JP4366495B2

JP4366495B2 - Microscope preparation and manufacturing method thereof

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Publication number: JP4366495B2
Application number: JP2003021192A
Authority: JP
Inventors: 茂松永; 幸子町田; 健徳安
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2023-01-29
Also published as: JP2004229548A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概して、顕微鏡プレパラートおよびその作製方法に関する。詳細には、高解像度の油浸式対物レンズでの観察に必須なカバーガラスを光学的透明基板にシーリング材で接着することにより、試料を封入した光学顕微鏡用プレパラートを作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡を用いた試料の観察、特に細胞・微生物・動植物の組織など水を多く含むか又は水の中に浸っている生物試料の観察に際しては、水の蒸発を防ぎ、かつ対物レンズの球面収差に試料を適合させるため、厚さ０．１７ｍｍの標準カバーガラス等で試料を覆うことが一般的に行われている。特に、高倍率・高解像度の対物レンズでは、レンズの開口数をかせぐため、試料とレンズとの間をガラスと同じ屈折率（ｎ≒１．５２）を持つ油で満たす必要があるので、試料と油との接触を防ぎ、かつレンズに適合した作動距離を確保するためには、厚さ０．１７ｍｍ程度のカバーガラスで試料を覆うことは、必須である（非特許文献１）。
【０００３】
試料の封入に際しては、光透過性（スライドガラス、アクリル板など）の下部材の上に水を含む試料を乗せ、さらにこの上をカバーガラスで被い試料をサンドイッチする。なお、このような封入試料を以下プレパラートと呼ぶ。固定・脱水処理の施された試料のように、樹脂中に包埋できる試料では、試料はカナダバルサム等の特殊接着剤でプレパラート内に封入できるので、長い時間をかけて接着剤が硬化されればカバーガラスはしっかりと固定される。
【０００４】
しかし生きている細胞や微生物を観察する場合など、樹脂で包埋できない試料では、従来カバーガラスはただ単に試料の上に置かれ水の表面張力で張り付かせるか、被せたカバーガラスの周囲にマニキュアやパラフィンなどを塗って封じる、若しくは、試料をワセリンで覆い、その上にカバーガラスを被せることで、試料を圧しつぶさずにカバーガラスを固定する、などの方法で接着が行われてきた（非特許文献２）。
【０００５】
さらに、生きた細胞の継続観察や、培地交換などが必要な場合には、下部材上にビニールテープなどを貼り、剃刀などでカバーガラスより小さな観察窓を開け厚さ０．１ｍｍ程度の台を確保すると同時に、液交換のために窓の両端などに切り込みをいれたものを準備する。観察窓を溶液で満たし、その上にカバーガラスを被せ、周辺をマニュキアなどで固定する。液交換を行う場合は、切り込みの一方に濾紙片を置き、他方に交換する液をピペットなどで落とす方法などが取られてきた（非特許文献３）。
【０００６】
また、生きた細胞を長時間に渡り観察する必要がある場合には、培地の流動が可能な特殊培養チャンバー（Ｌｕｃａｓ−Ｈｉｇｈｌａｎｄ１社製のＤｖｏｒａｋＣｈａｍｂｅｒ）、あるいは自作のチャンバーなどを顕微鏡ステージ上に装着し、培地を逐次供給する方法が取られてきた。
【０００７】
さらに、生きた細胞の観察においては温度管理も重要な要素であるが、顕微鏡全体を大掛かりで極めて高価な装置を装着する、あるいは、温度制御が可能な顕微鏡ステージを組み込むなどの方法が取られて来たが、いずれも場合も実際に試料を乗せるチャンバーは、自作するなどの必要性があった。
【０００８】
しかしながら、これらの方法では下部材とカバーガラスとの接着力が弱いので、以下の問題がしばしば発生し、これが高解像度の油浸式対物レンズを用いることの妨げとなっている。
【０００９】
対物レンズとカバーガラスの間を満たすオイル（粘性が高い）によりカバーガラスが対物レンズに付着し、プレパラートから剥離してしまう。特にこの問題は視野を移動する際に起こりやすい。
【００１０】
生物試料の観察時には、観察対象は培地などの液体中に密封する場合が多い。しかし、従来の方法ではカバーガラスの密着性が低いため、数分程度で徐々に液体が蒸発し、その結果プレパラート中に気泡が入り込む。このことは単一試料を長時間観察する場合に大きな障害となる。
【００１１】
動物の組織や培養細胞の観察では対物レンズがステージの下から上向きに出ている倒立型の顕微鏡が頻繁に用いられる。この倒立顕微鏡で油浸式のレンズを用いる場合にも、カバーガラスはレンズ側に来るようにセットすることが必要である（対物レンズの作動距離などの制約による）。すなわち、カバーガラスはプレパラートの下側に接着しなくてはならない。この場合、接着が弱いと培地などの液体がプレパラートから漏れ出し、対物レンズへと流れ落ちることもしばしばで、これがレンズや鏡筒内に入って顕微鏡の故障の原因となる。
【００１２】
培地交換などが必要な観察に利用されるビニールテープで細工をしたチャンバーを倒立型顕微鏡へ適用した場合、培地交換時にチャンバーを一度顕微鏡ステージから外す必要があり、細胞の継続的な観察は不可能である。さらに、上述の液漏れの問題が生じ易い。
【００１３】
培地流動が可能なチャンバーを使用する場合には、Ｌｕｃａｓ−Ｈｉｇｈｌａｎｄ社製のＤｖｏｒａｋＣｈａｍｂｅｒが、倒立型顕微鏡へも装着可能な装置であるが、特殊な形状のカバーガラスが必要など、汎用性に欠ける装置である。また、温度制御の厳密さにも欠け、しばしば細胞機能に重大な影響を与えていた。
【００１４】
従来の方法において、カバーガラスを接着する際の一般的な手順は、以下：
（ａ）スライドガラスに液体を少量乗せる；
（ｂ）気泡が入り込まないように丁寧にカバーガラスを被せる；
（ｃ）カバーガラスの周囲に漏れた液体をろ紙などで吸い取る；
（ｄ）マニュキアを辺縁部に塗って硬化するまで待つ、
の順番で行われてきた（非特許文献２、非特許文献３）。しかし、これら一連の作業には数分の時間を要し、その間観察が行えない。
【００１５】
生体試料の中には、試料の封入を開始してからの数秒、数分の時間帯が極めて重要な観察対象となる場合もしばしばである。例えば、受精直後の卵細胞の形態の変化を観察しようとすれば、主要な反応は卵細胞に精子を添加してから数分のうちに完了してしまう。また通常保温庫内で３７度に保たれている動物組織由来の培養細胞の中には、封入作業のためほんの数分間室温にさらすことで、収縮などの形態変化を経て細胞死に至るケースが知られている。このように”プレパラートへの封入に時間を要する”ということが、カバーガラスを必須とする高解像度での顕微鏡観察に対する大きな妨げの要因となっているのである。
【００１６】
【非特許文献１】
八鹿（１９７３）、生物顕微鏡の基礎：２６−３０
【００１７】
【非特許文献２】
井上（１９９８）、新版顕微鏡観察シリーズ▲１▼ 顕微鏡観察の基本：１２４−１２７
【００１８】
【非特許文献３】
井上（１９９８）、新版顕微鏡観察シリーズ▲３▼ 動物の顕微鏡観察：１８−２３
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題を解決するため、素早く、しかも強固に、カバーガラスを下部材に接着する方法を提供し、さらに、高解像度の油浸式対物レンズによる生きた細胞などの試料の長時間連続観察、および刺激に対する瞬時から長時間に渡る反応の観察が可能な、流体（培地など）の流動式チャンバー付き顕微鏡プレパラートを提供することである。
【００２０】
本発明者らは、シーリング材が主鎖あるいは側鎖の構造の違いにより、多くの用途に使用されていることに着目し、このシーリング材が生物試料の観察にも適用可能であること、さらに、シリコーンとウレタン樹脂溶液を組み合わせることにより、迅速かつ強固なカバーガラスの下部材への接着を可能にすることを見出した。
【００２１】
また、素早く、強固にカバーガラスを接着することにより試料の長時間連続観察を可能とする培地の流動、および試料の刺激に対する応答を観察するための物質添加が可能となるような様式の顕微鏡プレパラートを完成させ、本発明に到った。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は以下を提供する。
【００２３】
（１）光学顕微鏡用プレパラートを作製する方法であって、この方法は以下：カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部と、試料保持領域を備えた下部材との間を、少なくとも一種のシーリング材で接着する工程、
を包含する、方法。
【００２４】
（２）上記接着する工程が、以下：
上記下部材の片面にプライマーをコートすること；および
下部材のコートされた片面に、上記カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部をシーリング材で接着し、密封すること、
を包含する、項（１）に記載の方法。
【００２５】
（３）上記下部材が、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有し試料保持領域を取り囲む包囲部を貼り付けた透明基板、または透明基板を備える流動式チャンバーである、項（２）に記載の方法。
【００２６】
（４）上記包囲部が、疎水性ポリマー材料である、項（３）に記載の方法。
【００２７】
（５）上記包囲部が、テープ材である、項（３）に記載の方法。
【００２８】
（６）上記シーリング材が、シリコーン系ポリマー、変性シリコーン系ポリマー、ポリスルフィド、アクリル系ポリマー、ポリウレタン、ブチル系ポリマー、クロロスルホン化ポリエチレンおよびスチレントリブロック共重合体からなる群から選択される少なくとも１種のポリマーの混合物を含む有機溶液である、項（１）に記載の方法。
【００２９】
（７）上記シーリング材が、少なくとも１種のシリコーン系ポリマーの混合物およびポリウレタンを含む有機溶液である、項（１）に記載の方法。
【００３０】
（８）上記シーリング材が、少なくとも１種のシリコーン系ポリマーの混合物を含むアルコール溶液である、項（２）に記載の方法。
【００３１】
（９）上記プライマーが、ポリウレタンを含む有機溶液である、項（２）に記載の方法。
【００３２】
（１０）上記ポリウレタンを含む有機溶液の溶媒が、酢酸エチルである、項（９）に記載の方法。
【００３３】
（１１）上記シーリング材が少なくとも１種のシリコーン系ポリマーの混合物を含むアルコール溶液であり、かつ上記プライマーがポリウレタンを含む酢酸エチル溶液である、項（２）に記載の方法。
【００３４】
（１２）上記流動式チャンバーが、上記透明基板上に配置された、流体プールを有するリザーバ、およびノズルを備え、
透明基板が、リザーバに連通する第１の孔およびノズルに連通する第２の孔を有する、項（３）に記載の方法。
【００３５】
（１３）上記透明基板が、ガラス基板またはアクリル基板である、項（３）に記載の方法。
【００３６】
（１４）上記試料が、生細胞、固定化細胞、微生物、または動植物の組織である、項（１）に記載の方法。
【００３７】
（１５）光学顕微鏡用プレパラートであって、以下：
透明基板；
透明基板の上面に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；
試料保持領域内に保持された試料；および
包囲部の上面にシーリング材により接着されたカバーガラス、
を備える、プレパラート。
【００３８】
（１６）光学顕微鏡用プレパラートを作製するためのキットであって、
透明基板；
透明基板の上面に貼付けるための、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；および
包囲部の上面にカバーガラスを接着するためのシーリング材、
を備える、キット。
【００３９】
（１７）観察される試料をさらに備える、項（１６）に記載のキット。
【００４０】
（１８）上記包囲部がテープ材である、項（１６）に記載のキット。
【００４１】
（１９）上記シーリング材が、シリコーン系ポリマー、変性シリコーン系ポリマー、ポリスルフィド、アクリル系ポリマー、ポリウレタン、ブチル系ポリマー、クロロスルホン化ポリエチレンおよびスチレントリブロック共重合体からなる群から選択される少なくとも１種のポリマーの混合物を含む有機溶液である、項（１６）に記載のキット。
【００４２】
（２０）光学顕微鏡用プレパラートであって、以下：
流体の流動式チャンバーであって、以下：
第１の孔および第２の孔を備える透明基板；
透明基板の上面に配置された、リザーバ；および
透明基板の上面に配置された、ノズル、
を備え、第１の孔がリザーバと連通し、第２の孔がノズルと連通する、チャンバー；
透明基板の下面に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；ならびに
包囲部の下面にシーリング材により接着されたカバーガラス、
を備える、プレパラート。
【００４３】
（２１）上記リザーバが、温度可変装置に装着可能である、項（２０）に記載のプレパラート。
【００４４】
（２２）光学顕微鏡用プレパラートを作製するためのキットであって、以下：
第１の孔および第２の孔を備える透明基板；
第１の孔と連通されるリザーバ；
第２の孔と連通されるノズル；
透明基板に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；ならびに
包囲部にカバーガラスを接着するためのシーリング材、
を備える、キット。
【００４５】
（２３）観察される試料をさらに備える、項（２２）に記載のキット。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられることが理解されるべきである。
【００４７】
本発明によれば、例えば生きた細胞などの試料を観察するための光学顕微鏡用プレパラートの作製方法が提供される。本発明の作製方法は、カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部と下部材との間を、少なくとも一種のシーリング材で接着する工程、を包含する。
【００４８】
本明細書において、「試料」とは、観察される対象になり得るものであれば何でもよく、例えば、培養細胞、固定化細胞、微生物、または動植物の組織が挙げられ、これら組織の水溶液、水性懸濁液、水分散体、水中油エマルジョン、水和したゲル状物なども試料に含まれる。
【００４９】
本明細書において、「プレパラート」とは、光透過性の下部材（ガラス基板、アクリル基板など）とこれを被うカバーガラスから構成される構造体であり、下部材とカバーガラスとの間の空間に試料が密封可能な構造体をいう。ここで、下部材とカバーガラスとの間の空間には、試料が入っていても入っていなくてもよい。
【００５０】
本明細書において、「カバーガラス」とは、屈折率が１．５２程度で厚さ０．１７ｍｍ±０．０２ｍｍの市販のカバーガラスをいい、通常使用される大きさは１８×１８ｍｍ、１８×２４ｍｍ、２４×２４ｍｍ、２４×４０ｍｍであり、光学的視野に影響がない限り、本質的に任意の大きさおよび形状（円形でもよい）のものが使用され得る。本明細書中において、「カバーガラスの辺縁部」とは、カバーガラスの四辺５ｍｍ程度の幅の領域をいう。
【００５１】
本明細書において、「下部材」とは、顕微鏡観察が可能な程度に光学的に透明な「透明基板」または「透明基板」を備える流動式チャンバーをいう。下部材は、一般にカバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を備えている。下部材として、例えば、顕微鏡用スライドガラスなどのガラス基板またはアクリル基板が挙げられる。ここで、「光学的に透明な」とは、自然光または人工光の中の少なくとも光学顕微鏡に用いる範囲の電磁波に対し透過性であることを意味する。
【００５２】
本明細書において、「シーリング材」とは、曝露環境からの保護を目的として使用され、気体、液体、固体粒子の透過を防ぐ全ての建築、修理用シーリング材（不定形シーリング材）、およびコーキング材を含む処方物をいう。一般に、シーリング材は、建築外装の封止用に用いられる高性能シール材（２５％＋接合部の変位に対し、良好な回復約８０％を示す）、建築内装、一般住宅建築および補修に用いられる中性能シール材（１０〜２５％の変位に適応）および低性能シール材に大別されるが、本発明においては、いずれの性能のシール材を適用しても、接着または試料の密封に十分である。
【００５３】
本明細書におけるシーリング材として、例えば、シリコーン系ポリマー、変性シリコーン系ポリマー、ポリスルフィド、アクリル系ポリマー、ポリウレタン、ブチル系ポリマー、クロロスルホン化ポリエチレンおよびスチレントリブロック共重合体などが挙げられる。
【００５４】
本発明によれば、カバーガラスには細胞などが直接に接するため、適切なシーリング材として、細胞などへの影響が少ないシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ）を主鎖とする高分子溶液が好ましく、シリコーン系シーリング材がより好ましい。シリコーンアルコール溶液が、特に好ましい。溶媒のアルコールには、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノールなどが挙げられる。
【００５５】
代表的なシリコーン系ポリマーのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（ポリジメチルシロキサンジオール）８０〜８５重量％、架橋剤５〜７重量％、触媒（硬化促進、カルボン酸スズまたはチタン酸エステル）０．０５〜０．１０％、充填剤（シリカ、カーボンブラック、ガラスミクロバルーン）６〜１０重量％、可塑剤（非反応性シリコーンフルイド）０〜１０重量％。シリコーン系ポリマーのシーリング材は、任意の難燃剤、殺菌剤、接着促進剤、顔料および粘調剤を含んでもよい。この処方は、シリコーン系ポリマーのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５６】
代表的なポリスルフィドのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（ＬＰ（チオコール）ブレンド）１５〜６０重量％、充填剤（炭酸カルシウム）３０〜６０重量％、顔料（二酸化チタン）１０重量％未満、接着促進剤（シラン、チタン酸塩）１０重量％未満、酸化防止剤（フェニル−２−ナフチルアミン）１０重量％未満、促進剤（ｐ−キノンジオキシム、ジフェニルグラニジン）１０重量％未満、チキソトロープ剤（Ｃａｂｏｓｉｌ，Ｉｒｃｏｇｅｌ）１０重量％未満、遅延剤（ステアリン酸、ステアリン酸エステル）１０重量％未満、溶媒（トルエン、メチルエチルケトン）１０重量％未満から構成されるベースコンパウンド１００重量部に対し、触媒（二酸化マグネシウム、フタル酸ジブチル）１０重量部。この処方は、ポリスルフィドのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５７】
代表的なポリウレタンのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（ジイソシアネートプレポリマー、ジフェニルメタンジイソシアネート当量＝１２７２）５０〜６０重量％、充填剤（カーボンブラックなど）４０〜５０重量％、シリカ２〜４重量％、溶媒（トルエン）。ポリウレタンのシーリング材は、任意の紫外線吸収剤、酸化防止剤、難燃剤、充填剤および顔料を含んでもよい。この処方は、ポリウレタンのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５８】
代表的なブチル系ポリマーのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（イソブチレン、ポリブテン）４０〜４５重量％、充填剤（クレイ、シリカ、炭酸カルシウム、カーボンブラック）３０〜４０重量％、顔料（二酸化チタン、酸化亜鉛）２〜４重量％、粘着付与剤（ロジン−ペンタエリスリトールエステル）０．５〜１．０重量％、粘調剤（繊維）１０重量％、溶媒（シクロヘキサン）。この処方は、ポリウレタンのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５９】
代表的なアクリル系ポリマーのシーリング材の処方は、以下の通りである：ラテックスアクリルポリマー３０〜４０重量％、充填剤（炭酸カルシウム、アルミニウム、シリカ、タルク）３０〜４５重量％、顔料（二酸化チタン）１．０〜１．５重量％、界面活性剤１．０〜１．５重量％、凝固点降下剤（エチレングリコール）２０〜２５重量％、可塑剤７〜８重量％、チキソトロープ剤１〜２重量％、無機アルコール０．２重量％。アクリル系ポリマーのシーリング材は、任意の酸化防止剤、紫外線吸収剤および防カビ剤を含んでもよい。この処方は、アクリル系ポリマーのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００６０】
代表的なクロロスルホン化ポリエチレンのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（クロロスルホン化ポリエチレン）１５〜２０重量％、塩化パラフィン１５〜２０重量％、充填剤１５〜２０重量％、顔料１０〜１５重量％、酸化物触媒（鉛酸化物）６〜８重量％、可塑剤（フタル酸ジブチル）１５〜２０重量％、溶媒（イソプロピルアルコール）４〜５重量％。この処方は、クロロスルホン化ポリエチレンのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００６１】
本発明の方法によれば、カバーガラスの辺縁部のシーリング材によるコートは、液体の漏れない容器中にシリコーンアルコール溶液を５ｍｍ程度の深さで注ぎ、その壁にカバーガラスを立てかけることにより行われる。１辺のコートに必要な時間は１分程度であるが、コートの効率により時間の延長、短縮が可能である。１辺のコートが終了した後に、カバーガラスを９０度回転させて別の辺を容器に浸す。この操作を繰り返すことで、カバーガラスの４辺に５ｍｍ程度の幅でシリコーンコートがなされる。滅菌されたカバーガラスが必要な場合は、シリコーンコートを施した後に，乾熱滅菌することが可能である。
【００６２】
本発明によれば、好ましくは、下部材の片面にプライマーをコートし、この片面に、カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部をシーリング材で接着して試料を密封する方法がとられる。
【００６３】
本明細書において、下部材に塗布する「プライマー」とは、シーリング材の密着力をさらに高めるための高分子物質をいう。プライマーとしては、ウレタン結合（ＮＨＣＯＯ）を主鎖とする高分子溶液が好ましく、ポリウレタン溶液がより好ましい。このポリウレタン溶液として、ポリウレタンのシーリング材またはウレタン樹脂溶液がさらに好ましく、ウレタン樹脂／酢酸エチル溶液が特に有効に利用し得る。
【００６４】
本明細書において、「流動式チャンバー」とは、細胞などを生きたまま長時間保持するために、流体を逐次交換可能でかつ流動や還流が可能な形状のチャンバー、または流体を適宜添加可能な形状の全てのチャンバーをいう。「流体」とは、顕微鏡観察が可能な程度に光透過性であり、かつ水をベースとする任意の水溶液、水性懸濁液、水分散体、水中油エマルジョン、水和したゲル状物などをいう。例えば、流体には、培地または薬剤の溶液が挙げられる。
【００６５】
カバーガラスを迅速に強固に下部材に接着させるためには、カバーガラスの辺縁を「シーリング材」でコートすること、さらにカバーガラスを密着させる下部材部には「プライマー」が塗布されていることが好ましい。
【００６６】
下部材へのウレタン樹脂の塗布に先立ち、試料を密封する空間を確保するため、「透明基板」または「透明基板を備える流動式チャンバー」に、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有し厚みを有する「包囲部」が貼り付けられる。「包囲部」は、試料保持領域（または、観察窓ともいう）に充填される試料をはじくような疎水性ポリマー材料であることが好ましい。
【００６７】
本明細書における、「透明基板」は、光学的に透明なガラス基板またはアクリル基板などをいい、好ましくは、スライドガラスである。
【００６８】
包囲部を透明基板または透明基板を備える流動式チャンバーに貼り付ける際には、流体と化学反応をおこさない任意のシール材または接着剤が使用され得る。包囲部としてさらに好ましい例として、少なくとも片面に貼付け剤を有するテープ材が挙げられ、最も好ましくは、市販のビニールテープである。
【００６９】
テープ材を用いて試料保持領域（または、観察窓）を形成する例は、以下の通りである。まず、スライドガラスなどの上にビニールテープ（厚さ０．１ｍｍ程度）を貼る。ビニールテープ上にウレタン樹脂／酢酸エチル溶液を塗布した後、２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラスを使用する場合には、ビニールテープの中央部を１８ｍｍ×１８ｍｍの大きさにくり貫き、試料保持領域（または、観察窓）とする。
【００７０】
観察する試料が、カバーガラス上に接着している試料の場合、例えば接着性の培養細胞などの場合には、観察窓に試料に応じた培地などを添加し、細胞が接着しているシリコーンコート処理を施したカバーガラスを、細胞が観察窓の内部にくるように伏せ、ウレタン樹脂が硬化する前にカバーガラスの縁を押し付け、シリコーンとウレタン樹脂を密着させプレパラートを作製する。このシリコーンとウレタン樹脂の組み合わせによる作製方法を、本明細書以下、「シリコーン／ウレタン樹脂法」とする。
【００７１】
観察する試料が、浮遊性の場合には、試料懸濁液を観察窓に満たし、シリコーン処理を施したカバーガラスをウレタン樹脂が硬化する前に下部材に伏せ、カバーガラスの縁を押し付け、シリコーンとウレタン樹脂を密着させプレパラートを作製する。
【００７２】
観察する試料が、組織などの場合、観察窓に試料を設置すると共に適当な溶液で満たし、シリコーン処理を施したカバーガラスをウレタン樹脂が硬化する前に下部材に伏せ、カバーガラスの縁を押し付け、シリコーンとウレタン樹脂を密着させプレパラートを作製する。
【００７３】
シリコーンは疎水性と柔軟性を有するので、カバーガラスを押し付けると接着部位では液体がはじき出されると共に吸盤作用が生じて密着性が高まるものと考えられる。さらに、縁をシリコーンコートしたカバーガラスを硬化前のウレタン樹脂表面に押し付けると、接着面ではウレタン樹脂のシリコーンへの高い親和性とシリコーンの持つ疎水性とが同時に発揮され、水を押し出しながら両者が強く結合してゆくものと考えられる。
【００７４】
生きた細胞の長時間観察のためには、細胞の温度管理と細胞の代謝に伴う培地成分の変動を防ぐため、培地を逐次新鮮なものに交換する必要がある。また、生細胞の高解像度観察は、細胞の刺激に対する反応を観察する目的で行われる場合が多い。そのためには、試料を顕微鏡上から移動することなく顕微鏡上の細胞を封入した空間内に、必要に応じた量の薬剤などが添加されることが求められる。
【００７５】
培地交換、薬剤添加など、いずれの目的においても顕微鏡ステージ上における培地などの流動が可能なチャンバーが必要であるが、チャンバーを利用したプレパラートにもカバーガラスを密着する工程が含まれることから、迅速で強固な密着を可能とし、かつ、目的の培地の流動などが簡便に行われる必要がある。
【００７６】
実際に、培地などの交換、還流、添加が可能であるチャンバーを利用した高解像度観察に、本発明によるカバーガラスを下部材に密着させる方法を利用しようとする場合、従来の培地などの交換、還流、添加が可能であるチャンバーでは機能を発揮し得ない。
【００７７】
本発明によれば、シリコーン／ウレタン樹脂法の発明により、本発明と組み合せることにより効力を発する新様式の流体（培地など）の交換、還流、添加、さらに温度制御が可能である、流動式チャンバーを提供することができる。
【００７８】
以下、流動式チャンバーの構成の一例を示すが、これは単なる例示に過ぎない。例えば、流動式チャンバーは、温度制御が可能な倒立顕微鏡ステージ上にセットして用いる流体の流動式タイプとして組み立てられる。そのため、ステージと直接接触する部分には比較的熱伝導の良いガラス基板（スライドガラスなど）を用い、その上にアクリル樹脂で囲われた流体プール、並びに流体吸引ノズルを組み立てた（図３）。流体を供給および保持するための「リザーバ」は、顕微鏡光路への干渉と流体への熱伝導性とを考慮して、丈が低くかつ広い形状が好ましい。流体（例えば、新鮮な培地など）は、チャンバーの上面に溜め置かれるが、観察対象である試料はチャンバーの下面（対物レンズ側）にセットされるので、ガラス基板には、厚み方向に貫通する少なくとも２つの孔が設けられる。例えば、ガラス基板には、第１の孔および第２の孔が設けられ、それぞれ流体の流入および吸出しの役割を担う。第１の孔はリザーバと連通し、第２の孔はチャンバーと連通している。流入穴および吸出し穴の直径は、流体の種類、粘度および流体中に存在する微粒子の直径に応じて、適宜選択され得る。例えば、組織を含む培地の場合には、直径１．５ｍｍ程度が好ましい。
【００７９】
流体吸出しノズル（図３参照）より延びるチューブの遠位端にポンプを取り付けて流体をゆっくりと吸引すると、観察窓には、一定の温度に保たれた流体（例えば、新鮮で培養温度に保温された培地）がプールから供給される。またプールの流体流入口近くに、マイクロピペットで任意の薬剤を添加すれば、流体の流れに乗って薬剤はすぐさま細胞に投与されることになる。
【００８０】
このような仕組みにより、組織を含む培地の観察の場合、流動式チャンバーでは、高解像度の対物レンズがセットされた顕微鏡ステージ上において、培養温度を維持しながら培地の鮮度を保つことができる。また細胞への薬物等の投与・洗浄も顕微鏡上で自在に行うことができる。
【００８１】
本発明のチャンバーに、シリコーン／ウレタン樹脂法により迅速、かつ強固にカバーガラスを密着させることにより、生きた細胞の高解像度継続観察が可能になる。また、細胞の刺激に対する瞬時から長期に及ぶ反応を高解像度で観察することも可能となる。
【００８２】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳しく解説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１：接着強度試験）
本実施例では、シリコーン処理を施したカバーガラスと、ウレタン樹脂処理を施した下部材であるスライドガラスの接着強度を検討した。本実施例に使用したカバーガラスおよびスライドガラスは、従来の方法（井上（１９９８）、新版顕微鏡観察シリーズ▲１▼ 顕微鏡観察の基本：１２４−１２７［非特許文献２］）を用いて洗浄、保存したものである。
【００８４】
１．１．カバーガラスのシリコーン処理
液体の漏れない容器中に５ｍｍ程度の深さでシリコーン−アルコール溶液を注ぎ、その壁に２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラスを立てかけた。この状態で１分間放置した後、カバーガラスを９０度回転させて別の辺を溶液に浸しさらに１分放置した。この操作を繰り返すことで、カバーガラスの４辺に５ｍｍ程度の幅でシリコーンコートを施した（図１ａ）。
【００８５】
１．２．スライドガラスのウレタン樹脂処理
薄い層の蒸留水をプレパラート内に密閉するため、スライドガラスの上にビニールテープ（厚さ０．１ｍｍ）を貼り、ビニールテープ上にウレタン樹脂溶液（コニシ株式会社製、シールプライマー）を塗布した。さらにテープの中央部を１８ｍｍ角の大きさでくり貫いて容器を作製した（図１ｂ）。
【００８６】
１．３．カバーガラスのスライドガラスへの密着
テープをくり抜いた穴に十分な量（１００ｕｌ）の赤い色素で着色した蒸留水を満たし、上からカバーガラスを被せた（図２参照）。カバーガラスの接着にあたっては、何も処理を施さない対照区と、縁にシリコーンコートのみを施した場合、およびシリコーンとウレタン樹脂処理とを施した場合を用意し、その接着の強度を比較した。
【００８７】
１．４．接着強度の評価
接着強度の評価は、カバーガラス表面の中央付近に瞬間接着剤で糸を取り付け、その端に所定の重さの分銅を括り付けたうえ、プレパラートを垂直に立てて接着部に加重することで行った（図２）。
【００８８】
コート無しの場合（図２ａ）、１０ｇ重の力で１分以内にカバーガラスにズレが生じ液体が漏れ、さらに５分後には完全に脱落した。
【００８９】
シリコーンコートを施した場合（図２ｂ）は、１０ｇ重の力に対して１分では不動であったが、５分後には結局脱落した。
【００９０】
シリコーン／ウレタン樹脂処理を施した場合（図２ｃ）には、２０ｇ重の力を３０分間かけてもカバーガラスは全くずれず、さらに封入した液体の漏れや蒸発も無かった。接着の速さに関しても、シリコーン／ウレタン樹脂処理の場合は両者が接触した瞬間に密着した。
【００９１】
以上のことから、カバーガラスのシリコーンコートでは、ある程度の密着性の向上が見られるが、これだけでは油浸式対物レンズを使用する際の問題を全て解決することにはならず、これにウレタン樹脂の方法を追加することで、迅速で強固な密封が可能であることが明らかとなった。
【００９２】
（実施例２：生きた動物培養細胞の油浸式対物レンズによる高解像度撮影）
本実施例では動物の細胞レベルでの研究に一般的に用いられているチャイニーズハムスターの卵巣由来の培養細胞（ＣＨＯ−Ｋ１，ＲｉｋｅｎＣｅｌｌＢａｎｋ）を用いて、顕微鏡上で細胞の生理条件を維持したまま、油浸式対物レンズを用いて生細胞の高解像度顕微鏡撮影を行った。
【００９３】
２．１．チャンバー作製
細胞を顕微鏡上の小さな密閉容器内で生きたまま長時間保持するためには、温度を３７度程度に保つことが必要である他に、酸性老廃物の細胞外排出による培地の酸性化などを防ぐため、培地を逐次新鮮なものに交換する必要がある。
【００９４】
そこで本実施例では、図３に示すような流動式チャンバーを作製した。チャンバーは、スライドガラスを基板としている。チャンバーには下面の中央に２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラスを接着する観察窓が設けられており（図３ｂ）、ここに観察対象となる生物を入れ、カバーガラスを密着させることにより観察が可能となる。
【００９５】
付着性の培養細胞などの場合には、辺縁部にシリコーン処理を施したカバーガラス上に培養し、この観察窓にカバーガラスを密着させることにより、生きた状態での継続的な高解像度顕微鏡観察が可能となる。培地などの添加を可能とするためアクリル材で細工したプール、吸引ノズルなどが装着されている。実際の培地の流動や、薬剤の添加は、吸引ノズルを（低速で安定した速度での吸引が可能な）吸引ポンプへ接続することにより行われる。アクリル材で囲まれたプール上に目的の溶液を添加し、吸引の開始、並びに吸引速度の制御は全て吸引ポンプによって行われる。
【００９６】
２．２．観察窓の作製
上記チャンバー下面にビニールテープを貼り、さらにウレタン樹脂を塗布した後、カバーガラスを接着した際に実際に観察する部分に相当する範囲のビニールテープを切り取り、観察窓を作製した。別にシリコーン処理を施した２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラス上にＣＨＯ細胞を培養し、観察試料を準備した。
【００９７】
２．３．カバーガラスのチャンバーへの装着
観察窓に培地を満たした後、シリコーン処理を施したカバーガラス上に培養したＣＨＯ細胞が接着しているカバーガラスを細胞が培地に接するようにカバーガラスを観察窓に伏せ、辺縁部を下部材に押し付けることによりカバーガラスの装着が完了する。カバーガラスを装着することにより、培地の流動も可能となる。
【００９８】
２．４．接着強度の比較
チャンバー内部には培地流動による水圧が負荷されるため（図３ｃ）、カバーバラスを固定する際には強固な接着力が求められる。そこでプレパラート作製時のカバーガラスの固定方法として、周囲をマニュキアで塗り固める従来の方法（ａ）と、本発明のシリコーン／ウレタン樹脂による接着法（ｂ）を試みた。それぞれの方法で作製したプレパラートについて、実際に油浸式対物レンズを用いての細胞の観察を行い、両者の実用上の差異を比較検討した。
【００９９】
その結果、シリコーン／ウレタン樹脂法では、２時間の連続観察を行っても培地が漏れ出すことはなかった。
【０１００】
２．５．細胞観察
従来のカバーガラスの周囲をマニュキアで塗り固める方法（ａ）では、マニュキアが乾くのに要する時間などで、プレパラートの作製に５―６分程度の時間を要した（図４ａ）。その間、試料は室温に晒されるため、観察された細胞には著しい収縮が見られた。すなわち、従来の方法では、細胞の輪郭は丸まって楕円状になり、また細胞の周辺部には収縮により形成される小胞（白い矢頭で示した）がブドウの房状に多数観察された。また観察を続けると概ね２０〜３０分でチェンバー内の培地がカバーガラスの接着部から漏れ出す現象が見られ、この方法では長時間の連続観察には耐えなかった。
【０１０１】
一方、本発明のシリコーン／ウレタン樹脂による接着法（ｂ）では、プレパラートを２分以内に作製することができた。室温に晒される時間が短いため、細胞は収縮せずに紡錘形を保つか、さらに薄く伸展して三角形を呈した（図４ｂ）。これは細胞が極めて健康な状態を保っていることを示している。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明によれば、光学顕微鏡観察用プレパラートのカバーガラスの下部材への密着性の不十分さに起因する全ての問題が、簡便かつ迅速に解決され、光学顕微鏡による高解像度の長時間観察が可能となる。さらに、本発明の流動式チャンバーを使用することにより、例えば、培養細胞、固定化細胞、微生物、または動植物の組織などの生きた試料の刺激などに対する瞬時から長期に及ぶ反応の継続的な観察が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（ａ）本発明のカバーガラスの四辺に対するシリコーンコーティング、および（ｂ）本発明の光学顕微鏡用プレパラートを示す図である。
【図２】図２は、（ａ）全く処理を施していないカバーガラス、（ｂ）シリコーンコーティングしたカバーガラス、（ｃ）シリコーンコート＋ウレタン樹脂で処理したカバーガラスの接着強度を評価した比較実験結果を示す図である。
【図３】図３は、（ａ）流動式チャンバーの斜視図、（ｂ）流動式チャンバーの上面図、および（ｃ）流動式チャンバーの側面図を示す図である。
【図４】図４は、（ａ）従来のマニュキア法により作製したプレパラート、（ｂ）本発明の方法（シリコーン／ウレタン樹脂法）により作製したプレパラート、について撮影したチャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞の写真の比較を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention generally relates to microscope preparations and methods for making them. Specifically, the present invention relates to a method for producing a preparation for an optical microscope in which a sample is sealed by adhering a cover glass essential for observation with a high-resolution oil immersion objective lens to an optically transparent substrate with a sealing material.
[0002]
[Prior art]
When observing a sample using an optical microscope, especially when observing a biological sample that contains a lot of water such as cells, microorganisms, and animal and plant tissues, or is immersed in water, the evaporation of water is prevented and the spherical aberration of the objective lens In order to adapt the sample to the above, it is generally performed to cover the sample with a standard cover glass having a thickness of 0.17 mm. In particular, in a high-magnification / high-resolution objective lens, it is necessary to fill the space between the sample and the lens with oil having the same refractive index (n≈1.52) as that of the glass in order to increase the numerical aperture of the lens. It is indispensable to cover the sample with a cover glass having a thickness of about 0.17 mm in order to prevent contact between the oil and oil and to secure a working distance suitable for the lens (Non-patent Document 1).
[0003]
When the sample is sealed, a sample containing water is placed on a light-transmitting (slide glass, acrylic plate, etc.) lower member, and the sample is further covered with a cover glass to sandwich the sample. Such an encapsulated sample is hereinafter referred to as a preparation. For samples that can be embedded in resin, such as fixed and dehydrated samples, the sample can be enclosed in a preparation with a special adhesive such as Canadian Balsam, so that the adhesive is cured over a long period of time. The cover glass is firmly fixed.
[0004]
However, for samples that cannot be embedded with resin, such as when observing living cells and microorganisms, the conventional cover glass is simply placed on the sample and attached with the surface tension of water, or around the covered cover glass. Adhesion has been performed by applying nail polish or paraffin, or by covering the sample with petrolatum and covering it with a cover glass to fix the cover glass without crushing the sample ( Non-patent document 2).
[0005]
In addition, if continuous observation of live cells or medium replacement is necessary, a vinyl tape or the like is pasted on the lower member, and an observation window smaller than the cover glass is opened with a razor, etc. At the same time, prepare a cut in the window at both ends for liquid replacement. Fill the observation window with the solution, cover it with a cover glass, and fix the periphery with a manucia. In the case of performing liquid exchange, a method of placing a filter paper piece on one of the cuts and dropping the liquid to be exchanged on the other with a pipette or the like has been taken (Non-Patent Document 3).
[0006]
When it is necessary to observe live cells for a long time, a special culture chamber (Lucas-Highland 1 Dvorak Chamber) capable of flowing the culture medium or a self-made chamber is mounted on the microscope stage. However, a method of sequentially supplying the medium has been taken.
[0007]
In addition, temperature management is an important factor in observing living cells, but there are methods such as attaching a very expensive and very expensive device to the entire microscope, or incorporating a microscope stage that can control the temperature. However, in both cases, it was necessary to make a chamber to actually put the sample.
[0008]
However, in these methods, since the adhesive force between the lower member and the cover glass is weak, the following problems often occur, which hinders the use of a high-resolution oil immersion objective lens.
[0009]
The cover glass adheres to the objective lens due to oil filling the gap between the objective lens and the cover glass (high viscosity) and peels off from the preparation. This problem is particularly likely to occur when moving the field of view.
[0010]
When observing a biological sample, the observation target is often sealed in a liquid such as a culture medium. However, in the conventional method, since the adhesiveness of the cover glass is low, the liquid gradually evaporates within a few minutes, and as a result, bubbles enter the preparation. This is a major obstacle when observing a single sample for a long time.
[0011]
For observation of animal tissues and cultured cells, an inverted microscope in which an objective lens protrudes upward from below the stage is frequently used. Even when an oil immersion type lens is used in this inverted microscope, it is necessary to set the cover glass so as to come to the lens side (due to constraints such as the working distance of the objective lens). That is, the cover glass must adhere to the underside of the preparation. In this case, if the adhesion is weak, a liquid such as a medium often leaks from the preparation and flows down to the objective lens, which enters the lens or the lens barrel and causes a failure of the microscope.
[0012]
When a chamber crafted with vinyl tape, which is used for observations that require medium exchange, is applied to an inverted microscope, it is necessary to remove the chamber from the microscope stage at the time of medium exchange, and continuous observation of cells is impossible It is. Furthermore, the above-described problem of liquid leakage is likely to occur.
[0013]
When using a chamber capable of medium flow, the Dvorak Chamber manufactured by Lucas-Highland is a device that can be mounted on an inverted microscope, but it lacks versatility because it requires a specially shaped cover glass. Device. It also lacks strict temperature control and often has a significant effect on cell function.
[0014]
In a conventional method, the general procedure for bonding a cover glass is as follows:
(A) Place a small amount of liquid on the slide glass;
(B) Cover the cover glass carefully so that air bubbles do not enter;
(C) Absorb the liquid leaking around the cover glass with filter paper;
(D) Wait until the manicure is applied to the edges and hardened.
(Non-patent document 2, Non-patent document 3). However, these series of operations require several minutes, and observation cannot be performed during that time.
[0015]
In some biological samples, a time zone of several seconds or several minutes after the start of sample encapsulation is often a very important observation target. For example, if an attempt is made to observe a change in the morphology of an egg cell immediately after fertilization, the main reaction is completed within a few minutes after adding sperm to the egg cell. In addition, some of the cultured cells derived from animal tissues that are usually kept at 37 degrees in a heat storage chamber are exposed to room temperature for only a few minutes for inclusion work, leading to cell death through morphological changes such as contraction. It has been. Thus, “it takes time to encapsulate in a preparation” is a major obstacle to high-resolution microscopic observation that requires a cover glass.
[0016]
[Non-Patent Document 1]
Yoka (1973), Basics of Biological Microscope: 26-30
[0017]
[Non-Patent Document 2]
Inoue (1998), New Edition Microscopic Observation Series (1) Basics of Microscopic Observation: 124-127
[0018]
[Non-Patent Document 3]
Inoue (1998), new edition Microscopic observation series (3) Microscopic observation of animals: 18-23
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for quickly and firmly bonding a cover glass to a lower member in order to solve the above-mentioned problems, and further, a sample of a living cell or the like using a high-resolution oil immersion objective lens. The object is to provide a microscope preparation with a fluidized chamber of fluid (medium, etc.) capable of continuously observing for a long time and observing a reaction from a moment to a stimulus for a long time.
[0020]
The present inventors pay attention to the fact that the sealing material is used in many applications due to the difference in the structure of the main chain or side chain, and that this sealing material can be applied to observation of biological samples, The present inventors have found that by combining a silicone and urethane resin solution, it is possible to bond the cover glass to the lower member quickly and firmly.
[0021]
In addition, a microscope preparation in a mode that allows medium to be observed continuously for a long period of time by bonding a cover glass quickly and firmly, and addition of substances to observe the response to stimulation of the sample. The present invention has been completed.
[0022]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides the following.
[0023]
(1) A method for preparing a preparation for an optical microscope, which includes the following: at least one kind of sealing material between the edge of at least one side of the cover glass and the lower member provided with the sample holding region Bonding process,
Including the method.
[0024]
(2) The bonding step is as follows:
Coating a primer on one side of the lower member; and
Adhering at least one side edge of the cover glass to the coated one side of the lower member with a sealing material and sealing;
The method according to item (1), comprising:
[0025]
(3) The lower member is a transparent substrate having a sample holding region having an area smaller than or equal to that of the cover glass and having a surrounding portion surrounding the sample holding region, or a fluid chamber including the transparent substrate. The method according to 2).
[0026]
(4) The method according to item (3), wherein the surrounding portion is a hydrophobic polymer material.
[0027]
(5) The method according to item (3), wherein the surrounding portion is a tape material.
[0028]
(6) The sealing material is at least one selected from the group consisting of silicone polymers, modified silicone polymers, polysulfides, acrylic polymers, polyurethanes, butyl polymers, chlorosulfonated polyethylene, and styrene triblock copolymers. Item 2. The method according to Item (1), which is an organic solution containing a mixture of polymers.
[0029]
(7) The method according to item (1), wherein the sealant is an organic solution containing a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane.
[0030]
(8) The method according to item (2), wherein the sealing material is an alcohol solution containing a mixture of at least one silicone-based polymer.
[0031]
(9) The method according to item (2), wherein the primer is an organic solution containing polyurethane.
[0032]
(10) The method according to item (9), wherein the solvent of the organic solution containing the polyurethane is ethyl acetate.
[0033]
(11) The method according to item (2), wherein the sealing material is an alcohol solution containing a mixture of at least one silicone polymer, and the primer is an ethyl acetate solution containing polyurethane.
[0034]
(12) The fluid type chamber includes a reservoir having a fluid pool and a nozzle disposed on the transparent substrate,
Item 4. The method according to Item (3), wherein the transparent substrate has a first hole communicating with the reservoir and a second hole communicating with the nozzle.
[0035]
(13) The method according to item (3), wherein the transparent substrate is a glass substrate or an acrylic substrate.
[0036]
(14) The method according to item (1), wherein the sample is a living cell, an immobilized cell, a microorganism, or a tissue of an animal or plant.
[0037]
(15) An optical microscope preparation, the following:
Transparent substrate;
An enclosing portion that is affixed to the upper surface of the transparent substrate and has a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass;
A sample held in the sample holding area; and
A cover glass bonded to the upper surface of the surrounding portion with a sealing material;
A preparation with
[0038]
(16) A kit for preparing a preparation for an optical microscope,
Transparent substrate;
An enclosure having a sample holding area of equal or smaller area than the cover glass for application to the top surface of the transparent substrate; and
A sealing material for bonding the cover glass to the upper surface of the surrounding part,
A kit comprising:
[0039]
(17) The kit according to item (16), further comprising a sample to be observed.
[0040]
(18) The kit according to item (16), wherein the surrounding portion is a tape material.
[0041]
(19) The sealing material is at least one selected from the group consisting of silicone polymers, modified silicone polymers, polysulfides, acrylic polymers, polyurethanes, butyl polymers, chlorosulfonated polyethylene, and styrene triblock copolymers. Item 20. The kit according to Item (16), which is an organic solution containing a mixture of polymers.
[0042]
(20) A preparation for an optical microscope, the following:
Fluid flow chamber, the following:
A transparent substrate comprising a first hole and a second hole;
A reservoir disposed on the top surface of the transparent substrate; and
A nozzle disposed on the upper surface of the transparent substrate;
A chamber in which the first hole communicates with the reservoir and the second hole communicates with the nozzle;
An enclosing portion that is affixed to the lower surface of the transparent substrate and has a sample holding region having an area equal to or smaller than that of the cover glass; and
A cover glass bonded to the lower surface of the enclosing portion with a sealing material;
A preparation with
[0043]
(21) The preparation according to item (20), wherein the reservoir is attachable to a temperature variable device.
[0044]
(22) A kit for preparing a preparation for an optical microscope, the following:
A transparent substrate comprising a first hole and a second hole;
A reservoir in communication with the first hole;
A nozzle in communication with the second hole;
An enclosure that is affixed to a transparent substrate and has a sample holding area that is equal or smaller in area than the cover glass; and
A sealing material for bonding the cover glass to the enclosure,
A kit comprising:
[0045]
(23) The kit according to item (22), further comprising a sample to be observed.
[0046]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below. It should be understood that the terms used herein are commonly used in the art unless otherwise stated.
[0047]
According to the present invention, a method for producing a preparation for an optical microscope for observing a sample such as a living cell is provided. The production method of the present invention includes a step of adhering at least one kind of sealing material between the edge portion of at least one side of the cover glass and the lower member.
[0048]
In the present specification, the “sample” may be anything as long as it can be an object to be observed, and examples thereof include cultured cells, immobilized cells, microorganisms, and animal and plant tissues. Suspensions, water dispersions, oil-in-water emulsions, hydrated gels and the like are also included in the sample.
[0049]
In this specification, the “preparation” is a structure composed of a light-transmissive lower member (a glass substrate, an acrylic substrate, etc.) and a cover glass covering the lower member, and between the lower member and the cover glass. A structure in which a sample can be sealed in a space. Here, the space between the lower member and the cover glass may or may not contain a sample.
[0050]
In this specification, the “cover glass” refers to a commercially available cover glass having a refractive index of about 1.52 and a thickness of 0.17 mm ± 0.02 mm, and the sizes usually used are 18 × 18 mm, 18 ×. Essentially any size and shape (which may be circular) can be used as long as they are 24 mm, 24 × 24 mm, 24 × 40 mm and do not affect the optical field of view. In the present specification, the “edge portion of the cover glass” refers to a region having a width of about 5 mm on four sides of the cover glass.
[0051]
In this specification, the “lower member” refers to a fluidized chamber provided with a “transparent substrate” or “transparent substrate” that is optically transparent to the extent that microscopic observation is possible. The lower member generally includes a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass. Examples of the lower member include a glass substrate such as a microscope slide glass or an acrylic substrate. Here, “optically transparent” means that it is transparent to electromagnetic waves in a range used for at least an optical microscope in natural light or artificial light.
[0052]
In this specification, the term “sealing material” is used for the purpose of protection from an exposed environment, and prevents all gas, liquid, and solid particles from permeating through all construction, repairing sealing materials (non-uniform sealing materials), and caulking. A formulation that includes ingredients. Generally, sealing materials are used for sealing high performance sealing materials (25% + showing good recovery of about 80% with respect to joint displacement), building interiors, general residential buildings and repairs. The medium performance sealing material (adapted to displacement of 10 to 25%) and the low performance sealing material can be broadly classified, but in the present invention, any performance sealing material can be used for adhesion or sample sealing. It is enough.
[0053]
Examples of the sealing material in the present specification include silicone polymers, modified silicone polymers, polysulfides, acrylic polymers, polyurethanes, butyl polymers, chlorosulfonated polyethylene, and styrene triblock copolymers.
[0054]
According to the present invention, since cells and the like are in direct contact with the cover glass, a polymer solution having a siloxane bond (Si—O) as a main chain that has little influence on cells and the like is preferable as an appropriate sealing material. A system sealant is more preferable. A silicone alcohol solution is particularly preferred. Examples of the solvent alcohol include methanol, ethanol, isopropyl alcohol, and n-butanol.
[0055]
A typical silicone polymer sealant formulation is as follows: main component (polydimethylsiloxane diol) 80-85% by weight, crosslinker 5-7% by weight, catalyst (curing acceleration, tin carboxylate or Titanate ester) 0.05-0.10%, filler (silica, carbon black, glass microballoon) 6-10% by weight, plasticizer (non-reactive silicone fluid) 0-10% by weight. The silicone polymer sealant may include optional flame retardants, bactericides, adhesion promoters, pigments and thickeners. This formulation is just one example of a silicone-based polymer sealant and is not limited thereto.
[0056]
A typical polysulfide sealant formulation is as follows: main component (LP (thiocol) blend) 15-60 wt%, filler (calcium carbonate) 30-60 wt%, pigment (titanium dioxide) 10 Less than 10% by weight, less than 10% by weight of adhesion promoter (silane, titanate), less than 10% by weight of antioxidant (phenyl-2-naphthylamine), 10% by weight of accelerator (p-quinonedioxime, diphenylgranidine) Less than 10% by weight of thixotropic agent (Cabosil, Ircogel), less than 10% by weight of retarder (stearic acid, stearic acid ester), and less than 10% by weight of solvent (toluene, methyl ethyl ketone) , 10 parts by weight of catalyst (magnesium dioxide, dibutyl phthalate). This formulation is but one example of a polysulfide sealant and is not limited thereto.
[0057]
A typical polyurethane sealant formulation is as follows: main component (diisocyanate prepolymer, diphenylmethane diisocyanate equivalent = 1272) 50-60% by weight, filler (carbon black, etc.) 40-50% by weight, silica 2-4% by weight, solvent (toluene). The polyurethane sealant may contain optional UV absorbers, antioxidants, flame retardants, fillers and pigments. This formulation is just one example of a polyurethane sealant and is not limited thereto.
[0058]
A typical butyl polymer sealant formulation is as follows: main component (isobutylene, polybutene) 40-45 wt%, filler (clay, silica, calcium carbonate, carbon black) 30-40 wt% Pigment (titanium dioxide, zinc oxide) 2 to 4% by weight, tackifier (rosin-pentaerythritol ester) 0.5 to 1.0% by weight, thickener (fiber) 10% by weight, solvent (cyclohexane). This formulation is just one example of a polyurethane sealant and is not limited thereto.
[0059]
A typical acrylic polymer sealant formulation is as follows: latex acrylic polymer 30-40% by weight, filler (calcium carbonate, aluminum, silica, talc) 30-45% by weight, pigment (titanium dioxide) ) 1.0-1.5 wt%, surfactant 1.0-1.5 wt%, freezing point depressant (ethylene glycol) 20-25 wt%, plasticizer 7-8 wt%, thixotropic agent 1-2 Wt%, inorganic alcohol 0.2 wt%. The acrylic polymer sealant may contain optional antioxidants, UV absorbers and fungicides. This formulation is just one example of an acrylic polymer sealant and is not limited thereto.
[0060]
A typical chlorosulfonated polyethylene sealant formulation is as follows: main component (chlorosulfonated polyethylene) 15-20 wt%, chlorinated paraffin 15-20 wt%, filler 15-20 wt%, 10-15 wt% pigment, 6-8 wt% oxide catalyst (lead oxide), 15-20 wt% plasticizer (dibutyl phthalate), 4-5 wt% solvent (isopropyl alcohol). This formulation is just one example of a chlorosulfonated polyethylene sealant and is not limited thereto.
[0061]
According to the method of the present invention, the coating with the sealant on the edge of the cover glass is performed by pouring a silicone alcohol solution at a depth of about 5 mm into a container that does not leak liquid, and standing the cover glass against the wall. Is called. The time required for the coating on one side is about 1 minute, but the time can be extended or shortened depending on the efficiency of the coating. After the coating of one side is completed, the cover glass is rotated 90 degrees and the other side is immersed in the container. By repeating this operation, a silicone coat is formed on the four sides of the cover glass with a width of about 5 mm. If a sterilized cover glass is required, it can be sterilized by dry heat after applying a silicone coat.
[0062]
According to the present invention, preferably, a method is used in which a primer is coated on one side of the lower member, and a sample is sealed by adhering at least one side edge of the cover glass to the one side with a sealing material.
[0063]
In this specification, the “primer” applied to the lower member refers to a polymer substance for further enhancing the adhesion of the sealing material. As the primer, a polymer solution having a urethane bond (NHCOO) as a main chain is preferable, and a polyurethane solution is more preferable. As this polyurethane solution, a polyurethane sealant or a urethane resin solution is more preferable, and a urethane resin / ethyl acetate solution can be used particularly effectively.
[0064]
In this specification, the term “fluid chamber” refers to a chamber in which fluid can be sequentially exchanged and fluidized or refluxed, or fluid can be added as appropriate, in order to hold cells and the like alive for a long time. Refers to all chambers in shape. “Fluid” refers to any water-based aqueous solution, aqueous suspension, water dispersion, oil-in-water emulsion, hydrated gel, etc. that is light transmissive to the extent that microscopic observation is possible. Say. For example, the fluid includes a medium or a drug solution.
[0065]
In order to quickly and firmly bond the cover glass to the lower member, the edge of the cover glass is coated with a “sealing material”, and further, a “primer” is applied to the lower member portion that adheres the cover glass. It is preferable.
[0066]
Prior to the application of urethane resin to the lower member, in order to secure a space for sealing the sample, a sample holding area equal to or smaller than the area of the cover glass is provided in the “transparent substrate” or “fluid chamber equipped with a transparent substrate”. A “surrounding portion” having a thickness is pasted. The “enclosure” is preferably a hydrophobic polymer material that repels the sample that fills the sample holding region (also referred to as an observation window).
[0067]
In the present specification, the “transparent substrate” refers to an optically transparent glass substrate or an acrylic substrate, and is preferably a slide glass.
[0068]
When the surrounding portion is attached to a transparent substrate or a fluidized chamber including the transparent substrate, any sealing material or adhesive that does not chemically react with the fluid can be used. As a more preferable example of the surrounding portion, a tape material having a sticking agent on at least one surface is exemplified, and a commercially available vinyl tape is most preferable.
[0069]
An example of forming a sample holding region (or observation window) using a tape material is as follows. First, a vinyl tape (thickness of about 0.1 mm) is pasted on a slide glass or the like. After applying the urethane resin / ethyl acetate solution on the vinyl tape, when using a cover glass of 24 mm × 24 mm, the central portion of the vinyl tape is cut into a size of 18 mm × 18 mm, and the sample holding area (or Observation window).
[0070]
When the sample to be observed is a sample adhered on the cover glass, for example, in the case of adhesive cultured cells, add a medium according to the sample to the observation window, and the silicone coat to which the cells adhere The treated cover glass is turned down so that the cells are inside the observation window, and the edge of the cover glass is pressed before the urethane resin is cured, thereby preparing a preparation by bringing silicone and urethane resin into close contact. This production method using a combination of silicone and urethane resin is hereinafter referred to as “silicone / urethane resin method”.
[0071]
If the sample to be observed is floating, fill the sample suspension into the observation window, lay the silicone-treated cover glass down on the lower member before the urethane resin hardens, press the edge of the cover glass, And a urethane resin are closely attached to prepare a preparation.
[0072]
If the sample to be observed is a tissue, place the sample in the observation window, fill it with an appropriate solution, lay down the cover glass with silicone treatment on the lower member before the urethane resin hardens, and press the edge of the cover glass Then, silicone and urethane resin are brought into close contact to prepare a preparation.
[0073]
Since silicone has hydrophobicity and flexibility, it is considered that when the cover glass is pressed, the liquid is ejected at the adhesion site and a sucker action is generated to increase the adhesion. Furthermore, when the cover glass with silicone coating on the edge is pressed against the surface of the urethane resin before curing, the high affinity of the urethane resin to the silicone and the hydrophobicity of the silicone are simultaneously exhibited on the adhesive surface, and both of them are pushed out while pushing out water. It is considered that they are strongly coupled.
[0074]
In order to observe living cells for a long time, it is necessary to sequentially replace the medium with a fresh one in order to prevent fluctuations in the medium components accompanying cell temperature control and cell metabolism. In addition, high-resolution observation of living cells is often performed for the purpose of observing a response to cell stimulation. For that purpose, it is required that a drug or the like of a necessary amount be added to a space in which cells on the microscope are enclosed without moving the sample from the microscope.
[0075]
A chamber that allows the flow of the medium on the microscope stage is necessary for any purpose such as medium exchange or drug addition. However, since the preparation using the chamber also includes a step of closely attaching the cover glass, In addition, it is necessary to enable strong adhesion and to easily flow the target medium.
[0076]
Actually, when trying to use the method of closely attaching the cover glass to the lower member for high resolution observation using a chamber capable of exchanging, refluxing, and adding the medium, the exchange of the conventional medium, It cannot function in a chamber that can be refluxed and added.
[0077]
According to the present invention, according to the invention of the silicone / urethane resin method, it is possible to exchange, reflux, add and further control the temperature of a new type of fluid (medium etc.) that is effective when combined with the present invention. A chamber can be provided.
[0078]
Hereinafter, an example of the configuration of the fluid type chamber is shown, but this is merely an example. For example, the fluidized chamber is assembled as a fluidized type of fluid used by being set on an inverted microscope stage capable of temperature control. For this reason, a glass substrate (such as a slide glass) having relatively good heat conductivity was used for the portion in direct contact with the stage, and a fluid pool surrounded by acrylic resin and a fluid suction nozzle were assembled thereon (FIG. 3). The “reservoir” for supplying and holding the fluid preferably has a low length and a wide shape in consideration of interference with the optical path of the microscope and thermal conductivity to the fluid. A fluid (for example, a fresh culture medium) is stored on the upper surface of the chamber, but the sample to be observed is set on the lower surface (objective lens side) of the chamber, so that the glass substrate penetrates in the thickness direction. At least two holes are provided. For example, the glass substrate is provided with a first hole and a second hole, which play a role of fluid inflow and suction, respectively. The first hole communicates with the reservoir and the second hole communicates with the chamber. The diameters of the inflow hole and the suction hole can be appropriately selected according to the kind of fluid, the viscosity, and the diameter of the fine particles present in the fluid. For example, in the case of a medium containing tissue, a diameter of about 1.5 mm is preferable.
[0079]
When a pump is attached to the distal end of the tube extending from the fluid suction nozzle (see FIG. 3) and the fluid is sucked slowly, the observation window keeps the fluid kept at a constant temperature (for example, fresh and kept at the culture temperature). From the pool. In addition, if an arbitrary drug is added with a micropipette near the fluid inlet of the pool, the drug is immediately administered to the cells along the fluid flow.
[0080]
With such a mechanism, in the case of observing a culture medium containing a tissue, the fluidity chamber can maintain the freshness of the culture medium while maintaining the culture temperature on a microscope stage on which a high-resolution objective lens is set. Moreover, administration and washing of drugs and the like to cells can be freely performed on a microscope.
[0081]
By rapidly and firmly attaching the cover glass to the chamber of the present invention by the silicone / urethane resin method, it is possible to continuously observe living cells with high resolution. In addition, it is possible to observe the reaction from the moment to the long-term to the stimulation of the cell with high resolution.
[0082]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0083]
(Example 1: Adhesive strength test)
In this example, the adhesive strength between a cover glass treated with silicone and a slide glass as a lower member treated with urethane resin was examined. The cover glass and slide glass used in this example were washed and stored using a conventional method (Inoue (1998), new edition, microscope observation series (1): Basics of microscope observation: 124-127 [Non-patent Document 2]). It is a thing.
[0084]
1.1. Silicone treatment of cover glass
A silicone-alcohol solution was poured at a depth of about 5 mm into a container that did not leak liquid, and a cover glass of 24 mm × 24 mm was put on the wall. After leaving in this state for 1 minute, the cover glass was rotated 90 degrees, another side was immersed in the solution, and left for another 1 minute. By repeating this operation, a silicone coat was applied to the four sides of the cover glass with a width of about 5 mm (FIG. 1a).
[0085]
1.2. Urethane resin treatment of slide glass
In order to seal the thin layer of distilled water in the preparation, a vinyl tape (thickness: 0.1 mm) was pasted on the slide glass, and a urethane resin solution (manufactured by Konishi Co., Ltd., seal primer) was applied on the vinyl tape. Further, a container was manufactured by punching the central part of the tape with a size of 18 mm square (FIG. 1b).
[0086]
1.3. Adhering the cover glass to the slide glass
The hole in which the tape was cut out was filled with a sufficient amount (100 ul) of distilled water colored with a red pigment, and a cover glass was covered from above (see FIG. 2). When bonding the cover glass, a control group in which no treatment was performed, a case in which only the silicone coat was applied to the edge, and a case in which the silicone and urethane resin treatment were performed were prepared, and the strength of the adhesion was compared.
[0087]
1.4. Evaluation of adhesive strength
Evaluation of adhesive strength is performed by attaching a thread with an instantaneous adhesive near the center of the cover glass surface, attaching a weight of a predetermined weight to the end, and placing the preparation vertically and applying weight to the adhesive part. (FIG. 2).
[0088]
In the case of no coating (FIG. 2a), the cover glass slipped within 1 minute with a force of 10 g, and the liquid leaked, and after 5 minutes, it completely dropped off.
[0089]
When the silicone coat was applied (FIG. 2b), it was immobile in 1 minute against a force of 10 g, but eventually dropped out after 5 minutes.
[0090]
When the silicone / urethane resin treatment was applied (FIG. 2c), the cover glass did not shift at all even when a force of 20 g was applied for 30 minutes, and there was no leakage or evaporation of the enclosed liquid. Regarding the speed of adhesion, in the case of the silicone / urethane resin treatment, they were in close contact with each other at the moment of contact.
[0091]
From the above, the silicone coating of the cover glass shows some improvement in adhesion, but this alone does not solve all the problems when using an oil immersion objective lens. It became clear that a quick and strong sealing was possible by adding this method.
[0092]
(Example 2: High-resolution imaging of living animal cultured cells using an oil immersion objective lens)
In this example, cultured cells derived from the ovary of Chinese hamsters (CHO-K1, Riken Cell Bank) generally used for studies at the cell level of animals were used to maintain the physiological conditions of the cells on a microscope. The high-resolution microscope image of the living cell was performed using the oil immersion objective lens.
[0093]
2.1. Chamber fabrication
In order to keep the cells alive in a small sealed container on a microscope for a long time, it is necessary to keep the temperature at about 37 ° C. In addition to acidification of the medium by extracellular discharge of acidic waste products, etc. In order to prevent this, it is necessary to sequentially replace the medium with a fresh one.
[0094]
Therefore, in this example, a fluid type chamber as shown in FIG. 3 was produced. The chamber uses a slide glass as a substrate. The chamber is provided with an observation window for adhering a cover glass of 24 mm × 24 mm at the center of the lower surface (FIG. 3 b), and it becomes possible to observe by putting an organism to be observed and bringing the cover glass into close contact therewith. .
[0095]
In the case of adherent cultured cells, etc., it is cultured on a cover glass with a silicone treatment on the edge, and the cover glass is brought into close contact with this observation window, so that a continuous high-resolution microscope can be alive. Observation becomes possible. A pool crafted with acrylic material, a suction nozzle, etc. are installed to allow the addition of media and the like. The actual flow of the medium and the addition of the drug are performed by connecting the suction nozzle to a suction pump (capable of suction at a low speed and a stable speed). The target solution is added onto the pool surrounded by the acrylic material, and the start of suction and the control of the suction speed are all performed by a suction pump.
[0096]
2.2. Making observation windows
After applying a vinyl tape to the lower surface of the chamber and further applying a urethane resin, an area of the vinyl tape corresponding to the portion actually observed when the cover glass was adhered was cut out to produce an observation window. Separately, CHO cells were cultured on a cover glass of 24 mm × 24 mm subjected to silicone treatment to prepare an observation sample.
[0097]
2.3. Attaching the cover glass to the chamber
After filling the observation window with the culture medium, the cover glass to which the CHO cells cultured on the cover glass treated with silicone are adhered is covered with the observation window so that the cells are in contact with the culture medium. Installation of the cover glass is completed by pressing the member. By mounting the cover glass, the medium can also flow.
[0098]
2.4. Comparison of adhesive strength
Since the chamber is loaded with water pressure due to medium flow (FIG. 3c), a strong adhesive force is required when fixing the cover ballast. Therefore, as a method of fixing the cover glass during preparation of the slide, the conventional method (a) in which the periphery is solidified with manicia and the bonding method (b) using the silicone / urethane resin of the present invention were tried. For the preparations prepared by each method, cells were actually observed using an oil immersion objective lens, and the practical differences between the two were compared.
[0099]
As a result, in the silicone / urethane resin method, the medium did not leak even after continuous observation for 2 hours.
[0100]
2.5. Cell observation
In the conventional method (a) in which the periphery of the cover glass is solidified with manicia, it takes about 5-6 minutes to prepare the preparation, such as the time required for the manicia to dry (FIG. 4a). During that time, the samples were exposed to room temperature, so the observed cells showed significant contraction. That is, in the conventional method, the outline of the cell is rounded and becomes elliptical, and a large number of vesicles (indicated by white arrowheads) formed by contraction are observed in the periphery of the cell in the shape of grape bunches. Moreover, when the observation was continued, a phenomenon that the medium in the chamber leaked from the bonded portion of the cover glass in about 20 to 30 minutes was observed, and this method could not withstand continuous observation for a long time.
[0101]
On the other hand, in the adhesion method (b) using the silicone / urethane resin of the present invention, the preparation could be produced within 2 minutes. Due to the short time of exposure to room temperature, the cells did not contract and remained in a spindle shape, or extended further thinly to form a triangle (FIG. 4b). This indicates that the cells remain extremely healthy.
[0102]
【The invention's effect】
According to the present invention, all problems caused by insufficient adhesion of the preparation for optical microscope observation to the lower member of the cover glass can be solved easily and quickly, and high-resolution observation with an optical microscope can be performed for a long time. It becomes possible. Furthermore, by using the fluidized chamber of the present invention, it is possible to continuously observe instantaneous to long-term responses to, for example, stimulation of living samples such as cultured cells, immobilized cells, microorganisms, or animal and plant tissues. It becomes possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing (a) a silicone coating on four sides of a cover glass of the present invention, and (b) a preparation for an optical microscope of the present invention.
FIG. 2 is a comparative experiment in which the adhesive strength of (a) a cover glass not treated at all, (b) a cover glass coated with silicone, and (c) a cover glass treated with silicone coat + urethane resin was evaluated. It is a figure which shows a result.
FIG. 3 is a diagram showing (a) a perspective view of a fluidized chamber, (b) a top view of the fluidized chamber, and (c) a side view of the fluidized chamber.
FIG. 4 is a graph of Chinese hamster ovary-derived cultured cells taken for (a) a preparation prepared by a conventional Manucia method and (b) a preparation prepared by the method of the present invention (silicone / urethane resin method). It is a figure which shows the comparison of a photograph.

Claims

A method for preparing a preparation for a light microscope for observation of living cells, the method comprising:
Coating a primer on one side of a lower member having a sample holding region;
Bonding at least one side edge of the cover glass and one side coated with the lower member with at least one type of sealing material, and sealing,
Wherein the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane, and the primer is an organic solution comprising polyurethane.

The lower member is a transparent substrate having a sample holding region having an area equal to or smaller than that of a cover glass and having an enclosure surrounding the sample holding region, or a fluid chamber including the transparent substrate. The method described in 1.

The method of claim 2, wherein the enclosure is a hydrophobic polymer material.

The method according to claim 2, wherein the surrounding portion is a tape material.

The method according to claim 1, wherein the solvent of the organic solution containing the polyurethane is ethyl acetate.

The flow chamber includes a reservoir having a fluid pool and a nozzle disposed on the transparent substrate;
The method of claim 2, wherein the transparent substrate has a first hole in communication with the reservoir and a second hole in communication with the nozzle.

The method according to claim 2, wherein the transparent substrate is a glass substrate or an acrylic substrate.

The method according to claim 1, wherein the sample is a living cell, an immobilized cell, a microorganism, or an animal or plant tissue.

An optical microscope preparation, the following:
A transparent substrate with a primer coated on the top surface;
An enclosing portion attached to the upper surface of the transparent substrate and having a sample holding region having an area equal to or smaller than that of the cover glass;
A sample held in the sample holding region; and
A cover glass adhered by a sealing material on a transparent substrate coated with the primer ;
Wherein the primer is an organic solution comprising polyurethane and the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane.

A kit for preparing a preparation for an optical microscope,
Transparent substrate;
A primer for coating the upper surface of the transparent substrate;
An enveloping part having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of a cover glass for being attached to the upper surface of the transparent substrate; and
A sealing material for adhering a cover glass on a transparent substrate coated with the primer ;
Wherein the primer is an organic solution comprising polyurethane and the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane.

The kit of claim 10, further comprising a sample to be observed.

The kit according to claim 10, wherein the surrounding portion is a tape material.

An optical microscope preparation, the following:
Fluid flow chamber, the following:
Comprising a first hole and a second hole, a transparent substrate a primer underneath surface is coated;
A reservoir disposed on the top surface of the transparent substrate; and a nozzle disposed on the top surface of the transparent substrate;
A chamber in which the first hole communicates with the reservoir and the second hole communicates with the nozzle;
An enclosing portion attached to the lower surface of the transparent substrate and having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass; and
A cover glass adhered to the lower surface of the transparent substrate coated with the primer by a sealing material;
Wherein the primer is an organic solution comprising polyurethane and the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane.

The preparation according to claim 13, wherein the reservoir is attachable to a temperature variable device.

A kit for preparing a preparation for an optical microscope comprising:
A transparent substrate comprising a first hole and a second hole;
A primer for coating the upper surface of the transparent substrate;
A reservoir in communication with the first hole;
A nozzle in communication with the second hole;
An enclosing portion affixed to the transparent substrate and having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass; and
A sealing material for adhering a cover glass on a transparent substrate coated with the primer ;
Wherein the primer is an organic solution comprising polyurethane and the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane.

The kit according to claim 15, further comprising a sample to be observed.

A method for continuously observing live cells, the method comprising:
Preparing a sample containing living cells in the sample holding region of the preparation;
Coating a primer on one side of a lower member having a sample holding region;
Bonding at least one side edge of the cover glass and one side coated with the lower member with at least one type of sealing material, and sealing,
Continuously observing the sample containing the living cells with an optical microscope;
Wherein the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane, and the primer is an organic solution comprising polyurethane.

A preparation for observation of live cells, including:
A transparent substrate with a primer coated on the top surface;
An enclosing portion attached to the upper surface of the transparent substrate and having a sample holding region having an area equal to or smaller than that of the cover glass;
A sample held in the sample holding region; and
A cover glass bonded with a sealing material on a transparent substrate coated with the primer ,
Wherein the primer is an organic solution comprising polyurethane and the sealant is an organic solution comprising a mixture of at least one silicone-based polymer and polyurethane.