JP4344696B2 - 細胞分離組成物および細胞分離法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞を分離するための組成物および方法を提供する。これらの開示された組成物および方法は、例えば、組織培養、免疫表現型の特性評価、他の診断テスト、さらなる精製、および療法的投与にのために細胞を効率的に調製し得る。
本発明は、細胞を分離するための組成物および方法を特徴づける。本発明の組成物は、血液細胞含有サンプルから細胞を選択的に凝集することに使用され得る。特定の機構によって拘束されることなく、本発明の組成物は、細胞表面抗原との相互作用を介して、および/または、細胞表面接着因子(例えば、LFA−1(リンパ球機能関連抗原1、CD11a/CD18)およびICAM−1(細胞間接着分子1、CD54))の発現を刺激することによって、凝集し得る。凝集した細胞は、溶液中に残存している凝集されていない細胞から分画される。細胞は、上清相または凝集相から回収され得る。
本発明に記載の細胞分離組成物は、デキストランおよび細胞表面抗原に対する(すなわち、細胞表面抗原に対して特異的な結合アフィニティーがある)、1以上の抗体を含有し得る。
いくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、CD41に対する抗体を含み、それは血小板を選択的に凝集させ得る。いくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、CD3に対する抗体を含み、それはT細胞を選択的に凝集させ得る。いくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、CD2に対する抗体を含み、それはT細胞およびNK細胞を選択的に凝集させ得る。いくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、CD72に対する抗体を含み、それはB細胞を選択的に凝集させ得る。いくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、CD16に対する抗体を含み、それはNK細胞および好中球を選択的に凝集させ得る。これら抗体のそれぞれの濃度は、0.01mg/L〜15mg/Lの範囲であり得る。
この開示された方法は、例えば、組織培地、免疫表現性特性評価、診断テスト、さらなる精製、および治療的投与のために細胞を効率的に調製するために使用され得る。特別な機構によって拘束されることなく、本発明の組成物は、細胞表面抗原との相互作用を介して、および/または、細胞−細胞接着を刺激することによって(例えば、細胞表面因子の発現の増大を介して)、凝集し得る。凝集していない細胞から離れた凝集細胞画分は、溶液中に残る。
細胞分離組成物は、梱包材料と組み合わせられ、キットとして販売され得る。細胞分離組成物の成分は、別個に、または互いに組み合わせて、梱包され得る。いくつかの実施形態において、梱包材料は、血液収集容器を含む(例えば、血液バッグ、真空採血管)。代表的には、キットで備えられる梱包材料は、説明書、またはどのように細胞分離組成物が特定型の細胞を凝集することに用いられ得るかを記載したラベルを備える。このようなキットを製造するための成分および方法は、周知である。
この実施例は、以下で記載する細胞分離試薬を用いて、細胞を分離する一般的な方法を記載している。等量(すなわち、25ml)の細胞分離試薬を、50mlコニカル採血管中で、等量(すなわち、25ml)のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)抗凝固ヘパリン処理末梢血サンプルと組み合わされた。20×106細胞/mlより多い白血細胞数を含んでいるサンプルでは、血液と細胞分離試薬を1:2で組み合わせた。採血管を、ロッカープラットホーム上で、20分間〜45分間、室温で穏やかに混合した。採血管を、凝集していない細胞から、凝集細胞を分割させるために、ラックの中で30分間〜50分間、直立に静置した。凝集していない細胞は、溶液中に残った。凝集体をかき乱すことなく、ピペットを使用して、上清から凝集していない細胞を回収した。回収した細胞を、25ml PBSで洗浄し、そして、7分間に亘って500×gで遠心分離した。細胞ペレットを、4mlのPBS中に再懸濁した。
表1に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために用いた。
表3に記載した試薬を、実施例1に記載した方法によって細胞を分離するために使用した。
表5に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。
表7に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために用いた。
表9に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。
表11に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。
表13に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用する。T細胞およびCD3+細胞を、上清から回収する。B細胞および顆粒球を凝集体から回収する。
表14に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。CD8+細胞を、上清から回収した。
表15に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。CD4+細胞を、上清から回収した。
表16に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。CD34+細胞を、50%を超える純度かつ80%を超える収率で、上清から回収した。
表17に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。B細胞を、上清から回収された。
表18に記載した試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。塩酸(4N)または水酸化ナトリウム(4N)を、7.2と7.4との間であるpHに調整するために使用した。抗CD8抗体、抗CD16、抗CD19抗体、抗CD94抗体、および抗CD161抗体を、ビオチン化した。CD4 T細胞について濃縮された細胞懸濁液を、上清から得た。CD4細胞のおよそ75%〜94%を、それぞれの白血球サンプルから回収した(図1は、5人のドナーの代表的データを提供する)。比較のため、密度勾配分離を用いた市販の他の製品では、細胞の回収は50%またはそれ以下であった。平均して、CD4細胞の純度は、96.1%であるが(図2、12人のドナーの代表データを参照のこと)、他方、密度勾配分離を用いた市販の他の製品を用いて精製したCD4細胞については、平均純度は86.7%であった。
表19に記載された試薬を、実施例1に記載された方法によって細胞を分離するために使用した。塩酸(4N)または水酸化ナトリウム(4N)を、7.2と7.4との間にpHを調整するために使用した。抗CD4抗体、抗CD16、抗CD19抗体、抗CD94抗体、および抗CD161抗体を、ビオチン化した。CD8 T細胞を濃縮した細胞懸濁液を、上清から得た。CD8細胞のおよそ53%から81%が、それぞれの白血球サンプルから回収された(図3は、5人のドナーの代表データを提供する)。比較として、密度勾配分離を必要とする市販の他の製品では、細胞の回収は、52%以下であり、さらに代表的には、細胞回収は、35%未満であった。平均して、CD8細胞の純度は、93.9%であるが(図4を参照のこと、12人のドナーの代表データ)、他方、市販の製品により精製したCD8細胞については、平均純度は84.2%であった。
前述の詳細な記載および実施例について、本発明が記載されてきたが、前述の記載および実施例は、本発明の範囲を説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するのもではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利点、および改変は、その特許請求の範囲のうちにある。
Claims (33)
- 組成物であって、
a)デキストラン;
b)抗グリコホリンA抗体;
c)抗CD15抗体;
d)抗CD9抗体;
e)抗CD94抗体;および
f)抗CD161抗体
を含有する、組成物。 - 抗CD72抗体をさらに含有する、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD4抗体、抗CD16抗体、および抗CD19抗体をさらに含有する、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD8抗体、抗CD16抗体、および抗CD19抗体をさらに含有する、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD2抗体をさらに含有する、請求項1に記載の組成物。
- ヘパリンをさらに含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 二価のカチオンをさらに含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記二価のカチオンがCa 2+ またはMg 2+ である、請求項7に記載の組成物。
- リン酸緩衝化生理食塩水をさらに含有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物のpHが、6.8と7.8との間である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物のpHが、7.2と7.4との間である、請求項10に記載の組成物。
- 前記抗体が、IgM抗体またはIgG抗体である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗体が、抗体ヒト抗体である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗グリコホリンA抗体、前記抗CD15抗体、または前記抗C抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗グリコホリンA抗体、前記抗CD15抗体、または前記抗CD9抗体の濃度が、約0.1mg/Lから約15mg/Lである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗CD94抗体または前記抗CD161抗体の濃度が、約0.01mg/Lから約10mg/Lである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、
g)抗CD4抗体または抗CD8抗体;
h)抗CD16抗体;
i)抗CD19抗体;
j)ヘパリン;および
k)二価のカチオン
をさらに含有する、組成物。 - 抗CD4抗体を含む、請求項17に記載の組成物。
- 抗CD8抗体を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1つが、ビオチン化されている、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗CD16抗体、前記抗CD19抗体、前記抗CD94抗体、および前記抗CD161抗体が、ビオチン化されている、請求項20に記載の組成物。
- 血液収集容器、および請求項17〜21のいずれか1項に記載の組成物を備える、キット。
- 前記血液収集容器が、血液バッグまたは真空採血管である、請求項22に記載のキット。
- 細胞を分離するための方法であって、該方法は、以下のa)〜c):
a)i)デキストラン;
ii)抗グリコホリンA抗体;
iii)抗CD15抗体;
iv)抗CD9抗体;
v)抗CD94抗体;および
vi)抗CD161抗体
を含有する組成物と、血液細胞含有サンプルを接触させる工程、
b)該サンプルを、凝集相および上清相へと分画する工程、および、
c)該細胞を回収する工程
を包含する、方法。 - 前記組成物が、抗CD4抗体、抗CD16抗体、および抗CD19抗体をさらに含有する、請求項24に記載の方法。
- 抗CD8抗体、抗CD16抗体、および抗CD19抗体をさらに含有する、請求項24に記載の方法。
- 前記サンプルが、ヒト由来である、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、または骨髄サンプルである、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が、転移性腫瘍細胞である、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が、前記上清相から回収される、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項30に記載の方法。
- 記抗CD94抗体および前記CD161抗体がビオチン化された、請求項24に記載の方法。
- 請求項32に記載の方法であって、ここで、前記細胞を回収する工程は、
アビジンコートされた粒子を含有する組成物と前記上清相を接触させる工程、
前記上清相と前記組成物を分離する工程、および
前記上清相から細胞を回収する工程
を包含する、方法。
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