JP4362478B2 - 子宮内膜症関連疾患の判定方法 - Google Patents

Description

この出願の発明は、子宮内膜症関連疾患の分子生物学的な診断方法に関するものである。またこの出願の発明は、子宮内膜症関連疾患の分子メカニズムを利用した当該疾患の治療薬および治療方法に関するものである。

子宮内膜症は一般的な産婦人科疾患であり、生殖可能年齢にある全女性の１０％に影響している（非特許文献１）。子宮内膜症の組織は正所性子宮内膜のように周期的な増殖と崩壊を経て、周期的月経困難症、性交疼痛症、骨盤痛、および月経時血尿の原因になる。さらに不妊症患者の３０〜４０％がこの疾患を有していることも報告されている（非特許文献２）。一部の患者で子宮内膜細胞が転移し、異所的に増殖する際のメカニズムは未だに不明であるが、炎症性サイトカインの脱調節化が子宮内膜症の進行に寄与している可能性がある（非特許文献３、４）。事実、単球の活性化と腹腔内への移動が、子宮内膜症において最も一貫して報告されている免疫学的異常性の一つとなっている（非特許文献５〜８）。
ダイオキシンは内分泌攪乱物質の一種であり、環境中に遍在している。３，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｓｉｎ（ＴＣＤＤ；ダイオキシン）はダイオキシン群の中でも最も毒性が高い物質であり、各種の毒性効果（例えば、免疫毒性、血液毒性、催奇形性、および発ガン性など）を有している（非特許文献９、１０）。ＴＣＤＤおよび関連化合物が誘導する遺伝子発現の変化は、毒素がアリル炭化水素受容体（ＡｈＲ）に結合した時点で開始され、次にアリル炭化水素受容体核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）と二量体を形成して、ＸＲＥ（異物応答配列）モチーフを含む遺伝子調節要素と相互作用する複合体を形成する（非特許文献１１、１２）。サルをＴＣＤＤに慢性曝露させると、用量依存的に軽度から重度の子宮内膜症が発現したことから（非特許文献１３）、ダイオキシンと子宮内膜症の関連性について幾つかの研究が行われた（非特許文献１４〜１８）。しかしながらＴＣＤＤ曝露は子宮内膜症に相関しないと言う結果が最近報告され（非特許文献１９、２０）、ダイオキシン曝露と子宮内膜症の関連性は不明のままとなっている。
なおこの出願の発明者らは、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆｏｃｔｏｒ：ＨＲＦ）を含むＴＣＤＤ標的遺伝子を同定している（非特許文献２１〜２３）。しかしながら、このようなＴＣＤＤ標的遺伝子産物としてのＨＲＦと子宮内膜症との関係は一切知られていない。
Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｍｅｄ．１９８９，３４（１）：４１−６ Ｃａｎｄｉａｎｉ Ｇ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｏｂｓｔｃｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｓｕｒｖ．１９９１，４６（６）：３７４−８２ Ｇａｒｃｉａ−Ｖｅｌａｓｃｏ Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ａｒｉｃｉ Ａ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ．１９９９，７１（６）：９８３−９３ Ｂａｒｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．２０００，６（５）：１０４２−６ Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９８，１５２（１）：１２５−３３ Ｌｅｂｏｖｉｃ Ｄ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ ２００１，７５（１）：１−１０ Ｈｏｒｎｕｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００１，１５８（６）：１９４９−５４ Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０００，１５６（５）：１５８１−８ Ｃｈａｐｍａｎ Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｌｅｒ Ｃ．Ｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８５，７８（１）：１４７−５７ ＭｃＧｒｅｇｏｒ Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１９９８，１０６Ｓｕｐｐｌ ２：７５５−６０ Ｓａｇａｗａ Ｋ．ａｎｄ Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａ Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１９９７，１２２（６）：１０７５−９ Ｎｅｂｅｒｔ Ｄ．Ｗ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９８９，２０（３）：１５３−７４ Ｒｉｅｒ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｄａｍ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３，２１（４）：４３３−４１ Ｇｉｂｂｓｏｎｓ Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６２（５１８３）：１３７３ Ｏｂｓｔｅｅｎ Ｋ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｉｅｒｒａ−Ｒｉｖｅｒａ Ｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９７，１５（３）：３０１−８ Ｂｒｕｎｅｒ−Ｔｒａｎ Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９，４８ Ｓｕｐｐｌ．１：４５−５６ Ｊｏｈｓｏｎ Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ １９９７，１０５（７）：７５０−５ Ｙａｎｇ Ｊ．Ｚ．ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ Ｗ．Ｇ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｉｎｄ．Ｈｅａｌｔｈ １９９７，１３（１）：１５−２５ Ｉｇａｒａｓｈｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．１９９９，４６（６）：７６５−７２ Ｐａｕｗｅｌｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２００１，１６（１０）：２０５０−５ Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１，６１（１５）：５７０７−９ Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，２９０（３）：９８４−７ Ｏｈｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００１，５０８（３）：３４１−４

子宮内膜症の診断は、従来は、腹腔内視鏡による観血的な方法以外には有効な方法は存在しなかった。
一方、各種のヒト疾患に対して、その疾患に特異的なマーカータンパク質やその遺伝子発現を指標とする分子生物学的診断が普及しつつある。この方法は、大がかりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。しかしながら、子宮内膜症については、このような分子生物学的な診断方法を行うための有効なマーカータンパク質やその遺伝子は知られていない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、子宮内膜症に密接に関連する遺伝子発現を利用しい分子生物学的な診断方法を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、この診断方法に使用する各種材料を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１１）の発明を提供する。
（１）被験者の生体試料におけるヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）ポリヌクレオチドの発現量を測定し、ＨＲＦポリヌクレオチドの発現量を正常生体試料のそれと比較し、正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を示す被験者を、子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の診断方法。
（２）ＨＲＦポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＲＦオリゴヌクレオチド。
（３）前記発明（２）のＨＲＦオリゴヌクレオチドを標識化したオリゴヌクレオチドプローブ。
（４）前記発明（２）のＨＲＦオリゴヌクレオチドまたはＨＲＦポリヌクレオチドをターゲットキャプチャープローブとして備えたＤＮＡマイクロアレイ。
（５）ＨＲＦポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセット。
（６）少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製されたＲＮＡを電気泳動分離する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で分離されたＲＮＡを前記発明（３）のオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程；
（ｄ）工程（ｅ）でＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量をＨＲＦポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の診断方法。
（７）少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したＲＮＡから、標識ｃＤＮＡを調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で調製した標識ｃＤＮＡを前記発明（４）のＤＮＡマイクロアレイに接触させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）でＤＮＡマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識ｃＤＮＡの標識量をＨＲＦポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の診断方法。
（８）少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したＲＮＡを鋳型とし、前記発明（５）のプライマーセットを用いてｃＤＮＡを合成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で合成されたｃＤＮＡ量をＨＲＦポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｄ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の診断方法。
（９）前記発明（６）、（７）および（８）の診断方法からなる群より選択される２以上の診断方法を含む子宮内膜症関連疾患の診断方法。
（１０）細胞内ＨＲＦポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
（１１）細胞内ＨＲＦポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を体内に投与することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療方法。
すなわち、この出願の発明者らは、子宮内膜組織と子宮内膜症移植片におけるＴＣＤＤ標的遺伝子（ＨＲＦ、ＣＹＰ１Ａ１）の発現を調べた結果、子宮内膜症の進行とＨＲＦ発現レベルに高い相関関係を見出してこの出願の発明を完成させた。
なおこの発明において、「子宮内膜症関連疾患」とは、子宮内膜症、および子宮内膜症を原因とする月経困難症、不妊症および子宮腺筋症等を意味する。「診断」とは、被験者が子宮内膜症関連疾患に羅患しているか否かの判定、将来的に子宮内膜症関連疾患に羅患する危険性が存在するか否かの判定、および治療後に子宮内膜症関連疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断には、子宮内膜症関連疾患の羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
また「ＨＲＦポリヌクレオチド」とはＨＲＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド［プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が結合した分子を意味する。具体的には、ＨＲＦタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写される ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡである。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。また「ポリヌクレオチド」とは、前記のヌクレオチドが１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。さらに「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。特にアミノ酸残基２−３３個のものを「オリゴペプチド」、３４個以上のものを「ポリペプチド」と記載する。
また、配列表に示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含する。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ｔｏ４，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｂ）＆１０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｅ）＆１５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２１８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｊ．Ｃ．Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。

図１は、正常子宮内膜組織、子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるＨＲＦとＣＹＰ１Ａ１発現を調べた結果である。（Ａ）ＨＲＦ ｍＲＮＡレベルはノーザンブロット分析により調べた。ブロットの再プローブをヒトβアクチンプローブを用いて行い、トータルＲＮＡレベルを決定した。ノーザンブロットにより調べた試料中のＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＢＡレベルはサザンブロット分析を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。定量の精度を確認するため、５倍の異なる濃度のｃＤＮＡ試料（１ｘおよび５ｘ）をＰＣＲテンプレートとして用い、同様な配置で調べた。βアクチンをｍＲＮＡ量に対する内部対照として用いた。（Ｂ）ＨＲＦおよびＣＹＰ１Ａ１のｍＲＮＡレベルに対する画像表示を同様に示す。ｍＲＮＡレベルはｄｅｎｓｉｎｔｏｍｅｔｒｙ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＡＧＥＲ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料１１−２ＡはＨＲＦのｍＲＮＡレベル、１０−２ＡはＣＹＰ１Ａ１のｍＲＮＡレベルを示し、任意に１０に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。１２−１、７−１、８−１および６Ｂは正常な子宮内膜組織であり、アステリスクが印字された１Ｃは子宮内膜症患者の正所性子宮内膜である。
図２は、子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ発現を調べた結果である。（Ａ）正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ発現のノーザンブロット分析の結果である。ブロットはヒトβアクチンプローブを用いて再プローブを行い、トータルＲＮＡレベルを決定した。カラム上のＮ、ＥｕおよびＥｎはそれぞれ正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片を示す。（Ｂ）図１Ａおよび図２Ａにおいて調査した試料について、ノーザンブロット分析により測定したＨＲＦ ｍＲＮＡレベルのグラフ表示である。ＨＲＦ ｍＲＮＡレベルはｄｅｎｓｉｎｔｏｍｅｔｒｙ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＡＧＥＲ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料６ＢのｍＲＮＡレベルを任意に１に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。
図３は、ＨＲＦおよびＣＤ６８発現の免疫組織化学的分析の結果である。茶色の染色で陽性部分が可視化されている。逆染色にはヘマトキシリンを用いた。（Ａ）および（Ｂ）正常な子宮内膜組織におけるＨＲＦタンパク質の検出（Ａ：増殖フェーズ、Ｂ：分泌フェーズ、原図倍率ｘ２００）。（Ｃ）卵巣の子宮内膜症移植片内部におけるＨＲＦタンパク質の検出（原図倍率ｘ２００）。（Ｄ）子宮内膜症移植片の形態を示す連続切片のＨ＆Ｅ染色（原図倍率ｘ２００）。（Ｅ）さらに高倍率で（Ｃ）と同じ視野のＨＲＦタンパク質を検出したもの（原図倍率ｘ４００）。（Ｆ）子宮内膜症移植片の連続切片におけるＣＤ６８陽性マクロファージの免疫組織化学的局在（原図倍率ｘ４００）。
図４は、移植アッセイの結果である。（Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞内のＨＲＦタンパク質のウエスタンブロット分析の結果。ｗｔ：親のＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＲＦ：ＨＲＦを含むレトロウイルスベクターによる感染後に安定してＨＲＦを発現する細胞株（ｐＭＳＣＶ−ＨＲＦ−３Ｔ３）、ｖｅｃｔｏｒ：空のベクターを感染させた対照細胞（ｐＭＳＣＶ−３Ｔ３）。（Ｂ）ヌードマウスにおけるＨＲＦ過剰発現細胞の示す高い移植効率を示す。縦軸上のマークは次の状態を示す。＋＋＋：無数の移植コロニーが観察された状態、＋＋：数十個の移植コロニーが観察された状態、＋：数個の移植コロニーが観察された状態、−：移植コロニーは観察されなかった状態。対照細胞またはＨＲＦ過剰発現細胞を注射した個々のマウスは、それぞれ白丸または黒丸により示す。

この出願の発明（１）の診断方法は、被験者の生体試料におけるＨＲＦポリヌクレオチドの発現量を測定し、このＨＲＦポリヌクレオチドの発現量を指標として子宮内膜症関連疾患を診断する方法である。すなわち、ＨＲＦポリヌクレオチドの発現量が正常生体試料と比較して有意に多い被験者を子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定する。ＨＲＦポリヌクレオチドの発現量は子宮内膜症関連疾患と密接に関連することから、被験者の生体試料（例えば月経血等）におけるこのＨＲＦポリヌクレオチドの発現量を指標として子宮内膜症の診断を行うことができる。またＨＲＦポリヌクレオチド発現量が「有意に多い」とは、被験者のポリヌクレオチドの発現量が正常生体試料（すなわち健常者の生体試料）において測定されたＨＲＦポリヌクレオチドと比較して、１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上である場合を意味する。またさらに、この「有意に多い」とは、例えば同一被験者の複数試料についてのＨＲＦポリヌクレオチド発現量の平均値と、複数の正常試料における同様の平均値とを統計的に検定した場合、前者が後者よりも有意に多い場合である。
ＨＲＦポリヌクレオチドは、各種の変異体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＸＭ＿２９４０４５、ＸＭ＿０３８３９１、ＸＭ＿２９３２９１、ＸＭ＿２０９７４１、ＸＭ＿２１０５６６、ＸＭ＿０６６７０６、ＸＭ＿０６６６７５、ＸＭ＿０７１３２１等）が知られているが、ＳＥＱ ＩＤ：１（塩基配列）に示したＨＲＦ ｃＤＮＡ（またはＴＰＴ−１：ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００３２９５）を好ましいものとして例示する。このようなポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、ｃＤＮＡの場合には、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２，１６１−１７０，１９８２；Ｊ．Ｇｅｎｅ ２５，２６３−２６９，１９８３；Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０，１９９４）を用いてｃＤＮＡライブラリーを合成し、それぞれ公知の塩基塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを用いて、それぞれのｃＤＮＡを単離する方法によって取得することができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても必要量の各ｃＤＮＡを得ることができる。
以上のとおりのＨＲＦポリヌクレオチド発現量を指標とする発明（１）の診断方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２５，１６９−１９３（２０００）およびそこで引用されている文献）、ＤＮＡアレイ解析法（Ｍａｒｋ Ｓｈｅｎａ編、”Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００年３月）などによってＨＲＦポリヌクレオチド発現量を検知・測定して実施することができる。こうした技術を利用したＨＲＦポリヌクレオチド発現測定系、子宮内膜症関連疾患の検出系、子宮内膜症関連疾患のリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。
この出願は、前記の発明（１）の診断方法に使用する材料として、特に以下の発明（２）〜（５）を提供する。
発明（２）のＨＲＦオリゴヌクレオチドは、ＨＲＦポリヌクレオチドとストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。
このＨＲＦオリゴヌクレオチドは、例えば前記のＨＲＦポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。
またストリンジェントな条件とは、前記のポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好まし態様としては、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約３ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約１．５ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。１つの好ましい態様としては、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、４２℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行うことである。
発明（３）は、前記のＨＲＦオリゴヌクレオチドを標識化したオリゴヌクレオチドプローブである。標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅ^ＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ^２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法（例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅、ラベリング／テイリング法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法等）を適宜選択して使用できる。例えば、ＨＲＦオリゴヌクレオチドに官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、ＳＨ基など）を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化オリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。
発明（４）は、前記発明（２）のＨＲＦオリゴヌクレオチドまたはＨＲＦポリヌクレオチドをターゲットキャプチャープローブとして備えたＤＮＡマイクロアレイである。
マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明で使用するマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７，１９９１）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９１３，１９９６）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１１９−１１２３，１９９７）。このマイクロアレイを使用して血管炎を診断する場合には、例えば被験者の細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。
その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとする。この標識ｃＤＮＡをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注して標識ｃＤＮＡ水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
発明（５）は、ＨＲＦポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットである。このプライマーセットは公知の塩基塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を挙げることができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
以上のとおりの材料（発明（２）〜（５）を使用することによって、様々な形態の子宮内膜症関連疾患のそのリスクを診断するための試薬セットの作成や診断方法の構築が可能となる。特にこの出願では、子宮内膜症関連疾患およしそのリスクの診断方法として、以下の発明（６）〜（９）が提供される。
すなわち発明（６）の診断方法は、発明（３）のオリゴヌクレオチドプローブを用いてＨＲＦポリヌクレオチドの発現量（ｍＲＮＡ量）を検出する方法（ノーザンブロット分析法）である。この診断方法は、少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製されたＲＮＡを電気泳動分離する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で分離されたＲＮＡを前記発明（３）のオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程；
（ｄ）工程（ｅ）でＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量をＨＲＦポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
また発明（７）の診断方法は、発明（４）のＤＮＡマイクロアレイを使用する方法である。この方法は、少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したＲＮＡから、標識ｃＤＮＡを調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で調製した標識ｃＤＮＡを前記発明（４）のＤＮＡマイクロアレイに接触させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）でＤＮＡマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識ｃＤＮＡの標識量をＨＲＦポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
さらに発明（８）の診断方法は、発明（５）のプライマーセットを用いて、ＨＲＦポリヌクレオチド（具体的にはｍＲＮＡ）の発現量を測定する方法（ＲＴ−ＰＣＴ法）である。この方法は、少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したＲＮＡを鋳型とし、前記発明（５）のプライマーセットを用いてｃＤＮＡを合成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で合成されたｃＤＮＡ量をＨＲＦポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｄ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
またさらに、発明（９）の診断方法は、前記発明（６）、（７）および（８）の診断方法からなる群より選択される２以上の診断方法を含む方法である。
またこの出願によって提供される診断方法は、例えばＨＲＦポリヌクレオチドがコードするＨＲＦタンパク質を特異的に認識する抗体等を用いてＨＲＦタンパク質の存在量を測定することによって子宮内膜症関連疾患を診断する方法と組み合わせることもできる。
なお、以上の各診断方法において、標識の観察や標識量の測定には、標識の種類に応じて当該分野で知られた方法を適宜選択して使用でき、例えば暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡、螢光顕微鏡、デジタルイメージング顕微鏡、電子顕微鏡などによる方法も使用することができる。
以上の診断方法は、子宮内膜症関連疾患の診断、予防、治療において有用である。さらには、子宮内膜症関連疾患を治療した後、即ち、予後の状態を知る上でも有用である。
発明（１０）は、細胞内ＨＲＦポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬であり、また発明（１１）は、細胞内ＨＲＦポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を体内に投与することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療方法である。すなわち、後記実施例にも示したように、ＨＲＦポリヌクレオチドを過剰に発現する細胞はｉｎ ｖｉｖｏにおいて活発に増殖することから、細胞内ＨＲＦポリヌクレオチドの過剰発現が子宮内膜組織の移植や増殖の原因となっていると考えられる。そこでこのＨＲＦポリヌクレオチドの発現を抑制することによって、子宮内膜症関連疾患の治療、または少なくともその進行、悪化を停止もしくは抑制することが可能となる。
細胞内ＨＲＦポリヌクレオチドの発現を抑制する分子としては、アンチセンス配列、リボザイム、キメラオリゴ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を生じさせる二本鎖ＲＮＡ分子等（以下、これらは「発現抑制分子」と記載することがある）を使用することができる。特に、ＲＮＡｉは外来性ＲＮＡ分子によって標的遺伝子のｍＲＮＡを分解し、標的遺伝子の発現を抑制する手法であり、アンチセンス配列等と比較して、標的遺伝子の発現抑制効果が格段に優れているために、好ましい手段である。使用するＲＮＡ分子としては、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、より好ましくはその短鎖（２０−２５ｂｐ程度）のＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１，１５（２）：１８８−２００）、ヘアピン構造の短鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）（例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００２，１６（８）：９４８−９５８）、およびｓｉＲＮＡとは別の短鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＲＮＡ：ｓｔＲＮＡ）（例えば、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ Ｈ．ａｎｄ Ｓｌａｃｋ Ｆ．Ｊ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２，１５６（１）：１７−２１）等が好ましい。
以上のとおりの発現抑制分子は、標的遺伝子（ＨＲＦポリヌクレオチド）の配列（例えば配列番号１）に基づき設計され、公知の化学合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳等の手段で作成することができる。なお、例えばｓｉＲＮＡの設計に当たっては、以下を留意することが提案されている。（１）調節タンパク質結合部位の多い５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）と開始コドン周辺領域は除外する；（２）開始コドンの５０から１００ヌクレオチド下流の領域を選択する；（３）選択した領域からＡＡ（Ｎ１９）ＴＴまたはＡＡ（２１）となる領域であって、ＧＣ含量が少なくとも３０％から７０％、好ましくは５０％程度の領域を選択する。
作成された発現抑制分子は、適当な溶媒と混合した状態で体内に投与することができるが、その効果をより持続させるためには、発現ベクターの形態で投与することが好ましい。発現ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等を使用することができる。例えば、ＲＮＡｉ用のＲＮＡ分子を発現させる場合のプラスミドベクターとしては、市販のｐｉＧＥＮＥシリーズ、ｐＳＩＮｓｉ／ｐＢＡｓｉシリーズ等を使用することができる。また、ウイルスベクターとしては、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されたアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第６，０９６，７１８号；６，１１０，４５８号；６，１１３，９１３号；５，６３１，２３６号参照）、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクター等を使用することができる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第６，１１７，６８１号；６，１０７，４７８号；５，６５８，７７５号；５，４４９，６１４号；Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０参照）。このようなウイルスベクターは、例えばｓｉＲＮＡ発現用のアデノウイルスベクターの場合、先ず、基本プラスミドベクター（例えばｐＢＡｓｉ）を構築し、この基本ベクターからプロモーター＋ｓｉＲＮＡコード配列を切り出し、これをアデノウイルスベクター作成用コスミドに載せ換え、この組換えコスミドを２９３細胞等にトランスフェクションすることによって作成することができる。
以上のとおりの発現ベクターは、通常の遺伝子治療等の手順に従って、患者の子宮内膜等を含め、あらゆる投与経路によっても体内に投与することができる。また、プラスミドベクターの場合には、Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法（Ｓｏｎｇ Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００３，９（３）：３４７−３５１）によって静脈内に投与することも好ましい方法である。

以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
１．材料と方法
１−１．組織試料
ＲＮＡ調製のために、１８例の患者から以下の試料を得た。１）子宮内膜症移植片（ｎ＝２１）、２）子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織（掻爬による；ｎ＝４）、３）子宮内膜症を持たない患者に由来する正常子宮内膜組織（ｎ＝６）。いくつかの試料は一個人の異なる部位から得た。試料は液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵してＲＮＡ調製に備えた。子宮内膜症移植片は卵巣から得た。ＲＮＡ調製用の正常子宮内膜組織と、正常に増殖および分泌を行う子宮内膜組織をホルマリン固定、パラフィン包埋した試料は、平滑筋腫または子宮脱の患者から取得した。病理標本は組織学的試験により段階づけを行った結果、それらは子宮内膜症の第ＩＩＩからＩＶ段階にわたっていた（ｔ−ＡＳＲＭ：ｒｅｖｉｓｅｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ［改訂版米国生殖医学学会子宮内膜症分類］、１９９６）。また、この研究の女性被験者は子宮内膜の過形成や腫瘍形成を示さず、手術前に抗炎症剤やホルモン剤の投与を受けていなかった。手術前に書面の同意を得たが、これは東京医科大学病院の人体調査に関する施設内監査委員会により承認されたプロトコルに従った。
１−２．ノーザンブロット分析
ノーザンブロットは文献（Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１，６１（１５）：５７０７−９）の記載により実施した。ＨＲＦプローブは文献（Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，２９０（３）：９８４−７）の記載に従って調製した。ヒトβアクチンｃＤＮＡ対照プローブ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をスタンダードとした。
１−３．サザンブロット分析を用いたＲＴ−ＰＣＲ
文献（Ｋｕｂｏｔａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９７，１５１（３）：７３５−４４）の記載に従い、オリゴヌクレオチドｄＴプライマーを用いてトータルＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、得られた第１鎖ｃＤＮＡ溶液２μｌ（１ｘ）および１０μｌ（５ｘ）をテンプレートとして用い、ＰＣＲを行った。以下の４種類のプライマーを添加した後、初期変性を９５℃で２分間、（９５℃で０．５分、６５℃で０．５分、７２℃で１分）×２２サイクルの条件でＣＹＰ１Ａ１とβアクチンのｃＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅した。

増幅産物をアガロースゲル上の電気泳動により分画した後、ブロッティングとハイブリダイゼーションを行った。ＣＹＰ１Ａ１ ｃＤＮＡプローブは、上述のプライマー対を用いた逆転写ＰＣＲにより得た。ヒトβアクチンｃＤＮＡプローブ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を対照として用いた。Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ｒａｎｄｏｍ ｔｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、これらのｃＤＮＡプローブを^３２Ｐにより標識した。
１−４．抗体調製と免疫組織化学法
ヒトＨＲＦに由来するオリゴペプチド（ＧＫＬＥＥＱＲＰＥＲＶＫＰＦＭＴ：ＳＥＱ ＩＤ：２の１０１−１１６）に対するペプチド抗体を、ウサギを用いた標準法により行った作製し、ＨＲＦ−ＧＫＬと命名した。免疫組織化学的分析は、脱パラフィン化した切片を抗 ＨＲＦ抗体、ＨＲＦ−ＴＰＹ（Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，２９０（３）：９８４−７）およびＨＲＦ−ＧＫＬ（１：１００に稀釈）または抗ヒトＣＤ６８抗体（１：１００に稀釈；Ｄａｋｏ社）の混合液の存在下で一夜インキュベートした。抗ＨＲＦ染色用には、脱パラフィン化した切片を圧力滅菌器を用いて熱誘導性の抗原回復に供した。ＬＳＡＢＣ（Ｄａｋｏ）を用いて検出を行ったが、ここでは３，３’−ジアミノベンチジンを色素体として使用した。ヘマトキシリンを用いて逆染色を行った。
１−５．ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は文献（Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，２９０（３）：９８４−７）の記載に従って行った。膜のプローブ処理は抗ＨＲＦ（ＨＲＦ−ＧＫＬまたはＨＲＦ−ＴＰＹ）抗体を用い、１：２０００の稀釈比で行った。シグナル検出はＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。
１−６．細胞培養とレトロウイルス感染
ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より取得した。細胞は、３７℃条件で１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、５％ＣＯ_２環境下に維持した。全長ＯＲＦを含むマウスＨＲＦｃＤＮＡを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。

得られたｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、レトロウイルス発現ベクターＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。組み替えレトロウイルスの調製と感染のプロトコルは文献（Ｋｕｒｏｄａ＞ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９９，９６（９）：５０２５−３０）の記載に従った。感染の２４時間後、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて２週間にわたり感染細胞を選別した。
１−７．動物と処置
５×１０^５個の細胞の部分標本を、６週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの腹腔内に注射して移植アッセイを行った。２週間後に動物を屠殺し、移植片コロニー数を測定した。
２．結果
２−１．子宮内膜症におけるＴＣＤＤ誘導性遺伝子ＨＲＦの発現パターン
ノーザンブロット分析により、子宮内膜症時のＨＲＦ発現パターンを決定した。その結果、５例中３例の患者から得た子宮内膜症移植片組織中に高レベルのＨＲＦ発現が認められた（図１Ａおよび１Ｂ）。ヒトのチトクロームｐ４５０遺伝子スーパーファミリーの一部（例えばＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ１Ｂ１）はジオキシンにより誘導されるため、ＣＹＰ１Ａ１の誘導はジオキシン依存性の遺伝子発現調節に対する基本的な標的になる。このためジオキシン曝露とＨＲＦ発現の関連を調べるために、ここではサザン分析によるＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＹＰ１Ａ１発現を調査した（Ｔｒｉｆａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３（７）：３９８０−５；Ｏｉｋａｗａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ２０００，２６１（２）：２２１−８）。その結果、ＣＹＰ１Ａ１は必ずしも高ＨＲＦ発現を示す全例において誘導されている訳ではなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。このため、いくつかのケースではＨＲＦ発現がＴＣＤＤにより誘導されている可能性はあるにも関わらず、子宮内膜症移植片におけるＨＲＦはＴＣＤＤ曝露とは無関係に誘導されていることが確認された。
２−２．子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ過剰発現
子宮内膜症を追加発症した患者の子宮内膜症移植片において、ＨＲＦが過剰発現していることが確認された。すなわち、７例の子宮内膜症患者について、ノーザンブロット分析を行った（図２Ａ）。正常な子宮内膜組織および子宮内膜症患者の正所性の子宮内膜と比較すると、子宮内膜症移植片においては高度なＨＲＦ発現が観察された（図２Ｂ）。
２−３．正常子宮内膜と子宮内膜症移植片におけるＨＲＦの免疫組織化学
ＨＲＦを発現する子宮内膜細胞のタイプを、抗ＨＲＦポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により決定した。その結果、ＨＲＦが子宮内膜腺と正常組織の間質細胞に共に存在することが同定されたが、宮内膜腺は間質細胞より強い発現を示した（図３Ａおよび３Ｂ）。分泌と増殖フェーズの間における発現パターンの顕著な変化はなかった。さらに、子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ発現も調査した。その結果、卵巣の子宮内膜症移植片の間質および上皮成分の両方にＨＲＦが存在していた（図３Ｃと３Ｅ）。正常な子宮内膜の間質細胞でのＨＲＦ発現は弱いのに対して、卵巣の子宮内膜症移植片では子宮内膜腺と間質細胞はいずれも同様な高レベルのＨＲＦ発現を示した。これらのＨＲＦに対する特異的なシグナルは、免疫前血清を対照として用いた場合には観察されなかった（データ示さず）。しかしながら、子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ誘導のメカニズムは依然として不明である。Ｍ−ＣＳＦによる活性化段階においてマクロファージがＨＲＦを誘導することを示す報告（Ｔｅｓｈｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１（１１）：６３５３−６６）と一致するように、子宮内膜症移植片においてはＣＤ６８陽性のマクロファージの関与が観察されている（Ｈｏｒｎｕｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００１，１５８（６）：１９４９−５４）。従って、移植片の連続切片に対するＣＤ６８染色を利用して、ＨＲＦ過剰発現領域内部におけるＣＤ６８陽性のマクロファージを同定した（図３Ｆ）。ヘマトキシリン−エオジンを用いて染色した対照切片は、子宮内膜症移植片の全体的な形態を示している。これらの結果から、子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ産生にはマクロファージが寄与しているであろうと考えられる。
２−４．ＮＩＨ３Ｔ３細胞の腹腔内移植に対するＨＲＦの効果
ＨＲＦ発現増加による生理学的な影響について調査した。子宮内膜症の原因は未だに不明である（Ｋｌｎｉｎｃｋｘ Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９，４７ Ｓｕｐｐｌ １：３−９，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ９−１０；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ Ｐ．Ｊ．Ｑ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１９９７，２：ｃ４８−５２）。主要な仮説に従うならば、子宮内膜症の発症は、卵管逆流により腹腔に達した（逆行性月経）子宮内膜組織の移植および増殖による。ここではこの移植に対してＨＲＦが及ぼす影響を調査した。最初に、ＨＲＦを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の安定形質移入体を作製した。ＨＲＦ発現用のレトロウイルスベクター（ｐＭＳＣＶ−ＨＲＦ）を感染後に、高度なＨＲＦ発現が確認された（図４Ａ）。次にこれらの細胞（ｐＭＳＣＶ−ＨＲＦ−３Ｔ３細胞）をヌードマウスの腹腔内に注射した。ｐＭＳＣＶ−ＨＲＦ−３Ｔ３細胞は、対照ベクター（ｐＭＳＣ−３Ｔ３）を感染させた細胞と比較して高い移植能を有していた（図４Ｂ）。これらのデータから、ＨＲＦは免疫学的機能不全においてのみならず、子宮内膜症移植片の初期発達にも重要な役割を果たしていることが示唆された。

以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、子宮内膜症関連疾患およびそのリスクを簡便かつ確実に診断する方法と、そのための材料が提供される。これによって、子宮内膜症関連疾患の早期の発見、より適切な治療法の選択、再発の防止等が可能となる。

Claims (5)

1. 被験者の生体試料におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現量を測定し、HRFポリヌクレオチドの発現量を正常生体試料のそれと比較し、正常生体試料と比較して有意に高いHRFポリヌクレオチド発現量を示す被験者を、子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
2. 少なくとも以下の工程：
   (a) 被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
   (b) 工程(a)で調製されたRNAを電気泳動分離する工程；
   (c) 工程(b)で分離されたRNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程、ここでオリゴヌクレオチドプローブは、HRFポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識化したものであり；
   (d) 工程(e)でRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量をHRFポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
   (e) 正常生体試料と比較して有意に高いHRFポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
   を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
3. 少なくとも以下の工程：
   (a) 被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
   (b) 工程(a)で調製したRNAから、標識cDNAを調製する工程、
   (c) 工程(b)で調製した標識cDNAをDNAマイクロアレイに接触させる工程、ここでDNAマイクロアレイは、HRFポリヌクレオチドまたはHRFポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするHRFオリゴヌクレオチドをターゲットキャプチャープローブとして備えたものであり；
   (d) 工程(c)でDNAマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識cDNAの標識量をHRFポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
   (e) 正常生体試料と比較して有意に高いHRFポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
   を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
4. 少なくとも以下の工程：
   (a) 被験者の生体試料よりRNAを調製する工程；
   (b) 工程(a)で調製したRNAを鋳型とし、HRFポリヌクレオチドをPCR増幅するプライマーセットを用いてcDNAを合成する工程；
   (c) 工程(b)で合成されたcDNA量をHRFポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
   (d) 正常生体試料と比較して有意に高いHRFポリヌクレオチド発現量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
   を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
5. 請求項２、３および４の判定方法からなる群より選択される２以上の判定方法を含む子宮内膜症関連疾患の判定方法。

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