JP4353796B2 - 癌の再発予測のための採点システム - Google Patents
癌の再発予測のための採点システム Download PDFInfo
- Publication number
- JP4353796B2 JP4353796B2 JP2003515687A JP2003515687A JP4353796B2 JP 4353796 B2 JP4353796 B2 JP 4353796B2 JP 2003515687 A JP2003515687 A JP 2003515687A JP 2003515687 A JP2003515687 A JP 2003515687A JP 4353796 B2 JP4353796 B2 JP 4353796B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genes
- cancer
- proteins
- recurrence
- patients
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 85
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003498 protein array Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 12
- 238000002493 microarray Methods 0.000 abstract description 11
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 15
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 14
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 4
- 101710148465 Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 3
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 102100034597 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM22 Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 101000848629 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM22 Proteins 0.000 description 2
- 101000979629 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase A Proteins 0.000 description 2
- 101000979623 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase B Proteins 0.000 description 2
- 101001041721 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX17 Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000042106 MEF2 family Human genes 0.000 description 2
- 108091077694 MEF2 family Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100023252 Nucleoside diphosphate kinase A Human genes 0.000 description 2
- 102100023258 Nucleoside diphosphate kinase B Human genes 0.000 description 2
- -1 OCT compound Chemical class 0.000 description 2
- 101100236420 Oryza sativa subsp. japonica MADS2 gene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021409 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX17 Human genes 0.000 description 2
- 101710119496 Putative serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011155 quantitative monitoring Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150066838 12 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061968 Gastric neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 206010029098 Neoplasm skin Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N [[5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- YDMCWONVABEGBK-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;phenoxide Chemical compound NC(N)=N.OC1=CC=CC=C1 YDMCWONVABEGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 238000012333 histopathological diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000025421 tumor of uterus Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
本発明は、癌の再発予測のための採点システムに関する。より詳細には、本発明は、ヒトの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を測定して、その発現パターンを、癌が再発した患者および癌が再発していない患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質発現パターンと比較することによって、癌の再発予測のための、遺伝子および／またはタンパク質の選択、ならびに選択した遺伝子および／またはタンパク質に関する式の作製に関する。
本発明はまた、少なくとも2個またはそれ以上、好ましくは4個またはそれ以上、より好ましくは6個またはそれ以上、および最も好ましくは12個またはそれ以上の、癌再発の指標となる遺伝子および／またはタンパク質の発現を調べるために、DNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、タンパク質アレイ、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以降、RT-PCRと呼ぶ）を行うために必要な、DNAチップ、オリゴヌクレオチドチップ、タンパク質チップ、ペプチド、抗体、プローブ、およびプライマーを含む、本発明の方法を実施するためのキットにも関する。
発明の背景
癌は、世界における主な死因の一つである。全体的な癌の罹患率は、人口の約1％であり、年間発症率は約0.5％である。退院した患者の10人に約1人がその一次診断として癌を有する。主な既存の治療様式は、外科的切除、放射線療法、化学療法、およびホルモン治療を含む生物療法である。さらに、新たに開発されたバイオテクノロジーにより、遺伝子治療のような新しい治療様式が提供されている。それにもかかわらず、癌はほとんどの場合において真に有効な治療が利用できないために、恐ろしい疾患である。癌治療の主要な問題の一つは、癌細胞が薬物に対して耐性となり、組織の他の部位に広がり、そこで新しい腫瘍を形成し、その結果しばしば再発が起こることである。再発が起こる前に癌の再発を予測することができれば、そのような癌は、手術による局所治療によって治癒可能となる。
癌は、世界における主な死因の一つである。全体的な癌の罹患率は、人口の約1％であり、年間発症率は約0.5％である。退院した患者の10人に約1人がその一次診断として癌を有する。主な既存の治療様式は、外科的切除、放射線療法、化学療法、およびホルモン治療を含む生物療法である。さらに、新たに開発されたバイオテクノロジーにより、遺伝子治療のような新しい治療様式が提供されている。それにもかかわらず、癌はほとんどの場合において真に有効な治療が利用できないために、恐ろしい疾患である。癌治療の主要な問題の一つは、癌細胞が薬物に対して耐性となり、組織の他の部位に広がり、そこで新しい腫瘍を形成し、その結果しばしば再発が起こることである。再発が起こる前に癌の再発を予測することができれば、そのような癌は、手術による局所治療によって治癒可能となる。
様々な腫瘍の中で、肝細胞癌（以降、HCCと呼ぶ）は、世界中で最も一般的な致死性の癌の一つであり、発症数は、アメリカ、日本、中国、およびヨーロッパ諸国を含む多くの国において増加している。B型肝炎ウイルス（以降、HBVと呼ぶ）およびC型肝炎ウイルス（以降、HCVと呼ぶ）感染症はいずれもHCCの原因となりうる。実際に、HCC患者の増加は、慢性HCV感染症の増加と平行している（El-Serag, H.B. and Mason, A.C.、「Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States」、N. Engl. J. Med. 340：745〜750（1999）；およびOkuda, K.、「Hepatocellular carcinoma」、J. Hepatol. 32：225〜237（2000））。HCCの発症率の上昇にもかかわらず、この疾患に対する有望な治療はない。HCCの治療における主な問題は、肝臓内転移である。再発は、肝切除を受けたHCC患者の30％〜50％において認められた（Iizuka, N.ら、「NM23-H1 and NM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellular carcinoma」、Cancer Res. 55：652〜657（1995）；Yamamoto, J.ら、「Recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery」、Br. J. Surg. 83：1219〜1222（1996）；およびPoon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。病理的TNM分類システムがHCCの治療において適用されているが、このシステムは、肝切除を受ける患者における再発を正確に予想することはできない（Izumi, R.ら、「Prognostic factors of hepatocellular carcinoma in patient undergoing hepatic resection」、Gastroenterology 106：720〜727（1994））。多くの分子が同様にHCCの予測マーカーとして提唱されているが、それらのいずれも臨床的での有用性は証明されていない（Iizuka, N.ら、「NM23-H1 and NM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellular carcinoma」、Cancer Res. 55：652〜657（1995）；Hsu, H.C.ら、「Expression of p53 gene in 184 unifocal hepatocellular carcinomas：association with tumor growth and invasiveness」、Cancer Res. 53：4691〜4694（1993）；およびMathew, J.ら、「CD44 is expressed in hepatocellular carcinomas showing vascular invasion」、J. Pathol. 179：74〜79（1996））。このように、再発を予測する方法は、癌のメカニズムを理解する上で、そしてまた癌の新しい治療を確立する上で極めて有用である。しかし、従来の方法によって再発を予測するには技術的限界があり、腫瘍は患者間で不均一性が高いためにさらなる限界があることから、腫瘍を特徴づけて、癌の再発を予測する新たな方法を考案する必要がある。
多数の遺伝子の発現を同時に解析することができるマイクロアレイ技術が最近開発されたことにより、医科学に新たな時代が開かれた（Schena, M.ら、「Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray」、Science 270：467〜470（1995）；およびDeRisi, J.ら、「Use of a cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer」、Nature Genet. 14：457〜460（1996））。特に、cDNAマイクロアレイによる腫瘍の遺伝子発現に関する研究は、予後および薬物感受性のような悪性腫瘍の特性に有意義な洞察を与えた（Alizadeh, A.A.ら、「Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling」、Nature 403：503〜511（2000）；およびScherf, U.ら、「A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer」、Nature Genet. 24：236〜244（2000））。最近、遺伝子発現解析に管理学習（Supervised learning）が導入された（Brazma, A.およびVilo, J.「Gene expression data analysis」、FEBS Lett. 480、17〜24（2000）、ならびにKell, D.B.およびKing, R.D.「On the optimization of classes for the assignment of unidentified reading frames in functional genomics programs：the need for machine learning」、Trends Biotechnol. 18、93〜98（2000））。分類された試料を用いることで、管理学習はデータの本質に関する多くの先験的知識という点で大きな長所を有する（Duda, R.O.ら、「Pattern classification」、John Wiley & Sons（2001）；およびJain, A.K.ら、「Statistical pattern recognition：A review」、IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence. 22、4〜37（2000））。しかし、これまでに公表された管理学習法はどれも遺伝子の組み合わせを直接評価しておらず、したがって統計学的特徴、すなわち遺伝子の分布構造に関する情報を利用することができない（Golub, T.R.ら、「Molecular classification of cancer：class discovery and class prediction by gene expression monitoring」、Science 286、531〜537（1999）；およびBrown, M.P.ら、「Knowledge-based analysis of microarray gene expression data by using support vector machines」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97、262〜267（2000））。
癌の再発を予測する採点システムは、統計学的パターン認識における管理学習によるDNAマイクロアレイデータを解析することによって構築される（Duda, R.O.ら、「Pattern classification」、John Wiley & Sons（2001））。
統計学的パターン認識における管理学習は、文書の分類、言語認識、生物測定学的認識、および遠隔知覚のような、多様な問題を解決するために効果的に用いられている（Jain, A.K.ら、「Statistical pattern recognition：A review」、IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence 22、4〜37（2000））。
本発明において、本発明者らは、ヒトの原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現を解析することによって、癌の再発予測のための採点システムを提供する。すなわち本発明は、ヒトの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を測定して、それを癌が再発した患者および癌が再発していない患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現と比較することを含む、癌の再発を予測する方法に関するものである。
発明の詳細な説明
本発明では、脳、肺、乳腺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、結腸、直腸、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、前立腺、および皮膚の腫瘍を含む、腫瘍由来のヒト組織を用いる。手術中、ヒト組織を切除した後、それらを液体窒素またはドライアイスを含むアセトン中で直ちに凍結して、O.C.T.化合物（Sakura-Seiki、東京、日本、カタログ番号4583）に包埋後または包埋せずに、使用時まで-70℃〜-80℃で保存することが好ましい。
本発明では、脳、肺、乳腺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、結腸、直腸、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、前立腺、および皮膚の腫瘍を含む、腫瘍由来のヒト組織を用いる。手術中、ヒト組織を切除した後、それらを液体窒素またはドライアイスを含むアセトン中で直ちに凍結して、O.C.T.化合物（Sakura-Seiki、東京、日本、カタログ番号4583）に包埋後または包埋せずに、使用時まで-70℃〜-80℃で保存することが好ましい。
癌再発の確率について試験する患者からの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を、RNAおよび／またはタンパク質のレベルを測定することによって解析する。多くの場合、RNAおよび／またはタンパク質のレベルは、フルオレセインおよびローダミンを含む物質からの蛍光、ルミノールからの化学発光、3H、14C、35S、33P、32P、および125Iを含む放射活性材料からの放射活性、ならびに吸光度を測定することによって決定される。RNAおよび／またはタンパク質の発現レベルは、DNAマイクロアレイ（Schena, M.ら、「Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray」、Science 270、467〜470（1995）；およびLipshutz, R.J.ら、「High density synthetic oligonucleotide arrays」、Nature Genet. 21：20〜24（1999））、RT-PCR（Weis, J.H.ら、「Detection of rare mRNAs via quantitative RT-PCR」、Trends Genetics 8、263〜264（1992）；およびBustin, S.A.、「Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays」、J. Mol. Endocrinol. 25、169〜193（2000））、ノーザンブロッティングおよびインサイチューハイブリダイゼーション（Parker, R.M.およびBarnes, N.M.、「mRNA：detection in situ and nothern hybridization」、Methods Mol. Biol. 106、247〜283（1999））、RNA分解酵素プロテクションアッセイ（Hod, Y.A.、「Simplified ribonuclease protection assay」、Biotechniques 13、852〜854（1992）；Saccomanno, C.F.ら、「A faster ribonuclease protection assay」、Biotechniques 13：846〜850（1992））、ウェスタンブロッティング（Towbin, H.ら、「Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76、4350〜4354（1979）；Burnette, W.N.、「Western blotting：Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radioiodinated protein A」、Anal. Biochem. 112：195〜203（1981））、ELISAアッセイ（Engvall, E.およびPerlman, P.、「Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）：Quantitative assay of immunoglobulin G」、Immunochemistry 8：871〜879（1971））、ならびにタンパク質アレイ（Merchant, M.およびWeinberger, S.R.、「Review：Recent advancements in surface-enhanced laser desorption /ionization-time of flight-mass spectrometry」、Electrophoresis 21：1164〜1177（2000）；Paweletz, C.P.ら、「Rapid protein display profiling of cancer progression directly from human tissue using a protein biochip」、Drug Development Research 49：34〜42（2000））を含む、公知の方法によって決定される。
試験する患者の腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現を、早期再発した癌患者と再発していない患者の場合と同様に解析することで、再発の可能性を決定する。
癌の早期再発は、異なる癌のタイプでは変わるが、通常、切除後1年または2年以内に起こる。したがって、切除後1年または2年以内に再発した癌患者からの腫瘍を、早期再発患者の腫瘍として用いることができ、切除後1年または2年までに再発していない患者からの腫瘍を、早期再発していない患者の腫瘍として用いることができる。
早期再発した癌患者と再発していない癌患者の腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたはパターンの差異を、公知の統計学的解析法によって解析し検出することができる。統計学的パターン認識における管理学習を、腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現パターンの統計的解析のために用いることができる。統計学的パターン認識における管理学習によって、調べた遺伝子および／またはタンパク質から、その発現が癌の再発を示す2個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質を選択する。
癌の再発を示すいくつかの遺伝子および／またはタンパク質を、一次元基準によって最初に選択する。次に、遺伝子および／またはタンパク質の起こりうる全ての組み合わせを考慮に入れることができるリーブワンアウト（leave-one-out）法による網羅的な検索によって、これらの遺伝子および／またはタンパク質から最適な遺伝子および／またはタンパク質のサブセットを選択する。
その発現が癌の再発の指標となる、少なくとも2個またはそれ以上、好ましくは4個またはそれ以上、より好ましくは6個またはそれ以上、および最も好ましくは12個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質の最適なサブセットを用いることによって、癌の再発を予測する式を作製する。遺伝子および／またはタンパク質の数と比較して試料の数が少ない場合でも、十分に機能する線形分類（Duda, R.O.ら、「Pattern classification」、John Wiley & Sons（2001）、およびJain, A.K.ら、「Statistical pattern recognition：A review」、IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence 22、4〜37（2000））のような単純な分類を用いて、式を作製する。
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットにも関するものである。癌の再発の指標となる、2個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質の発現パターンを調べるためのキットは、RNA抽出のための試薬、cDNAおよびcRNAの合成のための酵素、DNAチップ、オリゴヌクレオチドチップ、タンパク質チップ、解析のためのプローブおよびプライマー、制御遺伝子のDNA断片、ならびに様々なタンパク質に対する抗体を含む成分からなる。キットの成分は容易に購入することができる。例えば、オリゴヌクレオチドチップ、グアニジン-フェノール試薬、逆転写酵素、T7 RNAポリメラーゼ、およびtaqポリメラーゼを購入して、本発明のキットのために組み立てることができる。
以下の実施例は、本発明の癌再発を予測するための好ましい方法を単に説明するのであって、それらに限定されると解釈されるべきではない。
実施例
実施例1．早期肝臓内再発を解析するための患者の選択
術後の早期肝臓内再発（1年以内）は、主に肝臓内転移から生じるが、後期再発は多中心性再発となる可能性がより高いことが報告されている（Poon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。その上、肝臓内再発を有する患者の転帰は、多中心性再発を有する患者の転帰より悪かったことは周知である（Yamamoto, J.ら、「Recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery」、Br. J. Surg. 83、1219〜1222（1996）；およびPoon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。したがって、早期肝臓内再発に連鎖した遺伝子発現パターンを、術後1年以内に調べた。
実施例1．早期肝臓内再発を解析するための患者の選択
術後の早期肝臓内再発（1年以内）は、主に肝臓内転移から生じるが、後期再発は多中心性再発となる可能性がより高いことが報告されている（Poon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。その上、肝臓内再発を有する患者の転帰は、多中心性再発を有する患者の転帰より悪かったことは周知である（Yamamoto, J.ら、「Recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery」、Br. J. Surg. 83、1219〜1222（1996）；およびPoon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。したがって、早期肝臓内再発に連鎖した遺伝子発現パターンを、術後1年以内に調べた。
1997年5月から2000年1月までの間に山口大学病院において、患者33人がHCCのための外科治療を受けた。手術前に全ての患者から書面でのインフォームドコンセントを得た。研究プロトコールは、1996年5月に山口大学医学部のヒトの利用に関する院内倫理委員会によって承認された。HCCの組織病理学的診断は、術後に全ての患者において行った。組織病理学検査によって、33例のHCC試料全てにおいて残留腫瘍がないこと（R0）も判明した。表1は、国際対癌連合（UICC）のTNM分類（Sobin, L.H.およびWittekind, C.、「TNM classification of malignant Tumors」、第5版、UICC、Wiley-Liss、74〜77（1997））に基づき、患者33人の臨床病理学的特徴を示す。血清学的に、患者7人がB型肝炎表面抗原陽性であり、患者22人が抗HCV抗体陽性であり、残りの患者4人が双方に対して陰性であった。患者33人は、肝切除後3ヶ月毎に超音波検査法、コンピューター断層撮影法、およびα-フェトプロテインレベルによって癌の再発に関して追跡した。必要であれば、磁気共鳴映像および肝血管造影法を加えた。HCC患者33人中、早期肝臓内再発を12人（36％）に認めた。患者12人中11人において、再発したHCCは、残存している肝臓において多数の結節または散在性の内転移として検出された。1人の患者では、術後9ヶ月目に、切除された一次病巣に隣接した部分における単一の結節として新規腫瘍が検出され、その後多数の肺転移を認めた。残りの患者21人はいずれも、術後1年以内に肝臓内再発および他の遠位転移を示さなかった。これらの患者を2群に分けた；A群には1年以内に肝臓内再発した患者（n＝12）、およびB群には再発しなかった患者（n＝21）（表1）。カイ二乗検定およびフィッシャーの直接確率検定を用いて、2群の間の臨床病理学的要因における差を解明した。
実施例2．組織からのRNAの抽出
組織片（約125 mm3）をTRIZOL（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号15596-018）、またはSepasol-RNAI（ナカライテスク、京都、日本、カタログ番号306-55）に懸濁して、ポリトロン（キネマティカ、リッタウ、スイス）（最高速度で5秒間）によって2回ホモジナイズした。クロロホルムを加えた後、組織ホモジネートを15,000×gで10分間遠心して、RNAを含む水相を回収した。総細胞RNAをイソプロピルアルコールで沈殿させて、70％エタノールで1回洗浄し、DEPC処置水（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号10813-012）中に懸濁した。RNAを1.5単位のDNA分解酵素I（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号18068-015）によって処理した後、RNAをTRIZOL/クロロホルムで再度抽出して、エタノールで沈殿させ、DEPC処置水に溶解した。その後、RNeasyミニキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ、カタログ番号74104）を用いて、製造元の取扱説明書に従って低分子量ヌクレオチドを除去した。総RNAの品質は、アガロースゲル電気泳動後の28Sと18SリボソームRNAの比から判断した。精製した総RNAは、使用するまで70％エタノール溶液中で-80℃にて保存した。
組織片（約125 mm3）をTRIZOL（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号15596-018）、またはSepasol-RNAI（ナカライテスク、京都、日本、カタログ番号306-55）に懸濁して、ポリトロン（キネマティカ、リッタウ、スイス）（最高速度で5秒間）によって2回ホモジナイズした。クロロホルムを加えた後、組織ホモジネートを15,000×gで10分間遠心して、RNAを含む水相を回収した。総細胞RNAをイソプロピルアルコールで沈殿させて、70％エタノールで1回洗浄し、DEPC処置水（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号10813-012）中に懸濁した。RNAを1.5単位のDNA分解酵素I（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号18068-015）によって処理した後、RNAをTRIZOL/クロロホルムで再度抽出して、エタノールで沈殿させ、DEPC処置水に溶解した。その後、RNeasyミニキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ、カタログ番号74104）を用いて、製造元の取扱説明書に従って低分子量ヌクレオチドを除去した。総RNAの品質は、アガロースゲル電気泳動後の28Sと18SリボソームRNAの比から判断した。精製した総RNAは、使用するまで70％エタノール溶液中で-80℃にて保存した。
実施例3．cDNAおよび標識cRNAプローブの合成
cDNAは、製造元の取扱説明書に従って、reverse SuperScript Choiceシステム（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号18090-019）を用いて合成した。精製した総RNA 5 μgを、T7プロモーターの配列とSuperScript II逆転写酵素200単位とを含むオリゴ-dTプライマー（サワディー・テクノロジー、東京、日本）とハイブリダイズさせて、42℃で1時間インキュベートした。得られたcDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、Phase Lock Gel Light（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ、カタログ番号0032.005.101）で精製した。
cDNAは、製造元の取扱説明書に従って、reverse SuperScript Choiceシステム（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号18090-019）を用いて合成した。精製した総RNA 5 μgを、T7プロモーターの配列とSuperScript II逆転写酵素200単位とを含むオリゴ-dTプライマー（サワディー・テクノロジー、東京、日本）とハイブリダイズさせて、42℃で1時間インキュベートした。得られたcDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、Phase Lock Gel Light（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ、カタログ番号0032.005.101）で精製した。
cRNAも同様に、MEGAscriptT7キット（アンビオン、オースチン、アメリカ、カタログ番号1334）、および鋳型としてcDNAを用いて製造元の説明書に従って合成した。cDNA約5 μgを、T7ポリメラーゼ、アデノシン三リン酸（ATP）およびグアノシン三リン酸（GTP）各7.5 mM、シチジン三リン酸（CTP）およびウリジン三リン酸（UTP）各5.625 mM、Bio-11-CTPおよびBio-16-UTP（ENZOダイアグノスティックス、ファーミングデール、アメリカ、それぞれカタログ番号42818および42814）各1.875 mMを含む酵素混合物2 μlと共に、37℃で6時間インキュベートした。モノヌクレオチドおよび短いオリゴヌクレオチドをCHROMA SPIN＋STE-100カラムでのカラムクロマトグラフィー（クロンテック、パロアルト、アメリカ、カタログ番号K1302-2）によって除去し、エタノールを加えて溶出液中のcRNAを沈降させた。cRNAの品質は、アガロースゲル電気泳動後のcRNAの長さから判断した。精製したcRNAは使用するまで70％エタノール溶液中で-80℃で保存した。
実施例4．再発した患者と再発していない患者からの腫瘍の遺伝子発現解析
生存している癌患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子発現を、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって調べた（HuGeneFLアレイ、アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ、カタログ番号510137）（Lipshutz, R.L.ら、「High density synthetic oligonucleotide arrays」、Nature Genet. 21：20〜24（1999））。チップ上でのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに向けて、cRNAを、40 mMトリス（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号T1503）-酢酸（和光、大阪、日本、カタログ番号017-00256）（pH 8.1）、100 mM酢酸カリウム（和光、大阪、日本、カタログ番号160-03175）、および30 mM酢酸マグネシウム（和光、大阪、日本、カタログ番号130-00095）を含む緩衝液において95℃で35分間断片化した。ハイブリダイゼーションは、0.1 M 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸（MES）（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号M3885）（pH 6.7）、1 M NaCl（ナカライテスク、東京、日本、カタログ番号313-20）、0.01％ポリオキシレン(10)オクチルフェニルエーテル（和光、大阪、日本、カタログ番号168-11805）、ニシン精子DNA（プロメガ、マディソン、アメリカ、カタログ番号D181B）20 μg、アセチル化ウシ血清アルブミン（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号B-8894）100 μg、断片化したcRNA 10 μg、およびビオチン化対照オリゴヌクレオチド、ビオチン-5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'（サワディー・テクノロジー、東京、日本）を含む緩衝液200 μlにおいて、45℃で12時間行った。0.01 M MES（pH 6.7）、0.1 M NaCl、0.001％ポリオキシレン(10)オクチルフェニルエーテル緩衝液を含む緩衝液でチップを洗浄した後、取扱説明書（アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ）に記載されたようにハイブリダイゼーションシグナルを増大させるために、チップをビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（フナコシ、東京、日本、カタログ番号BA0500）と共にインキュベートして、ストレプトアビジンR-フィコエリスリン（モレキュラープローブズ、ユージーン、アメリカ、カタログ番号S-866）によって染色した。各ピクセルレベルをレーザースキャナ（アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ）で収集し、各cDNAの発現レベルおよび信頼性（有無の判定）を、アフィメトリクスGeneChipバージョン3.3およびアフィメトリクスMicroarray Suiteバージョン4.0ソフトウェアによって計算した。この実験から、肝癌患者のヒト原発腫瘍において6000個の遺伝子発現が明らかとなる。
生存している癌患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子発現を、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって調べた（HuGeneFLアレイ、アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ、カタログ番号510137）（Lipshutz, R.L.ら、「High density synthetic oligonucleotide arrays」、Nature Genet. 21：20〜24（1999））。チップ上でのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに向けて、cRNAを、40 mMトリス（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号T1503）-酢酸（和光、大阪、日本、カタログ番号017-00256）（pH 8.1）、100 mM酢酸カリウム（和光、大阪、日本、カタログ番号160-03175）、および30 mM酢酸マグネシウム（和光、大阪、日本、カタログ番号130-00095）を含む緩衝液において95℃で35分間断片化した。ハイブリダイゼーションは、0.1 M 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸（MES）（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号M3885）（pH 6.7）、1 M NaCl（ナカライテスク、東京、日本、カタログ番号313-20）、0.01％ポリオキシレン(10)オクチルフェニルエーテル（和光、大阪、日本、カタログ番号168-11805）、ニシン精子DNA（プロメガ、マディソン、アメリカ、カタログ番号D181B）20 μg、アセチル化ウシ血清アルブミン（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号B-8894）100 μg、断片化したcRNA 10 μg、およびビオチン化対照オリゴヌクレオチド、ビオチン-5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'（サワディー・テクノロジー、東京、日本）を含む緩衝液200 μlにおいて、45℃で12時間行った。0.01 M MES（pH 6.7）、0.1 M NaCl、0.001％ポリオキシレン(10)オクチルフェニルエーテル緩衝液を含む緩衝液でチップを洗浄した後、取扱説明書（アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ）に記載されたようにハイブリダイゼーションシグナルを増大させるために、チップをビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（フナコシ、東京、日本、カタログ番号BA0500）と共にインキュベートして、ストレプトアビジンR-フィコエリスリン（モレキュラープローブズ、ユージーン、アメリカ、カタログ番号S-866）によって染色した。各ピクセルレベルをレーザースキャナ（アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ）で収集し、各cDNAの発現レベルおよび信頼性（有無の判定）を、アフィメトリクスGeneChipバージョン3.3およびアフィメトリクスMicroarray Suiteバージョン4.0ソフトウェアによって計算した。この実験から、肝癌患者のヒト原発腫瘍において6000個の遺伝子発現が明らかとなる。
実施例5．カイネティックRT-PCR解析
遺伝子の発現も同様に、カイネティックRT-PCRによって決定する。カイネティックRT-PCRは、リアルタイム蛍光PCRシステムによって行った。ライトサイクラー（LightCycler）装置（ライトサイクラーシステム、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号2011468）を用いるPCR増幅を、ライトサイクラー・キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号1909339）において、マスター混合物および緩衝液（ライトサイクラーDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号2158825）、4 mM塩化マグネシウム（ナカライテスク、東京、日本、カタログ番号7791-18-6）、PCRプライマー（サワディー・テクノロジー、東京、日本）10 pmol、増幅された産物の鎖上で標的配列と頭部-尾部の配置でハイブリダイズするように設計された、蛍光ハイブリダイゼーションプローブ（日本ゲノムリサーチラボラトリーズ、仙台、日本）4 pmol、および鋳型cDNA 2μlからなる反応混合物20 μl中で行った。供与プローブは、3'末端を蛍光によって標識し、受容プローブは、5'末端をLC-Red640によって標識して、伸長を防止するために3'末端をリン酸化によって修飾した。供与プローブの3'末端と受容プローブの5'末端の間のギャップは1〜3塩基であった。増幅前、TaqStart抗体（クロンテック、パロアルト、アメリカ、カタログ番号5400-1）0.16 μlを反応混合物に加えて、その後、プライマーの伸長を防止するために室温で10分間インキュベートした。次に、抗体を95℃で90秒間インキュベートして不活化し、増幅は、ライトサイクラーにおいて変性を95℃で0秒間、アニーリングを57〜60℃で3〜10秒間、および伸長を72℃で10秒間を温度勾配20℃／秒の40サイクルによって行った。リアルタイムRT-PCRモニタリングは、各増幅サイクルにおいてアニーリング段階の終了時に蛍光シグナルを測定することによって行った。単離したRNAの完全性を限定し、標的配列のコピー数を標準化するために、グリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に関するカイネティックRT-PCRも同様に、ハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。標的mRNAおよびGAPDH mRNAの外部標準は、プラスミドDNAの10倍連続希釈（103〜108）によって調製した。各試料におけるmRNAの定量は、ライトサイクラー・ソフトウェア（ライトサイクラー・ソフトウェア、バージョン3、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）に従って、各時点で作製した標準曲線を参照して自動的に行った。
遺伝子の発現も同様に、カイネティックRT-PCRによって決定する。カイネティックRT-PCRは、リアルタイム蛍光PCRシステムによって行った。ライトサイクラー（LightCycler）装置（ライトサイクラーシステム、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号2011468）を用いるPCR増幅を、ライトサイクラー・キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号1909339）において、マスター混合物および緩衝液（ライトサイクラーDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号2158825）、4 mM塩化マグネシウム（ナカライテスク、東京、日本、カタログ番号7791-18-6）、PCRプライマー（サワディー・テクノロジー、東京、日本）10 pmol、増幅された産物の鎖上で標的配列と頭部-尾部の配置でハイブリダイズするように設計された、蛍光ハイブリダイゼーションプローブ（日本ゲノムリサーチラボラトリーズ、仙台、日本）4 pmol、および鋳型cDNA 2μlからなる反応混合物20 μl中で行った。供与プローブは、3'末端を蛍光によって標識し、受容プローブは、5'末端をLC-Red640によって標識して、伸長を防止するために3'末端をリン酸化によって修飾した。供与プローブの3'末端と受容プローブの5'末端の間のギャップは1〜3塩基であった。増幅前、TaqStart抗体（クロンテック、パロアルト、アメリカ、カタログ番号5400-1）0.16 μlを反応混合物に加えて、その後、プライマーの伸長を防止するために室温で10分間インキュベートした。次に、抗体を95℃で90秒間インキュベートして不活化し、増幅は、ライトサイクラーにおいて変性を95℃で0秒間、アニーリングを57〜60℃で3〜10秒間、および伸長を72℃で10秒間を温度勾配20℃／秒の40サイクルによって行った。リアルタイムRT-PCRモニタリングは、各増幅サイクルにおいてアニーリング段階の終了時に蛍光シグナルを測定することによって行った。単離したRNAの完全性を限定し、標的配列のコピー数を標準化するために、グリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に関するカイネティックRT-PCRも同様に、ハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。標的mRNAおよびGAPDH mRNAの外部標準は、プラスミドDNAの10倍連続希釈（103〜108）によって調製した。各試料におけるmRNAの定量は、ライトサイクラー・ソフトウェア（ライトサイクラー・ソフトウェア、バージョン3、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）に従って、各時点で作製した標準曲線を参照して自動的に行った。
実施例6．その発現によって早期肝臓内再発した肝癌患者と早期肝臓内再発していない患者とを区別する遺伝子セットの同定
早期肝臓内再発は、原発腫瘍の数およびTNM段階とそれぞれ、p値0.041および0.006で関連する傾向があったが、他の臨床病理学的要因とは関連しなかった（表1）。手術時の原発腫瘍の数により、A群とB群は区別されたが、その感度および特異性は限られていた（それぞれ、62％および75％）。TNM段階も同様に、A群とB群の分離に関して感度（67％）および特異性（83％）が限られていた。このように、これらの従来の分類では、早期肝臓内再発を予測することができないと考えられる。
早期肝臓内再発は、原発腫瘍の数およびTNM段階とそれぞれ、p値0.041および0.006で関連する傾向があったが、他の臨床病理学的要因とは関連しなかった（表1）。手術時の原発腫瘍の数により、A群とB群は区別されたが、その感度および特異性は限られていた（それぞれ、62％および75％）。TNM段階も同様に、A群とB群の分離に関して感度（67％）および特異性（83％）が限られていた。このように、これらの従来の分類では、早期肝臓内再発を予測することができないと考えられる。
統計学的パターン認識における管理学習を適用して、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイのデータを解析した。採点システムは、練習試料によって設計し、被験試料によってその成績を確認した（図1）。練習試料と被験試料の独立性を維持するために、練習試料と被験試料とを交換する交差検定アプローチを採用した。交差検定アプローチでは、利用可能な試料33個を練習試料30個と被験試料3個に分けた（図1、段階1）。事前確率に基づいて、A群からの試料11個とB群からの試料19個からなる練習試料のセットを10個作製した。その結果、A群の1個およびB群の2個からなる被験試料3個のセットを10個作製した。
予測採点システムを作製するために、平均差の平均値がA群とB群との間で2倍を超える有用な遺伝子50個を、フィッシャー基準（図1、段階2〜3）を用いて調べた全ての遺伝子から選択し、これを以下の式（I）によって示す：
式中、μA(i)は、A群の試料平均ベクトルμAの第i番目の成分であり、σ2 A(i)は、A群の試料の共分散行列ΣAのi番目の対角要素であり、P(A)は、A群の先験的確率である。
次に、採点システムに関して遺伝子の最適なサブセットを以下のように同定した。
フィッシャーの線形分類は、以下の式（II）において被験試料xをA群に分類するように割り当てる。
FA(x)＜FB(x)であれば、
FA(x)＜FB(x)であれば、
リーブワンアウト法において、試料の平均ベクトル、試料の共分散行列、および先験的確率を、練習試料として試料29個を用いて概算した。次に、得られたフィッシャー線形分類を、偽被験試料として残りの試料について試験した。この操作を30回繰り返した。遺伝子のそれぞれの可能なサブセットについて誤差率を計算した。例えば、遺伝子50個の中から5個を選択する場合、調べるサブセットの数は、200万個である。
次に、誤差率を最小限にする候補遺伝子サブセットを選択した（図1、段階4）。この試行を独立して10回繰り返した（図1、段階5）。
候補遺伝子サブセットにおいて、10回の試行を通じて最も頻繁に出現する遺伝子サブセットを、二つの群を識別するための遺伝子の最適なサブセットとして選択した（図1、段階6）。選択した遺伝子の最適なサブセットを用いて、評点Tは以下の式（III）によって得られる。
T(x)＝FA(x)-FB(x)
T(x)＝FA(x)-FB(x)
この採点システムにおいて、T値が負であるHCCは全てA群（早期肝臓内再発群）に分類され、T値が正であるHCCは全てB群（再発がない群）に分類される。
遺伝子の最適な数は、以下の式（IV）によって得られる基準Jに従って決定された（図1、段階7）。
基準Jは、A群のB群との分離可能性を測定する。異なる練習セット10個におけるJ値の平均値および95％信頼区間を、様々な数の遺伝子に関して計算した（図2）。分離可能性は、遺伝子数の増加と平行して良好になった。信頼区間の95％は、遺伝子数が10および12に達した場合にほとんど類似となり、12が二群の分離可能性に関して最も適当な遺伝子数であることを示している（図2）。
実施例7．その発現が早期肝臓内再発を示す遺伝子12個の最適なサブセット
上記のアルゴリズムに従って、A群とB群とを区別する遺伝子12個の最適なサブセットを同定した。最適な遺伝子サブセットは、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRA）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）誘導タンパク質A20、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質（LAPTm5）、HLA-DRα重鎖、rel癌原遺伝子、Staf50、推定のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、MADS/MEF2ファミリー転写因子（MEF2C）、3p21.3由来のHUMLUCA19ヒトコスミドクローンLUCA19、DEADボックスタンパク質p72、ビメンチン、およびKIAK0002からなった（表2）。選択した遺伝子12個の中で、11個の発現はA群において下方制御された；A群におけるこれらの遺伝子の平均差の平均値は、B群の平均値の半分以下であった（図3）。対照的に、HUMLUCA19遺伝子発現はA群において上方制御された；A群におけるHUMLUCA19遺伝子の平均差の平均値は、B群と比較して3倍より多く増加した（図3）。早期肝臓内再発を予測するための採点システムの精度を、被験試料3個の異なる10セットについて評価した（図4）。HCCの早期再発は、HCC患者からの遺伝子12個のT値を計算することによって予測する。術後1年以内の再発は、T値がゼロ未満である場合に非常に可能性が高く、術後1年以内の再発はT値がゼロより高ければかなり可能性が低い。採点システムは、10回の試行全てにおいて被験試料3個の早期肝臓内再発を完全に予測することができた（図4）。採点システムは、ウイルス感染パターンとは独立しており、TNM分類システムよりはるかに正確であった（図4）。上記の遺伝子12個によるHCC33例全てに基づく採点システム（図5）には、以下の式（V）が含まれる。
式（V）
T(x)＝0.053862x1＋0.038848x2＋0.030176x3＋0.001824x4＋0.096997x5＋0.017259x6＋0.015908x7＋0.103081x8-0.093746x9＋0.024031x10-0.005417x11-0.119177x12-11.046007、
式中、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10、x11、x12は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRA）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）誘導タンパク質A20、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質（LAPTm5）、HLA-DRα重鎖、rel癌原遺伝子、Staf50、推定のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、MADS/MEF2ファミリー転写因子（MEF2C）、3p21.3由来のHUMLUCA19ヒトコスミドクローンLUCA19、DEADボックスタンパク質p72、ビメンチン、およびKIAK0002遺伝子に関するmRNAの標準化した平均差である（表2）。
上記のアルゴリズムに従って、A群とB群とを区別する遺伝子12個の最適なサブセットを同定した。最適な遺伝子サブセットは、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRA）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）誘導タンパク質A20、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質（LAPTm5）、HLA-DRα重鎖、rel癌原遺伝子、Staf50、推定のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、MADS/MEF2ファミリー転写因子（MEF2C）、3p21.3由来のHUMLUCA19ヒトコスミドクローンLUCA19、DEADボックスタンパク質p72、ビメンチン、およびKIAK0002からなった（表2）。選択した遺伝子12個の中で、11個の発現はA群において下方制御された；A群におけるこれらの遺伝子の平均差の平均値は、B群の平均値の半分以下であった（図3）。対照的に、HUMLUCA19遺伝子発現はA群において上方制御された；A群におけるHUMLUCA19遺伝子の平均差の平均値は、B群と比較して3倍より多く増加した（図3）。早期肝臓内再発を予測するための採点システムの精度を、被験試料3個の異なる10セットについて評価した（図4）。HCCの早期再発は、HCC患者からの遺伝子12個のT値を計算することによって予測する。術後1年以内の再発は、T値がゼロ未満である場合に非常に可能性が高く、術後1年以内の再発はT値がゼロより高ければかなり可能性が低い。採点システムは、10回の試行全てにおいて被験試料3個の早期肝臓内再発を完全に予測することができた（図4）。採点システムは、ウイルス感染パターンとは独立しており、TNM分類システムよりはるかに正確であった（図4）。上記の遺伝子12個によるHCC33例全てに基づく採点システム（図5）には、以下の式（V）が含まれる。
式（V）
T(x)＝0.053862x1＋0.038848x2＋0.030176x3＋0.001824x4＋0.096997x5＋0.017259x6＋0.015908x7＋0.103081x8-0.093746x9＋0.024031x10-0.005417x11-0.119177x12-11.046007、
式中、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10、x11、x12は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRA）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）誘導タンパク質A20、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質（LAPTm5）、HLA-DRα重鎖、rel癌原遺伝子、Staf50、推定のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、MADS/MEF2ファミリー転写因子（MEF2C）、3p21.3由来のHUMLUCA19ヒトコスミドクローンLUCA19、DEADボックスタンパク質p72、ビメンチン、およびKIAK0002遺伝子に関するmRNAの標準化した平均差である（表2）。
本発明によって選択された遺伝子12個は、広範囲の生物学的過程に関与している。これらの中で、HLA-DRα重鎖、TNF-α誘導タンパク質A20、およびStaf50のような免疫応答関連遺伝子は、早期肝臓内再発を有するHCCにおいて下方制御された。HLC-DRα重鎖は、マクロファージによる抗原提示において重要な役割を果たすと考えられることから（Tissot, C.およびMechti, N.、「Molecular cloning of a new interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat expression」、J. Biol. Chem. 270：14891〜14898（1995））、腫瘍状組織において下方制御されると、宿主の免疫監視から腫瘍細胞が容易に逃れることができる可能性がある。NF-κBと同様に細胞内シグナル伝達経路に関与しているRel癌原遺伝子もまた、早期肝臓内再発を有するHCCにおいて下方制御された。さらに、rel/NF-κBの発現は、T細胞活性化に関連すると報告されている（Mora, A.ら、「NF-kappa B/Rel participation in the lymphokine-dependent proliferation of T lymphoid cells」、J. Immunol. 166：2218〜2227（2000））。このように、本発明によって早期肝臓内再発を予測するために用いるように選択されたいくつかの遺伝子は、高い転移能を有するHCC細胞に対する宿主免疫応答を弱めることに関与していると考えられる。
追跡期間が最近1年に達した他のHCC患者の遺伝子発現パターンも同様に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって解析して、遺伝子12個の発現の評点を上記の式に従って計算した。術後1年を超えても再発せずに生存している患者のT値は陽性（正の評点）であり、術後1年以内に肝臓内再発した他の患者のT値は陰性（負）であった。このように、6000個から得られた遺伝子12個のサブセットからなる採点システムは、早期肝臓内再発を正確に予測することができる。統計学的パターン認識における管理学習の臨床標本への応用は、HCCのみならず他の疾患の予防、診断、および治療の進歩において重要な情報を提供しうる。さらに、DNAマイクロアレイのみならず、RT-PCRのような他の方法も、遺伝子の最適なセットの発現を決定するために用いることができる。
（表１）早期肝臓内再発に対して用いられるHCCの臨床病理学的要因
＊ UICCのTNM分類に基づく評価
HBV：B型肝炎ウイルス、HCV：C型肝炎ウイルス、非B非C：HBVでもHCVでもない、A群：早期肝臓内再発（＋）、B群：早期肝臓内再発（-）
N.S.：有意差なし
HBV：B型肝炎ウイルス、HCV：C型肝炎ウイルス、非B非C：HBVでもHCVでもない、A群：早期肝臓内再発（＋）、B群：早期肝臓内再発（-）
N.S.：有意差なし
（表２）早期肝臓内再発を予測するための式および12個の遺伝子
GB＊：Gene bankアクセス番号
Claims (9)
- （a）再発したおよび再発していない複数のヒト癌患者から調製された癌組織において、遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたは発現パターンを調べる工程；および
（b）工程（a）で調べた、再発したヒト癌患者から調製された癌組織における遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたは発現パターンと、再発していないヒト癌患者から調製された癌組織における遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたは発現パターンとの間で、平均差の平均値が所定の閾値を超える2個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質をフィッシャー基準により選択する工程；
を含む、癌再発の予測に用いるための遺伝子および／またはタンパク質の選択方法。 - 再発したおよび再発していない患者から調製されたヒト原発癌組織の遺伝子の発現を、DNAマイクロアレイまたは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって調べる、請求項1に記載の方法。
- 再発したおよび再発していない患者から調製されたヒト原発癌組織のタンパク質の発現を、タンパク質アレイによって調べる、請求項1に記載の方法。
- フィッシャー基準により選択された遺伝子および／またはタンパク質の数が4個またはそれ以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- フィッシャー基準により選択された遺伝子および／またはタンパク質の数が6個またはそれ以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- フィッシャー基準により選択された遺伝子および／またはタンパク質の数が12個またはそれ以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 癌再発が早期肝臓内癌再発である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 癌組織が肝癌組織である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 工程（b）の後に、（b-2）リーブワンアウト法による網羅的な検索によって、工程（b）で選択された遺伝子および／またはタンパク質から遺伝子および／またはタンパク質の候補サブセットを選択する工程；および（b-3）候補サブセットにおいて、（b）から（b-2）の工程を独立して繰り返す試行を通じて最も頻繁に出現する遺伝子および／またはタンパク質のサブセットを選択する工程を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2001/006330 WO2003010337A1 (en) | 2001-07-23 | 2001-07-23 | Scoring system for the prediction of cancer recurrence |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004536610A JP2004536610A (ja) | 2004-12-09 |
| JP4353796B2 true JP4353796B2 (ja) | 2009-10-28 |
Family
ID=11737575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003515687A Expired - Lifetime JP4353796B2 (ja) | 2001-07-23 | 2001-07-23 | 癌の再発予測のための採点システム |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7747389B2 (ja) |
| EP (1) | EP1409716B1 (ja) |
| JP (1) | JP4353796B2 (ja) |
| CN (1) | CN100398663C (ja) |
| AT (1) | ATE318935T1 (ja) |
| CA (1) | CA2455649C (ja) |
| DE (1) | DE60117555T2 (ja) |
| ES (1) | ES2254450T3 (ja) |
| WO (1) | WO2003010337A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2254450T3 (es) | 2001-07-23 | 2006-06-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Sistema de evaluacion para predecir la recidiva del cancer. |
| GB2398379A (en) * | 2003-02-11 | 2004-08-18 | Qinetiq Ltd | Automated digital image analysis |
| JP4698228B2 (ja) | 2003-04-08 | 2011-06-08 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 腫瘍の分化段階を規定する方法 |
| WO2004092365A1 (ja) * | 2003-04-13 | 2004-10-28 | Kyushu Tlo Company Limited | 肝障害関連遺伝子群の抽出選択法およびそれを用いた肝障害もしくは肝機能評価・診断方法 |
| US20050112622A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-05-26 | Ring Brian Z. | Reagents and methods for use in cancer diagnosis, classification and therapy |
| EP1661991A4 (en) * | 2003-08-24 | 2007-10-10 | Univ Nihon | WITH HEPATOCELLULAR CARCINOMA ASSOCIATED GEN |
| FR2861744A1 (fr) * | 2003-11-05 | 2005-05-06 | Biomerieux Sa | Procede pour le pronostic du cancer du sein |
| US8135595B2 (en) | 2004-05-14 | 2012-03-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Computer systems and methods for providing health care |
| FR2881143B1 (fr) * | 2005-01-27 | 2010-12-17 | Librophyt | Systeme de production de terpenoides dans les plantes |
| US20070072175A1 (en) * | 2005-05-13 | 2007-03-29 | Biogen Idec Ma Inc. | Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof |
| KR101133243B1 (ko) * | 2009-10-29 | 2012-04-06 | 국립암센터 | 암의 진단 및 치료를 위한 ｅＩＦ３ｍ의 용도 |
| CN104200060A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-12-10 | 福建医科大学附属第一医院 | 预测巨大肝癌患者术后近期复发转移概率的模型及方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5862304A (en) | 1990-05-21 | 1999-01-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for predicting the future occurrence of clinically occult or non-existent medical conditions |
| US6025128A (en) | 1994-09-29 | 2000-02-15 | The University Of Tulsa | Prediction of prostate cancer progression by analysis of selected predictive parameters |
| US5800347A (en) | 1995-11-03 | 1998-09-01 | The General Hospital Corporation | ROC method for early detection of disease |
| EP0957749A2 (en) | 1995-09-12 | 1999-11-24 | The General Hospital Corporation | Method for early detection of ovarian cancer |
| AU7830598A (en) | 1997-06-10 | 1998-12-30 | Michael A. Levine | Methods for thyroid cell detection |
| US6128608A (en) * | 1998-05-01 | 2000-10-03 | Barnhill Technologies, Llc | Enhancing knowledge discovery using multiple support vector machines |
| DE19840671A1 (de) * | 1998-08-26 | 2000-03-02 | Stiftung Tumorbank Basel | Verfahren zur Diagnose von Rezidiven bei nodal-negativem Brustkrebs |
| US6647341B1 (en) | 1999-04-09 | 2003-11-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for classifying samples and ascertaining previously unknown classes |
| JP2003503770A (ja) | 1999-06-29 | 2003-01-28 | インターセット リミテッド | ヒト癌仮想シミュレーション装置 |
| WO2001018542A2 (en) * | 1999-09-03 | 2001-03-15 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer |
| EP1283904A2 (en) | 1999-11-03 | 2003-02-19 | Oncotech, Inc. | Cancer diagnosis using cell-sorting and gene-expression-profiles |
| US6703202B2 (en) | 1999-11-30 | 2004-03-09 | Oxo Chemie Ag | Evaluating and predicting clinical outcomes by gene expression analysis |
| WO2002077895A2 (en) * | 2001-03-26 | 2002-10-03 | Epigenomics Ag | Method for epigenetic feature selection |
| US6728642B2 (en) | 2001-03-29 | 2004-04-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method of non-linear analysis of biological sequence data |
| WO2002103030A2 (en) * | 2001-06-14 | 2002-12-27 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Multidimensional biodata integration and relationship inference |
| ES2254450T3 (es) | 2001-07-23 | 2006-06-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Sistema de evaluacion para predecir la recidiva del cancer. |
| JP4698228B2 (ja) | 2003-04-08 | 2011-06-08 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 腫瘍の分化段階を規定する方法 |
-
2001
- 2001-07-23 ES ES01951968T patent/ES2254450T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 CN CNB018236588A patent/CN100398663C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 AT AT01951968T patent/ATE318935T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-07-23 JP JP2003515687A patent/JP4353796B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 WO PCT/JP2001/006330 patent/WO2003010337A1/en active IP Right Grant
- 2001-07-23 DE DE60117555T patent/DE60117555T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 EP EP01951968A patent/EP1409716B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 US US10/484,664 patent/US7747389B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-23 CA CA002455649A patent/CA2455649C/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-04-13 US US12/759,263 patent/US8655597B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1549864A (zh) | 2004-11-24 |
| JP2004536610A (ja) | 2004-12-09 |
| CN100398663C (zh) | 2008-07-02 |
| US8655597B2 (en) | 2014-02-18 |
| DE60117555T2 (de) | 2007-01-11 |
| ES2254450T3 (es) | 2006-06-16 |
| EP1409716A1 (en) | 2004-04-21 |
| WO2003010337A1 (en) | 2003-02-06 |
| CA2455649C (en) | 2009-11-10 |
| EP1409716B1 (en) | 2006-03-01 |
| US20120065892A1 (en) | 2012-03-15 |
| ATE318935T1 (de) | 2006-03-15 |
| DE60117555D1 (de) | 2006-04-27 |
| US20040234988A1 (en) | 2004-11-25 |
| CA2455649A1 (en) | 2003-02-06 |
| US7747389B2 (en) | 2010-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8655597B2 (en) | Scoring system for the prediction of cancer recurrence | |
| JP6908571B2 (ja) | 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験 | |
| JP6824923B2 (ja) | 胃腸癌での増殖の徴候及び予後 | |
| KR101579934B1 (ko) | 직장결장암용 예후 예측 | |
| JP5486719B2 (ja) | 結腸直腸癌の予後のための遺伝子発現マーカー | |
| JP2024009859A (ja) | 変異に基づく病気の診断および追跡 | |
| US9476098B2 (en) | Multigene prognostic assay for lung cancer | |
| US9347088B2 (en) | Molecular signature of liver tumor grade and use to evaluate prognosis and therapeutic regimen | |
| WO2015073949A1 (en) | Method of subtyping high-grade bladder cancer and uses thereof | |
| AU2018200973B2 (en) | Prognosis prediction for colorectal cancer | |
| JP4698228B2 (ja) | 腫瘍の分化段階を規定する方法 | |
| van der Stok et al. | mRNA expression profiles of colorectal liver metastases as a novel biomarker for early recurrence after partial hepatectomy | |
| EP2138589A1 (en) | Molecular signature of liver tumor grade and use to evaluate prognosis and therapeutic regimen | |
| KR20200129562A (ko) | 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예측 마커 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070810 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071108 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090306 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090311 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090611 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090612 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090706 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090728 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4353796 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130807 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |