JP2004229548A - Preparation for microscope and method for making the same - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概して、顕微鏡プレパラートおよびその作製方法に関する。詳細には、高解像度の油浸式対物レンズでの観察に必須なカバーガラスを光学的透明基板にシーリング材で接着することにより、試料を封入した光学顕微鏡用プレパラートを作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡を用いた試料の観察、特に細胞・微生物・動植物の組織など水を多く含むか又は水の中に浸っている生物試料の観察に際しては、水の蒸発を防ぎ、かつ対物レンズの球面収差に試料を適合させるため、厚さ０．１７ｍｍの標準カバーガラス等で試料を覆うことが一般的に行われている。特に、高倍率・高解像度の対物レンズでは、レンズの開口数をかせぐため、試料とレンズとの間をガラスと同じ屈折率（ｎ≒１．５２）を持つ油で満たす必要があるので、試料と油との接触を防ぎ、かつレンズに適合した作動距離を確保するためには、厚さ０．１７ｍｍ程度のカバーガラスで試料を覆うことは、必須である（非特許文献１）。
【０００３】
試料の封入に際しては、光透過性（スライドガラス、アクリル板など）の下部材の上に水を含む試料を乗せ、さらにこの上をカバーガラスで被い試料をサンドイッチする。なお、このような封入試料を以下プレパラートと呼ぶ。固定・脱水処理の施された試料のように、樹脂中に包埋できる試料では、試料はカナダバルサム等の特殊接着剤でプレパラート内に封入できるので、長い時間をかけて接着剤が硬化されればカバーガラスはしっかりと固定される。
【０００４】
しかし生きている細胞や微生物を観察する場合など、樹脂で包埋できない試料では、従来カバーガラスはただ単に試料の上に置かれ水の表面張力で張り付かせるか、被せたカバーガラスの周囲にマニキュアやパラフィンなどを塗って封じる、若しくは、試料をワセリンで覆い、その上にカバーガラスを被せることで、試料を圧しつぶさずにカバーガラスを固定する、などの方法で接着が行われてきた（非特許文献２）。
【０００５】
さらに、生きた細胞の継続観察や、培地交換などが必要な場合には、下部材上にビニールテープなどを貼り、剃刀などでカバーガラスより小さな観察窓を開け厚さ０．１ｍｍ程度の台を確保すると同時に、液交換のために窓の両端などに切り込みをいれたものを準備する。観察窓を溶液で満たし、その上にカバーガラスを被せ、周辺をマニュキアなどで固定する。液交換を行う場合は、切り込みの一方に濾紙片を置き、他方に交換する液をピペットなどで落とす方法などが取られてきた（非特許文献３）。
【０００６】
また、生きた細胞を長時間に渡り観察する必要がある場合には、培地の流動が可能な特殊培養チャンバー（Ｌｕｃａｓ−Ｈｉｇｈｌａｎｄ１社製のＤｖｏｒａｋ Ｃｈａｍｂｅｒ）、あるいは自作のチャンバーなどを顕微鏡ステージ上に装着し、培地を逐次供給する方法が取られてきた。
【０００７】
さらに、生きた細胞の観察においては温度管理も重要な要素であるが、顕微鏡全体を大掛かりで極めて高価な装置を装着する、あるいは、温度制御が可能な顕微鏡ステージを組み込むなどの方法が取られて来たが、いずれも場合も実際に試料を乗せるチャンバーは、自作するなどの必要性があった。
【０００８】
しかしながら、これらの方法では下部材とカバーガラスとの接着力が弱いので、以下の問題がしばしば発生し、これが高解像度の油浸式対物レンズを用いることの妨げとなっている。
【０００９】
対物レンズとカバーガラスの間を満たすオイル（粘性が高い）によりカバーガラスが対物レンズに付着し、プレパラートから剥離してしまう。特にこの問題は視野を移動する際に起こりやすい。
【００１０】
生物試料の観察時には、観察対象は培地などの液体中に密封する場合が多い。しかし、従来の方法ではカバーガラスの密着性が低いため、数分程度で徐々に液体が蒸発し、その結果プレパラート中に気泡が入り込む。このことは単一試料を長時間観察する場合に大きな障害となる。
【００１１】
動物の組織や培養細胞の観察では対物レンズがステージの下から上向きに出ている倒立型の顕微鏡が頻繁に用いられる。この倒立顕微鏡で油浸式のレンズを用いる場合にも、カバーガラスはレンズ側に来るようにセットすることが必要である（対物レンズの作動距離などの制約による）。すなわち、カバーガラスはプレパラートの下側に接着しなくてはならない。この場合、接着が弱いと培地などの液体がプレパラートから漏れ出し、対物レンズへと流れ落ちることもしばしばで、これがレンズや鏡筒内に入って顕微鏡の故障の原因となる。
【００１２】
培地交換などが必要な観察に利用されるビニールテープで細工をしたチャンバーを倒立型顕微鏡へ適用した場合、培地交換時にチャンバーを一度顕微鏡ステージから外す必要があり、細胞の継続的な観察は不可能である。さらに、上述の液漏れの問題が生じ易い。
【００１３】
培地流動が可能なチャンバーを使用する場合には、Ｌｕｃａｓ−Ｈｉｇｈｌａｎｄ社製のＤｖｏｒａｋ Ｃｈａｍｂｅｒが、倒立型顕微鏡へも装着可能な装置であるが、特殊な形状のカバーガラスが必要など、汎用性に欠ける装置である。また、温度制御の厳密さにも欠け、しばしば細胞機能に重大な影響を与えていた。
【００１４】
従来の方法において、カバーガラスを接着する際の一般的な手順は、以下：
（ａ）スライドガラスに液体を少量乗せる；
（ｂ）気泡が入り込まないように丁寧にカバーガラスを被せる；
（ｃ）カバーガラスの周囲に漏れた液体をろ紙などで吸い取る；
（ｄ）マニュキアを辺縁部に塗って硬化するまで待つ、
の順番で行われてきた（非特許文献２、非特許文献３）。しかし、これら一連の作業には数分の時間を要し、その間観察が行えない。
【００１５】
生体試料の中には、試料の封入を開始してからの数秒、数分の時間帯が極めて重要な観察対象となる場合もしばしばである。例えば、受精直後の卵細胞の形態の変化を観察しようとすれば、主要な反応は卵細胞に精子を添加してから数分のうちに完了してしまう。また通常保温庫内で３７度に保たれている動物組織由来の培養細胞の中には、封入作業のためほんの数分間室温にさらすことで、収縮などの形態変化を経て細胞死に至るケースが知られている。このように”プレパラートへの封入に時間を要する”ということが、カバーガラスを必須とする高解像度での顕微鏡観察に対する大きな妨げの要因となっているのである。
【００１６】
【非特許文献１】
八鹿（１９７３）、生物顕微鏡の基礎：２６−３０
【００１７】
【非特許文献２】
井上（１９９８）、新版 顕微鏡観察シリーズ▲１▼ 顕微鏡観察の基本：１２４−１２７
【００１８】
【非特許文献３】
井上（１９９８）、新版 顕微鏡観察シリーズ▲３▼ 動物の顕微鏡観察：１８−２３
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題を解決するため、素早く、しかも強固に、カバーガラスを下部材に接着する方法を提供し、さらに、高解像度の油浸式対物レンズによる生きた細胞などの試料の長時間連続観察、および刺激に対する瞬時から長時間に渡る反応の観察が可能な、流体（培地など）の流動式チャンバー付き顕微鏡プレパラートを提供することである。
【００２０】
本発明者らは、シーリング材が主鎖あるいは側鎖の構造の違いにより、多くの用途に使用されていることに着目し、このシーリング材が生物試料の観察にも適用可能であること、さらに、シリコーンとウレタン樹脂溶液を組み合わせることにより、迅速かつ強固なカバーガラスの下部材への接着を可能にすることを見出した。
【００２１】
また、素早く、強固にカバーガラスを接着することにより試料の長時間連続観察を可能とする培地の流動、および試料の刺激に対する応答を観察するための物質添加が可能となるような様式の顕微鏡プレパラートを完成させ、本発明に到った。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は以下を提供する。
【００２３】
（１）光学顕微鏡用プレパラートを作製する方法であって、この方法は以下：
カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部と、試料保持領域を備えた下部材との間を、少なくとも一種のシーリング材で接着する工程、
を包含する、方法。
【００２４】
（２）上記接着する工程が、以下：
上記下部材の片面にプライマーをコートすること；および
下部材のコートされた片面に、上記カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部をシーリング材で接着し、密封すること、
を包含する、項（１）に記載の方法。
【００２５】
（３）上記下部材が、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有し試料保持領域を取り囲む包囲部を貼り付けた透明基板、または透明基板を備える流動式チャンバーである、項（２）に記載の方法。
【００２６】
（４）上記包囲部が、疎水性ポリマー材料である、項（３）に記載の方法。
【００２７】
（５）上記包囲部が、テープ材である、項（３）に記載の方法。
【００２８】
（６）上記シーリング材が、シリコーン系ポリマー、変性シリコーン系ポリマー、ポリスルフィド、アクリル系ポリマー、ポリウレタン、ブチル系ポリマー、クロロスルホン化ポリエチレンおよびスチレントリブロック共重合体からなる群から選択される少なくとも１種のポリマーの混合物を含む有機溶液である、項（１）に記載の方法。
【００２９】
（７）上記シーリング材が、少なくとも１種のシリコーン系ポリマーの混合物およびポリウレタンを含む有機溶液である、項（１）に記載の方法。
【００３０】
（８）上記シーリング材が、少なくとも１種のシリコーン系ポリマーの混合物を含むアルコール溶液である、項（２）に記載の方法。
【００３１】
（９）上記プライマーが、ポリウレタンを含む有機溶液である、項（２）に記載の方法。
【００３２】
（１０）上記ポリウレタンを含む有機溶液の溶媒が、酢酸エチルである、項（９）に記載の方法。
【００３３】
（１１）上記シーリング材が少なくとも１種のシリコーン系ポリマーの混合物を含むアルコール溶液であり、かつ上記プライマーがポリウレタンを含む酢酸エチル溶液である、項（２）に記載の方法。
【００３４】
（１２）上記流動式チャンバーが、上記透明基板上に配置された、流体プールを有するリザーバ、およびノズルを備え、
透明基板が、リザーバに連通する第１の孔およびノズルに連通する第２の孔を有する、項（３）に記載の方法。
【００３５】
（１３）上記透明基板が、ガラス基板またはアクリル基板である、項（３）に記載の方法。
【００３６】
（１４）上記試料が、生細胞、固定化細胞、微生物、または動植物の組織である、項（１）に記載の方法。
【００３７】
（１５）光学顕微鏡用プレパラートであって、以下：
透明基板；
透明基板の上面に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；
試料保持領域内に保持された試料；および
包囲部の上面にシーリング材により接着されたカバーガラス、
を備える、プレパラート。
【００３８】
（１６）光学顕微鏡用プレパラートを作製するためのキットであって、
透明基板；
透明基板の上面に貼付けるための、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；および
包囲部の上面にカバーガラスを接着するためのシーリング材、
を備える、キット。
【００３９】
（１７）観察される試料をさらに備える、項（１６）に記載のキット。
【００４０】
（１８）上記包囲部がテープ材である、項（１６）に記載のキット。
【００４１】
（１９）上記シーリング材が、シリコーン系ポリマー、変性シリコーン系ポリマー、ポリスルフィド、アクリル系ポリマー、ポリウレタン、ブチル系ポリマー、クロロスルホン化ポリエチレンおよびスチレントリブロック共重合体からなる群から選択される少なくとも１種のポリマーの混合物を含む有機溶液である、項（１６）に記載のキット。
【００４２】
（２０）光学顕微鏡用プレパラートであって、以下：
流体の流動式チャンバーであって、以下：
第１の孔および第２の孔を備える透明基板；
透明基板の上面に配置された、リザーバ；および
透明基板の上面に配置された、ノズル、
を備え、第１の孔がリザーバと連通し、第２の孔がノズルと連通する、チャンバー；
透明基板の下面に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；ならびに
包囲部の下面にシーリング材により接着されたカバーガラス、
を備える、プレパラート。
【００４３】
（２１）上記リザーバが、温度可変装置に装着可能である、項（２０）に記載のプレパラート。
【００４４】
（２２）光学顕微鏡用プレパラートを作製するためのキットであって、以下：
第１の孔および第２の孔を備える透明基板；
第１の孔と連通されるリザーバ；
第２の孔と連通されるノズル；
透明基板に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；ならびに
包囲部にカバーガラスを接着するためのシーリング材、
を備える、キット。
【００４５】
（２３）観察される試料をさらに備える、項（２２）に記載のキット。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられることが理解されるべきである。
【００４７】
本発明によれば、例えば生きた細胞などの試料を観察するための光学顕微鏡用プレパラートの作製方法が提供される。本発明の作製方法は、カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部と下部材との間を、少なくとも一種のシーリング材で接着する工程、を包含する。
【００４８】
本明細書において、「試料」とは、観察される対象になり得るものであれば何でもよく、例えば、培養細胞、固定化細胞、微生物、または動植物の組織が挙げられ、これら組織の水溶液、水性懸濁液、水分散体、水中油エマルジョン、水和したゲル状物なども試料に含まれる。
【００４９】
本明細書において、「プレパラート」とは、光透過性の下部材（ガラス基板、アクリル基板など）とこれを被うカバーガラスから構成される構造体であり、下部材とカバーガラスとの間の空間に試料が密封可能な構造体をいう。ここで、下部材とカバーガラスとの間の空間には、試料が入っていても入っていなくてもよい。
【００５０】
本明細書において、「カバーガラス」とは、屈折率が１．５２程度で厚さ０．１７ｍｍ±０．０２ｍｍの市販のカバーガラスをいい、通常使用される大きさは１８×１８ｍｍ、１８×２４ｍｍ、２４×２４ｍｍ、２４×４０ｍｍであり、光学的視野に影響がない限り、本質的に任意の大きさおよび形状（円形でもよい）のものが使用され得る。本明細書中において、「カバーガラスの辺縁部」とは、カバーガラスの四辺５ｍｍ程度の幅の領域をいう。
【００５１】
本明細書において、「下部材」とは、顕微鏡観察が可能な程度に光学的に透明な「透明基板」または「透明基板」を備える流動式チャンバーをいう。下部材は、一般にカバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を備えている。下部材として、例えば、顕微鏡用スライドガラスなどのガラス基板またはアクリル基板が挙げられる。ここで、「光学的に透明な」とは、自然光または人工光の中の少なくとも光学顕微鏡に用いる範囲の電磁波に対し透過性であることを意味する。
【００５２】
本明細書において、「シーリング材」とは、曝露環境からの保護を目的として使用され、気体、液体、固体粒子の透過を防ぐ全ての建築、修理用シーリング材（不定形シーリング材）、およびコーキング材を含む処方物をいう。一般に、シーリング材は、建築外装の封止用に用いられる高性能シール材（２５％＋接合部の変位に対し、良好な回復約８０％を示す）、建築内装、一般住宅建築および補修に用いられる中性能シール材（１０〜２５％の変位に適応）および低性能シール材に大別されるが、本発明においては、いずれの性能のシール材を適用しても、接着または試料の密封に十分である。
【００５３】
本明細書におけるシーリング材として、例えば、シリコーン系ポリマー、変性シリコーン系ポリマー、ポリスルフィド、アクリル系ポリマー、ポリウレタン、ブチル系ポリマー、クロロスルホン化ポリエチレンおよびスチレントリブロック共重合体などが挙げられる。
【００５４】
本発明によれば、カバーガラスには細胞などが直接に接するため、適切なシーリング材として、細胞などへの影響が少ないシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ）を主鎖とする高分子溶液が好ましく、シリコーン系シーリング材がより好ましい。シリコーンアルコール溶液が、特に好ましい。溶媒のアルコールには、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノールなどが挙げられる。
【００５５】
代表的なシリコーン系ポリマーのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（ポリジメチルシロキサンジオール）８０〜８５重量％、架橋剤５〜７重量％、触媒（硬化促進、カルボン酸スズまたはチタン酸エステル）０．０５〜０．１０％、充填剤（シリカ、カーボンブラック、ガラスミクロバルーン）６〜１０重量％、可塑剤（非反応性シリコーンフルイド）０〜１０重量％。シリコーン系ポリマーのシーリング材は、任意の難燃剤、殺菌剤、接着促進剤、顔料および粘調剤を含んでもよい。この処方は、シリコーン系ポリマーのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５６】
代表的なポリスルフィドのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（ＬＰ（チオコール）ブレンド）１５〜６０重量％、充填剤（炭酸カルシウム）３０〜６０重量％、顔料（二酸化チタン）１０重量％未満、接着促進剤（シラン、チタン酸塩）１０重量％未満、酸化防止剤（フェニル−２−ナフチルアミン）１０重量％未満、促進剤（ｐ−キノンジオキシム、ジフェニルグラニジン）１０重量％未満、チキソトロープ剤（Ｃａｂｏｓｉｌ，Ｉｒｃｏｇｅｌ）１０重量％未満、遅延剤（ステアリン酸、ステアリン酸エステル）１０重量％未満、溶媒（トルエン、メチルエチルケトン）１０重量％未満から構成されるベースコンパウンド１００重量部に対し、触媒（二酸化マグネシウム、フタル酸ジブチル）１０重量部。この処方は、ポリスルフィドのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５７】
代表的なポリウレタンのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（ジイソシアネートプレポリマー、ジフェニルメタンジイソシアネート当量＝１２７２）５０〜６０重量％、充填剤（カーボンブラックなど）４０〜５０重量％、シリカ２〜４重量％、溶媒（トルエン）。ポリウレタンのシーリング材は、任意の紫外線吸収剤、酸化防止剤、難燃剤、充填剤および顔料を含んでもよい。この処方は、ポリウレタンのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５８】
代表的なブチル系ポリマーのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（イソブチレン、ポリブテン）４０〜４５重量％、充填剤（クレイ、シリカ、炭酸カルシウム、カーボンブラック）３０〜４０重量％、顔料（二酸化チタン、酸化亜鉛）２〜４重量％、粘着付与剤（ロジン−ペンタエリスリトールエステル）０．５〜１．０重量％、粘調剤（繊維）１０重量％、溶媒（シクロヘキサン）。この処方は、ポリウレタンのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００５９】
代表的なアクリル系ポリマーのシーリング材の処方は、以下の通りである：ラテックスアクリルポリマー３０〜４０重量％、充填剤（炭酸カルシウム、アルミニウム、シリカ、タルク）３０〜４５重量％、顔料（二酸化チタン）１．０〜１．５重量％、界面活性剤１．０〜１．５重量％、凝固点降下剤（エチレングリコール）２０〜２５重量％、可塑剤７〜８重量％、チキソトロープ剤１〜２重量％、無機アルコール０．２重量％。アクリル系ポリマーのシーリング材は、任意の酸化防止剤、紫外線吸収剤および防カビ剤を含んでもよい。この処方は、アクリル系ポリマーのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００６０】
代表的なクロロスルホン化ポリエチレンのシーリング材の処方は、以下の通りである：主成分（クロロスルホン化ポリエチレン）１５〜２０重量％、塩化パラフィン１５〜２０重量％、充填剤１５〜２０重量％、顔料１０〜１５重量％、酸化物触媒（鉛酸化物）６〜８重量％、可塑剤（フタル酸ジブチル）１５〜２０重量％、溶媒（イソプロピルアルコール）４〜５重量％。この処方は、クロロスルホン化ポリエチレンのシーリング材のほんの一例に過ぎず、これに限定されない。
【００６１】
本発明の方法によれば、カバーガラスの辺縁部のシーリング材によるコートは、液体の漏れない容器中にシリコーンアルコール溶液を５ｍｍ程度の深さで注ぎ、その壁にカバーガラスを立てかけることにより行われる。１辺のコートに必要な時間は１分程度であるが、コートの効率により時間の延長、短縮が可能である。１辺のコートが終了した後に、カバーガラスを９０度回転させて別の辺を容器に浸す。この操作を繰り返すことで、カバーガラスの４辺に５ｍｍ程度の幅でシリコーンコートがなされる。滅菌されたカバーガラスが必要な場合は、シリコーンコートを施した後に，乾熱滅菌することが可能である。
【００６２】
本発明によれば、好ましくは、下部材の片面にプライマーをコートし、この片面に、カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部をシーリング材で接着して試料を密封する方法がとられる。
【００６３】
本明細書において、下部材に塗布する「プライマー」とは、シーリング材の密着力をさらに高めるための高分子物質をいう。プライマーとしては、ウレタン結合（ＮＨＣＯＯ）を主鎖とする高分子溶液が好ましく、ポリウレタン溶液がより好ましい。このポリウレタン溶液として、ポリウレタンのシーリング材またはウレタン樹脂溶液がさらに好ましく、ウレタン樹脂／酢酸エチル溶液が特に有効に利用し得る。
【００６４】
本明細書において、「流動式チャンバー」とは、細胞などを生きたまま長時間保持するために、流体を逐次交換可能でかつ流動や還流が可能な形状のチャンバー、または流体を適宜添加可能な形状の全てのチャンバーをいう。「流体」とは、顕微鏡観察が可能な程度に光透過性であり、かつ水をベースとする任意の水溶液、水性懸濁液、水分散体、水中油エマルジョン、水和したゲル状物などをいう。例えば、流体には、培地または薬剤の溶液が挙げられる。
【００６５】
カバーガラスを迅速に強固に下部材に接着させるためには、カバーガラスの辺縁を「シーリング材」でコートすること、さらにカバーガラスを密着させる下部材部には「プライマー」が塗布されていることが好ましい。
【００６６】
下部材へのウレタン樹脂の塗布に先立ち、試料を密封する空間を確保するため、「透明基板」または「透明基板を備える流動式チャンバー」に、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有し厚みを有する「包囲部」が貼り付けられる。「包囲部」は、試料保持領域（または、観察窓ともいう）に充填される試料をはじくような疎水性ポリマー材料であることが好ましい。
【００６７】
本明細書における、「透明基板」は、光学的に透明なガラス基板またはアクリル基板などをいい、好ましくは、スライドガラスである。
【００６８】
包囲部を透明基板または透明基板を備える流動式チャンバーに貼り付ける際には、流体と化学反応をおこさない任意のシール材または接着剤が使用され得る。包囲部としてさらに好ましい例として、少なくとも片面に貼付け剤を有するテープ材が挙げられ、最も好ましくは、市販のビニールテープである。
【００６９】
テープ材を用いて試料保持領域（または、観察窓）を形成する例は、以下の通りである。まず、スライドガラスなどの上にビニールテープ（厚さ０．１ｍｍ程度）を貼る。ビニールテープ上にウレタン樹脂／酢酸エチル溶液を塗布した後、２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラスを使用する場合には、ビニールテープの中央部を１８ｍｍ×１８ｍｍの大きさにくり貫き、試料保持領域（または、観察窓）とする。
【００７０】
観察する試料が、カバーガラス上に接着している試料の場合、例えば接着性の培養細胞などの場合には、観察窓に試料に応じた培地などを添加し、細胞が接着しているシリコーンコート処理を施したカバーガラスを、細胞が観察窓の内部にくるように伏せ、ウレタン樹脂が硬化する前にカバーガラスの縁を押し付け、シリコーンとウレタン樹脂を密着させプレパラートを作製する。このシリコーンとウレタン樹脂の組み合わせによる作製方法を、本明細書以下、「シリコーン／ウレタン樹脂法」とする。
【００７１】
観察する試料が、浮遊性の場合には、試料懸濁液を観察窓に満たし、シリコーン処理を施したカバーガラスをウレタン樹脂が硬化する前に下部材に伏せ、カバーガラスの縁を押し付け、シリコーンとウレタン樹脂を密着させプレパラートを作製する。
【００７２】
観察する試料が、組織などの場合、観察窓に試料を設置すると共に適当な溶液で満たし、シリコーン処理を施したカバーガラスをウレタン樹脂が硬化する前に下部材に伏せ、カバーガラスの縁を押し付け、シリコーンとウレタン樹脂を密着させプレパラートを作製する。
【００７３】
シリコーンは疎水性と柔軟性を有するので、カバーガラスを押し付けると接着部位では液体がはじき出されると共に吸盤作用が生じて密着性が高まるものと考えられる。さらに、縁をシリコーンコートしたカバーガラスを硬化前のウレタン樹脂表面に押し付けると、接着面ではウレタン樹脂のシリコーンへの高い親和性とシリコーンの持つ疎水性とが同時に発揮され、水を押し出しながら両者が強く結合してゆくものと考えられる。
【００７４】
生きた細胞の長時間観察のためには、細胞の温度管理と細胞の代謝に伴う培地成分の変動を防ぐため、培地を逐次新鮮なものに交換する必要がある。また、生細胞の高解像度観察は、細胞の刺激に対する反応を観察する目的で行われる場合が多い。そのためには、試料を顕微鏡上から移動することなく顕微鏡上の細胞を封入した空間内に、必要に応じた量の薬剤などが添加されることが求められる。
【００７５】
培地交換、薬剤添加など、いずれの目的においても顕微鏡ステージ上における培地などの流動が可能なチャンバーが必要であるが、チャンバーを利用したプレパラートにもカバーガラスを密着する工程が含まれることから、迅速で強固な密着を可能とし、かつ、目的の培地の流動などが簡便に行われる必要がある。
【００７６】
実際に、培地などの交換、還流、添加が可能であるチャンバーを利用した高解像度観察に、本発明によるカバーガラスを下部材に密着させる方法を利用しようとする場合、従来の培地などの交換、還流、添加が可能であるチャンバーでは機能を発揮し得ない。
【００７７】
本発明によれば、シリコーン／ウレタン樹脂法の発明により、本発明と組み合せることにより効力を発する新様式の流体（培地など）の交換、還流、添加、さらに温度制御が可能である、流動式チャンバーを提供することができる。
【００７８】
以下、流動式チャンバーの構成の一例を示すが、これは単なる例示に過ぎない。例えば、流動式チャンバーは、温度制御が可能な倒立顕微鏡ステージ上にセットして用いる流体の流動式タイプとして組み立てられる。そのため、ステージと直接接触する部分には比較的熱伝導の良いガラス基板（スライドガラスなど）を用い、その上にアクリル樹脂で囲われた流体プール、並びに流体吸引ノズルを組み立てた（図３）。流体を供給および保持するための「リザーバ」は、顕微鏡光路への干渉と流体への熱伝導性とを考慮して、丈が低くかつ広い形状が好ましい。流体（例えば、新鮮な培地など）は、チャンバーの上面に溜め置かれるが、観察対象である試料はチャンバーの下面（対物レンズ側）にセットされるので、ガラス基板には、厚み方向に貫通する少なくとも２つの孔が設けられる。例えば、ガラス基板には、第１の孔および第２の孔が設けられ、それぞれ流体の流入および吸出しの役割を担う。第１の孔はリザーバと連通し、第２の孔はチャンバーと連通している。流入穴および吸出し穴の直径は、流体の種類、粘度および流体中に存在する微粒子の直径に応じて、適宜選択され得る。例えば、組織を含む培地の場合には、直径１．５ｍｍ程度が好ましい。
【００７９】
流体吸出しノズル（図３参照）より延びるチューブの遠位端にポンプを取り付けて流体をゆっくりと吸引すると、観察窓には、一定の温度に保たれた流体（例えば、新鮮で培養温度に保温された培地）がプールから供給される。またプールの流体流入口近くに、マイクロピペットで任意の薬剤を添加すれば、流体の流れに乗って薬剤はすぐさま細胞に投与されることになる。
【００８０】
このような仕組みにより、組織を含む培地の観察の場合、流動式チャンバーでは、高解像度の対物レンズがセットされた顕微鏡ステージ上において、培養温度を維持しながら培地の鮮度を保つことができる。また細胞への薬物等の投与・洗浄も顕微鏡上で自在に行うことができる。
【００８１】
本発明のチャンバーに、シリコーン／ウレタン樹脂法により迅速、かつ強固にカバーガラスを密着させることにより、生きた細胞の高解像度継続観察が可能になる。また、細胞の刺激に対する瞬時から長期に及ぶ反応を高解像度で観察することも可能となる。
【００８２】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳しく解説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１：接着強度試験）
本実施例では、シリコーン処理を施したカバーガラスと、ウレタン樹脂処理を施した下部材であるスライドガラスの接着強度を検討した。本実施例に使用したカバーガラスおよびスライドガラスは、従来の方法（井上（１９９８）、新版 顕微鏡観察シリーズ▲１▼ 顕微鏡観察の基本：１２４−１２７［非特許文献２］）を用いて洗浄、保存したものである。
【００８４】
１．１． カバーガラスのシリコーン処理
液体の漏れない容器中に５ｍｍ程度の深さでシリコーン−アルコール溶液を注ぎ、その壁に２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラスを立てかけた。この状態で１分間放置した後、カバーガラスを９０度回転させて別の辺を溶液に浸しさらに１分放置した。この操作を繰り返すことで、カバーガラスの４辺に５ｍｍ程度の幅でシリコーンコートを施した（図１ａ）。
【００８５】
１．２． スライドガラスのウレタン樹脂処理
薄い層の蒸留水をプレパラート内に密閉するため、スライドガラスの上にビニールテープ（厚さ０．１ｍｍ）を貼り、ビニールテープ上にウレタン樹脂溶液（コニシ株式会社製、シールプライマー）を塗布した。さらにテープの中央部を１８ｍｍ角の大きさでくり貫いて容器を作製した（図１ｂ）。
【００８６】
１．３． カバーガラスのスライドガラスへの密着
テープをくり抜いた穴に十分な量（１００ｕｌ）の赤い色素で着色した蒸留水を満たし、上からカバーガラスを被せた（図２参照）。カバーガラスの接着にあたっては、何も処理を施さない対照区と、縁にシリコーンコートのみを施した場合、およびシリコーンとウレタン樹脂処理とを施した場合を用意し、その接着の強度を比較した。
【００８７】
１．４． 接着強度の評価
接着強度の評価は、カバーガラス表面の中央付近に瞬間接着剤で糸を取り付け、その端に所定の重さの分銅を括り付けたうえ、プレパラートを垂直に立てて接着部に加重することで行った（図２）。
【００８８】
コート無しの場合（図２ａ）、１０ｇ重の力で１分以内にカバーガラスにズレが生じ液体が漏れ、さらに５分後には完全に脱落した。
【００８９】
シリコーンコートを施した場合（図２ｂ）は、１０ｇ重の力に対して１分では不動であったが、５分後には結局脱落した。
【００９０】
シリコーン／ウレタン樹脂処理を施した場合（図２ｃ）には、２０ｇ重の力を３０分間かけてもカバーガラスは全くずれず、さらに封入した液体の漏れや蒸発も無かった。接着の速さに関しても、シリコーン／ウレタン樹脂処理の場合は両者が接触した瞬間に密着した。
【００９１】
以上のことから、カバーガラスのシリコーンコートでは、ある程度の密着性の向上が見られるが、これだけでは油浸式対物レンズを使用する際の問題を全て解決することにはならず、これにウレタン樹脂の方法を追加することで、迅速で強固な密封が可能であることが明らかとなった。
【００９２】
（実施例２：生きた動物培養細胞の油浸式対物レンズによる高解像度撮影）
本実施例では動物の細胞レベルでの研究に一般的に用いられているチャイニーズハムスターの卵巣由来の培養細胞（ＣＨＯ−Ｋ１，Ｒｉｋｅｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を用いて、顕微鏡上で細胞の生理条件を維持したまま、油浸式対物レンズを用いて生細胞の高解像度顕微鏡撮影を行った。
【００９３】
２．１． チャンバー作製
細胞を顕微鏡上の小さな密閉容器内で生きたまま長時間保持するためには、温度を３７度程度に保つことが必要である他に、酸性老廃物の細胞外排出による培地の酸性化などを防ぐため、培地を逐次新鮮なものに交換する必要がある。
【００９４】
そこで本実施例では、図３に示すような流動式チャンバーを作製した。チャンバーは、スライドガラスを基板としている。チャンバーには下面の中央に２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラスを接着する観察窓が設けられており（図３ｂ）、ここに観察対象となる生物を入れ、カバーガラスを密着させることにより観察が可能となる。
【００９５】
付着性の培養細胞などの場合には、辺縁部にシリコーン処理を施したカバーガラス上に培養し、この観察窓にカバーガラスを密着させることにより、生きた状態での継続的な高解像度顕微鏡観察が可能となる。培地などの添加を可能とするためアクリル材で細工したプール、吸引ノズルなどが装着されている。実際の培地の流動や、薬剤の添加は、吸引ノズルを（低速で安定した速度での吸引が可能な）吸引ポンプへ接続することにより行われる。アクリル材で囲まれたプール上に目的の溶液を添加し、吸引の開始、並びに吸引速度の制御は全て吸引ポンプによって行われる。
【００９６】
２．２． 観察窓の作製
上記チャンバー下面にビニールテープを貼り、さらにウレタン樹脂を塗布した後、カバーガラスを接着した際に実際に観察する部分に相当する範囲のビニールテープを切り取り、観察窓を作製した。別にシリコーン処理を施した２４ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラス上にＣＨＯ細胞を培養し、観察試料を準備した。
【００９７】
２．３． カバーガラスのチャンバーへの装着
観察窓に培地を満たした後、シリコーン処理を施したカバーガラス上に培養したＣＨＯ細胞が接着しているカバーガラスを細胞が培地に接するようにカバーガラスを観察窓に伏せ、辺縁部を下部材に押し付けることによりカバーガラスの装着が完了する。カバーガラスを装着することにより、培地の流動も可能となる。
【００９８】
２．４． 接着強度の比較
チャンバー内部には培地流動による水圧が負荷されるため（図３ｃ）、カバーバラスを固定する際には強固な接着力が求められる。そこでプレパラート作製時のカバーガラスの固定方法として、周囲をマニュキアで塗り固める従来の方法（ａ）と、本発明のシリコーン／ウレタン樹脂による接着法（ｂ）を試みた。それぞれの方法で作製したプレパラートについて、実際に油浸式対物レンズを用いての細胞の観察を行い、両者の実用上の差異を比較検討した。
【００９９】
その結果、シリコーン／ウレタン樹脂法では、２時間の連続観察を行っても培地が漏れ出すことはなかった。
【０１００】
２．５． 細胞観察
従来のカバーガラスの周囲をマニュキアで塗り固める方法（ａ）では、マニュキアが乾くのに要する時間などで、プレパラートの作製に５―６分程度の時間を要した（図４ａ）。その間、試料は室温に晒されるため、観察された細胞には著しい収縮が見られた。すなわち、従来の方法では、細胞の輪郭は丸まって楕円状になり、また細胞の周辺部には収縮により形成される小胞（白い矢頭で示した）がブドウの房状に多数観察された。また観察を続けると概ね２０〜３０分でチェンバー内の培地がカバーガラスの接着部から漏れ出す現象が見られ、この方法では長時間の連続観察には耐えなかった。
【０１０１】
一方、本発明のシリコーン／ウレタン樹脂による接着法（ｂ）では、プレパラートを２分以内に作製することができた。室温に晒される時間が短いため、細胞は収縮せずに紡錘形を保つか、さらに薄く伸展して三角形を呈した（図４ｂ）。これは細胞が極めて健康な状態を保っていることを示している。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明によれば、光学顕微鏡観察用プレパラートのカバーガラスの下部材への密着性の不十分さに起因する全ての問題が、簡便かつ迅速に解決され、光学顕微鏡による高解像度の長時間観察が可能となる。さらに、本発明の流動式チャンバーを使用することにより、例えば、培養細胞、固定化細胞、微生物、または動植物の組織などの生きた試料の刺激などに対する瞬時から長期に及ぶ反応の継続的な観察が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（ａ）本発明のカバーガラスの四辺に対するシリコーンコーティング、および（ｂ）本発明の光学顕微鏡用プレパラートを示す図である。
【図２】図２は、（ａ）全く処理を施していないカバーガラス、（ｂ）シリコーンコーティングしたカバーガラス、（ｃ）シリコーンコート＋ウレタン樹脂で処理したカバーガラスの接着強度を評価した比較実験結果を示す図である。
【図３】図３は、（ａ）流動式チャンバーの斜視図、（ｂ）流動式チャンバーの上面図、および（ｃ）流動式チャンバーの側面図を示す図である。
【図４】図４は、（ａ）従来のマニュキア法により作製したプレパラート、（ｂ）本発明の方法（シリコーン／ウレタン樹脂法）により作製したプレパラート、について撮影したチャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞の写真の比較を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates generally to microscope preparations and methods for making the same. More specifically, the present invention relates to a method for producing a slide for an optical microscope in which a sample is enclosed by bonding a cover glass, which is essential for observation with a high-resolution oil-immersion objective lens, to a transparent optical substrate with a sealing material.
[0002]
[Prior art]
When observing a sample using an optical microscope, especially when observing a biological sample that contains a large amount of water or is immersed in water, such as cells, microorganisms, or animal and plant tissues, prevent evaporation of water and prevent spherical aberration of the objective lens. It is common practice to cover the sample with a standard cover glass or the like having a thickness of 0.17 mm in order to adapt the sample. Particularly, in the case of a high-magnification / high-resolution objective lens, it is necessary to fill the gap between the sample and the lens with oil having the same refractive index as glass (n ≒ 1.52) in order to increase the numerical aperture of the lens. It is essential to cover the sample with a cover glass having a thickness of about 0.17 mm in order to prevent contact between the sample and oil and secure a working distance suitable for the lens (Non-Patent Document 1).
[0003]
When enclosing the sample, a sample containing water is placed on a lower member of a light-transmitting (slide glass, acrylic plate, etc.), and the sample is sandwiched by covering the sample with a cover glass. In addition, such an enclosed sample is hereinafter referred to as a preparation. For a sample that can be embedded in resin, such as a sample that has been fixed and dehydrated, the sample can be enclosed in a preparation with a special adhesive such as Canadian balsam, so the adhesive is hardened over a long time. The cover glass is firmly fixed.
[0004]
However, for samples that cannot be embedded in resin, such as when observing living cells or microorganisms, the conventional cover glass is simply placed on top of the sample and attached by the surface tension of water, or placed around the cover glass. Adhesion has been performed by applying a method such as sealing with manicure or paraffin, or covering the sample with petrolatum and covering the sample with a cover glass, thereby fixing the cover glass without crushing the sample. Non-patent document 2).
[0005]
If it is necessary to continuously observe living cells or change the culture medium, attach vinyl tape or the like to the lower member, open an observation window smaller than the cover glass with a razor, etc., and mount a table with a thickness of about 0.1 mm. At the same time, prepare a notch at both ends of the window for liquid exchange. The observation window is filled with the solution, a cover glass is put on the observation window, and the periphery is fixed with manicure or the like. When performing liquid exchange, a method of placing a piece of filter paper on one side of the cut and dropping the liquid to be exchanged on the other side with a pipette or the like has been adopted (Non-Patent Document 3).
[0006]
If it is necessary to observe living cells for a long period of time, a special culture chamber (Dvorak Chamber manufactured by Lucas-Highland 1) that allows the flow of the culture medium or a self-made chamber is mounted on the microscope stage. However, a method of sequentially supplying a medium has been adopted.
[0007]
In addition, temperature control is also an important factor in observing living cells, but methods such as mounting a very large and extremely expensive device on the entire microscope or incorporating a microscope stage capable of controlling the temperature have been adopted. In each case, there was a need to create a chamber for actually placing the sample on it.
[0008]
However, in these methods, since the adhesive strength between the lower member and the cover glass is weak, the following problems often occur, which hinder the use of a high-resolution oil-immersion type objective lens.
[0009]
The oil (high viscosity) that fills the gap between the objective lens and the cover glass causes the cover glass to adhere to the objective lens and separate from the preparation. In particular, this problem is likely to occur when moving the field of view.
[0010]
When observing a biological sample, the observation target is often sealed in a liquid such as a culture medium. However, in the conventional method, since the adhesiveness of the cover glass is low, the liquid gradually evaporates in about several minutes, and as a result, bubbles enter the preparation. This is a major obstacle when observing a single sample for a long time.
[0011]
When observing animal tissues or cultured cells, an inverted microscope in which an objective lens projects upward from below the stage is frequently used. Even when an oil immersion type lens is used in this inverted microscope, it is necessary to set the cover glass so as to come to the lens side (due to restrictions such as the working distance of the objective lens). That is, the cover glass must adhere to the underside of the preparation. In this case, if the adhesion is weak, a liquid such as a culture medium leaks from the preparation and often flows down to the objective lens, which enters the lens or the lens barrel and causes a failure of the microscope.
[0012]
When a chamber that has been crafted with vinyl tape, which is used for observations that require medium exchange, is applied to an inverted microscope, it is necessary to remove the chamber from the microscope stage once at the time of medium exchange, and continuous observation of cells is not possible It is. Further, the above-described problem of liquid leakage is likely to occur.
[0013]
When using a chamber capable of medium flow, Dvorak Chamber manufactured by Lucas-Highland is a device that can be attached to an inverted microscope, but lacks versatility such as the need for a specially shaped cover glass. Device. It also lacked rigor of temperature control and often had a significant effect on cell function.
[0014]
In a conventional method, the general procedure for bonding a cover glass is as follows:
(A) Put a small amount of liquid on a glass slide;
(B) carefully cover the glass so that no air bubbles enter;
(C) absorb liquid leaking around the cover glass with a filter paper or the like;
(D) apply manicure to the margins and wait for it to cure,
(Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3). However, these series of operations require several minutes, during which observation cannot be performed.
[0015]
In a biological sample, a time zone of several seconds or several minutes after the start of enclosing the sample is often an extremely important observation target. For example, to observe changes in the morphology of an egg cell immediately after fertilization, the main reaction is completed within a few minutes after adding sperm to the egg cell. In addition, among cultured cells derived from animal tissues that are usually kept at 37 ° C in an incubator, exposure to room temperature for only a few minutes for encapsulation may lead to cell death through morphological changes such as shrinkage. Have been. Thus, "it takes time to enclose in a preparation" is a major hindrance to high-resolution microscopic observation which requires a cover glass.
[0016]
[Non-patent document 1]
Yoka (1973), Basics of Biological Microscopy: 26-30
[0017]
[Non-patent document 2]
Inoue (1998), new edition Microscopy series (1) Basics of microscopy: 124-127
[0018]
[Non-Patent Document 3]
Inoue (1998), new edition Microscopic observation series (3) Animal microscopic observation: 18-23
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for quickly and firmly adhering a cover glass to a lower member in order to solve the above-mentioned problems. An object of the present invention is to provide a microscope preparation with a flowable chamber of a fluid (such as a culture medium), which enables long-term continuous observation and observation of an instantaneous to long-term response to a stimulus.
[0020]
The present inventors have noticed that the sealing material is used in many applications due to the difference in the structure of the main chain or the side chain, and that the sealing material is applicable to observation of a biological sample. It has been found that a combination of a silicone and a urethane resin solution enables quick and strong adhesion of a cover glass to a lower member.
[0021]
In addition, a microscope slide in a format that allows rapid and strong adhesion of the cover glass to allow continuous observation of the sample for a long period of time and allows the addition of a substance to observe the response of the sample to stimulus. Have been completed, and the present invention has been achieved.
[0022]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides the following.
[0023]
(1) A method for preparing a preparation for an optical microscope, the method comprising:
At least one edge of the cover glass, between the lower member provided with the sample holding region, a step of bonding with at least one type of sealing material,
A method comprising:
[0024]
(2) The bonding step is as follows:
Coating a primer on one side of the lower member; and
On one side coated with the lower member, at least one edge of the cover glass is adhered with a sealing material, and sealed,
The method according to Item (1), comprising:
[0025]
(3) The lower member is a transparent substrate having a sample holding region having an area equal to or smaller than that of the cover glass and having an enclosure surrounding the sample holding region attached thereto, or a flow chamber including the transparent substrate. The method according to 2).
[0026]
(4) The method according to item (3), wherein the surrounding portion is a hydrophobic polymer material.
[0027]
(5) The method according to item (3), wherein the surrounding portion is a tape material.
[0028]
(6) The sealing material is at least one selected from the group consisting of a silicone polymer, a modified silicone polymer, a polysulfide, an acrylic polymer, a polyurethane, a butyl polymer, a chlorosulfonated polyethylene, and a styrene triblock copolymer. The method according to item (1), which is an organic solution containing a mixture of the polymers of
[0029]
(7) The method according to item (1), wherein the sealing material is an organic solution containing a mixture of at least one type of silicone polymer and polyurethane.
[0030]
(8) The method according to item (2), wherein the sealing material is an alcohol solution containing a mixture of at least one silicone-based polymer.
[0031]
(9) The method according to item (2), wherein the primer is an organic solution containing polyurethane.
[0032]
(10) The method according to item (9), wherein the solvent of the organic solution containing the polyurethane is ethyl acetate.
[0033]
(11) The method according to item (2), wherein the sealing material is an alcohol solution containing a mixture of at least one silicone-based polymer, and the primer is an ethyl acetate solution containing polyurethane.
[0034]
(12) the flow-type chamber includes a reservoir having a fluid pool and a nozzle disposed on the transparent substrate;
[0035]
(13) The method according to item (3), wherein the transparent substrate is a glass substrate or an acrylic substrate.
[0036]
(14) The method according to item (1), wherein the sample is a living cell, an immobilized cell, a microorganism, or an animal or plant tissue.
[0037]
(15) A preparation for an optical microscope, comprising:
Transparent substrate;
An enclosure attached to the top surface of the transparent substrate and having a sample holding area equal to or smaller than the cover glass;
A sample held in the sample holding area; and
A cover glass adhered to the upper surface of the enclosure by a sealing material,
A prepared slide.
[0038]
(16) A kit for preparing a preparation for an optical microscope,
Transparent substrate;
An enclosure having a sample holding area with an area equal to or smaller than the cover glass for attaching to the upper surface of the transparent substrate; and
A sealing material for bonding a cover glass to the upper surface of the enclosure,
A kit comprising:
[0039]
(17) The kit according to (16), further comprising a sample to be observed.
[0040]
(18) The kit according to item (16), wherein the surrounding portion is a tape material.
[0041]
(19) The sealing material is at least one selected from the group consisting of a silicone polymer, a modified silicone polymer, a polysulfide, an acrylic polymer, a polyurethane, a butyl polymer, a chlorosulfonated polyethylene, and a styrene triblock copolymer. The kit according to item (16), which is an organic solution containing a mixture of the above polymers.
[0042]
(20) A preparation for an optical microscope, comprising:
A fluid flow chamber, comprising:
A transparent substrate having a first hole and a second hole;
A reservoir disposed on a top surface of the transparent substrate; and
A nozzle arranged on the upper surface of the transparent substrate,
A chamber having a first aperture in communication with the reservoir and a second aperture in communication with the nozzle;
An enclosure attached to the lower surface of the transparent substrate and having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass;
A cover glass adhered to the lower surface of the surrounding part by a sealing material,
A prepared slide.
[0043]
(21) The preparation according to (20), wherein the reservoir is mountable on a temperature variable device.
[0044]
(22) A kit for preparing a preparation for an optical microscope, comprising:
A transparent substrate having a first hole and a second hole;
A reservoir communicating with the first hole;
A nozzle communicating with the second hole;
An enclosure attached to the transparent substrate and having a sample holding area equal to or smaller than the cover glass; and
Sealing material for bonding the cover glass to the surrounding area,
A kit comprising:
[0045]
(23) The kit according to (22), further comprising a sample to be observed.
[0046]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. It is to be understood that the terms used herein are commonly used in the art unless otherwise specified.
[0047]
According to the present invention, there is provided a method for preparing a preparation for an optical microscope for observing a sample such as a living cell. The manufacturing method of the present invention includes a step of bonding at least one side edge of the cover glass and the lower member with at least one sealing material.
[0048]
In the present specification, the “sample” may be anything as long as it can be a target to be observed, and includes, for example, cultured cells, fixed cells, microorganisms, or tissues of animals and plants, and an aqueous solution or aqueous solution of these tissues. Suspensions, aqueous dispersions, oil-in-water emulsions, hydrated gels and the like are also included in the sample.
[0049]
In this specification, the “preparation” is a structure composed of a light-transmissive lower member (a glass substrate, an acrylic substrate, or the like) and a cover glass that covers the lower member. A structure in which a sample can be sealed in a space. Here, the sample may or may not enter the space between the lower member and the cover glass.
[0050]
In the present specification, “cover glass” refers to a commercially available cover glass having a refractive index of about 1.52 and a thickness of 0.17 mm ± 0.02 mm, which is usually used in a size of 18 × 18 mm, 18 × 24 mm, 24 × 24 mm, 24 × 40 mm and essentially any size and shape (which may be circular) may be used as long as the optical field of view is not affected. In this specification, the “edge of the cover glass” refers to an area having a width of about 5 mm on each side of the cover glass.
[0051]
In the present specification, the “lower member” refers to a “transparent substrate” or a flowable chamber provided with a “transparent substrate” that is optically transparent to the extent that microscopic observation is possible. The lower member generally includes a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass. Examples of the lower member include a glass substrate such as a microscope slide glass and an acrylic substrate. Here, “optically transparent” means that it is transparent to electromagnetic waves in at least a range used for an optical microscope in natural light or artificial light.
[0052]
As used herein, "sealing material" is used for the purpose of protection from an exposed environment, and all construction, repair sealing materials (amorphous sealing material), and caulking that prevent the transmission of gas, liquid, and solid particles. Refers to a formulation containing ingredients. Generally, sealing materials are used for high performance sealing materials (25% + good recovery about 80% against displacement of joints) used for sealing of building exteriors, building interiors, general home building and repair. It is roughly classified into a medium-performance sealing material (adapted to a displacement of 10 to 25%) and a low-performance sealing material. It is enough.
[0053]
Examples of the sealing material in the present specification include a silicone polymer, a modified silicone polymer, a polysulfide, an acrylic polymer, a polyurethane, a butyl polymer, a chlorosulfonated polyethylene, and a styrene triblock copolymer.
[0054]
According to the present invention, since a cell or the like comes into direct contact with the cover glass, a polymer solution having a siloxane bond (Si—O) as a main chain that has little effect on the cell or the like is preferable as an appropriate sealing material. A system sealing material is more preferred. Silicone alcohol solutions are particularly preferred. Examples of the alcohol as the solvent include methanol, ethanol, isopropyl alcohol, and n-butanol.
[0055]
A typical silicone polymer sealant formulation is as follows: 80-85% by weight of the main component (polydimethylsiloxane diol), 5-7% by weight of the crosslinking agent, catalyst (curing acceleration, tin carboxylate or Titanate ester) 0.05 to 0.10%, filler (silica, carbon black, glass microballoon) 6 to 10% by weight, plasticizer (non-reactive silicone fluid) 0 to 10% by weight. The silicone-based polymer sealant may include any flame retardants, germicides, adhesion promoters, pigments and thickeners. This formulation is only one example of a silicone-based polymer sealant and is not limiting.
[0056]
A typical polysulfide sealant formulation is as follows: 15-60% by weight of the main component (LP (thiochol) blend), 30-60% by weight of the filler (calcium carbonate), 10 of the pigment (titanium dioxide). Less than 10% by weight, less than 10% by weight of an adhesion promoter (silane, titanate), less than 10% by weight of an antioxidant (phenyl-2-naphthylamine), 10% by weight of an accelerator (p-quinonedioxime, diphenylgranidine) Less than 10% by weight of a thixotropic agent (Cabosil, Ircogel), less than 10% by weight of a retarder (stearic acid, stearic acid ester), and less than 10% by weight of a solvent (toluene, methyl ethyl ketone) based on 100 parts by weight of the base compound. , Catalyst (magnesium dioxide, dibutyl phthalate) 10 parts by weight. This formulation is only one example of a polysulfide sealant and is not limiting.
[0057]
A typical polyurethane sealant formulation is as follows: 50-60% by weight of main components (diisocyanate prepolymer, diphenylmethane diisocyanate equivalent = 1272), 40-50% by weight of filler (such as carbon black), silica 2-4% by weight, solvent (toluene). The polyurethane sealant may include any UV absorbers, antioxidants, flame retardants, fillers and pigments. This formulation is only one example of a polyurethane sealant and is not limiting.
[0058]
A typical butyl polymer sealing material formulation is as follows: 40-45% by weight of main component (isobutylene, polybutene), 30-40% by weight of filler (clay, silica, calcium carbonate, carbon black). 2 to 4% by weight of a pigment (titanium dioxide, zinc oxide), 0.5 to 1.0% by weight of a tackifier (rosin-pentaerythritol ester), 10% by weight of a viscosity modifier (fiber), and a solvent (cyclohexane). This formulation is only one example of a polyurethane sealant and is not limiting.
[0059]
A typical acrylic polymer sealant formulation is as follows: 30-40% by weight latex acrylic polymer, 30-45% by weight filler (calcium carbonate, aluminum, silica, talc), pigment (titanium dioxide) ) 1.0-1.5% by weight, surfactant 1.0-1.5% by weight, freezing point depressant (ethylene glycol) 20-25% by weight, plasticizer 7-8% by weight, thixotropic agent 1-2 Wt%, inorganic alcohol 0.2 wt%. The acrylic polymer sealant may include any antioxidants, UV absorbers and fungicides. This formulation is only one example of an acrylic polymer sealant and is not limiting.
[0060]
A typical chlorosulfonated polyethylene sealant formulation is as follows: 15-20% by weight of the main component (chlorosulfonated polyethylene), 15-20% by weight of paraffin chloride, 15-20% by weight of a filler, Pigment 10-15% by weight, oxide catalyst (lead oxide) 6-8% by weight, plasticizer (dibutyl phthalate) 15-20% by weight, solvent (isopropyl alcohol) 4-5% by weight. This formulation is only one example of a chlorosulfonated polyethylene sealant and is not limiting.
[0061]
According to the method of the present invention, the peripheral portion of the cover glass is coated with the sealing material by pouring the silicone alcohol solution into a liquid-tight container at a depth of about 5 mm and leaning the cover glass against the wall. Is The time required for a coat on one side is about one minute, but the time can be extended or shortened depending on the efficiency of the coat. After the coating on one side is completed, the cover glass is rotated 90 degrees and the other side is immersed in the container. By repeating this operation, a silicone coat is formed on four sides of the cover glass with a width of about 5 mm. If a sterilized cover glass is required, it can be dry-heat sterilized after applying a silicone coat.
[0062]
According to the present invention, a method is preferably adopted in which a primer is coated on one surface of the lower member, and at least one edge of the cover glass is adhered to this one surface with a sealing material to seal the sample.
[0063]
In this specification, the “primer” applied to the lower member refers to a polymer substance for further increasing the adhesion of the sealing material. As the primer, a polymer solution having a urethane bond (NHCOO) as a main chain is preferable, and a polyurethane solution is more preferable. As the polyurethane solution, a polyurethane sealing material or a urethane resin solution is more preferable, and a urethane resin / ethyl acetate solution can be particularly effectively used.
[0064]
As used herein, the term "flow-type chamber" refers to a chamber capable of sequentially exchanging fluids and capable of flowing or refluxing, or a fluid to which a fluid can be appropriately added in order to keep cells and the like alive for a long time. Refers to all chambers in shape. "Fluid" refers to any water-based aqueous solution, aqueous suspension, water dispersion, oil-in-water emulsion, hydrated gel, etc. Say. For example, fluids include media or solutions of drugs.
[0065]
In order to quickly and firmly adhere the cover glass to the lower member, the edge of the cover glass is coated with a "sealing material", and furthermore, a "primer" is applied to the lower member portion which adheres the cover glass. Is preferred.
[0066]
Prior to applying the urethane resin to the lower member, a sample holding area having an area equal to or smaller than the cover glass is provided on the `` transparent substrate '' or `` flowable chamber with a transparent substrate '' in order to secure a space for sealing the sample. The “enclosing portion” having a thickness is attached. The "enclosure" is preferably a hydrophobic polymer material that repels a sample filled in a sample holding area (or an observation window).
[0067]
In the present specification, the “transparent substrate” refers to an optically transparent glass substrate, an acrylic substrate, or the like, and is preferably a slide glass.
[0068]
When attaching the surrounding portion to the transparent substrate or the flowable chamber including the transparent substrate, any sealing material or adhesive that does not cause a chemical reaction with the fluid can be used. More preferred examples of the surrounding portion include a tape material having an adhesive on at least one surface, and most preferably a commercially available vinyl tape.
[0069]
An example of forming a sample holding area (or an observation window) using a tape material is as follows. First, a vinyl tape (about 0.1 mm thick) is stuck on a slide glass or the like. After applying the urethane resin / ethyl acetate solution on the vinyl tape, when using a cover glass of 24 mm × 24 mm, the center of the vinyl tape is pierced to a size of 18 mm × 18 mm, and the sample holding area (or, Observation window).
[0070]
When the sample to be observed is a sample adhered on a cover glass, for example, in the case of adhesive cultured cells, a medium or the like corresponding to the sample is added to the observation window, and a silicone coat to which the cells adhere is added. The treated cover glass is laid down so that the cells come inside the observation window, the edge of the cover glass is pressed before the urethane resin hardens, and the silicone and the urethane resin adhere to each other to prepare a preparation. This method for producing a combination of silicone and urethane resin is hereinafter referred to as “silicone / urethane resin method”.
[0071]
If the sample to be observed is floating, fill the observation window with the sample suspension, lay the silicone-covered cover glass down on the lower member before the urethane resin hardens, press the edge of the cover glass, And a urethane resin are adhered to each other to prepare a preparation.
[0072]
If the sample to be observed is a tissue, place the sample in the observation window, fill it with an appropriate solution, and lower the silicone-treated cover glass against the lower member before the urethane resin cures, and press the edge of the cover glass. Then, a silicone and urethane resin are adhered to each other to prepare a preparation.
[0073]
Since silicone has hydrophobicity and flexibility, it is considered that when the cover glass is pressed, the liquid is repelled at the bonding site and a sucker action is generated to increase the adhesion. Furthermore, when the cover glass whose edge is coated with silicone is pressed against the urethane resin surface before curing, the high affinity of the urethane resin to the silicone and the hydrophobicity of the silicone are simultaneously exerted on the adhesive surface. It is thought to be strongly coupled.
[0074]
For long-term observation of living cells, it is necessary to sequentially replace the medium with fresh ones in order to control the temperature of the cells and prevent fluctuations in the medium components accompanying the metabolism of the cells. In addition, high-resolution observation of living cells is often performed for the purpose of observing the response of cells to stimulation. For that purpose, it is required that a necessary amount of a drug or the like be added to the space in which cells are sealed on the microscope without moving the sample from the microscope.
[0075]
For any purpose such as medium exchange and drug addition, a chamber that allows the flow of medium and the like on the microscope stage is required.However, since the preparation using the chamber also includes the step of closely attaching the cover glass, rapid preparation is possible. Therefore, it is necessary to enable strong adhesion and to easily carry out the flow of the target medium.
[0076]
Actually, medium exchange, reflux, high-resolution observation using a chamber in which addition is possible, when trying to use the method of contacting the cover glass to the lower member according to the present invention, conventional medium exchange, etc. The function cannot be exhibited in a chamber in which reflux and addition are possible.
[0077]
According to the present invention, the invention of the silicone / urethane resin method enables the exchange, reflux, addition, and further temperature control of a new type of fluid (such as a medium) which is effective when combined with the present invention, and a flow type. A chamber can be provided.
[0078]
Hereinafter, an example of the configuration of the flow chamber will be described, but this is merely an example. For example, the flow chamber is assembled as a flow type of a fluid used by being set on an inverted microscope stage capable of controlling the temperature. For this reason, a glass substrate (such as a slide glass) having relatively good heat conductivity was used for a portion directly in contact with the stage, and a fluid pool surrounded by an acrylic resin and a fluid suction nozzle were assembled thereon (FIG. 3). The “reservoir” for supplying and holding the fluid preferably has a low length and a wide shape in consideration of interference with the microscope optical path and thermal conductivity to the fluid. The fluid (for example, fresh medium) is stored on the upper surface of the chamber, but the sample to be observed is set on the lower surface (the objective lens side) of the chamber, and penetrates the glass substrate in the thickness direction. At least two holes are provided. For example, a first hole and a second hole are provided in a glass substrate, and play a role of inflow and suction of a fluid, respectively. The first hole is in communication with the reservoir and the second hole is in communication with the chamber. The diameters of the inflow hole and the suction hole can be appropriately selected according to the type and viscosity of the fluid and the diameter of the fine particles present in the fluid. For example, in the case of a culture medium containing a tissue, the diameter is preferably about 1.5 mm.
[0079]
When a pump is attached to the distal end of the tube extending from the fluid suction nozzle (see FIG. 3) and the fluid is slowly sucked, the observation window shows a fluid maintained at a constant temperature (for example, fresh and kept at the culture temperature). Medium) is supplied from the pool. In addition, if an arbitrary drug is added by a micropipette near the fluid inlet of the pool, the drug will be immediately administered to the cells along with the flow of the fluid.
[0080]
With such a mechanism, in the case of observation of a culture medium containing a tissue, in a flow chamber, freshness of the culture medium can be maintained while maintaining the culture temperature on a microscope stage on which a high-resolution objective lens is set. In addition, administration and washing of a drug or the like to cells can be freely performed on a microscope.
[0081]
By rapidly and firmly attaching the cover glass to the chamber of the present invention by the silicone / urethane resin method, high-resolution continuous observation of living cells becomes possible. In addition, it is possible to observe a response from a moment to a long term to a cell stimulation with high resolution.
[0082]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0083]
(Example 1: adhesive strength test)
In this example, the adhesive strength between a cover glass subjected to silicone treatment and a slide glass as a lower member subjected to urethane resin treatment was examined. The cover glass and the slide glass used in this example were washed and stored using a conventional method (Inoue (1998), new edition Microscope Observation Series (1) Microscope Observation Basics: 124-127 [Non-Patent Document 2]). It was done.
[0084]
1.1. Silicone treatment of cover glass
The silicone-alcohol solution was poured at a depth of about 5 mm into a liquid-tight container, and a 24 mm × 24 mm cover glass was placed on the wall. After being left for 1 minute in this state, the cover glass was rotated 90 degrees, another side was immersed in the solution, and then left for another 1 minute. By repeating this operation, four sides of the cover glass were coated with a silicone coat with a width of about 5 mm (FIG. 1a).
[0085]
1.2. Urethane resin treatment of slide glass
In order to seal a thin layer of distilled water in the preparation, a vinyl tape (0.1 mm thick) was attached on the slide glass, and a urethane resin solution (manufactured by Konishi Co., Ltd., seal primer) was applied on the vinyl tape. Further, a container was produced by piercing the center of the tape with a size of 18 mm square (FIG. 1b).
[0086]
1.3. Adhesion of cover glass to slide glass
The hole in which the tape was cut out was filled with a sufficient amount (100 ul) of distilled water colored with a red pigment, and a cover glass was placed from above (see FIG. 2). For the adhesion of the cover glass, a control group where no treatment was applied, a case where only the silicone coat was applied to the edge, and a case where silicone and urethane resin treatment were applied were prepared, and the adhesive strength was compared.
[0087]
1.4. Evaluation of adhesive strength
Evaluation of adhesive strength was performed by attaching a thread with an instant adhesive near the center of the surface of the cover glass, tying a weight of a predetermined weight to the end, and standing upright to load the adhesive on the adhesive part. (FIG. 2).
[0088]
In the case of no coating (FIG. 2a), the cover glass was displaced within 1 minute with a force of 10 g weight, and the liquid leaked, and after 5 minutes completely dropped off.
[0089]
When the silicone coat was applied (FIG. 2b), the film was immobile in 1 minute against a force of 10 g weight, but dropped off after 5 minutes.
[0090]
When the silicone / urethane resin treatment was performed (FIG. 2c), the cover glass was not displaced at all even after applying a force of 20 g weight for 30 minutes, and there was no leakage or evaporation of the enclosed liquid. Regarding the bonding speed, in the case of the silicone / urethane resin treatment, the two adhered at the moment they contacted each other.
[0091]
From the above, the silicone glass on the cover glass improves the adhesion to some extent, but this alone does not solve all problems when using the oil immersion type objective lens. It has been clarified that the addition of the method of (1) enables quick and strong sealing.
[0092]
(Example 2: High-resolution imaging of living animal cultured cells with an oil-immersion objective lens)
In this example, physiological conditions of cells were maintained under a microscope using cultured cells (CHO-K1, Riken Cell Bank) derived from the ovaries of Chinese hamsters, which are generally used for research at the cell level of animals. Live cells were photographed with a high-resolution microscope using an oil-immersion objective lens.
[0093]
2.1. Chamber fabrication
In order to keep cells alive in a small closed vessel on a microscope for a long time, it is necessary to maintain the temperature at about 37 ° C. In addition, acidification of the medium by extracellular discharge of acidic wastes, etc. In order to prevent this, it is necessary to change the medium successively.
[0094]
Therefore, in this example, a flow chamber as shown in FIG. 3 was manufactured. The chamber uses a slide glass as a substrate. The chamber is provided with an observation window for bonding a 24 mm × 24 mm cover glass at the center of the lower surface (FIG. 3 b), and the observation target is placed here, and observation can be performed by bringing the cover glass into close contact. .
[0095]
In the case of adherent cultured cells, etc., the cells are cultured on a cover glass that has been subjected to silicone treatment on the periphery, and the cover glass is brought into close contact with this observation window, so that a continuous high-resolution microscope in a living state can be obtained. Observation becomes possible. In order to enable the addition of a culture medium and the like, a pool and a suction nozzle made of acrylic material are attached. The actual flow of the culture medium and the addition of the drug are performed by connecting the suction nozzle to a suction pump (which can suction at a low and stable speed). The target solution is added to the pool surrounded by the acrylic material, and the start of suction and the control of the suction speed are all performed by the suction pump.
[0096]
2.2. Preparation of observation window
After attaching a vinyl tape to the lower surface of the chamber and further applying a urethane resin, a vinyl tape was cut off in a range corresponding to a part to be actually observed when a cover glass was adhered, to prepare an observation window. Separately, CHO cells were cultured on a silicone-treated 24 mm × 24 mm cover glass to prepare an observation sample.
[0097]
2.3. Attach cover glass to chamber
After the observation window is filled with the medium, the cover glass to which the CHO cells cultured on the siliconized cover glass are adhered is laid down on the observation window so that the cells come into contact with the medium, and the edge is lowered. Pressing the cover glass completes the mounting of the cover glass. By attaching a cover glass, the flow of the culture medium is also possible.
[0098]
2.4. Comparison of adhesive strength
Since water pressure is applied to the inside of the chamber due to the flow of the culture medium (FIG. 3c), a strong adhesive force is required when fixing the cover ballast. Therefore, as a method of fixing the cover glass at the time of preparing the preparation, the conventional method (a) in which the periphery is coated with a nail polish and the bonding method (b) using the silicone / urethane resin of the present invention were attempted. For the preparations prepared by each method, the cells were actually observed using an oil-immersion type objective lens, and the practical differences between the two were compared and examined.
[0099]
As a result, in the silicone / urethane resin method, the culture medium did not leak even after continuous observation for 2 hours.
[0100]
2.5. Cell observation
In the conventional method (a) in which the periphery of the cover glass is coated with manicure, it took about 5 to 6 minutes to prepare the preparation because of the time required for the manicure to dry (FIG. 4a). During that time, the sample was exposed to room temperature and the observed cells showed significant contraction. That is, according to the conventional method, the outline of the cell was rounded and formed into an elliptical shape, and a large number of vesicles (indicated by white arrowheads) formed by contraction were observed in the periphery of the cell in a bunch of grapes. When the observation was continued, a phenomenon in which the culture medium in the chamber leaked out from the adhesive portion of the cover glass was observed in about 20 to 30 minutes, and this method could not withstand continuous observation for a long time.
[0101]
On the other hand, in the bonding method (b) using the silicone / urethane resin of the present invention, a preparation could be prepared within 2 minutes. Due to the short time of exposure to room temperature, the cells did not shrink and remained spindle-shaped, or extended thinner to form a triangle (FIG. 4b). This indicates that the cells are extremely healthy.
[0102]
【The invention's effect】
According to the present invention, all problems caused by insufficient adhesion of the preparation for optical microscope observation to the lower member of the cover glass can be easily and quickly solved, and high-resolution long-term observation with an optical microscope can be performed. It becomes possible. In addition, the use of the flow chamber of the present invention allows for continuous observation of an instantaneous to long-term response to a living sample such as a cultured cell, an immobilized cell, a microorganism, or a tissue of an animal or plant. It becomes possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing (a) a silicone coating on four sides of a cover glass of the present invention, and (b) a preparation for an optical microscope of the present invention.
FIG. 2 is a comparative experiment evaluating the adhesive strength of (a) a cover glass without any treatment, (b) a cover glass coated with silicone, and (c) a cover glass treated with silicone coat + urethane resin. It is a figure showing a result.
FIG. 3 is a diagram showing (a) a perspective view of a flow chamber, (b) a top view of the flow chamber, and (c) a side view of the flow chamber.
FIG. 4 is a photograph of (a) a preparation prepared by the conventional manicure method and (b) a preparation prepared by the method of the present invention (silicone / urethane resin method), in which cultured cells derived from Chinese hamster ovary were photographed. It is a figure which shows the comparison of a photograph.
Claims (23)
カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部と、試料保持領域を備えた下部材との間を、少なくとも一種のシーリング材で接着する工程、
を包含する、方法。A method for preparing a preparation for an optical microscope, comprising:
At least one edge of the cover glass, between the lower member provided with the sample holding region, a step of bonding with at least one type of sealing material,
A method comprising:
前記下部材の片面にプライマーをコートすること；および
該下部材のコートされた片面に、前記カバーガラスの少なくとも片面の辺縁部をシーリング材で接着し、密封すること、
を包含する、請求項１に記載の方法。The bonding step includes the following:
Coating a primer on one surface of the lower member; and bonding and sealing a peripheral portion of at least one surface of the cover glass to a coated one surface of the lower member with a sealing material,
The method of claim 1, comprising:
該透明基板が、該リザーバに連通する第１の孔および該ノズルに連通する第２の孔を有する、請求項３に記載の方法。The flow chamber comprises a reservoir disposed on the transparent substrate, the reservoir having a fluid pool, and a nozzle;
4. The method of claim 3, wherein the transparent substrate has a first hole communicating with the reservoir and a second hole communicating with the nozzle.
透明基板；
該透明基板の上面に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；
該試料保持領域内に保持された試料；および
該包囲部の上面にシーリング材により接着されたカバーガラス、
を備える、プレパラート。A preparation for an optical microscope, comprising:
Transparent substrate;
An enclosing portion attached to the upper surface of the transparent substrate and having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass;
A sample held in the sample holding region; and a cover glass adhered to a top surface of the surrounding portion by a sealing material;
A prepared slide.
透明基板；
該透明基板の上面に貼付けるための、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；および
該包囲部の上面にカバーガラスを接着するためのシーリング材、
を備える、キット。A kit for preparing a preparation for an optical microscope,
Transparent substrate;
An enclosing portion having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass for attaching to the upper surface of the transparent substrate; and a sealing material for bonding the cover glass to the upper surface of the enclosing portion;
A kit comprising:
流体の流動式チャンバーであって、以下：
第１の孔および第２の孔を備える透明基板；
該透明基板の上面に配置された、リザーバ；および
該透明基板の上面に配置された、ノズル、
を備え、該第１の孔が該リザーバと連通し、該第２の孔が該ノズルと連通する、チャンバー；
該透明基板の下面に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；ならびに
該包囲部の下面にシーリング材により接着されたカバーガラス、
を備える、プレパラート。A preparation for an optical microscope, comprising:
A fluid flow chamber, comprising:
A transparent substrate having a first hole and a second hole;
A reservoir disposed on the upper surface of the transparent substrate; and a nozzle disposed on the upper surface of the transparent substrate.
A chamber wherein the first aperture communicates with the reservoir and the second aperture communicates with the nozzle;
An enclosing portion attached to the lower surface of the transparent substrate and having a sample holding area having an area equal to or smaller than that of the cover glass; and a cover glass adhered to the lower surface of the enclosing portion by a sealing material;
A prepared slide.
第１の孔および第２の孔を備える透明基板；
該第１の孔と連通されるリザーバ；
該第２の孔と連通されるノズル；
該透明基板に貼付けられ、カバーガラスより面積の等しいかまたは小さい試料保持領域を有する、包囲部；ならびに
該包囲部にカバーガラスを接着するためのシーリング材、
を備える、キット。A kit for preparing a preparation for an optical microscope, comprising:
A transparent substrate having a first hole and a second hole;
A reservoir in communication with the first hole;
A nozzle communicating with the second hole;
An enclosing portion attached to the transparent substrate and having a sample holding area having an area equal to or smaller than the cover glass; and a sealing material for bonding the cover glass to the enclosing portion;
A kit comprising:
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007244250A (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-27 | National Agriculture & Food Research Organization | Apparatus for observing dynamic state of cell |
| JP2008154579A (en) * | 2006-11-28 | 2008-07-10 | National Agriculture & Food Research Organization | One action type cell kinetic-observing apparatus |
| JP2010539543A (en) * | 2007-09-13 | 2010-12-16 | アプライド プレシジョン インコーポレイテッド | Method of supplying immersion liquid on a sample substrate for high resolution imaging and lithography |
| JP2017058285A (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | 不二製油株式会社 | Observation method of fluid emulsified food |
| JP2018026197A (en) * | 2016-08-08 | 2018-02-15 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Microscopic observation method and microscopic observation auxiliary device |
-
2003
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007244250A (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-27 | National Agriculture & Food Research Organization | Apparatus for observing dynamic state of cell |
| JP2008154579A (en) * | 2006-11-28 | 2008-07-10 | National Agriculture & Food Research Organization | One action type cell kinetic-observing apparatus |
| JP2010539543A (en) * | 2007-09-13 | 2010-12-16 | アプライド プレシジョン インコーポレイテッド | Method of supplying immersion liquid on a sample substrate for high resolution imaging and lithography |
| JP2017058285A (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | 不二製油株式会社 | Observation method of fluid emulsified food |
| JP2018026197A (en) * | 2016-08-08 | 2018-02-15 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Microscopic observation method and microscopic observation auxiliary device |
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