JP4366498B2 - ペルオキシダーゼ複合粘土膜及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ペルオキシダーゼ複合粘土膜及びその製造方法に関するものであり、更に詳しくは、自立膜として利用可能な機械的強度を有し、粘土粒子の積層を高度に配向させた、新規粘土配向薄膜を利用して、該粒子配向の揃った粘土薄膜粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布した複合粘土膜を製造する方法及び該方法で調製された複合粘土膜等に関するものである。
本発明は、分析用酵素触媒として重要なペルオキシダーゼ、その用途及び機能性粘土薄膜の技術分野において、粘土粒子の積層を高度に配向させた、自立膜として利用可能な機械的強度を有する新規粘土配向薄膜を利用して、該粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分散させた、耐熱性を有するペルオキシダーゼ酵素触媒性能を有する粘土薄膜を製造する方法、該方法により調製された複合粘土膜、耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒、及び耐熱性及び高バリアー性部材等を提供するものとして有用である。
本発明は、分析用酵素触媒として重要なペルオキシダーゼ、その用途及び機能性粘土薄膜の技術分野において、粘土粒子の積層を高度に配向させた、自立膜として利用可能な機械的強度を有する新規粘土配向薄膜を利用して、該粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分散させた、耐熱性を有するペルオキシダーゼ酵素触媒性能を有する粘土薄膜を製造する方法、該方法により調製された複合粘土膜、耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒、及び耐熱性及び高バリアー性部材等を提供するものとして有用である。
ペルオキシダーゼを始めとする酵素は、生体触媒として有用であり、きわめて高選択的特異的に反応を司るが、耐熱性に劣るという欠点がある。しかしながら、有機物の熱安定性は、それが無機物で包接されたときには、一般には、かなり高くなることが知られている。
酵素は、室温で長時間保存すると、活性が低下するものがある。したがって、酵素反応を利用して分析を行う場合、測定直前に、その都度、溶液の調製をしなければならない。この場合、測定手順が面倒になる他、無駄になる溶液あるいは試薬が発生し、経済的に好ましくないだけではなく、廃液あるいは廃薬品が発生し、それらの処分に手間がかかるという問題点がある。
一方、粘土は、水やアルコールに分散し、その分散液をガラス板の上に広げ、静置乾燥することにより粒子の配向の揃った膜を形成することが知られており、この方法でＸ線回折用の定方位試料が調製されてきた（非特許文献１）。しかしながら、ガラス板上に膜を形成した場合、ガラス板から粘土膜を剥がすことが困難であり、剥がす際に膜に亀裂が生じるなど、自立膜として得ることが難しかった。また、ガラス板から粘土膜を剥がせたとしても、膜が脆く、強度が不足であり、しかも、ピンホールのない均一の厚さの膜を調製することは困難であった。
酵素は、室温で長時間保存すると、活性が低下するものがある。したがって、酵素反応を利用して分析を行う場合、測定直前に、その都度、溶液の調製をしなければならない。この場合、測定手順が面倒になる他、無駄になる溶液あるいは試薬が発生し、経済的に好ましくないだけではなく、廃液あるいは廃薬品が発生し、それらの処分に手間がかかるという問題点がある。
一方、粘土は、水やアルコールに分散し、その分散液をガラス板の上に広げ、静置乾燥することにより粒子の配向の揃った膜を形成することが知られており、この方法でＸ線回折用の定方位試料が調製されてきた（非特許文献１）。しかしながら、ガラス板上に膜を形成した場合、ガラス板から粘土膜を剥がすことが困難であり、剥がす際に膜に亀裂が生じるなど、自立膜として得ることが難しかった。また、ガラス板から粘土膜を剥がせたとしても、膜が脆く、強度が不足であり、しかも、ピンホールのない均一の厚さの膜を調製することは困難であった。
最近、ラングミュアーブロジェット法（Langmuir-Blodgett Method）を応用した粘土薄膜の作製が行われている（非特許文献２）。しかし、この方法でも、粘土薄膜は、ガラス等の材料でできた基板表面上に形成されるものであり、自立膜としての強度を得ることができなかった。更に、従来、例えば、機能性粘土薄膜等を調製する方法が種々報告されている。例えば、ハイドロタルサイト系層間化合物の水分散液を膜状化して乾燥することからなる粘土薄膜の製造方法（特許文献１）、層状粘土鉱物と燐酸又は燐酸基との反応を促進させる熱処理を施すことによる層状粘土鉱物が持つ結合構造を配向固定した層状粘土鉱物薄膜の製造方法（特許文献２）、スメクタイト系粘土鉱物と２価以上の金属の錯化合物を含有する皮膜処理用水性組成物（特許文献３）、等をはじめ、多数の事例が存在する。しかしながら、これまで、自立膜として利用可能な機械的強度を有し、粘土粒子の積層を高度に配向させた膜の開発例はなかった。
更に、化粧品及び医薬品分野においては、例えば、好適な球状の有機複合粘土鉱物（特許文献４、特許文献５）、粘土鉱物と酸と酵素とを混合した湿潤性水虫の治療薬の製造（特許文献６、特許文献７）等が提案されており、粘土と有機化合物を複合化させることが行われている。しかしながら、これらの有機複合粘土鉱物を自立膜として用いることはなされてこなかったのが実情であり、当技術分野では、そのような特性を有し、自立膜として利用可能な機械的強度を有する新しい粘土薄膜を開発し、実用化することが強く求められていた。
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、自立膜として利用可能な機械的強度を有し、しかも、優れたフレキシビリティーを有し、高温度条件下で使用できる新しい粘土薄膜を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねる過程で、粘土分散水溶液を調製し、これにペルオキシダーゼを少量混合し、均一な分散液を得た後、この分散液を水平に静置し、粘土粒子を沈積させるとともに、分散液である液体を種々の固液分離方法、例えば、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法で分離し、膜状に形成した後、これを支持体から剥離することにより、粘土粒子が配向した粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布した複合粘土膜が得られることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
本発明は、ペルオキシダーゼを含み、該ペルオキシダーゼが均一に分散し、かつ該ペルオキシダーゼの熱安定性に優れた配向性粘土自立膜を製造し、提供することを目的とするものである。
また、本発明は、耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒性能を有する複合粘土膜の製造方法、及び該方法で作製された新規複合粘土膜及びペルオキシダーゼ酵素触媒を提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、フレキシブリティーに優れ、かつ高温条件において、気体・液体のバリアー性に優れた粘土配向膜からなる耐熱性及び高バリアー性部材、及び過酸化水素定量用試薬等の新規材料を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒性能を有する複合粘土膜の製造方法、及び該方法で作製された新規複合粘土膜及びペルオキシダーゼ酵素触媒を提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、フレキシブリティーに優れ、かつ高温条件において、気体・液体のバリアー性に優れた粘土配向膜からなる耐熱性及び高バリアー性部材、及び過酸化水素定量用試薬等の新規材料を提供することを目的とするものである。
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）自立膜として利用可能な機械的強度と耐熱性及びフレキシビリティーを有し、粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布した複合粘土膜を調製する方法であって、１）ペルオキシダーゼ及び粘土を水あるいは水を主成分とする分散媒である液体に分散し、均一な粘土分散液を調製する、２）この分散液を静置し、粘土粒子を沈積させるとともに、分散媒である液体を固液分離手段で分離して、膜状に形成して乾燥し、複合粘土膜を作製する、３）これにより、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分布させた、耐熱性のペルオキシダーゼ酵素触媒性を有する複合粘土膜を自立膜として得る、４）薄膜調製時にグルコースオキシダーゼを添加する、ことを特徴とする複合粘土膜の調製方法。
（２）粘土として、天然あるいは合成スメクタイト、又はそれらの混合物を用いる、前記（１）記載の方法。
（３）粘土分散液の濃度が、０．５〜１０重量パーセントである、前記（１）記載の方法。
（４）粘土粒子を沈積させるとともに、分散媒である液体を、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法による固液分離手段で分離して、膜状に形成し、複合粘土薄膜を作製する、前記（１）記載の方法。
（５）上記分散液を平坦な支持体に注いで水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で、３０〜７０℃の温度条件下で、分散媒である液体をゆっくり蒸発させて、膜状に形成し、複合粘土膜を作製する、前記（１）記載の方法。
（６）該薄膜中のペルオキシダーゼの、全固体に対する重量割合が１パーセントから３０パーセントである、前記（１）記載の方法。
（７）該薄膜調製時にルミノールを添加し、ルミノールの全固体に対する重量割合が０．１パーセントから５パーセントである、前記（１）記載の方法。
（８）該薄膜中のグルコースオキシダーゼの、全固体に対する重量割合が１パーセントから１５パーセントである、前記（１）記載の方法。
（９）前記（１）から（８）のいずれかに記載の方法で調製された、自立膜として利用可能な機械的強度を有し、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布したことを特徴とする複合粘土膜。
（１０）任意の形状を有し、自立膜として用いることが可能である、前記（９）記載の複合粘土膜。
（１１）厚さは１ｍｍよりも薄く、面積は１ｃｍ2 よりも大きい、前記（９）記載の複合粘土膜。
（１２）粘土膜の主要構成成分が、雲母、バーミキュライト、モンモリロナイト、鉄モンモリロナイト、バイデライト、サポナイト、ヘクトライト、スチーブンサイト、又はノントロナイトである、前記（９）記載の複合粘土膜。
（１３）前記（９）から（１２）のいずれかに記載の複合粘土膜を構成要素として含むことを特徴とする耐熱性・高バリアー性部材。
（１４）前記（９）から（１２）のいずれかに記載の複合粘土膜を構成要素として含むことを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒。
（１５）前記（７）に記載の方法で作製されたルミノールとペルオキシダーゼが共存する複合粘土膜からなる試薬であって、過酸化水素水溶液と接するとルミノール反応による化学発光する作用を有することを特徴とする過酸化水素定量用試薬。
（１）自立膜として利用可能な機械的強度と耐熱性及びフレキシビリティーを有し、粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布した複合粘土膜を調製する方法であって、１）ペルオキシダーゼ及び粘土を水あるいは水を主成分とする分散媒である液体に分散し、均一な粘土分散液を調製する、２）この分散液を静置し、粘土粒子を沈積させるとともに、分散媒である液体を固液分離手段で分離して、膜状に形成して乾燥し、複合粘土膜を作製する、３）これにより、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分布させた、耐熱性のペルオキシダーゼ酵素触媒性を有する複合粘土膜を自立膜として得る、４）薄膜調製時にグルコースオキシダーゼを添加する、ことを特徴とする複合粘土膜の調製方法。
（２）粘土として、天然あるいは合成スメクタイト、又はそれらの混合物を用いる、前記（１）記載の方法。
（３）粘土分散液の濃度が、０．５〜１０重量パーセントである、前記（１）記載の方法。
（４）粘土粒子を沈積させるとともに、分散媒である液体を、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法による固液分離手段で分離して、膜状に形成し、複合粘土薄膜を作製する、前記（１）記載の方法。
（５）上記分散液を平坦な支持体に注いで水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で、３０〜７０℃の温度条件下で、分散媒である液体をゆっくり蒸発させて、膜状に形成し、複合粘土膜を作製する、前記（１）記載の方法。
（６）該薄膜中のペルオキシダーゼの、全固体に対する重量割合が１パーセントから３０パーセントである、前記（１）記載の方法。
（７）該薄膜調製時にルミノールを添加し、ルミノールの全固体に対する重量割合が０．１パーセントから５パーセントである、前記（１）記載の方法。
（８）該薄膜中のグルコースオキシダーゼの、全固体に対する重量割合が１パーセントから１５パーセントである、前記（１）記載の方法。
（９）前記（１）から（８）のいずれかに記載の方法で調製された、自立膜として利用可能な機械的強度を有し、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布したことを特徴とする複合粘土膜。
（１０）任意の形状を有し、自立膜として用いることが可能である、前記（９）記載の複合粘土膜。
（１１）厚さは１ｍｍよりも薄く、面積は１ｃｍ2 よりも大きい、前記（９）記載の複合粘土膜。
（１２）粘土膜の主要構成成分が、雲母、バーミキュライト、モンモリロナイト、鉄モンモリロナイト、バイデライト、サポナイト、ヘクトライト、スチーブンサイト、又はノントロナイトである、前記（９）記載の複合粘土膜。
（１３）前記（９）から（１２）のいずれかに記載の複合粘土膜を構成要素として含むことを特徴とする耐熱性・高バリアー性部材。
（１４）前記（９）から（１２）のいずれかに記載の複合粘土膜を構成要素として含むことを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒。
（１５）前記（７）に記載の方法で作製されたルミノールとペルオキシダーゼが共存する複合粘土膜からなる試薬であって、過酸化水素水溶液と接するとルミノール反応による化学発光する作用を有することを特徴とする過酸化水素定量用試薬。
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者らは、粘土分散水溶液を調製し、これにペルオキシダーゼ等の有機試薬を適量混合し、均一な分散液を得た後、この分散液を静置し、粘土粒子を沈積させるとともに、種々の固液分離方法、すなわち、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法で分離し、膜状に形成した後、支持体から剥離することにより、粘土粒子が配向し、粘土粒子間隙にペルオキシダーゼ等の有機試薬が均一に分布した粘土薄膜を自立膜として得られることを見出し、更に、均一な厚さで自立膜として用いるに十分な強度を得るための製造方法及び条件を見出した。すなわち、本発明は、希薄で均一な粘土及びペルオキシダーゼを含む分散水溶液を調製し、該分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、分散媒である液体を種々の固液分離方法、例えば、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法で分離し、膜状に形成した後、これを支持体から剥離すること、その際に、均一な厚さで自立膜として用いるに十分な強度を得るための製造条件を採用すること、これにより、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分布させた複合粘土膜を自立膜として得ること、を特徴とするものである。
本発明者らは、粘土分散水溶液を調製し、これにペルオキシダーゼ等の有機試薬を適量混合し、均一な分散液を得た後、この分散液を静置し、粘土粒子を沈積させるとともに、種々の固液分離方法、すなわち、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法で分離し、膜状に形成した後、支持体から剥離することにより、粘土粒子が配向し、粘土粒子間隙にペルオキシダーゼ等の有機試薬が均一に分布した粘土薄膜を自立膜として得られることを見出し、更に、均一な厚さで自立膜として用いるに十分な強度を得るための製造方法及び条件を見出した。すなわち、本発明は、希薄で均一な粘土及びペルオキシダーゼを含む分散水溶液を調製し、該分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、分散媒である液体を種々の固液分離方法、例えば、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法で分離し、膜状に形成した後、これを支持体から剥離すること、その際に、均一な厚さで自立膜として用いるに十分な強度を得るための製造条件を採用すること、これにより、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分布させた複合粘土膜を自立膜として得ること、を特徴とするものである。
本発明では、粘土として、天然あるいは合成物、好ましくは天然あるいは合成スメクタイトの何れかあるいはそれらの混合物を用い、水あるいは水を主成分とする液体に加え、希薄で均一な分散液を調製する。粘土分散液の濃度は、好適には０．５から１０重量パーセント、より好ましくは１から３重量パーセントである。このとき、粘土分散液の濃度が薄すぎる場合、乾燥に時間がかかり過ぎるという問題点がある。また、粘土分散液の濃度が濃過ぎる場合、よく粘土が分散しないため、粘土粒子の配向が悪く、均一な膜ができないという問題がある。次に、秤量したペルオキシダーゼ粉末を粘土分散液に加え、均一なペルオキシダーゼ粘土分散液を調製する。ペルオキシダーゼの全固体に対する割合は、１パーセントから３０パーセントであり、好ましくは５パーセントから２０パーセントである。このとき、ペルオキシダーゼの割合が低過ぎる場合、ペルオキシダーゼの添加の効果が現れず、ペルオキシダーゼの割合が高過ぎる場合、調製した膜中でペルオキシダーゼと粘土の分布が不均一になり、やはり添加効果が薄れる。
本発明において、薄膜調製時に、分散液に適量のルミノールを添加すると、ペルオキシダーゼ及びルミノールが均一に分散した粘土膜を得ることができる。このルミノールとペルオキシダーゼが共存する粘土薄膜は、過酸化水素水溶液と接すると、ルミノール反応による化学発光し、過酸化水素水溶液中の過酸化水素の定量に用いることが可能である。このとき、ペルオキシダーゼは、ルミノール反応の酵素触媒として働く。添加するルミノールの全固体に対する重量割合は、０．１パーセントから５パーセントであり、このとき、ルミノールの割合が低過ぎる場合、ルミノールの添加の効果が現れず、高い発光強度が得られない。また、ルミノールの割合が高過ぎる場合、調製した膜中でルミノールと粘土の分布が不均一になり、発光挙動が不安定になるという問題点がある。
また、本発明では、薄膜調製時に、分散液に適量のグルコースオキシダーゼを添加すると、粘土薄膜の乾燥時及び乾燥後の粘土膜のひび割れを防ぐ効果がある。グルコースオキシダーゼの、全固体に対する重量割合は、１パーセントから１５パーセントであり、このとき、グルコースオキシダーゼの割合が低過ぎる場合、グルコースオキシダーゼの添加の効果が現れず、また、グルコースオキシダーゼの割合が高過ぎる場合、調製した膜中でグルコースオキシダーゼと粘土の分布が不均一になり、やはり添加効果が薄れる。
次に、このペルオキシダーゼ粘土分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、例えば、分散液である液体をゆっくりと蒸発させ、膜状に形成する。この場合、好適には、例えば、種々の固液分離方法、好適には、例えば、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、加熱蒸発法の何れか、あるいはこれらの方法を組み合わせて乾燥粘土薄膜を得る。これらの方法のうち、例えば、加熱蒸発法を用いる場合、真空引きにより事前に脱気した分散液を平坦なトレイ、好ましくはプラスチック製あるいは金属製のトレイ等の支持体に注ぎ、水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で３０から７０℃の温度条件下、好ましくは３０から５０℃の温度条件下で、３時間から半日間程度、好ましくは３時間から５時間乾燥して粘土薄膜を得る。分散液を事前に脱気しない場合、粘土薄膜に気泡に由来する孔ができ易くなるという問題点がある。
また、乾燥条件は、液体分を蒸発によって取り除くのに十分であるように設定される。このとき、温度が低過ぎると乾燥に時間がかかるという問題点がある。また、温度が高過ぎると分散液の対流が起こり、粘土粒子の配向度が低下するという問題点がある。粘土薄膜がトレイ等の支持体から自然に剥離しない場合は、１１０から２００℃の温度条件下で乾燥し、剥離を容易にして自立膜を得る。このとき、温度が低過ぎる場合には、剥離が起こりにくいという問題点がある。温度が高過ぎる場合には、乾燥による亀裂が発生しやすくなるという問題点がある。本発明において、粘土粒子の積層を高度に配向させるとは、粘土粒子の単位構造層（厚さ約１ナノメートル）を、層面の向きを一にして積み重ね、層面に垂直な方向に高い周期性を持たせることを意味する。このような粘土粒子の配向を得るためには、希薄で均一な粘土分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、例えば、分散媒である液体をゆっくりと蒸発させ、膜状に形成する必要がある。このプロセスにおける好適な製造条件を示すと、粘土分散液中の粘土の濃度は、好ましくは０．５から１０重量パーセント、より好ましくは１から３重量パーセントであり、また、加熱乾燥法による乾燥条件は、好ましくは強制送風式オーブン中で３０℃から７０℃の温度条件下、より好ましくは３０℃から５０℃の温度条件下で、３時間から半日間程度の乾燥、より好ましくは３時間から５時間程度の乾燥である。
本発明の粘土薄膜は、例えば、はさみ、カッター等で容易に円、正方形、長方形などの任意の大きさ、形状に切り取ることができる。本発明の粘土薄膜は、好適には、厚さは１ｍｍよりも薄く、面積は１ｃｍ2 よりも大きい。また、粘土薄膜の主要構成成分は、好適には、例えば、雲母、バーミキュライト、モンモリロナイト、鉄モンモリロナイト、バイデライト、サポナイト、ヘクトライト、スチーブンサイト、又はノントロナイトである。また、本発明の粘土薄膜は、粘土粒子の積層が高度に配向し、ピンホールの存在しないことを特徴とし、フレキシビリティーに優れ、高温においても構造変化しないことを特徴とする。本発明の粘土薄膜は、自立膜として用いることが可能であり、高温条件下で使用が可能であり、フレキシビリティーに優れており、ピンホールの存在しない緻密な材料であり、かつ気体・液体のバリアー性に優れているといった特徴を有する。
更に、本発明の複合粘土膜は、耐熱性を有するペルオキシダーゼ酵素触媒として用いることが可能であり、フレキシビリティーに優れており、ピンホールの存在しない緻密な材料であり、かつバリアー性に優れているといった特徴を有する。したがって、本発明の複合粘土膜は、高温条件下でフレキシビリティーに優れた自立膜として広範に使用することができ、例えば、化学産業分野の生産ラインの配管連結部などのパッキン又はその類似製品等の耐熱性・高バリアー性部材として利用することができる。本発明の複合粘土膜中のペルオキシダーゼの熱安定性は、上記複合化で著しく改善されており、耐熱型の酵素触媒としての利用も見込める。ペルオキシダーゼが粘土粒子間隙に均一に分散することの意義は、膜強度の均一性を実現するとともに、本発明の複合粘土膜をルミノール反応に基づく過酸化水素の定量に利用する際に、高い定量再現性を実現できることである。また、薄膜調製時に、グルコースオキシダーゼを添加すると、グルコースオキシダーゼが粘土粒子外表面と親和性があるため、グルコースオキシダーゼが粘土粒子外表面に付着した状態で粘土粒子が積層し、結果として、グルコースオキシダーゼが粘土粒子間隙を満たし、粘土粒子を結合する役割を果たす。そのため、グルコースオキシダーゼの配合により複合粘土膜の亀裂の発生が抑えられ、それにより、自立膜として利用可能な優れた特性を有する粘土薄膜が得られる。
本発明により、（１）粘土粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分散し、粘土粒子の配向が揃ったペルオキシダーゼ複合粘土薄膜を製造し、提供できる、（２）該薄膜は、自立膜として用いることができ、耐熱性に優れた酵素触媒としての応用が見込める、（３）該薄膜は、自立膜として用いることができ、耐熱性・高バリアー性部材として応用できる、（４）耐熱性に優れたペルオキシダーゼ酵素触媒性能を有する粘土薄膜を提供できる、（５）グルコースオキシダーゼの配合により膜の亀裂の発生を抑えることができ、亀裂の発生のない粘土薄膜を作製することが可能となる、という効果が奏される。
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの例によって何ら限定されるものではない。
（１）粘土薄膜の製造
本実施例では、ペルオキシダーゼの添加効果を調べるために、ペルオキシダーゼを加え、粘土薄膜を作製した。粘土として、０．７０グラムの天然モンモリロナイト（クニピアＰ、クニミネ工業株式会社製）を６０ｃｍ3 の蒸留水に加え、プラスチック製密封容器にテフロン（登録商標）回転子とともに入れ、激しく振とうし、均一な分散液を得た。この分散液に、０．３０グラムのペルオキシダーゼ粉末（和光純薬工業株式会社製）を加え、この分散液を、底面が平坦であり、底面の形状が正方形であり、その一辺の長さが約１０ｃｍのポリプロピレン製トレイに注ぎ、分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、トレイの水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で５０℃の温度条件下で５時間乾燥して、厚さ約４０マイクロメートルの均一な褐色粘土薄膜を得た。
本実施例では、ペルオキシダーゼの添加効果を調べるために、ペルオキシダーゼを加え、粘土薄膜を作製した。粘土として、０．７０グラムの天然モンモリロナイト（クニピアＰ、クニミネ工業株式会社製）を６０ｃｍ3 の蒸留水に加え、プラスチック製密封容器にテフロン（登録商標）回転子とともに入れ、激しく振とうし、均一な分散液を得た。この分散液に、０．３０グラムのペルオキシダーゼ粉末（和光純薬工業株式会社製）を加え、この分散液を、底面が平坦であり、底面の形状が正方形であり、その一辺の長さが約１０ｃｍのポリプロピレン製トレイに注ぎ、分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、トレイの水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で５０℃の温度条件下で５時間乾燥して、厚さ約４０マイクロメートルの均一な褐色粘土薄膜を得た。
（２）粘土薄膜の特性
この粘土薄膜のＸ線回折チャートを図１に示す。底面反射ピーク００１がｄ＝４．１６及び１．５３ｎｍの位置に観察された。前者はモンモリロナイト（クニピアＰ）の層間にペルオキシダーゼが入り込んだ構造、後者はモンモリロナイト（クニピアＰ）の構造に対応する。この結果から上記方法で作製した粘土薄膜では、モンモリロナイト（クニピアＰ）層間にペルオキシダーゼが存在し、粘土層に抱接されていることが分かる。このペルオキシダーゼ複合粘土膜（ペルオキシダーゼ−クニピアＰ薄膜）のＴＧ−ＤＴＡチャートを図２に示す。ここで、ペルオキシダーゼの全固体に対する重量割合は３０％である。ＴＧ曲線より、室温から２００℃までに吸着水の脱水による重量減少が観察される。また、２００から４５０℃にかけて大きな重量減少が観察される。モンモリロナイト（クニピアＰ、図３）とペルオキシダーゼ（図４）のＴＧ−ＤＴＡチャートを比較すると、モンモリロナイト（クニピアＰ）では２００から４５０℃に大きな重量減少は観察されないのに対し、ペルオキシダーゼではこの温度範囲に大きな重量減少が観察されることがわかる。このことから、この重量減少は、ペルオキシダーゼの分解に伴う変化と考えられる。また、ＤＴＡ曲線から、上記粘土薄膜では、ペルオキシターゼのみで測定した場合よりも、分解が高温側に移っていることがわかる。
この粘土薄膜のＸ線回折チャートを図１に示す。底面反射ピーク００１がｄ＝４．１６及び１．５３ｎｍの位置に観察された。前者はモンモリロナイト（クニピアＰ）の層間にペルオキシダーゼが入り込んだ構造、後者はモンモリロナイト（クニピアＰ）の構造に対応する。この結果から上記方法で作製した粘土薄膜では、モンモリロナイト（クニピアＰ）層間にペルオキシダーゼが存在し、粘土層に抱接されていることが分かる。このペルオキシダーゼ複合粘土膜（ペルオキシダーゼ−クニピアＰ薄膜）のＴＧ−ＤＴＡチャートを図２に示す。ここで、ペルオキシダーゼの全固体に対する重量割合は３０％である。ＴＧ曲線より、室温から２００℃までに吸着水の脱水による重量減少が観察される。また、２００から４５０℃にかけて大きな重量減少が観察される。モンモリロナイト（クニピアＰ、図３）とペルオキシダーゼ（図４）のＴＧ−ＤＴＡチャートを比較すると、モンモリロナイト（クニピアＰ）では２００から４５０℃に大きな重量減少は観察されないのに対し、ペルオキシダーゼではこの温度範囲に大きな重量減少が観察されることがわかる。このことから、この重量減少は、ペルオキシダーゼの分解に伴う変化と考えられる。また、ＤＴＡ曲線から、上記粘土薄膜では、ペルオキシターゼのみで測定した場合よりも、分解が高温側に移っていることがわかる。
本実施例では、ペルオキシダーゼの添加効果を調べるために、ペルオキシダーゼを加え、粘土薄膜を作製した。粘土として、０．７０グラムの合成サポナイト（スメクトン、クニミネ工業株式会社製）を６０ｃｍ3 の蒸留水に加え、プラスチック製密封容器にテフロン（登録商標）回転子とともに入れ、激しく振とうし、均一な分散液を得た。この分散液に、０．３０グラムのペルオキシダーゼ粉末（和光純薬工業株式会社製）を加え、この分散液を、底面が平坦であり、底面の形状が正方形であり、その一辺の長さが約１０ｃｍのポリプロピレン製トレイに注ぎ、分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、トレイの水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で５０℃の温度条件下で５時間乾燥して、厚さ約４０マイクロメートルの均一な褐色粘土薄膜を得た。このペルオキシダーゼ複合粘土膜（ペルオキシダーゼ−クニピアＰ薄膜）のＴＧ−ＤＴＡチャートを図５に示す。ＴＧ曲線より、２００から４５０℃にかけてペルオキシダーゼの分解に伴う大きな重量減少が観察される。ＤＴＡ曲線から、上記粘土薄膜では、ペルオキシターゼのみで測定した場合よりも、分解が高温側に移っていることがわかる。
本実施例では、ペルオキシダーゼの添加効果を調べるために、ペルオキシダーゼを加え、粘土薄膜を作製した。粘土として、０．７０グラムの天然モンモリロナイト（クニピアＰ、クニミネ工業株式会社製）を５０ｃｍ3 の蒸留水に加え、プラスチック製密封容器にテフロン（登録商標）回転子とともに入れ、激しく振とうし、均一な分散液Ａを得た。次に、分散液Ａに、０．３０グラムのペルオキシダーゼ粉末（和光純薬工業株式会社製）を加え、激しく振とうし、均一な分散液Ｂを得た。次に、ルミノール（東京化成工業株式会社製）０．０１グラムを溶解させた水酸化ナトリウム水溶液１０ｃｍ3 溶液を分散液Ｂに加え、激しく振とうし、均一な分散液Ｃを得た。この分散液Ｃを、底面が平坦であり、底面の形状が正方形であり、その一辺の長さが約１０ｃｍのポリプロピレン製トレイに注ぎ、分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、トレイの水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で５０℃の温度条件下で５時間乾燥して、厚さ約４０マイクロメートルの均一な褐色粘土薄膜を得た。
本実施例では、グルコースオキシダーゼの添加効果を調べるために、ペルオキシダーゼとグルコースオキシダーゼを加え、粘土薄膜を作製した。粘土として０．７０グラムの天然モンモリロナイト（クニピアＰ、クニミネ工業株式会社製）を５０ｃｍ3 の蒸留水に加え、プラスチック製密封容器にテフロン（登録商標）回転子とともに入れ、激しく振とうし、均一な分散液Ａを得た。次に、分散液Ａに０．１５グラムのペルオキシダーゼ粉末（和光純薬工業株式会社製）を加え、激しく振とうし、均一な分散液Ｂを得た。次に、分散液Ｂに０．１５グラムのグルコースオキシダーゼ粉末（東京化成工業株式会社製）を加え、激しく振とうし、均一な分散液Ｃを得た。次に、ルミノール（東京化成工業株式会社製）０．０１グラムを溶解させた水酸化ナトリウム水溶液１０ｃｍ3 溶液を分散液Ｃに加え、激しく振とうし、均一な分散液Ｄを得た。この分散液Ｄを、底面が平坦であり、底面の形状が正方形であり、その一辺の長さが約１０ｃｍのポリプロピレン製トレイに注ぎ、分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、トレイの水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で５０℃の温度条件下で５時間乾燥して、厚さ約４０マイクロメートルの均一な褐色粘土薄膜を得た。
本実施例では、ペルオキシダーゼの添加効果を調べるために、ペルオキシダーゼを加え、粘土薄膜を作製した。粘土として、０．７０グラムの天然モンモリロナイト（クニピアＰ、クニミネ工業株式会社製）を６０ｃｍ3 の蒸留水に加え、プラスチック製密封容器にテフロン（登録商標）回転子とともに入れ、激しく振とうし、均一な分散液を得た。この分散液に、０．３０グラムのペルオキシダーゼ粉末（和光純薬工業株式会社製）を加え、この分散液を、底面が平坦であり、底面の形状が円形であり、その直径の長さが約１５ｃｍの真鍮製トレイに注ぎ、分散液を水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、トレイの水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で５０℃の温度条件下で５時間乾燥して、円形の厚さ約３０マイクロメートルの半透明粘土薄膜を得た。生成した粘土薄膜は、２００℃に保ったオーブン中で乾燥することにより、トレイから容易に剥がすことができた。
以上詳述したように、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素触媒性能を有する粘土配向膜及びその製造方法等に係るものであり、本発明により、自立膜として用いることが可能であり、優れたフレキシビリティーを有し、ピンホールの存在しない緻密な材料であり、優れたバリアー性を有し、２５０℃を超える高温条件下で使用し得る、化学的に安定な、粘土配向膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布した新規複合粘土薄膜及びその製造技術を提供することができる。本発明は、粘土の粒子配向を揃えることにより、粘土のバリアー性、耐熱性に優れた膜を提供することを可能とする。また、本発明の粘土薄膜は、自立膜として使用可能であり、耐熱性及びフレキシビリティーに優れることから、例えば、化学産業分野の生産ラインの配管連結部などのパッキンに使用可能である。また、本発明は、上記粘土薄膜を、廃液を出さない簡便な工程で製造する方法を提供する。
本発明の複合粘土薄膜は、該薄膜中のペルオキシダーゼの熱安定性も上記複合化で著しく改善されており、耐熱型の酵素触媒、過酸化水素定量用試薬等としての利用も見込める。
本発明では、酵素を膜化するとともに、任意の大きさに揃えて切り取り保存することにより、必要なときに必要な量の試薬を利用することが可能となる。したがって、本発明の複合粘土膜は、簡便で環境にやさしい分析プロセスに利用できる。
本発明の複合粘土薄膜は、該薄膜中のペルオキシダーゼの熱安定性も上記複合化で著しく改善されており、耐熱型の酵素触媒、過酸化水素定量用試薬等としての利用も見込める。
本発明では、酵素を膜化するとともに、任意の大きさに揃えて切り取り保存することにより、必要なときに必要な量の試薬を利用することが可能となる。したがって、本発明の複合粘土膜は、簡便で環境にやさしい分析プロセスに利用できる。
Claims (15)
- 自立膜として利用可能な機械的強度と耐熱性及びフレキシビリティーを有し、粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布した複合粘土膜を調製する方法であって、（１）ペルオキシダーゼ及び粘土を水あるいは水を主成分とする分散媒である液体に分散し、均一な粘土分散液を調製する、（２）この分散液を静置し、粘土粒子を沈積させるとともに、分散媒である液体を固液分離手段で分離して、膜状に形成して乾燥し、複合粘土膜を作製する、（３）これにより、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼを均一に分布させた、耐熱性のペルオキシダーゼ酵素触媒性を有する複合粘土膜を自立膜として得る、（４）薄膜調製時にグルコースオキシダーゼを添加する、ことを特徴とする複合粘土膜の調製方法。
- 粘土として、天然あるいは合成スメクタイト、又はそれらの混合物を用いる、請求項１記載の方法。
- 粘土分散液の濃度が、０．５〜１０重量パーセントである、請求項１記載の方法。
- 粘土粒子を沈積させるとともに、分散媒である液体を、遠心分離、ろ過、真空乾燥、凍結真空乾燥、又は加熱蒸発法による固液分離手段で分離して、膜状に形成し、複合粘土薄膜を作製する、請求項１記載の方法。
- 上記分散液を平坦な支持体に注いで水平に静置し、粘土粒子をゆっくりと沈積させるとともに、水平を保った状態で、強制送風式オーブン中で、３０〜７０℃の温度条件下で、分散媒である液体をゆっくり蒸発させて、膜状に形成し、複合粘土膜を作製する、請求項１記載の方法。
- 該薄膜中のペルオキシダーゼの、全固体に対する重量割合が１パーセントから３０パーセントである、請求項１記載の方法。
- 該薄膜調製時にルミノールを添加し、ルミノールの全固体に対する重量割合が０．１パーセントから５パーセントである、請求項１記載の方法。
- 該薄膜中のグルコースオキシダーゼの、全固体に対する重量割合が１パーセントから１５パーセントである、請求項１記載の方法。
- 請求項１から８のいずれかに記載の方法で調製された、自立膜として利用可能な機械的強度を有し、粘土粒子の積層を高度に配向させた粘土薄膜の粒子間隙にペルオキシダーゼが均一に分布したことを特徴とする複合粘土膜。
- 任意の形状を有し、自立膜として用いることが可能である、請求項９記載の複合粘土膜。
- 厚さは１ｍｍよりも薄く、面積は１ｃｍ2 よりも大きい、請求項９記載の複合粘土膜。
- 粘土膜の主要構成成分が、雲母、バーミキュライト、モンモリロナイト、鉄モンモリロナイト、バイデライト、サポナイト、ヘクトライト、スチーブンサイト、又はノントロナイトである、請求項９記載の複合粘土膜。
- 請求項９から１２のいずれかに記載の複合粘土膜を構成要素として含むことを特徴とする耐熱性・高バリアー性部材。
- 請求項９から１２のいずれかに記載の複合粘土膜を構成要素として含むことを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼ酵素触媒。
- 請求項７に記載の方法で作製されたルミノールとペルオキシダーゼが共存する複合粘土膜からなる試薬であって、過酸化水素水溶液と接するとルミノール反応による化学発光する作用を有することを特徴とする過酸化水素定量用試薬。
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