JP4330878B2 - 炎症性疾患の処置及び創傷治癒過程における補助療法のためのブロメラインの使用 - Google Patents

Description

本発明は、個体における炎症性疾患を軽減又は予防するための、そして創傷治癒過程を促進する補助療法としての、個体におけるＩＬ−８レベルを増加させるための医薬の製造のための、ブロメライン及びそのコンポーネントの使用に関する。

炎症、又は炎症過程は、それぞれ変性期、血管期、及び治癒期という３つの連続的な期で進行する、いくつかの生物学的反応を含んでいる。

変性期においては、影響を受けた細胞が膨潤する。影響を受けた細胞の細胞質に液胞が形成され、細胞核の拡大及び断片化を観察することができる。傷害を受けた血管内の血小板の一部が崩壊すると、交感神経終末に作用するメディエーターが放出される。

続いて、血管期においては、血管内の変化を観察することができる。この期では、特に、いわゆる炎症細胞（顆粒球、特に好中球、リンパ球、マクロファージ、及び単球）の広範囲の遊走及び活性、並びに細胞片及び変性した細胞の除去が起こる。能動性充血において、毛細管網及び後毛細管小静脈に血液が充満し、うっ血、充血が起こり、多数の毛細管が増殖するにつれ、炎症を起こした組織の赤みがかった外観が、結果として生じる。

最後の期（治癒期）では、炎症が鎮静し始め、創傷の修復が開始する。

浸透圧活性（osmotic active）化合物に関する輸送活性が、炎症を起こした領域で局所的に減少するため、しばしば、炎症過程は、組織間隙への液体の蓄積である浮腫の形成をもたらす。この現象と密接な関係にあるのが、しばしば患者に相当な苦痛を与える、手術又は外傷の後に観察される膨潤である。

分子的には、例えばサイトカイン、特にインターロイキン１−α、インターロイキン１−β、インターロイキン６、腫瘍壊死因子α及びβ、インターロイキン８（ＩＬ−８）のような活性メディエーターの過多が、炎症の発生に関与している。

特に、ＩＬ−８は、炎症を起こした領域へ顆粒球及び好中球を誘引し、ファゴサイトーシス、細胞毒性、走化性等のような顆粒球の機能的能力を活性化することが見出されている。ＩＬ−８は、７２個のアミノ酸を有する８ｋＤａの非グリコシル化タンパク質であり、ＡＮＡＰ（陰イオン性好中球活性化ペプチド）、ＧＣＰ（顆粒球走化性ペプチド）、ＬＣＦ（リンパ球走化性因子）、及びＬＩＦ（白血球阻害因子）としても知られている。ＩＬ−８は、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＬＰＳ、及びウイルスのような前炎症誘発性刺激に対する応答として、様々な細胞、例えば単球／マクロファージ、顆粒球、Ｔ細胞、線維芽細胞、又は内皮細胞において産生される。

従来、炎症状態及び浮腫の治療は、例えばアセチルサリチル酸、フェニルブタゾン、ジクロフェナク、又はインドメタシンのような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）の経口投与を利用してきた。しかしながら、これらの薬剤は、いくつかの、時には重篤な二次作用、例えば胃腸障害、及び胃腸粘膜に対する有害作用を示す。

これらの欠点を克服するため、当分野は、炎症を治療するためのさらなる薬剤を提供した。これに関して、ＷＯ９８／１３０５７は、抗炎症特性を有している雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook F）根調製物を含有している組成物の使用を開示している。しかし、この組成物は、免疫抑制活性をも示すため、その炎症の治療における効果は極めて不十分であった。さらに、ＥＰ１００９４０４には、炎症性疾患の治療のためのｐＡＤＰＲＴ（ポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ）阻害性化合物の使用が提案されている。しかしながら、この例においても、投与時に、不要な二次作用が起こる。

従って、副作用を示さない、炎症性疾患（inflammatory diseases）及び／又は炎症性疾患（inflammatory dieseases）を治療するための、さらなる安全な（well tolerated）薬剤が、当分野においては必要とされている。

従って、第一の面によると、本発明は、個体におけるＩＬ−８レベルを増加させるための医薬の製造のための、ブロメライン又はその１個以上のコンポーネントの使用を提供する。

パイナップルの茎（Ananas comosus）からの抽出物であるブロメラインは、酵素（例えばプロテアーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ阻害剤等）、炭水化物、及びその他の未同定コンポーネントのような様々な化合物の混合物である。ブロメラインに関する薬理学的研究は、極めて稀な例においてのみアレルギー反応が観察されることを示した。さらに、これらの反応は、通常、比較的急速に消失する。

本発明に至る広範囲の研究において、予期せぬことに、患者へのブロメラインの投与が、炎症性疾患の発症及び期間を軽減し、かつ創傷治癒過程中の状態も改善することが見出された。食品成分としてのブロメラインは身体にとって完全に受容されているため、副作用は、最小限にしか、又は全く観察されない。このブロメラインの抗炎症効果は、明らかに、主に、免疫系の細胞によるＩＬ−８分泌（ＩＬ−８分泌は、炎症領域における免疫応答を刺激し、走化性の過程によって該領域へと免疫細胞を誘引する）の増加による。そのような刺激の結果として、炎症過程に関与している免疫過程は、実際、炎症の位置において、より迅速で、かつより効率的な任務を成し遂げることができ、そのため、炎症状態に罹患した個体が経験する実際の生理学的状態は、より重篤でなくなり、より迅速に軽減される。

本発明に従い、乾癬、慢性関節リウマチ、多発関節炎のような炎症応答に基づく多様な異なる疾患状態を、処置することができる。さらに、個体における炎症の軽減におけるブロメラインの作用は、個体の自己の免疫系の刺激に基づいているため、該化合物は、創傷治癒過程及びアレルギーにおける補助療法にも十分利用することができる。

他方、ＩＬ−８は、好塩基球及び肥満細胞からのヒスタミン放出を阻害することが知られており、従ってＩＬ−４により誘導される、Ｂリンパ球によるＩｇＥ産生に拮抗する。従って、ブロメライン又はそのコンポーネントは、抗アレルギー剤、特に抗ヒスタミン薬（anti-histaminikum）として適当である。

ブロメラインを高温処理に供した場合でも、ブロメラインの刺激活性は保持されるため、ブロメラインのコンポーネントのうちの１個以上は、好ましくは（１個以上の）非プロテアーゼコンポーネントである。

以下の実施例及び図面を参照して、本発明をさらに説明する。

実施例
ブロメラインＢＰ及び熱不活化ブロメラインの、好中球からのＩＬ−８の分泌に対する効果
ブロメラインベースパウダー（base powder）（ＢＰ）
ブロメラインＢＰ（CPC Wolfgang Muehlbauer GmbH, Hamburg, Germanyより購入）を水に溶解し、凍結乾燥した。タンパク質分解活性及びタンパク質含量を、それぞれ、基質Ｌ−Ｐｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（Harrach et al., J Protein Chem 14(1995)41-52）及びバイオラドプロテインアッセイ（Bio-Rad Protein Assay）（Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen, Germany）を使用することにより決定した。ブロメラインＢＰは、０．３４U/mgである比活性を示した。ブロメラインＢＰ溶液を８０℃で１時間、加熱することにより、プロテアーゼ活性を破壊した。

好中球の調製
好中球は、Ferranteら（J. Immunol. Methods. 36(1980)109）によって記載されているような一段階法によって単離した。

健康有志者より提供された、単離したての血液、約２０〜３０mlを、保存剤を含まないヘパリン（最終濃度１０U/ml、Sigma, Deisenhofen, Germany）で抗凝固処理し、ポリモルフプレップ（Polymorphprep）（Nycomed Pharma, Oslo, Norway上に重層した。２０℃での遠心分離（４００g、３０分）の後、第２白血球バンドから好中球を回収した。赤血球を溶解させるため、水１mlを細胞懸濁液に１分間にわたって添加した。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。トリパンブルー色素排除法によって決定された細胞生存率は、９８％を超えていることが見出された。

ＩＬ−８の分泌：
無細胞上清中のＩＬ−８を、サンドイッチ酵素イムノアッセイ技術（R&D Systems, Minneapolis, USA）を使用して、定量した。２×１０⁵個の好中球を、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で、被検物質と共に、又は被検物質なしで、３７℃でインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離（４００×g、７分）し、無細胞上清を使用した。試料及び標品を、ＩＬ−８モノクローナル抗体でプレコーティングされたウェルへピペットで移し、室温で２．５時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、基質溶液を添加した。発色を停止させ、マイクロタイタープレートリーダー（SLT Labinstruments, Austria）を使用して測定した。

統計分析：
処理群と対照群との間の統計的有意性を、マンホイトニー−ウィルコクソン（Mann-Whitney-Wilcoxon）の検定、及びコンピュータープログラムインスタット（Instat）を使用して計算した。

実験結果：
ブロメラインＢＰ及び熱不活化ブロメラインを、好中球におけるＩＬ−８の分泌を増加させる能力に関して試験した。

好中球を、様々な量のブロメラインＢＰ及び熱処理ブロメラインＢＰ（０．１μg/ml〜１００μgの範囲のブロメラインＢＰ）と共に、計２４時間インキュベートした。図１に示されるように、ブロメラインＢＰ及び熱処理ブロメラインＢＰは、約４５０〜２６４０pg/ml ＩＬ−８の範囲で、用量依存的に、ＩＬ−８の上清への分泌の有意な増加を誘導した。ブロメラインＢＰ及び熱不活化ブロメラインにより活性化されなかった好中球は、上清へ分泌されるＩＬ−８を全く示さなかった。

熱処理ブロメラインベースパウダーも、ＩＬ−８分泌を刺激することができたため、タンパク質分解活性は好中球活性化の能力と相関していないことと結論付けることができた。

ブロメラインＢＰ（ブロメラインベースパウダー）及び熱不活化ブロメラインの、健康供与者の好中球からのＩＬ−８の分泌に対する効果を示す図である。３つの独立した実験を、実施した。

Claims (4)

1. 創傷治癒過程における補助療法のための医薬の製造のための、加熱処理によりそのプロテアーゼ活性が破壊されたブロメラインの使用。
2. 医薬が炎症性疾患の処置のために設計されたものである、請求項１に記載の使用。
3. 炎症性疾患が、乾癬、慢性関節リウマチ、もしくは多発関節炎、又はアレルギーに関連している、請求項２に記載の使用。
4. 医薬が抗ヒスタミン薬である、請求項１に記載の使用。

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