JP4350925B2

JP4350925B2 - Novel Lactobacillus bacteria and primers or probes specific to the bacteria

Info

Publication number: JP4350925B2
Application number: JP2001374612A
Authority: JP
Inventors: 早苗岡田; 寛人森田; 幸一渡辺; 佳美丸山
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2009-10-28
Anticipated expiration: 2021-12-07
Also published as: JP2003169680A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ラクトバチルス属細菌であるラクトバチルス・アシディファリナリウス（Lactbacillus acidifarinarius）（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８５７７）および本菌に特異的なプライマー、新規ラクトバチルス属細菌の同定方法および新規ラクトバチルス属細菌の検出方法に関するもので、主として世界的に有名なパネトーネ（イタリアンケーキ）の製造に極めて有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
世界的に有名なイタリアンケーキであるところのパネトーネの製造は、古来、イタリアのミラノを中心とした地方で伝承的に引き継がれており、その根源はアルプス山麓のコモ湖周辺であるといわれている。その元種は不安定であり、伝統的な植え継ぎ方法で培養されていて、その醗酵作用とケーキ独特の風味・食感・長期間の日持ち等が良好であることの原因については明らかでない。もちろんこの元種には何らかの微生物の作用が関与し、醗酵作用とその独特の風味、食感、長期保存性の原因をなしていると考えられている。
【０００３】
この件に関しては、上記パネトーネ元種中の微生物中特に重要な醗酵作用をするものの１つとして、サンフランシスコサワーパンの製造に関係があるとの報告が既になされているサッカロミセス・イグジグース（Saccharomyces exiguus）がある（特公昭５８−５８０７０号公報）。また、上記パネトーネ元種中に独特の風味を与えるものとして乳酸菌であるところのラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）が存在するという報告がある。この乳酸菌はサンフランシスコサワーパンにおいても重要なものであり、Ｄｒ．スギハラ（Applied Microbiology ２１、４６５〜４５９（１９７１））によってその微生物的性質が詳しく報告されている。さらに舟橋はラクトバチルス・サンフランシスエンシスと生成乳酸の旋光性が異なる乳酸菌を上記元種中に発見し、この乳酸菌については新菌種ラクトバチルス・コモエンシス（L. comoensis）として報告している（特公平４−４８６９号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、イタリアンケーキの特殊な味、香り、食感、日持ちの良さに関与する微生物は上記のもののみではなく、他に何らかの微生物の作用があると本発明者等は推察していた。そして本発明者等の研究の結果、その微生物が何であるかを見出すことができた。それは乳酸菌の一種ではあるが、未だに報告されていない乳酸菌であることが分かった。
【０００５】
本発明の第１の目的は、上記のごとき経過から、上記のサッカロミセス・イグジグース、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス、ラクトバチルス・コモエンシスの他にイタリアンケーキであるところのパネトーネ独特の風味、香り、食感、日もち性の良さを左右する元種中の微生物である新菌種を提供することである。
【０００６】
さらに、本発明の第２の目的は、見出した新規ラクトバチルス属細菌について菌種レベルで特異的に同定できるプライマーもしくは検知できるプローブを合成し、これを用いて新規ラクトバチルス属細菌を迅速、簡便に解析することができるようなプライマーまたはプローブを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記パネトーネの元種に存在する微生物が何であるかを研究中、生理・生化学的性状および１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の特異配列により、これらのものの一つは新規ラクトバチルス属細菌であることを見出し本発明を成すに至った。
さらに本発明者等は、新規ラクトバチルス属細菌であるところのラクトバチルス・アシディファリナリウスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行い、本菌に特異的な塩基配列に従い合成した配列番号１および２のＤＮＡプライマーで本菌を特異的に検出できることを見出し、本発明を成すに至った。これを用いることで、生理・生化学的性状の確認など煩雑な操作を行うことなく検体から抽出した本菌由来のＤＮＡを使ったＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に新規ラクトバチルス属細菌の同定・解析を行う事が可能となった。
【０００８】
すなわち本発明の請求項１記載の発明は、配列番号１または２で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有する新規ラクトバチルス属細菌であるところのラクトバチルス・アシディファリナリウス（Lactobacillus acidifarinarius 受託番号ＦＥＲＭＰ−１８５７７）であって、下記の菌学的性質を有することを特徴とする。
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度１５〜３７℃
（８）生育ｐＨ３．５〜８．０
（９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。
（10）細胞壁 L-Lys-D-Asp型
（11）ＧＣ含量５１．２−５１．７ｍｏｌ％
(12) ＭＹＰ寒天培地での２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
【００１０】
本発明の請求項２記載の発明は、配列番号１または２で表される塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有し、請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なDNAプライマーまたはプローブである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における新規ラクトバチルス属細菌であるところのラクトバチルス・アシディファリナリウスの性質は以下の通りである。
（１）形態的性質
ＭＹＰ培地での２４時間培養で２．０〜５．０×０．４μｍの長桿菌で単一または連鎖状に存在する。胞子は形成せず、非運動性で、グラム陽性である。
ＭＹＰ培地の組成は下記の通りである。
マルトース１０ｇ
酵母エキス１０ｇ
ペプトン５ｇ
肉エキス２ｇ
酢酸ナトリウム3水和物２ｇ
硫酸マグネシウム２００ｍｇ
硫酸マンガン１０ｍｇ
硫酸第一鉄１０ｍｇ
塩化ナトリウム１０ｍｇ
Tween 80 ０．２５ｇ
水１０００ｍｌ
１N HClでpH５．０に調整
【００１４】
（２）培養的性質
(1)ＭＹＰ寒天平板培地
ＭＹＰ寒天培地はＭＹＰ培地１０００ｍｌにさらに寒天12ｇを添加されてなる培地である。
２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
(2)ＭＹＰ培地（液体培地）
３０℃、２日培養で菌体が増殖して培地が白濁し、綿毛状の沈殿を生ずる。
(3)ＭＹＰ寒天培地（穿刺培養）
穿刺によって一様に生育、表面にも生育する。
【００１５】
（３）生理・生化学的性質
(1)生育温度１５〜３７℃、４５℃では生育せず
(2)生育ｐＨ域３．５〜８．０
(3)酸素との関係
通性嫌気性。酸素存在下でも嫌気的条件でも生育できる。
(4)生育必須物質
上記ＭＹＰ培地中、不飽和脂肪酸を必須要求する。
(5)糖類醗酵性
フラクトース、ガラクトース、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノース、グルコン酸ナトリウムからは酸及びガスを生成する。しかしセロビオース、ラクトース、マンノース、メレジトース、メリビオース、ラフィノース、ラムノース、サリシン、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンニトール、でんぷんからは酸及びガスを生成しない。
(6)リトマスミルク：不変
(7)硝酸塩の還元：陰性
(8)ゼラチンを液化しない
(9)脱窒反応：陰性
(10) ウレアーゼ：陰性
(11) カタラーゼ：陰性
(12) オキシダーゼ：陰性
(13) インドール生成：陰性
(14) 硫化水素：陰性
(15) でんぷんを加水分解しない
(16) ＶＰ反応：陰性
(17) グルコース及びマルトースからの生成物
L(+)−乳酸、D(+)−乳酸、エタノール
【００１６】
上記の菌はグラム陽性、無胞子、通性嫌気性、カタラーゼ陰性の桿菌であり、糖から乳酸とエタノールを生成することから、絶対ヘテロ醗酵型（obligatoryheterofermentative)のラクトバチルス属に属するものと考えられる。
【００１７】
またラクトバチルス・アシディファリナリウスの分類学的位置を確認する為に、16SrRNA遺伝子の塩基配列データと既知種の配列データとを比較し系統解析を行った。系統樹の作成方法は次の通りである。まず細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌からＤＮＡを抽出する方法は様々であるが、一般的には細胞をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法やガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す処理方法などが用いられる。また抽出用の試薬も市販されている。しかしながらＰＣＲ法にてゲノムＤＮＡを鋳型として用いる場合、ＤＮＡを必ずしもインタクトな状態で抽出する必要はない。よって試料のコンタミネーションの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行う事のできる方法を選ぶ事ができる。
【００１８】
次にＰＣＲ法により１６ＳｒＲＮＡをコードする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ法は基本的には反対鎖とハイブリッド形成し、かつ鋳型ＤＮＡ上の標的領域に隣接する２つのプライマーを利用して特定の遺伝子配列を酵素合成する方法である。鋳型ＤＮＡの変成、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長というサイクルを繰り返す事により特定の遺伝子配列を含む断片を指数的に増幅する事ができる。
【００１９】
次に、ＰＣＲ法で得られた増幅断片を精製する。増幅したＤＮＡはスピンカラム（spin column）を用いて精製する方法が好ましい。
【００２０】
次に精製した増幅断片の塩基配列を決定する。ＤＮＡの塩基配列を決定する方法には、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの合成反応を塩基特異的に停止させるジデオキシ法と、塩基特異的な化学修飾を用いる化学分解法がある。現在はＤＮＡシークエンス法の中でも操作が簡単でキット類も市販されているジデオキシ法によって、ダイレクトにシークエンスする方法が一般的であり、すでにＤＮＡシークエンサーにより自動化されている。
【００２１】
最後に、増幅したＤＮＡの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、ラクトバチルス・アシディファリナリウスの分類学的位置を特定する。分子進化系統樹解析ソフトがインターネット等でも公開されており利用する事が可能である（CLUSTAL W：DDBJ等）。
【００２２】
以上ラクトバチルス・アシディファリナリウスの分類学的位置を特定した結果、本菌は分類学上他種とは別の独立したクラスターを形成しており、これまで報告されているどの種にもあてはまらなかった。
【００２３】
上記の理由から本発明者等は本菌を新規ラクトバチルス属細菌とみなし、ラクトバチルス・アシディファリナリウスと命名した。なおラクトバチルス・アシディファリナリウスの菌学的性質および新規ラクトバチルス属細菌として命名した準拠については以下に示す通りである。同定の方法は「乳酸菌実験マニュアル」（朝倉書店）に従った。また分類同定の基準としてバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジーＶｏｌ．２（１９８６）を参照した。
【００２４】
こうした特性を有するラクトバチルス・アシディファリナリウスは、例えばパン製造に用いられるパネトーネ元種から公知の方法により単離する事ができる。すなわち元種を滅菌した生理食塩水にて段階的に希釈し、ＭＹＰ寒天培地などの分離用寒天培地に混釈、培養する方法である。上記により得られたラクトバチルス・アシディファリナリウスはＦＥＲＭＰ−１８５７７として平成１３年１１月２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託している。
【００２５】
またラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析にはＰＣＲ法などの手段が必要となる為、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いた。
【００２６】
プライマー設計の際には本菌に近縁の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を収集し、塩基配列の整列（アライメント）を実施した。アライメントにはインターネットで公開されているアライメントソフト（CLUSTAL Ｗ：DDBJ）を利用する事ができる。その結果、大腸菌のナンバリングシステムにおけるポジションでフォワード：65‐79、リバース：250‐232にラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的な箇所があったので、この領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。
【００２７】
このようにして得られたプライマーである配列表に示した配列番号１および２記載の塩基配列を有するものはラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、本菌の同定、解析を行う為のプライマーとして使用する事ができる。
【００２８】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成できる。その特異性は以下の実施例に示す近縁種のＤＮＡに対するプライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として特異性に問題はなかった。
【００２９】
本発明のプライマーは、このようにラクトバチルス・アシディファリナリウスへの特異性を有するため、培地に形成したコロニーを釣菌、培養した菌体からDNAを抽出し、本プライマーとの反応性を調べる事によって菌の簡易同定を行う事ができる。例えばまず培養液１ｍｌを遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法などによってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行う事により、菌に特異的なDNA配列（ＰＣＲ産物）を得る事ができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無により本菌を同定する事ができる。
【００３０】
また本発明のプライマーを用いれば培養を行うことなく各種サワー種およびその他生地中における本菌の同定を行う事が可能である。この場合は極少量のサンプルを１．５ｍｌのエッペンチューブにとり、塩化ベンジル法にて直接ＤＮＡを抽出、その後は上記と同様の方法により本菌の同定を行う。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明の内容をさらに具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
本菌の培養方法
培地には目的に応じて寒天培地及び液体培地が使用できる。ラクトバチルス・アシディファリナリウス菌体の培養には、前述のＭＹＰ培地が最適である。酢酸ナトリウム添加は生育の促進に有効である。また、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化ナトリウムなどの無機塩類の添加も生育促進に有効である。
本菌は不飽和脂肪酸を必須要求するので、オレイン酸、ツイーン８０などの添加が必要である。培養温度は１５℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３０℃で、ｐＨ３．５〜８．０、好ましくはｐＨ４．０〜８．０である。具体的に本菌について実施例で説明すれば、パネトーネ元種１ｇを滅菌した０．８５％塩化ナトリウム水溶液５０ｍｌ中に懸濁した。その後段階的に希釈を行い、シャーレに１ｍｌずつ採り、その後溶解した寒天培地（１０ｐｐｍのシクロヘキシミドおよび１０ｐｐｍのアジ化ナトリウムを加えたもの）を流し込み混和した。寒天が固まった後、シャーレを３０℃で４〜５日間培養し形成したコロニーを分離した。分離した菌株の同定は本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウス特異的プライマーを用いて行った。
【００３２】
（実施例２）
本菌の系統解析
本菌の系統解析は次のように行った。塩化ベンジル法にて本菌より抽出したＤＮＡより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ反応により増幅した。得られたＰＣＲ産物をPCR Kleen spin Columns (BIO-RAD)を用いて精製した後、１２種のプライマーを用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応は BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (ABI) を用いて行い、ABI PRISM 310 Automatic sequencer を用いて塩基配列を読み取った。各プライマーによって得られた配列データはオーバーラップ部分をつなげて連続したＤＮＡ配列データとした。データはCLUSTAL X（DDBJ）を用いて多重アライメントを行い、この結果に基づいて系統樹を作成したところ新規ラクトバチルス属細菌であるとの結果が得られた。
得られた系統樹を図１に示す。
【００３３】
(実施例3)
ラクトバチルス・アシディファリナリウス特異的プライマーの作成
プライマー設計の際にはラクトバチルス・アシディファリナリウスおよび本菌の近縁菌であるL. brevis、L. plantarum、L. hilgardii、L. collinoides、L. vermiformおよびE. coliの16SrRNA遺伝子配列をアライメントし、ラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的な領域をターゲットとしてPCRプライマーを設計した（表１に本菌種と近縁種とのアライメントの結果得られた特異箇所を示す）。
【００３４】
【表１】

【００３５】
その結果、表２に示したように配列番号１および２の塩基配列を有するラクトバチルス・アシディファリナリウスの特異的プライマーが設計できた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーの合成を行った。
【００３６】
【表２】

【００３７】
プライマーの特異性の確認
上記のように設計したプライマーの特異性を、本菌および近縁種であるL. brevis 、L. collinoides、L. plantarumおよび近縁種以外のL. farciminis 、L. casei、L. sanfranciscensis 、L. kimuchii 、L. fermentumの基準株について、プライマーのPCR反応によるバンド形成能を指標として確認した。
【００３８】
各菌の培養は以下のように行った。
各菌はMYPもしくはMRS培地（Difco）にて２４時間培養した。培養液１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンチューブに採取後遠心分離し、塩化ベンジル法にてＤＮＡを抽出した後でＰＣＲ反応を行った。
【００３９】
ＰＣＲ反応は以下のように行った。
10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP mixture、1.2μM(PrimerF,PrimerRともに)、1.0u Taq DNA polymerase(Takara EX)、D.W.19.7μl、10ng鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine Model PTC-200,MJ RESERCH,INC）により、９４℃２分の後、９４℃４５秒、６５℃２分、７２℃２分を２９回サイクル、さらに７２℃１０分のＰＣＲ反応を行った。
【００４０】
上で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーと各菌株のＤＮＡとの結合能を確認してプライマーの特異性を判定した。１％AgaroseLO3（宝酒造株式会社製）でミューピットにより１００Ｖ３０分間電気泳動し、Ethidium Bromideで染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果プライマーはラクトバチルス・アシディファリナリウスにのみ特異的にバンドを形成した。結果をまとめて表３に示す。
【００４１】
【表３】

【００４２】
（実施例４）
特異的プライマーによるラクトバチルス・アシディファリナリウスの同定
本発明のプライマーは、このようにラクトバチルス・アシディファリナリウスへの特異性を有するため、これを用いて分離した菌の菌種同定およびパネトーネ元種中のラクトバチルス・アシディファリナリウスの存在を迅速に確認した。
まず培養菌体またはごく少量のパネトーネ元種サンプルから塩化ベンジル法によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより本菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得た。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動した結果、バンドが形成されており、培養物中でのラクトバチルス・アシディファリナリウスを同定する事ができた。
【００４３】
各菌の特異的プライマーを用いたパネトーネ元種中に存在する菌の調査
国内３箇所で使用されているパネトーネ元種について菌の調査を行った。調査はL. brevis、L. farciminis、L. casei、L. sanfranciscensis、L. plantarum、L. kimuchii、L. fermentumおよび本菌それぞれの特異的プライマーを用いて、PCR法により各菌の存在を調査した。
その結果、表４に示すように、パネトーネ元種３種類ともにL.sanfranciscensisおよびL. acidifarinariusの特異的プライマーを使用した場合のみでバンドが認められ、この２種類の菌が複数のパネトーネ元種中に存在することが明らかとなった。
【００４４】
【表４】

【００４５】
（実施例５）
新規ラクトバチルス属細菌であるラクトバチルス・アシディファリナリウスを添加したパネトーネの製造
酵母であるサッカロミセス・イグジグース、乳酸菌であるラクトバチルス・サンフランシスコおよびラクトバチルス・コモエンシスを含む小麦粉生地に、別に培養しておいたラクトバチルス・アシディファリナリウスを添加して元種とした。この元種を醗酵させ、その他原料を添加、成形、醗酵、焼成、冷却工程を経てパネトーネを製造した。その結果、保存性が良く、風味および食感に優れたパネトーネが製造できた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスは、イタリアンケーキであるところのパネトーネ元種中から分離・発見された新規ラクトバチルス属細菌である。本研究の結果、パネトーネ元種中には舟橋らが報告したサッカロミセス・イグジグース、ラクトバチルス・サンフランシスコ、ラクトバチルス・コモエンシス３菌種だけでなく、本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウスを含めた計４種類の微生物が存在することにより、パネトーネ独特の風味、食感と長期間の日持ち性が生ずるものであることがわかった。これまで従来のイタリア北部の伝承的な秘法によって作られていたパネトーネが、本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウスの利用により広く世界の国々で作られるようになるという段階に来たことは、本菌の持つ大きな効果ということができる。
本発明のラクトバチルス・アシディファリナリウスは、下記の菌学的性質を有することを特徴とするものであり、これら性質により他の菌と区別できるという顕著な効果を奏する。
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度１５〜３７℃
（８）生育ｐＨ３．５〜８．０
（９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。
（10）細胞壁 L-Lys-D-Asp型
（11）ＧＣ含量５１．２−５１．７ｍｏｌ％
(12) ＭＹＰ寒天培地での２５℃、４日間培養で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、半透明の乳白色コロニーを形成する。
【００４８】
また本発明の請求項２記載の発明は、配列番号１または２で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有し、新規ラクトバチルス属細菌であるところの請求項１記載のラクトバチルス・アシディファリナリウスに特異的なDNAプライマーまたはプローブである。本菌特異的プライマーまたはプローブを作成したことにより、生理・生化学的性状の確認など煩雑な操作を行うことなく検体から抽出した本菌由来のDNAのPCR反応により、培養液中、元種および生地中に本菌が存在するかどうかが迅速、簡便かつ高精度に調査できるようになった。本発明のプライマーまたはプローブは、今後様々なサワー種を調査するにあたり大変有用であるということができる。
【００５１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規ラクトバチルス属細菌の系統樹を示す説明図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to Lactbacillus acidifarinarius (accession number FERM P-18777) which is a novel Lactobacillus genus bacterium, a primer specific to the bacterium, a method for identifying a novel Lactobacillus genus, and a novel Lactobacillus The present invention relates to a method for detecting genus bacteria, and is extremely useful mainly for the production of world-famous panettone (Italian cake).
[0002]
[Prior art]
The production of Panettone, a world-famous Italian cake, has been handed down traditionally in the region of Milan, Italy, and is said to have originated around Lake Como at the foot of the Alps. . The original species is unstable, and it is cultivated by the traditional method of transplanting, and it is unclear what causes the fermentation and its unique flavor, texture, and long-term shelf life. Of course, this original species is involved in the action of some microorganisms and is considered to cause fermentation and its unique flavor, texture, and long-term preservation.
[0003]
In this regard, Saccharomyces exiguus, which has already been reported to be related to the production of San Francisco sour bread, is one of the most important fermentations among the microorganisms in the original species of Panettone. Yes (Japanese Patent Publication No. 58-58070). In addition, there is a report that Lactobacillus sanfranciscensis, which is a lactic acid bacterium, is present as a unique flavor in the original species of panetone. This lactic acid bacterium is also important in San Francisco sour bread. Sugihara (Applied Microbiology 21, 465-459 (1971)) reports its microbial properties in detail. In addition, Funabashi discovered a lactic acid bacterium with a different optical rotation of lactate produced in Lactobacillus sanfrancisensis in the above-mentioned original species, and this lactic acid bacterium has been reported as a new species Lactobacillus comoensis (L. comoensis). No. 4-4869).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, the present inventors have inferred that the microorganisms involved in the special taste, aroma, texture, and shelf life of the Italian cake are not limited to those described above, and that there are other microorganisms. As a result of the inventors' research, it was possible to find out what the microorganism was. It was found to be a lactic acid bacterium that is a kind of lactic acid bacterium but has not yet been reported.
[0005]
The first object of the present invention is the unique taste, aroma, and texture of the panettone, which is an Italian cake in addition to the above Saccharomyces iggoose, Lactobacillus sanfrancisensis, Lactobacillus comoensis. It is to provide a new bacterial species that is a microorganism in the original species that influences the goodness of the sun.
[0006]
Furthermore, the second object of the present invention is to synthesize a primer or a detectable probe that can be specifically identified at the bacterial species level for the found novel Lactobacillus bacterium, and use this to quickly and conveniently use the novel Lactobacillus bacterium. It is to provide such a primer or probe that can be analyzed .
[0007]
[Means for Solving the Problems]
While the present inventors are studying what microorganisms are present in the original species of the above-mentioned panetone, one of these is a novel Lactobacillus genus bacteria due to its physiological and biochemical properties and the specific sequence of the 16S rRNA gene. The present invention has been found.
Furthermore, the present inventors conducted a 16S rRNA gene analysis of Lactobacillus acidiphalinarius, a novel bacterium belonging to the genus Lactobacillus, and used DNA primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 synthesized according to the base sequence specific to this bacterium. It discovered that this microbe could be detected specifically, and came to make this invention. By using this, it is possible to identify new Lactobacillus genus bacteria quickly and easily by PCR reaction using DNA derived from this bacteria extracted from the specimen without complicated operations such as confirmation of physiological and biochemical properties. Analysis is now possible.
[0008]
That is, the invention according to claim 1 of the present invention is a novel Lactobacillus bacterium having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a sequence complementary to the base sequence. (Lactobacillus acidifarinarius accession number FERM P-18577) , characterized by having the following mycological properties .
(1) Gram positive
(2) Neisseria gonorrhoeae
(3) No mobility
(4) Aspores
(5) facultative anaerobic
(6) Catalase negative
(7) Growth temperature 15-37 ° C
(8) Growth pH 3.5-8.0
(9) Utilizing fructose, galactose, sodium gluconate, glucose, maltose, D-ribose, D-xylose, D-arabinose to produce D (+)-lactic acid, L (+)-lactic acid, ethanol and carbon dioxide To do.
(10) Cell wall L-Lys-D-Asp type
(11) GC content 51.2-51.7 mol%
(12) Form a circular, golden rice saccharid, and translucent milky white colony having a diameter of about 1 mm or less by culturing at 25 ° C. for 4 days on an MYP agar medium.
[0010]
The invention of claim 2, wherein the present invention has a sequence complementary to the nucleotide sequence or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, specific to Lactobacillus reed di Farina Cruccuris of 請 Motomeko 1, wherein DNA primer or probe.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The properties of Lactobacillus acidifarilinus which are novel Lactobacillus bacteria in the present invention are as follows.
(1) Morphological properties It exists in a single or linked form of 2.0-5.0 × 0.4 μm long bacillus cultured for 24 hours in MYP medium. Spores do not form, are non-motile, and are Gram positive.
The composition of the MYP medium is as follows.
10g maltose
Yeast extract 10g
Peptone 5g
2g meat extract
Sodium acetate trihydrate 2g
Magnesium sulfate 200mg
Manganese sulfate 10mg
Ferrous sulfate 10mg
Sodium chloride 10mg
Tween 80 0.25g
1000ml of water
Adjust to pH 5.0 with 1N HCl.
(2) Culture characteristics
(1) MYP agar plate medium The MYP agar medium is a medium obtained by adding 12 g of agar to 1000 ml of MYP medium.
Form a circular, gold-and-rice sac-like process, translucent milky white colony having a diameter of about 1 mm or less by culturing at 25 ° C. for 4 days.
(2) MYP medium (liquid medium)
When cultured at 30 ° C. for 2 days, the cells grow and the medium becomes cloudy, resulting in fluffy precipitation.
(3) MYP agar medium (puncture culture)
It grows uniformly by puncture and grows on the surface.
[0015]
(3) Physiological and biochemical properties
(1) Growth temperature 15-37 ° C, not growing at 45 ° C
(2) Growth pH range 3.5-8.0
(3) Relationship with oxygen facultative anaerobic. It can grow in the presence of oxygen or under anaerobic conditions.
(4) Essential Substances for Growth Essentially required for unsaturated fatty acids in the MYP medium.
(5) Acid and gas are produced from saccharide-fermentable fructose, galactose, glucose, maltose, D-ribose, D-xylose, D-arabinose and sodium gluconate. However, acid and gas are not generated from cellobiose, lactose, mannose, melezitose, melibiose, raffinose, rhamnose, salicin, sorbitol, sucrose, trehalose, mannitol, and starch.
(6) Litmus milk: unchanged
(7) Reduction of nitrate: negative
(8) Do not liquefy gelatin
(9) Denitrification reaction: negative
(10) Urease: Negative
(11) Catalase: Negative
(12) Oxidase: negative
(13) Indole production: negative
(14) Hydrogen sulfide: Negative
(15) Do not hydrolyze starch
(16) VP reaction: negative
(17) Products from glucose and maltose
L (+)-lactic acid, D (+)-lactic acid, ethanol
The above bacteria are Gram-positive, aspore-free, facultative anaerobic, and catalase-negative bacilli, which produce lactic acid and ethanol from sugar, and are considered to belong to the absolute heterofermentative Lactobacillus genus .
[0017]
In addition, in order to confirm the taxonomic position of Lactobacillus acidiphalinarius, phylogenetic analysis was performed by comparing the base sequence data of 16S rRNA gene with the sequence data of known species. The method of creating a phylogenetic tree is as follows. First, genomic DNA as a template is extracted from bacteria. There are various methods for extracting DNA from bacteria. Generally, a method of treating cells with a cell wall degrading enzyme such as lysozyme, a physical destruction method using glass beads, a treatment method of repeating freeze-thawing, and the like are used. Extraction reagents are also commercially available. However, when genomic DNA is used as a template in the PCR method, it is not always necessary to extract DNA in an intact state. Therefore, the possibility of sample contamination is low, the operation is simple, and a method that can be performed quickly can be selected.
[0018]
Next, the target DNA encoding 16S rRNA is amplified by the PCR method. The PCR method is basically a method in which a specific gene sequence is enzymatically synthesized using two primers that hybridize with opposite strands and are adjacent to the target region on the template DNA. A fragment containing a specific gene sequence can be exponentially amplified by repeating a cycle of template DNA modification, annealing, and primer extension by DNA polymerase.
[0019]
Next, the amplified fragment obtained by the PCR method is purified. A method of purifying the amplified DNA using a spin column is preferred.
[0020]
Next, the base sequence of the purified amplified fragment is determined. There are two methods for determining the base sequence of DNA, the dideoxy method in which dideoxynucleotides are used to specifically stop the synthesis reaction of DNA polymerase, and the chemical decomposition method using base-specific chemical modification. At present, a direct sequencing method is generally used by the dideoxy method, which is easy to operate and kits are also commercially available, and has already been automated by a DNA sequencer.
[0021]
Finally, a molecular evolutionary phylogenetic tree is estimated based on the amplified DNA base sequence, and the taxonomic position of Lactobacillus acidifarinarius is specified. Molecular evolutionary phylogenetic tree analysis software is available on the Internet and can be used (CLUSTAL W: DDBJ, etc.).
[0022]
As a result of identifying the taxonomic position of Lactobacillus acidiphalinarius as described above, the bacterium has formed an independent cluster that is taxonomically distinct from other species and does not apply to any species reported so far. There wasn't.
[0023]
For the above reasons, the present inventors regarded the bacterium as a novel genus Lactobacillus and named it Lactobacillus acidiphalinus. Note that the mycological properties of Lactobacillus acidifarilinus and the standards named as novel Lactobacillus bacteria are as follows. The identification method followed the “Lactic acid bacteria experiment manual” (Asakura Shoten). In addition, as a standard for classification and identification, the Burseys Manual of Systematic Bacteriology Vol. 2 (1986).
[0024]
Lactobacillus acidifarinarius having such characteristics can be isolated by a known method from, for example, the original panettone used for bread production. That is, this is a method in which the original species is diluted stepwise with sterilized physiological saline, and mixed and cultured in a separation agar medium such as MYP agar medium. Lactobacillus asidifarinarius obtained as described above has been deposited as FERM P-18577 on November 2, 2001 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center.
[0025]
In addition, when creating a primer specific for Lactobacillus acidiphalinarius, a reliable 16S rRNA gene is used as an index of phylogeny for the target, and means such as PCR is required for identification and analysis. Therefore, DNA was used instead of RNA.
[0026]
At the time of primer design, 16S rRNA gene sequences of bacteria closely related to this bacterium were collected, and the base sequences were aligned. Alignment software (CLUSTAL W: DDBJ) published on the Internet can be used for alignment. As a result, there was a position specific to Lactobacillus acidiphalinus in the forward: 65-79 and reverse: 250-232 positions in the E. coli numbering system, and PCR primers were designed with this region as a target.
[0027]
The primer thus obtained and having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 and 2 shown in the Sequence Listing is a DNA oligonucleotide specific for Lactobacillus acidiphalinarius, It can be used as a primer for analysis.
[0028]
The oligonucleotide primer designed as described above can be artificially synthesized by a DNA synthesizer according to its base sequence. The specificity was confirmed by using the band-forming ability of the primers for the closely related DNAs shown in the following examples as an index. As a result, there was no problem with specificity.
[0029]
Since the primer of the present invention has specificity for Lactobacillus acidiphalinarius as described above, the colony formed in the medium is fished, DNA is extracted from the cultured cells, and the reactivity with the primer is demonstrated. A simple identification of bacteria can be performed by examining. For example, DNA is first extracted from a pellet obtained by centrifuging 1 ml of the culture solution by the benzyl chloride method or the like, and this is used as template DNA. By combining the template DNA with the primer of the present invention and carrying out an amplification reaction, a DNA sequence (PCR product) specific to the bacterium can be obtained. If the DNA thus obtained is electrophoresed, the present bacterium can be identified by the presence or absence of a band.
[0030]
In addition, if the primer of the present invention is used, it is possible to identify the bacteria in various sour species and other doughs without culturing. In this case, a very small amount of sample is placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, DNA is directly extracted by the benzyl chloride method, and then the bacterium is identified by the same method as described above.
[0031]
【Example】
Hereinafter, the content of the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples without departing from the gist of the present invention.
(Example 1)
An agar medium and a liquid medium can be used as the culture method medium of the present bacterium according to the purpose. The aforementioned MYP medium is optimal for culturing Lactobacillus acidiphalinarius cells. Addition of sodium acetate is effective in promoting growth. Addition of inorganic salts such as magnesium sulfate, ferrous sulfate and sodium chloride is also effective for promoting growth.
Since this bacterium essentially requires unsaturated fatty acids, it is necessary to add oleic acid, Tween 80 and the like. The culture temperature is 15 ° C. to 37 ° C., preferably 25 ° C. to 30 ° C., and pH 3.5 to 8.0, preferably pH 4.0 to 8.0. Specifically, in the Examples, this bacterium was suspended in 50 ml of a sterilized 0.85% sodium chloride aqueous solution. Thereafter, dilution was performed stepwise, 1 ml was taken in a petri dish, and then dissolved agar medium (with 10 ppm cycloheximide and 10 ppm sodium azide added) was poured and mixed. After the agar solidified, the petri dish was cultured at 30 ° C. for 4 to 5 days to separate colonies formed. The isolated strain was identified using the Lactobacillus acidiphalinarius-specific primer of the present invention.
[0032]
(Example 2)
Phylogenetic analysis of the bacterium The phylogenetic analysis of the bacterium was performed as follows. The 16S rRNA gene was amplified from the DNA extracted from this bacterium by the benzyl chloride method by PCR reaction. The obtained PCR product was purified using PCR Kleen spin Columns (BIO-RAD), and then a sequence reaction was performed using 12 kinds of primers. The sequencing reaction was performed using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (ABI), and the nucleotide sequence was read using ABI PRISM 310 Automatic sequencer. The sequence data obtained by each primer was connected to the overlap portion to obtain continuous DNA sequence data. The data was subjected to multiple alignment using CLUSTAL X (DDBJ), and a phylogenetic tree was created based on this result, and the result was a novel genus Lactobacillus.
The obtained phylogenetic tree is shown in FIG.
[0033]
(Example 3)
Preparation of Lactobacillus acidiphalinus-specific primers In designing primers, L. brevis, L. plantarum, L. hilgard ii, L. collinoides , L. vermiform and E. coli 16S rRNA gene sequences were aligned, and PCR primers were designed targeting a region specific to Lactobacillus acidifarinalius (Table 1 shows alignment between this species and related species) Shows the peculiar part obtained as a result.
[0034]
[Table 1]

[0035]
As a result, specific primers of Lactobacillus acidifarinarius having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 as shown in Table 2 could be designed. Primers were synthesized using a DNA synthesizer according to the designed base sequence.
[0036]
[Table 2]

[0037]
Confirmation of the specificity of the primer The specificity of the primer designed as described above was determined based on L. brevis, L. collinoides, L. plantarum and L. farciminis, L. casei other than the related species. For the reference strains of L. sanfranciscensis , L. kimuchii, and L. fermentum, the band forming ability of the primer by PCR reaction was confirmed as an index.
[0038]
Each bacterium was cultured as follows.
Each bacterium was cultured in MYP or MRS medium (Difco) for 24 hours. 1 ml of the culture solution was collected in a 1.5 ml Eppendorf tube, centrifuged, and DNA was extracted by the benzyl chloride method, followed by PCR reaction.
[0039]
The PCR reaction was performed as follows.
Reaction solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTP mixture, 1.2 μM (both PrimerF and PrimerR), 1.0 u Taq DNA polymerase (Takara EX), DW 19.7 μl, 10 ng template DNA Then, using a DNA thermal cycler (DNA Engine Model PTC-200, MJ RESERCH, INC), after 94 ° C. for 2 minutes, cycled at 94 ° C. for 45 seconds, 65 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 2 minutes 29 times, and further at 72 ° C. 10 A min PCR reaction was performed.
[0040]
The PCR product obtained above was electrophoresed, and the specificity of the primer was determined by confirming the binding ability between the primer and the DNA of each strain based on the presence or absence of a band. Electrophoresis was performed with 1% AgaroseLO3 (Takara Shuzo Co., Ltd.) using a mupit at 100 V for 30 minutes, and after staining with Ethidium Bromide, the band was observed under a UV lamp. As a result, the primer formed a band specifically only for Lactobacillus acidiphalinus. The results are summarized in Table 3.
[0041]
[Table 3]

[0042]
(Example 4)
Identification of Lactobacillus acidifarinarius by specific primer Since the primer of the present invention has specificity for Lactobacillus acidifarinarius as described above, it is possible to identify the bacterial species isolated from it and to use panetone The presence of Lactobacillus acidifarinarius in the original species was quickly confirmed.
First, DNA was extracted from cultured bacterial cells or a very small amount of Panettone original seed sample by the benzyl chloride method, and this was used as template DNA. A DNA sequence (PCR product) specific to the bacterium was obtained by combining the template DNA with the primer of the present invention and carrying out an amplification reaction. As a result of electrophoresis of the DNA obtained in this manner, a band was formed, and Lactobacillus acidifarinarius in the culture could be identified.
[0043]
Investigation of bacteria present in the original species of panetone using the specific primers of each bacteria The fungus was investigated for the original species of panettone used in three places in Japan. The investigation was carried out by PCR using specific primers of L. brevis, L. farcimi nis , L. casei, L. sanfranciscensis, L. plantarum, L. kimuchii, L. fermentum, and this bacterium. investigated.
As a result, as shown in Table 4, bands were observed only when L. sanfranciscensis and L. acidifarinarius specific primers were used for all three types of Panettone species. It became clear that it exists.
[0044]
[Table 4]

[0045]
(Example 5)
Separately cultivate on flour dough containing Saccharomyces ignigus, a yeast producing yeast of panetone added with a new Lactobacillus bacterium Lactobacillus acidiphalinarius, Lactobacillus San Francisco and Lactobacillus comoensis Lactobacillus acidifarinarius was added to make the original species. The original seed was fermented, and other raw materials were added, and then the panetone was manufactured through molding, fermentation, firing and cooling steps. As a result, it was possible to produce a panettone having good storage stability and excellent flavor and texture.
[0046]
【The invention's effect】
The Lactobacillus acidifarinarius according to claim 1 of the present invention is a novel Lactobacillus genus bacterium isolated and discovered from Panettone original species which is an Italian cake. As a result of this study, the total number of the original Panettotone species included not only three Saccharomyces iggoose, Lactobacillus San Francisco and Lactobacillus comoensis strains reported by Funahashi et al., But also Lactobacillus acidifarinalius of the present invention. It was found that the presence of the four types of microorganisms produced a panetone-specific flavor, texture and long-term shelf life. It has come to the stage that Panettone, which has been made by the traditional secret method of northern Italy so far, will be made widely in countries around the world by using Lactobacillus acidifarinarius of the present invention, It can be said that this bacteria has a great effect.
The Lactobacillus acidiphalinarius of the present invention is characterized by having the following mycological properties, and has a remarkable effect that it can be distinguished from other bacteria by these properties.
(1) Gram positive
(2) Neisseria gonorrhoeae
(3) No mobility
(4) Aspores
(5) facultative anaerobic
(6) Catalase negative
(7) Growth temperature 15-37 ° C
(8) Growth pH 3.5-8.0
(9) Utilizing fructose, galactose, sodium gluconate, glucose, maltose, D-ribose, D-xylose, D-arabinose to produce D (+)-lactic acid, L (+)-lactic acid, ethanol and carbon dioxide To do.
(10) Cell wall L-Lys-D-Asp type
(11) GC content 51.2-51.7 mol%
(12) Form a circular, golden rice saccharid, and translucent milky white colony having a diameter of about 1 mm or less by culturing at 25 ° C. for 4 days on an MYP agar medium.
[0048]
The invention described in claim 2 of the present invention has a sequence complementary to the nucleotide sequence or a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, according to claim 1 where a new lactobacilli DNA primer or probe specific for Lactobacillus acidiphalinarius. By creating a bacterium-specific primer or probe, a PCR reaction of the bacterium-derived DNA extracted from the specimen without complicated operations such as confirmation of physiological and biochemical properties, Whether or not the bacteria are present in the dough can be investigated quickly, simply and with high accuracy. It can be said that the primer or probe of the present invention is very useful in investigating various sour species in the future.
[0051]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram showing a phylogenetic tree of the novel Lactobacillus bacterium of the present invention.

Claims

Lactobacillus acidifarinarius (Lactobacillus acidifarinarius) having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a sequence complementary to the nucleotide sequence, and having the following mycological properties A novel Lactobacillus bacterium.
(1) Gram positive (2) Neisseria gonorrhoeae (3) No motility (4) Aspore (5) Facultative anaerobic (6) Catalase negative (7) Growth temperature 15-37 ° C
(8) Growth pH 3.5-8.0
(9) Utilizing fructose, galactose, sodium gluconate, glucose, maltose, D-ribose, D-xylose, D-arabinose to produce D (+)-lactic acid, L (+)-lactic acid, ethanol and carbon dioxide To do.
(10) Cell wall L-Lys-D-Asp type (11) GC content 51.2-51.7 mol%
(12) Form a circular, golden rice saccharid, and translucent milky white colony having a diameter of about 1 mm or less by culturing at 25 ° C. for 4 days on an MYP agar medium.

SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary to the nucleotide sequence or the base sequence represented by 2,請 Motomeko 1 wherein the Lactobacillus reed di Farina specific DNA primers or probes Cruccuris.