility by immunologically measuring human medalacin using an anti-human medalacin antibody, and the present invention has been completed based on these findings. Is.
[0005]
That is, the first of the present invention is a blood sample characterized in that a human blood sample is treated with an aqueous liquid containing a hemolytic agent to completely destroy white blood cells, and then human medalacin is quantified using an anti-human medalacin antibody. The present invention relates to an immunological measurement method for human medalacin.
[0006]
In the second aspect of the present invention, a human blood sample is treated with an aqueous liquid containing a hemolytic agent to completely destroy white blood cells, and then contacted with an anti-human medalacin antibody and a labeled anti-human medalacin antibody immobilized on an insoluble carrier. In a human blood sample characterized by quantifying human medalacin in a human blood sample by forming a sandwich complex by antigen-antibody reaction to capture human medalacin on an insoluble carrier and then quantifying the label in the complex The present invention relates to a method for immunological measurement of human medalacin.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
Since most of the human medalacin in the human blood sample to be measured in the immunomedical assay method for human medalacin of the present invention is present inside granulocytes, which are one of the white blood cell components present in the blood, It is an essential requirement to obtain an accurate measurement value after completely destroying the sphere and releasing all human medalacin out of the cell. Therefore, when this essential requirement is not completely satisfied, there is a problem that the measured values vary widely and only data with poor reproducibility can be obtained.
[0008]
As a method for completely destroying granulocytes in a blood sample, a mechanical method, an ultrasonic method, a method of repeatedly freezing and thawing, a method of treating with an aqueous liquid having different osmotic pressure, and a cell membrane with enzymes, complements, etc. As a practical method that has higher measurement accuracy than these methods and can be carried out relatively easily, as a result of extensive studies by the present inventors, the cell membrane is moderated. The present invention focuses on a method of treating a blood sample with an aqueous liquid containing a hemolytic agent that is a drug that can be destroyed under various conditions.
[0009]
As hemolytic agents, anionic surfactants such as higher fatty acid salts, alkylaryl sulfonates, alkyl sulfonates, alkyl sulfate esters, and cationic surfactants such as alkyl pyridinium salts, alkyl trimethyl ammonium salts, Nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amphoteric surfactants such as alkylbetaine, natural surfactants such as saponin, lecithin, cholic acid, Specific examples include snake venom, bee venom, enzymes such as protease, biological components such as complement, and the like. Such hemolytic agents can be used as 0.0001 wt% to 10 wt%, preferably 0.001 wt% to 5 wt%, particularly preferably 0.005 wt% to 1 wt% aqueous liquid. Examples of the aqueous liquid medium include water or a mixed medium with an organic solvent miscible with water. Moreover, the usage-amount of this aqueous liquid is 50 to 100,000 times by volume unit with respect to a blood sample, Preferably it is 100 to 10,000 times, Most preferably, it is 500 to 2,000 times.
[0010]
The immunoassay method for human medalacin using the aqueous dilution of a human blood sample obtained by completely destroying the granulocytes thus obtained as a sample is an anti-human medalacin antibody in the presence of an antigen or antibody labeled with the measurement sample. And an immunoreaction step of capturing as a labeled immune complex by an antigen-antibody reaction, and a detection step of measuring the generated immune complex using a labeling substance present in the molecule.
[0011]
The method of antigen-antibody reaction that constitutes the preceding immune reaction stage is arbitrary.
For example,
(1) Sandwich method of forming an antibody-antigen-antibody sandwich complex in which an antibody to be measured is captured by an antibody bound to an insoluble carrier and then reacted with a labeled antibody;
(2) A two-antibody method in which an antibody derived from a different animal species than an antibody bound to an insoluble carrier is used in the sandwich method, and the resulting sandwich complex is further reacted with a labeled second antibody against the antibody,
(3) A competition method in which an antibody to be measured is reacted with an antibody bound to an insoluble carrier in the presence of a labeled antigen (for example, labeled with a peroxidase enzyme),
(4) Aggregation-precipitation method in which a labeled antibody that reacts specifically with a sample containing the antigen to be measured is allowed to act on the sample to aggregate and precipitate, and then the labeled substance in the immune complex separated by centrifugation is detected. In addition,
(5) The biotin-avidin method in which labeled avidin is reacted with a biotin-labeled antibody can be used without limitation.
[0012]
When an insoluble carrier is used in the immunoassay method for human medalacin of the present invention, examples of the insoluble carrier include high molecular compounds such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, and polysaccharides. Other examples include glass, metal, magnetic particles, and combinations thereof. As the shape of the insoluble carrier, various shapes such as a tray shape, a spherical shape, a fiber shape, a rod shape, a disk shape, a container shape, a cell, a microplate, and a test tube can be employed.
[0013]
The method for immobilizing the antigen or antibody on these insoluble carriers is arbitrary, but a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or the like can be used.
The class of antibodies used in the method for immunological measurement of human medalacin of the present invention is arbitrary, but an IgG class antibody is preferably used. The antibody can be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred. In addition, the form thereof is whole antibody or F (ab ′) ₂ Fragments such as Fab and the like can be used. The origin of the antibody is arbitrary, but antibodies derived from mice, rats, rabbits, sheep, goats, chickens and the like are preferably used.
[0014]
Next, it is preferable to use an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive substance or the like as a labeling substance for measuring the labeled immune complex of human medalacin captured in this manner at the detection stage. Such enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc., fluorescent materials such as fluorescein isocyanate and phycobiliprotein, luminescent materials such as luminols, dioxetanes, acridinium salts, and the like As a substance ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹¹¹ In, ^99m Tc etc. can be mentioned without limitation. When the labeling substance is an enzyme, a substrate, and if necessary, a color former, a fluorescent agent, and a luminescent agent are used for measuring the activity. When peroxidase is used as an enzyme, hydrogen peroxide or the like is used as a substrate, and 2,2′-azinodi [3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid] ammonium salt (ABTS), 5-aminosalicylic acid, o-phenylene as a color former. Diamine, 4-aminoantipyrine, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, etc., fluorescent agents such as 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, etc., luminous agents such as luminols , A lucigenin charge transfer complex (see, for example, International Publication No. WO00 / 09626) and the like can be used. When alkaline phosphatase is used as the enzyme, 4-nitrophenyl phosphate, 4-methylumbelliferyl phosphate, cortisol-21-phosphate, etc. as the substrate, and when β-D-galactosidase is used as the enzyme, 2- Nitrophenyl-β-D-galactoside, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside, 3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4 (3 ″ -β-D-galactosyloxyphenyl) -1,2-dioxetane (AMPGD) or the like can be used.
[0015]
Polyclonal antibodies that can be used in the immunoassay method for human medalacin of the present invention are those isolated and purified as antibody components of anti-human medalacin antiserum obtained by immunizing animals with human medalacin as an antigen by a conventionally known method. Can be used. Among them, for example, goat anti-human medalacin-polyclonal antibody and rabbit anti-human medalacin-polyclonal antibody are preferably used. Further, the monoclonal antibody and its production method are described in detail in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-151085 filed earlier.
[0016]
An anti-human medalacin monoclonal antibody that can be used in the immunoassay method for human medalacin of the present invention is an antibody-producing cell collected from an animal immunized with human medalacin extracted from granulocytes isolated from blood of healthy humans and myeloma cells. The hybridoma produced by cell fusion can be cultured on a medium, or can be produced by administering it into the abdominal cavity of an animal and growing it in ascites, and then collecting it from the culture or ascites. That is, a hybridoma that produces an anti-human medalacin monoclonal antibody is obtained by so-called cell fusion, and is obtained by collecting antibody-producing cells from animals immunized with human medalacin as an antigen and fusing them with myeloma cells. The obtained hybridoma can be selectively proliferated, an antibody-producing hybridoma can be searched from the hybridoma, and the desired monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced by cloning.
[0017]
Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, B-lymphocytes and the like obtained from animals immunized with human medalacin or a composition or cells containing the same. Examples of animals to be immunized include mice, rats, rabbits, goats, sheep and horses. For immunization, for example, human medalacin is administered as it is or with an appropriate adjuvant, subcutaneously, intramuscularly or intraperitoneally at about 1 μg / dose to 1 mg / dose once / month to 2 times / month for 1 month to 6 months. Is done. Separation of antibody-producing cells is performed by collecting from the immunized animal 2 to 4 days after the final immunization.
[0018]
As myeloma cells, those derived from mice and rats can be used. The antibody-producing cells and the myeloma cells are preferably derived from the same species.
The method of cell fusion is arbitrary, but for example, it can be carried out by mixing antibody-producing cells and myeloma cells in the presence of a fusion promoter such as polyethylene glycol in a medium such as Darcope modified Eagle medium (DMEM). .
After completion of cell fusion, the hybridoma is selected by appropriately diluting with DMEM or the like, centrifuging, suspending the obtained precipitate in a selective medium such as HAT medium and culturing. Subsequently, antibody-producing hybridomas are searched for by the enzyme antibody method using the culture supernatant, and cloning is performed by the limiting dilution method or the like, so that a hybridoma producing an anti-human medalacin monoclonal antibody can be obtained.
[0019]
In order to produce a monoclonal antibody using the antibody-producing hybridoma thus obtained, the hybridoma is cultured in a medium or in vivo, and the monoclonal antibody is collected from the culture. In order to produce a large amount of monoclonal antibody, it is preferable to collect a method in which the hybridoma is administered into the abdominal cavity of an animal of the same species as the myeloma cell-derived cells, and the monoclonal antibody is accumulated in the ascites and collected from the ascites. .
Separation of the monoclonal antibody from the culture or ascites can be performed by an ammonium sulfate fractionation method commonly used for IgG purification, chromatography using an anion exchanger, or a column such as protein A or G.
[0020]
There are four types of anti-human medalacin monoclonal antibodies obtained as described above, 3F03, 3G03, 2E04, and 1G12, depending on the type of hybridoma that produces them. All of these monoclonal antibodies are IgG in the globulin class and IgG in the subclass. ₁ Each antibody specifically reacts with human medalacin, which is an antigen, and is useful for an immunological assay for human medalacin.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to reference examples. However, the present invention is not limited to the examples. In addition,% in an Example means weight%.
[0022]
[Reference Example 1]
Preparation of purified human medalacin
A 6% physiological saline solution of dextran (molecular weight 200,000-300,000) is mixed in a ratio of blood: dextran aqueous solution = 2: 1 to 400 ml of healthy human blood, and lightly stirred with a glass rod or the like, and then at a temperature of 4 ° C. to 8 ° C. The precipitate was separated from the supernatant by centrifugation at 15,000 rpm, and the precipitate was collected to obtain leukocytes. Next, an extraction solution consisting of 1M potassium phosphate buffer (PKB) of pH 7.0 containing 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) and 1 mM p-chloromercurybenzoic acid (PCMB) is added to the leukocytes. Incubate for 20 minutes at 37 ° C under agitation, then completely disrupt cells by sonication for 15 seconds, and further incubate for 20 minutes at 37 ° C, then 12,000 rpm at 4 ° C. The supernatant was collected by centrifuging for 10 minutes, and the supernatant was dialyzed against distilled water. The precipitate was extracted several times by repeating the same operation as described above. The extract was then passed through a CM-Sepharose gel column equilibrated with 50 mM PKB (pH 6.0), washed with the same buffer, and the adsorbate was eluted with 1 M PKB (pH 6.0). The eluate was dialyzed against distilled water overnight and desalted, and then concentrated with a collodion membrane to obtain 1.5 mg of purified human medalacin.
[0023]
[Reference Example 2]
Preparation of anti-human medalacin monoclonal antibody
(1) Hybridoma production by cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells
Human medalacin extracted and purified from human granulocytes in Reference Example 1 was emulsified with Freund's complete adjuvant and administered subcutaneously to 7-week-old BALB / C mice in an amount of 50 μg / mouse. After 4 weeks, this mouse was boosted in the same manner as the first time, and after 7 days, it was confirmed that the amount of antibody had increased in the blood. After 7 days, 50 μg of antigen was injected into the peritoneal cavity as the final immunization. The dose was administered per animal. On the other hand, mouse myeloma cells P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) were maintained and cultured in a Darcope modified eagle (DMEM) medium supplemented with 20% fetal bovine serum. Three days after the final immunization, Spleen cells were collected and fused with P3U1 using polyethylene glycol 4000 and plated on 96-well microplates. After cell fusion, the medium is replaced with DMEM (HAT medium) supplemented with 100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, and 16 μM thymidine, and is a fusion of spleen cells and myeloma cells by selective culture for 2-3 weeks. A hybridoma was obtained.
[0024]
(2) Screening for hybridomas producing anti-human medalacin antibodies
Next, the antibody activity in the culture solution of this hybridoma was screened by ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Specifically, human medalacin was adsorbed on a microplate for ELISA, subjected to blocking treatment with a solution of 2% bovine serum albumin (BSA) added to 10 mM phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4, and then hybridoma. 50 μl of the culture solution was added to the microplate and allowed to stand for 1 hour, and then the hybridoma culture solution was removed and washed. To this was added 100 μl of a 2 μg / ml PBS solution of peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG-Fc specific antibody, The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour. Next, this enzyme-labeled antibody solution was removed and washed, and then 200 μl of 0.1 M phosphate citrate buffer (pH 4.6) containing 0.05% ABTS and 0.0034% hydrogen peroxide was added to develop the color, thereby causing anti-human medalacin. Antibody-producing hybridomas were selected.
[0025]
(3) Cloning of antibody-producing strains and production of monoclonal antibodies
This anti-human medalacin antibody-producing hybridoma culture solution was collected and cloned by limiting dilution to finally obtain four types of single clone hybridomas. Each of these hybridomas was administered to the peritoneal cavity of pristane-administered BALB / C mice to proliferate, and ascites containing monoclonal antibodies was obtained. Next, 50% saturated ammonium sulfate is added to the obtained ascites to precipitate the antibody, the precipitate is separated and dissolved in PBS, and dialyzed against 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 3 M NaCl. 3F03, 3GO3, 2E04, 3E03, 3GO3, 2E04, by purifying by applying to a protein A-Sepharose CL4B column (Pharmacia), and eluting the adsorbed antibody with 0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer (pH 5.0) and neutralizing it. And 4 types of monoclonal antibodies consisting of 1G12 were obtained.
[0026]
(4) Properties of monoclonal antibodies
[Western blotting method]
Antigen specific for the monoclonal antibody was immobilized using Western blotting.
First, human granulocyte-derived medalacin was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, then a solution containing 25 mM glycine and 20% methanol in an electrolyte buffer, and a voltage gradient from 7 s / cm for 2 hours. The protein was transferred to a nitrocellulose sheet. Next, each lane of the nitrocellulose sheet was separated, one sheet was protein-stained with amide black, and the other was subjected to the following enzyme immunoassay. Specifically, after blocking with 2% BSA / PBS, a mouse anti-human medalacin monoclonal antibody is added as a primary antibody, and a peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG-Fc specific antibody is added as a secondary antibody to react and washed. By adding a substrate solution consisting of PBS containing 0.04% 3,3'-diaminobenzidine and 0.0034% hydrogen peroxide, the four mouse anti-human medalacin monoclonal antibodies recognize human granulocyte-derived medalacin Confirmed to do.
[0027]
[Inhibition assay]
Human medalacin immobilized on an ELISA microplate was reacted with a biotinylated first antibody and an unlabeled second antibody in the presence of avidin, and then reacted with avidinized peroxidase. Inhibition assay, in which the amount of biotinylated antibody reaction is measured by adding color, the biotinylated antibody reaction amount does not change in any two combinations. All of the monoclonal antibodies were confirmed to recognize different epitopes (antigen sites).
[0028]
[Example 1]
Creating a calibration curve for measuring human medalacin
(1) Preparation of monoclonal antibody-immobilized beads
The polystyrene beads (diameter 6 mm) are washed thoroughly, and then left in PBS (pH 7.4) solution containing 10 μg / ml of mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04) at a temperature of 4 ° C. for one day and night. The antibody was washed and allowed to stand for 1 day at night at a temperature of 4 ° C. in a 1% BSA aqueous solution to give a blocking treatment to obtain monoclonal antibody-immobilized beads.
[0029]
(2) Preparation of peroxidase-labeled monoclonal antibody
In a PBS solution containing 1.0 mg / ml of mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04), 0.1 ml of a dimethylformamide solution having a concentration of 10 mg / ml of N- (m-maleimidobenzoic acid) -N-succinimide ester (MBS) was added. Add and react for 30 minutes at a temperature of 25 ° C. Next, this reaction mixture was subjected to gel filtration with a 0.1M phosphate buffer (pH 6.O) using a column packed with Sephadex G-25 to separate the maleimidated monoclonal antibody and unreacted MBS.
On the other hand, an ethanol solution of N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) at a concentration of 10 mg / ml was added to a 1.0 mg / ml PBS solution of horseradish peroxidase (HRP) as a peroxidase, React for 30 minutes at a temperature of 25 ° C. The reaction mixture was then purified by gel filtration with 10 mM acetate buffer (pH 4.5) using a column packed with Sephadex G-25, and a fraction containing pyridyl disulfide HRP was collected. Concentrate about 10 times under ice-cooling in collodion bag. Next, 1 ml of 0.1 M acetic acid buffered saline (pH 4.5) containing 0.1 M dithiothreitol was added thereto and stirred at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes to introduce pyridyl disulfide groups introduced into the HRP molecule. After the reduction, the reaction mixture was subjected to gel filtration using a column packed with Sephadex G-25 to obtain a fraction containing thiolated HRP.
Next, the maleimidated monoclonal antibody and thiolated HRP were mixed, concentrated to a protein concentration of 4 mg / ml under ice-cooling using a collodion bag, and allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then Ultrogel AcA44 (SEPRACOR) was used. Gel filtration was performed using a packed column to obtain a peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibody.
[0030]
(3) sandwich enzyme immunoassay method for human medalacin
2% containing one bead on which mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (3F03) is immobilized and purified human medalacin (standard substance) at concentrations of 0, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml, and 200 ng / ml Add 50 μl of BSA-containing PBS solution and 350 μl of 2% BSA-containing PBS solution containing 0.2 μg / ml HRP-labeled mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (2E04) and incubate at 37 ° C. for 30 minutes, then in vitro After the solution is removed by suction, it is washed with physiological saline. Next, 250 μl each of 0.015% 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine hydrochloride aqueous solution (250 μl) and 0.1M phosphate citrate buffer (pH 4.5) containing 0.0034% hydrogen peroxide in a test tube. Add to each tube and incubate for 30 minutes at a temperature of 37 ° C. Add 500 ml of 1N sulfuric acid as a reaction terminator to stop the enzyme reaction, and then measure the absorbance at a wavelength of 450 nm using a spectrophotometer. By plotting this against the standard substance concentration, a calibration curve having a good concentration dependency as shown in FIG. 1 was obtained.
[0031]
[Example 2]
Determination of human medalacin in clinical samples by enzyme immunoassay
Samples of healthy and multiple sclerosis blood collected and cryopreserved are thawed back to room temperature, 10 μl is collected and added to 2 ml of purified water containing 0.01% dodecyltrimethylammonium bromide, and a vortex mixer is added. Mix well to make the sample solution, and add 10 μl to the test tube. Next, 40 μl of 2% BSA-containing PBS (pH 7.4) was added thereto for dilution, and one bead each immobilized with a mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (3F03) and an HRP-labeled mouse anti-human medalacin were added to this test tube. 350 μl of 2% BSA-containing PBS solution containing monoclonal antibody (2E04) at a concentration of 0.2 μg / ml was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 30 minutes. Next, after washing, enzymatic reaction, and stopping the reaction by exactly the same operations as those for creating the calibration curve described above, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using a spectrophotometer, and the human medalacin concentration was determined from the calibration curve. Asked. As a result of performing the measurement operation five times separately from the sample dilution process for the purpose of examining the reproducibility of this measurement, the human medalacin concentration in the sample blood may show a very good reproducibility as shown in Table 1. confirmed.
[0032]
[Table 1]

[0033]
[Comparative Example 1]
Determination of human medalacin in clinical samples by enzyme immunoassay
A blood sample of a healthy person and multiple sclerosis patient collected and cryopreserved is returned to room temperature and thawed, 10 μl of the sample is taken into 2 ml of PBS (pH 7.4) and mixed uniformly to obtain a sample solution. 10 μl of the solution was added to a test tube, and 40 μl of PBS (pH 7.4) containing 2% BSA was added thereto for dilution. Next, a PBS solution containing 2% BSA containing one bead in which a mouse anti-human medalacin monoclonal antibody (3F03) is immobilized in this test tube and an HRP-labeled mouse anti-human medalasin monoclonal antibody (2E04) at a concentration of 0.2 μg / ml. 350 μl was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Next, after washing, enzymatic reaction, and stopping the reaction by exactly the same operations as those for creating the calibration curve described above, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using a spectrophotometer, and the human medalacin concentration was determined from the calibration curve. Asked. As a result of performing the measurement operation five times separately from the sample dilution process for the purpose of examining the reproducibility of this measurement, the measured value of the human medalacin concentration in the sample blood cannot be said to have good reproducibility as shown in Table 2. The data is shown.
[0034]
[Table 2]

[0035]
【The invention's effect】
By adopting the configuration of the invention as described above, it becomes possible to accurately measure the amount of human medalacin in a human blood sample with good reproducibility, and it is used for blood diagnosis of chronic inflammatory diseases, particularly multiple sclerosis. The place that contributes to
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a calibration curve for measuring human medalacin prepared by measuring human medalacin (standard substance) using the enzyme immunoassay method described in Example 1 and plotting the absorbance as a function of antigen concentration.

Claims

A human blood sample is treated with an aqueous liquid containing 0.005% to 1% by weight of a surfactant to completely destroy white blood cells in the human blood sample, and then human medalacin is purified using an anti-human medalacin monoclonal antibody. An immunological measurement method for human medalacin in a human blood sample, characterized in that the absorbance at a wavelength of 450 nm is measured for quantification.

An anti-human medalacin monoclonal immobilized on an insoluble carrier after treating a human blood sample with an aqueous liquid containing 0.005% to 1% by weight of a surfactant to completely destroy white blood cells in the human blood sample The label in the complex is quantified by contacting the antibody and a labeled anti-human medalacin monoclonal antibody to form a sandwich complex by an antigen-antibody reaction, capturing human medalacin on an insoluble carrier, and then measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm. And quantifying human medalacin in a human blood sample.

The immunology of human medalacin according to claim 1 or 2, wherein the surfactant is any one of an anionic surfactant, a cationic surfactant, a nonionic surfactant, and an amphoteric surfactant. Measurement method.

The method for immunoassay of human medalacin according to any one of claims 1 to 3, wherein the surfactant is a cationic surfactant.

The anionic surfactant is a higher fatty acid salt, an alkyl aryl sulfonate, an alkyl sulfonate, or an alkyl sulfate salt, and the cationic surfactant is an alkyl pyridinium salt or an alkyl trimethyl ammonium salt. The nonionic surfactant is polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene alkyl ether or polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, and the zwitterionic surfactant is alkylbetaine. Immunological assay for human medalacin.