JP4344064B2 - 核酸の分離方法及びその装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動による核酸の分離方法及び装置、特に電気泳動槽を用いて巨大な高分子核酸をより効果的に分離する方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物のゲノム（生物特有の１揃いの染色体のことであり、染色体とは遺伝子の１次元的集合体のことである）は、数百万塩基対（Ｍｂ：メガベース）の範囲のＤＮＡで構成されている。
ピペットや撹拌操作などの通常の方法でゲノムＤＮＡを水溶液中で抽出すると、該ピペットや撹拌操作などにより物理的剪断応力が生じ、２００ｋｂ（キロベース）以上のＤＮＡを得るのは極めて困難であった。
しかしながら、従来のアガロースを用いる電気泳動法では、抽出されたＤＮＡの小さな断片（数１０ｋｂ以下）でなければ分離ができないので、液体法によって抽出されたＤＮＡの解析には不十分であった。
【０００３】
近年、ゲノム解析の必要性が高まる一方で、低融点アガロース中に細胞または核を封じ込めて物理的剪断応力を避け、そのままＤＮＡを抽出する方法が確立された。上記のように、従来の電気泳動法により分離されたものでは十分なゲノム解析ができないので、この電気泳動法を改善してゲノム程度のより大きな高分子核酸の分離方法が必要になってきた。
【０００４】
通常の電気泳動法では、担体であるアガロースの綱目構造による分子篩（ふるい）効果を利用しており、長い直鎖状の核酸でも十分な篩効果を受け、分子量に比例した泳動の応力を受け、その結果、分子量に応じた分離をする。すなわち、低分子核酸は早く移動し、高分子核酸はゆっくり移動する。
しかし、一定以上の高分子ＤＮＡは、一定の電場の中に置かれると時間経過とともに次第に直線的になり、アガロースの綱目の中を、抵抗なく進むようになる。このことは、一定の大きさ以上の核酸は分離できないことを意味する。
実際、通常の電気泳動では、５０ｋｂを超える核酸は全て一緒に移動するか、あるいは、アガロースに複雑に絡まったものはそのままサンプル溝（ウェル）に残ってしまう。これは、核酸が分離されようとする担体、すなわちアガロースゲルを用いる以上避けられない問題であった。しかも、現在のところ、アガロースに代わる優れた担体はないという問題がある。
【０００５】
これを解決するため、ある程度伸び切ったＤＮＡに対して、別の方向から電場をかける提案がなされた。これによると核酸分子は再び新たな電場の方向に伸び始め、これが伸びきる間、分子量に応じて分子篩効果を受け、高分子の分離が可能になるというものである。
このため、従来の平行な電極に加え、直角方向にもう一組の電極を置き、時間と共に横方向にも電場を形成することで高分子核酸の分離を行うものである。（パルスフィールド電気泳法、Schwartz，D.C. and Cantor, C.R. Cell 31:67-75 (1984)）。
【０００６】
この後、上記の方法にいくつか改善が加えられ現在に至っている。いずれも、従来の直線的に電極を配置した水平型サブマリン電気泳動とは異なり、電気的に電場の方向を変化させることができるようになっている。
しかしながら、高分子核酸を分離するためには、このような時間と共に電場が変化するという複雑な特別の装置が必要であって、装置は高価であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高分子核酸の分離を、安価で、従来のパルスフィールド電気泳動法とは異なる原理を用いた電気泳動による核酸の分離方法および装置を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、泳動装置を傾けることにより、泳動方向のみならず、泳動に直角に交差する方向成分を含む、歪んだ電場を発生できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
１）電気泳動による核酸の分離方法であって、水平型サブマリンゲル電気泳動槽を傾斜させることにより、アガロースゲル内に、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法
２）電気泳動による核酸を分離する方法であって、水平型アガロースゲル電気泳動槽を経時的に傾斜させることにより、アガロースゲル内に時間と共に連続して変化する、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法
３）電気泳動による核酸を分離する方法であって、水平型アガロースゲル電気泳動槽の傾斜角度を一定に保ちながら、時間と共に傾斜位置を変化させ、アガロースゲル内に時間と共に連続して変化する、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法
４）電気泳動による核酸を分離する方法であって、電気泳動槽を傾斜させることにより、水槽内に設置されたアガロースゲルを、緩衝液の水面から一部露出させることにより、該アガロースゲル内に電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法
５）電気泳動による核酸を分離する方法であって、アガロースゲル内に発生させた時間と共に変化する電場を一定の周期で繰り返し、電気泳動の可動力となる直交する方向成分を含む電場を連続して周期的に変化させながら核酸をほぼ直線的に泳動させることを特徴とする上記１〜４のそれぞれに記載する核酸の分離方法
６）水平型アガロースゲル電気泳動槽と該電気泳動槽を載せかつ傾斜させることのできる台を備えることを特徴とする電気泳動による核酸の分離装置
７）傾斜角度調節装置を備えることを特徴とする上記６記載の核酸の分離装置
８）時間と共に傾斜位置を変化させる装置を備えることを特徴とする上記６又は７記載の核酸の分離装置
、を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を図に基づいて説明する。
図１に示す通り、通常、電気泳動槽には２本の白金線が平行に向い合って設置されており、その白金線に対し直角方向に整然とした電流が流れる。
図１において、符号１は電気泳動槽、２は陰極側の白金線、３は陽極側の白金線、４はアガロ−スゲル、５は試料を載せるウェル、６は直流電源、７は電流の方向、８は試料の泳動方向を示す。試料の泳動方向が電流の方向と逆であるのは、試料である核酸が負に帯電しているためである。
【００１０】
この時、傾斜した面に電気泳動槽が乗っており、かつアガロ−スゲルの一端が電気泳動用緩衝液面の上に出るように配置されると、液面から出たゲル部分には電流が一様に流れないので、アガロースゲル内には、歪んだ電流が流れると考えられる。すなわち、泳動中のゲルに図２に示すような傾斜をつけると、図３に示すような電流がアガロ−ス内に発生すると考えられる。このことは、本発明の重要なヒントとなった。
【００１１】
図２において、符号９は電気泳動装置「東洋紡績株式会社製：ゲルメイト」を示し、手前側が陽極方向である。符号１０は斜面を表わし、水平面との角度θを保っている。
図３において、符号１１の斜線部分は水面上に露出したアガロ−スゲルを示し、矢印は電流の向き１２を示している。すなわち、核酸の泳動は電流と正反対方向の軌跡を描く。符号１３は液体中にあるアガロ−スゲル、符号１４は泳動槽の一部をそれぞれ示す。なお、図３の上部は負極側、下部は正極側である。
【００１２】
歪んだ電流とは、電流成分として、泳動方向（以下Ｘ軸方向とよぶ）および泳動方向に直角な方向（以下Ｙ軸方向とよぶ）の電流と考えることができる。一定の傾斜面上では、Ｘ軸方向の電場の他に、一定方向のＹ軸方向成分の電場が形成され、ゲル上のＤＮＡは直線的に移動しない。
この時、経時的に傾斜面を回転させると、試料の載ったアガロースゲルの一端が順序よく水面に露出され、異なった向きでＹ軸方向成分を含む電流を発生させることができる。
したがって、傾斜面の一回転によって、ＤＮＡは左右に振りながら泳動方向に移動させられることになる。巨大ＤＮＡは常に異なった方向の電場による力を得るので、通常の電気泳動のように伸び切った構造をとらない。このため、アガロースの分子篩構造による泳動の応力を常に受け、巨大ＤＮＡを効率よく分離することができる。
【００１３】
本発明の原理はパルスフィールド電気泳動法と異なり、形成される電場は時間に対し連続的に変化するサインカーブに近いカーブを描き、この時間とともに変化する電場が、電気泳動によって直線状になりやすい巨大ＤＮＡの形状を常に変化させるので、より解像度の高い泳動が期待できる。
本発明を下記の確認試験及び実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００１４】
（確認試験１）
まず、傾斜した台１６上の電気泳動槽１内で、どのように電場が形成されるかを検討した。電気泳動槽１は前記電気泳動装置９「ゲルメイト」を用い、プラスチック製の平らな台（板状の）１６に載せ、該台１６を８度に傾斜させた。
台１６の傾斜面に対し、ゲルメイトを４５度刻みで回転させながら１回転させ、計８点の各々の角度での電場を観察した。
電場の観察は、泳動用色素であるブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）とキシレンシアノール（ＸＣ）を混合した液をアガロースゲルに載せ、１００Ｖで約４０分間泳動を行ない、色素の移動軌跡を記録した。電気泳動用緩衝液としてＴＢＥ（トリス−ほう酸緩衝液）を０．５Ｘの濃度で用いた。
【００１５】
図４にその結果の一部を示す。Ｙ軸方向に電場が発生する４５度、１３５度、２２５度、３１５度の場合を示した。泳動槽を斜面に対して、陰極を上部にし、平行に置いた時を０度とし、時計周りに角度を表わした。
色素は電気泳動槽１の置かれる角度によって異なった方向に力を受け、歪んだ移動軌跡が形成されているのが解った。
【００１６】
（確認試験２）
次に、確認試験１で観察された歪んだ移動軌跡が、電場の歪みによるものであるかどうかを検証した。
電気泳動槽１は上記確認試験１と同様に設置し、アガロースゲル（１％）に対し、図５に示す位置に白金のプローブ２０を差し込んで、各々の点における、各々の角度による、直交する二方向成分（以下Ｘ軸方向とＹ軸方向と呼ぶ）の電位差をそれぞれ測定した。
図５に示す通り、各プローブ２０間の距離はそれぞれ５ｍｍであり、電気泳動槽１内のアガロースゲルの寸法は縦７５ｍｍ、横５１ｍｍであり、上側のプローブ２０は上端から１０ｍｍの位置に設置した。
【００１７】
Ｘ軸方向とは泳動方向であり、泳動方向をマイナス、電流方向をプラスとする。また、Ｙ軸方向とはＸ軸方向に直交する方向である。
白金プローブは、ゲルに完全に埋没するように、長さを３ｍｍとし、緩衝液に露出する部分はシリコンチューブで覆い、ゲル外での電位差が測定に影響しないよう工夫した。電気泳動用緩衝液としてＴＢＥ（トリス−ほう酸緩衝液）を０．５Ｘの濃度で用いた。
【００１８】
図５において、位置Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆはそれぞれ測定用白金プローブ２０の差し込んだ位置を表わし、ＡのＹ軸方向の電位差としてＡＢ間の電位差を、ＢのＹ軸方向の電位差としてＢＣ間の電位差を各々とり、また、ＡのＸ軸方向の電位差としてＡＤ間の電位差を、ＢのＸ軸方向の電位差としてＢＥ間の電位差を、ＣのＸ軸方向の電位差としてＣＦ間の電位差を各々とった。Ｙ軸方向を測定するときは、プローブ２０の陽極側を左に、また、Ｘ軸方向を測定するときには、プローブ２０の陰極側を上にして測定した。
いずれも電流方向を正の電位差として表わした。また、泳動槽を斜面に対して、陰極を上部にし、平行に置いた時を０度とし、時計周りに角度を表わした。
結果は図６Ａに示すように、Ｙ軸方向には、角度の変化とともに電位差は増減し、図６Ｂに示すように、Ｘ軸方向には、予想通り、角度に応じた電位差が生じており、角度と共に変化しているのが解った。
【００１９】
【実施例１】
実際に、泳動槽の傾斜位置および角度を時間と共に変化させたとき、予想通り巨大ＤＮＡが分離できるかどうかを検証するため、装置を作製した（以下クレイドル（「ゆりかご」の意）と呼ぶ）。図７に電気泳動揺動装置の回路構成図の一例を示す。クレイドルは、これにより揺動できるように構成されている。
また、電気泳動揺動装置１５の概観を図８に示す。該装置１５において、角度と回転速度が設定できるようになっている。また、Ｘ軸方向に対し、Ｙ軸方向に複数回振らせることができるように、それぞれ異なった記憶素子を用意した。
図８において、電気泳動装置を載せる台（プレート）１６、符号１７は該台（プレート）の支柱、符号１８はステッピングモーター、符号１９は揺動装置１５のコントロール回路基板を示す。図の矢印方向は移動方向を示す。
なお、上記図７及び図８に示す装置は、いずれも本発明の実施に好適な装置の一例を示すものであるが、この例に限定される必要はなく、他の揺動装置への置換や設計変更することは可能である。
【００２０】
泳動にはバクテリオファージのλＤＮＡを無秩序に結合した高分子マーカーであるλラダ−と、酵母ゲノムを用い、１％アガロースに載せ、傾斜角８度、回転速度1時間にクレイドルを動作し、ゲルメイトを泳動電圧５０Ｖに設定して２０時間泳動を行なった。電気泳動用緩衝液としてＴＢＥ（トリス−ほう酸緩衝液）を０．５Ｘの濃度で用いた。
以上の結果を図９に示す。図９に示す通り、いずれのマーカーＤＮＡも階段状に分離され、本発明が有効に機能したことが証明された。Ａがλラダーであり、Ｂが酵母ゲノムである。
【００２１】
【発明の効果】
本発明では全方向に電気泳動槽を経時的に傾けることにより、泳動方向と直角方向に、一定のリズムを持った電場を発生させることができ、このために巨大な核酸を効率よく分離することが可能になる。
このために、装置が簡便になり、安価な装置を得ることができる。さらに、この装置は電気泳動槽とは独立しているため、従来の電気泳動槽がそのまま転用可能になるので、より経済的である。
また、分離する核酸の分子量範囲によって、泳動の条件設定が傾斜角度と回転速度のみ調節することで済み、操作が簡便になるという著しい効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】電気泳動槽に流れる電流の概念図である。
【図２】傾斜角度を調節できる台の傾斜面に載せた電気泳動槽の模式図である。
【図３】図２の傾斜面における電気泳動槽内に流れる電流の概念図である。
【図４】傾斜面が変化したときの電気泳動槽内に流れる電流の軌跡を示す試験結果である。
【図５】電位差を測定したゲル内の位置及び電位差測定用白金プローブの位置を示す模式図である。
【図６】傾斜角度に対する各点における測定電位差を表す図である。
【図７】電気泳動揺動装置の回路構成図の一例を示す図である。
【図８】電気泳動揺動装置１５の概観を示す図である。
【図９】本実施例におけるマーカーＤＮＡを電気泳動した結果を示す写真である。
【符号の説明】
１ 電気泳動槽
２ 陰極側の白金線
３ 陽極側の白金線
４ アガロ−スゲル
５ 試料を載せるウェル
６ 直流電源
７ 電流の方向
８ 試料の泳動方向
９ 電気泳動装置
１０ 斜面
１１ 水面上に露出したアガロ−スゲル
１２ 電流の向き
１３ 液体中にあるアガロ−スゲル
１４ 泳動槽の一部
１５ 電気泳動揺動装置
１６ 電気泳動装置を載せる台（プレート）
１７ 台の支柱
１８ ステッピングモーター
１９ コントロール回路基板
２０ プローブ

Claims (6)

1. 電気泳動による核酸の分離方法であって、水平型サブマリンゲル電気泳動槽を傾斜させて、電気泳動槽内に設置されたアガロースゲルを、緩衝液の水面から一部露出させることにより、アガロースゲル内に、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法。
2. 電気泳動による核酸を分離する方法であって、水平型アガロースゲル電気泳動槽を経時的に傾斜させて、電気泳動槽内に設置されたアガロースゲルを、緩衝液の水面から一部露出させることにより、アガロースゲル内に時間と共に連続して変化する、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法。
3. 電気泳動による核酸を分離する方法であって、水平型アガロースゲル電気泳動槽の傾斜角度を一定に保ちながら、時間と共に傾斜位置を変化させて、電気泳動槽内に設置されたアガロースゲルを、緩衝液の水面から一部露出させることにより、アガロースゲル内に時間と共に連続して変化する、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることを特徴とする核酸の分離方法。
4. 電気泳動による核酸を分離する方法であって、アガロースゲル内に時間と共に変化する電場を一定の周期で繰り返し、電気泳動の可動力となる直交する方向成分を含む電場を連続して周期的に変化させながら核酸をほぼ直線的に泳動させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載する核酸の分離方法。
5. 水平型アガロースゲル電気泳動槽と該電気泳動槽を載せかつ傾斜させることのできる台及び該台を時間と共に傾斜位置を変化させる装置を備えることを特徴とする電気泳動による核酸の分離装置。
6. 傾斜角度調節装置を備えることを特徴とする請求項５記載の核酸の分離装置。

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