JP4317966B2

JP4317966B2 - Recombinant vector containing α-glucosidase gene, transformant and method for producing α-glucosidase using the same

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Publication number: JP4317966B2
Application number: JP2002347291A
Authority: JP
Inventors: 健山本; 剛裕海野; 幹男山本; 浩一小川
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2002-11-29
Publication date: 2009-08-19
Anticipated expiration: 2022-11-29
Also published as: JP2004173650A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα−１，３−結合、またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素の遺伝子に関するものであり、より具体的には、例えば澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質の非還元末端グルコース部の３位に、グルコース単位をα−１，３−結合する糖転移活性を有し、α−１，３−結合を分子内に含む糖類、特にニゲロース（３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルグルコース）等のオリゴ糖を生成する活性を有する糖転移酵素の遺伝子に関するものである。
【０００２】
更に本発明は、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該プラスミドにより形質転換された生物（微生物、動植物細胞など）、該形質転換体を用いた糖転移酵素の製造方法、該組換え酵素を用いた糖類の製造方法、特にニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース等のニゲロオリゴ糖の製造方法および遺伝子組換えによって得られる上記転移酵素に関するものである。
【０００３】
本発明の糖転移酵素は分子内にα−１，３−結合を含む糖類、特にニゲロオリゴ糖を製造するうえで産業上重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転換体は本酵素を著量に生産し、これら酵素を用いる産業界（食品、医薬など）に大いに貢献するものである。
【０００４】
【従来の技術】
オリゴ糖はその構成単糖、結合様式及び立体構造に応じ、従来から甘味料、医薬品、酵素の検定用基質、あるいは種々の薬品中間体などの用途に使用されている。天然のものに加え、これまでマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、カップリングシュガー等のオリゴ糖が開発されている。
【０００５】
近年、ニゲロース（３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルグルコース）、ニゲロシルグルコース（３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルマルトース）等のα−１，３−結合を分子中に有するニゲロオリゴ糖について、免疫賦活活性（特許文献１）等の生理活性を有することが明らかにされた。また機能性食品素材（特許文献２）としての用途についても注目され、本糖の安価な供給が望まれている。
【０００６】
従来からα−１，３−結合のオリゴ糖は酒、蜂蜜、麹汁、ビール等に含まれることが知られているが、天然には極く僅かにしか存在しない。また本糖の生産方法としてはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の菌糸中に含まれる３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルグルコースを構成糖として含むニゲランを部分酸加水分解する方法、あるいはα−１，３−結合、α−１，４−結合を有するエルシノエ（Elsinoe）属微生物産生の特種な多糖エルシナンをα-アミラーゼで酵素分解（特許文献３）する方法が知られているが、本糖の安価な供給には至っていない。また一般に利用可能な澱粉分解物等の基質から本糖を酵素的または化学的に取得しようとする試みに関しても、公知のα-グルコシダーゼによる縮合、転移反応では本糖は極く僅かしか生成しないほか（非特許文献１）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の酵素による、マルトースからニゲロースの生成についても学術報告はあるものの、その生成量は少なく実用上の価値は少なかった。
【０００７】
ところで本発明者らは先に、アクレモニウム（Acremonium）属に属するある種の菌株が、コージビオース、ニゲロース、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質は水解するが、ショ糖やトレハロースは実質的に水解せず、かつα−１，３−結合へのグルコース転移反応またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移反応を選択的に触媒する糖転移酵素を産生することを見いだしており、該酵素を用いて、適当な基質、特にマルトオリゴ糖に作用させ、α−１，３−結合を分子内に含むニゲロース等のオリゴ糖を高収率で製造する方法を提案している（特許文献４）。
【０００８】
ニゲロース等のオリゴ糖の大量生産の為には、本酵素の大量取得が望まれる。従来の菌株育種方法は、主として、紫外線や変異誘発剤によって得られる糖転移酵素生産菌の変異株を選抜する方法に限られていたため、安定な変異体を単離するのが困難な場合もある。また、従来法による育種の場合、好まざる形質変化を伴うことも多い。
【０００９】
【特許文献１】
特開平９−５２８３４号公報
【特許文献２】
特開平３−２２９５８号公報
【特許文献３】
特開昭５５−１９００４号公報
【非特許文献１】
フジモト、Ｈ.、ニシダ、Ｈ.、及びアジサカ、Ｋ. 、：Agric.Biol.Chem.、５２、１３４５- 、１９８８
【特許文献４】
特開平７−５９５５９号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記糖転移酵素の大量生産のためには、本酵素の遺伝子を取得し、遺伝子工学的にそれを生産することが望まれる。さらに、遺伝子を取得出来れば変異体を作成することにより、活性の高い酵素を得ることができ、更には蛋白工学の技術を用いて、耐熱性、耐pH性の向上、反応速度が増大された酵素を得ることも期待できる。
【００１１】
このような状況下、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する上記糖転移酵素の部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素の生産菌アクレモニウム・インプリカタム（Acremonium implicatum IFO30538）から調製したcDNAより当該酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、さらに酵母等の微生物での発現にも成功した。本発明はそれらの知見に基づいて完成されたものである。従って本発明は該酵素の遺伝子を提供するものである。さらに、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより形質転換された生物、該形質転換体を用いた組換え糖転移酵素及びその製造法、該組換え糖転移酵素を用いた、α１→３結合を分子内に含む糖類、特にニゲロオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【００１２】
本発明は以下の通りである。
（請求項１）以下の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１に示される塩基配列番号１０４〜２８５１の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）に示すＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
（請求項２）請求項１に記載の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子を含む組換えベクター。
（請求項３）ベクターが、酵母で機能するベクターである請求項２記載の組換えベクター。
（請求項４）酵母で機能するベクターがピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）またはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）に属する宿主で機能するベクターである請求項３に記載の組換えベクター。
（請求項５）ベクターが、カビで機能するベクターである請求項２記載の組換えベクター。
（請求項６）カビで機能するベクターが、リゾープスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｖｅｕｓ）またはリゾープスデルマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒ）で機能するベクターである請求項５に記載の組換えベクター。
（請求項７）請求項２〜６のいずれか一項に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（請求項８）宿主が、微生物、酵母またはカビである請求項７に記載の形質転換体。
（請求項９）宿主が酵母であり、組換えベクターが請求項３または４記載の組換えベクターである請求項７に記載の形質転換体。
（請求項１０）宿主がカビであり、組換えベクターが請求項５または６記載の組換えベクターである請求項７に記載の形質転換体。
（請求項１１）請求項７〜１０のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする酵素の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明による糖転移酵素遺伝子は、糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。さらに、この転移酵素活性を有するタンパク質（糖転移酵素）は、コージビオース、ニゲロース、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質は水解するが、ショ糖やトレハロースは実質的に水解しない。より具体的には、配列番号２のアミノ酸番号１〜９１６で示されるアミノ酸配列またはアミノ酸番号２６〜９１６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列（該アミノ酸配列またはその１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列）を有し、かつ例えば、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質の非還元末端グルコース部の３位に、グルコース単位をα−１，３−結合する糖転移活性を有し、α−１，３−結合を分子内に含むニゲロース（３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルグルコース）等のオリゴ糖を生成する活性を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列である。
【００１４】
本発明によるベクター（プラスミド）は、上記のＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドであり、本発明による形質転換体は上記の組換えプラスミドにより形質転換された細胞（微生物、動植物細胞等）である。
【００１５】
本発明による糖転移酵素の製造方法は、上記の形質転換細胞を培養し、この培養物中から、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明による組換え糖転移酵素は上記遺伝子の発現産物である。すなわち、本発明による糖転移酵素は、配列番号２のアミノ酸番号１〜９１６で示されるアミノ酸配列またはアミノ酸番号２６〜９１６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質である。
【００１７】
更にまた、本発明によるα−１，３−結合を分子内に含む糖類、特にニゲロオリゴ糖の製造方法は、上記組換え糖転移酵素を、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質と接触させる工程を含んでなるものである。
【００１８】
［糖転移酵素遺伝子］
上述のように、本発明による糖転移酵素遺伝子は、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα−１，３−（またはα−１，３−およびα−１，４−）結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、α−１，３−結合への転移反応を触媒する糖転移酵素の部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素の生産菌アクレモニウム・インプリカタム（Acremonium implicatum IFO30538）から調製したcDNAより当該酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、さらに酵母等の微生物での発現にも成功することによって決定されたものである。
【００１９】
［糖転移酵素遺伝子のクローニング］
アクレモニウム（Acremonium）より得られるα−１，３−結合（またはα−１，３−およびα−１，４−結合）をもたらす糖転移酵素にはそれぞれが分子量が異なる２つのサブユニットから成ることが明らかにされている。特定の蛋白質をコードする遺伝子を単離する場合、蛋白質の部分アミノ酸配列を決定し、その縮重コドンからなる混合オリゴヌクレオチドをプロープとして遺伝子ライブラリーから単離することが可能である。また、本発明において実施したようなPCRにより単離することも可能である。しかしながら、本酵素のように酵素が２種類のサブユニットからなるヘテロオリゴマー分子である場合、２つのサブユニットがそれぞれ異なる遺伝子に独立してコードされる可能性がある。また、それらがひとつの遺伝子から由来するにしても２つのサブユニットをコードする領域が構造遺伝子のなかでどのような位置関係となっているかなどその構造については予測ができない。
【００２０】
本発明者らは、まず酵素のペプチドマップを明らかにした。そして、いくつかの部分アミノ酸配列を決定した。さらにゲノムDNAを鋳型とするPCRによる部分断片の取得の後、その断片情報をもとにプライマーを設計した。そして、設計したプライマーを用いたRT-PCR, RACE(Rapid Amplify cDNA end)法を用いcDNAのクローニングに成功し、遺伝子構造を解析することによってこれら２つのサブユニットが同一の遺伝子にコードされることを明らかにした。すなわち、α１→３結合をもたらす糖転移酵素は、それをコードする遺伝子から１つのポリペプチドとして生成された。
【００２１】
［糖転移酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片］
本発明による糖転移酵素をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片の具体例としては、図１に示される制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片が挙げられる。
この断片は、アクレモニウムAcremonium属に属する菌体、より好ましくはアクレモニウム・インプリカタム（Acremonium implicatum） IFO30538より調製されるmRNAを鋳型としたRT-PCR, RACE(Rapid Amplify cDNA end)法より単離することができる。本発明による糖転移酵素遺伝子は、配列番号２（糖転移酵素遺伝子から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列）のアミノ酸番号１〜９１６もしくはアミノ酸番号２６〜９１６で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明による糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、配列番号１に示される塩基配列の１０４番目から２８５１番目（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜９１６に相当）までの塩基配列および塩基配列の１７９番目から２８５１番目（配列番号２におけるアミノ酸番号２６〜９１６に相当）が挙げられる。
【００２３】
さらに本発明による糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるDNA、または配列番号１に示される塩基配列番号１７９〜２８５１の塩基配列からなるDNAと相補的な配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００２４】
また、本発明は、糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡとして、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるDNA、または配列番号１に示される塩基配列番号１７９〜２８５１の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含する。
【００２５】
本発明において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより低いＤＮＡ同士がハイブリダイズされない条件が挙げられる。
【００２６】
蛋白質のアミノ酸配列が与えられば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して決定することができる。よって配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択することが可能である。本発明の好ましい態様において、配列番号２のアミノ酸番号１〜９１６または２６〜９１６に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とは、配列番号１に示される塩基配列の１０４番から２８５１番または１７９から２８５１番の配列を有するもの、およびその縮重関係にあるコドンが使用されている部分以外は同一の塩基配列を有し且つ上記のアミノ酸をコードする塩基配列、更には該配列において１もしくは複数（たとえば１もしくは数個）のコドンが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列をも包含するものである。配列番号１に示される塩基配列の１０４番から２８５１番または１７９から２８５１番までの配列を有するＤＮＡ断片は塩基配列が決定されていることから、そのＤＮＡ断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法たとえば、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（モデル３９２，アプライドバイオシステムズ）を用い、そのマニュアルに記載の方法に従って製造することができる。またこの配列は、前記したアクレモニウム（Acremonium）属に属する菌体、より好ましくはアクレモニウム・インプリカタム（Acremonium implicatum）IFO30538から遺伝子工学的な手法を用いて得ることが出きる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、 Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))などに記載の方法で好ましく行なうことができる。具体的な方法は、後記する実施例に詳細に説明されている。
【００２７】
［糖転移酵素］
本発明による糖転移酵素は、以下の活性を保持することを特徴とするものである。すなわち、コージビオース、ニゲロース、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質は水解するが、ショ糖やトレハロースは実質的に水解しない。さらに、糖受容体へのα−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を高い選択性をもって触媒する活性を有する。α−１，３−結合のグルコース転移またはα−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移は実質的に生じないか、生じたとしても、極僅かである。また、反応条件により、α−１，３−結合のグルコース転移のみを触媒する場合と、α−１，３−およびα−１，４−結合のグルコース転移を触媒する場合とがある。
【００２８】
より具体的には、例えば澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質の非還元末端グルコース部の３位に、グルコース単位をα−１，３−結合してα−１，３−結合を分子内に含むニゲロース（３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルグルコース）等のオリゴ糖を生成する活性により特徴付けられる。従って本発明による糖転移酵素は、澱粉及びその分解物から、α−１，３−結合を分子内に含むニゲロース（３-Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシルグルコース）等のオリゴ糖を生成することができる。
【００２９】
本発明の一つの態様による糖転移酵素のアミノ酸配列は、具体的には、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜９１６のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、且つ上記した糖転移酵素活性を依然として保持する、改変された配列を包含するものとする。その改変配列における糖転移酵素活性の保持とは、その活性を利用した実際の使用態様において、配列番号２に示される配列を全て有するポリペプチドと、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいうものとする。このような改変された配列は、配列番号２に示されている配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難なしに選択し、製造可能であることは明らかである。
【００３０】
さらに、本発明の別の態様によれば、配列表の配列番号２のアミノ酸番号２６番から９１６番までに示されるアミノ酸配列が提供される。この配列は、本酵素が培地に分泌される過程で、１〜２５番に存在するペプチドが切断されることにより得られる場合のものであり、培地中に回収される酵素は、天然体であっても組換え体であっても実質的にこの配列を含む（上記改変配列を包含する）ものである。従って、本発明のもう一つの態様による糖転移酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜９１６のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、且つ上記した糖転移酵素活性を依然として保持する改変された配列を包含するものとする。
【００３１】
なお、後述のように本発明遺伝子を酵母で分泌発現させた場合、この酵素タンパク質は糖鎖が結合した形で得られ、糖鎖の切断によって糖鎖のない酵素タンパク質とすることができるが、これらも糖転移酵素活性を保持している限り本発明の酵素に包含される。
【００３２】
アクレモニウム・インプリカタム（Acremonium imuplicatum） IFO30538の菌体の培養にあたっては、培地に菌体を接種し、常法に従い培養すればよい。培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適量含有せしめると好ましい。この炭素源窒素源については、特に制限はないが、例えば、コーングルテン、大豆粉、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等が挙げられる。
【００３３】
一方炭素源としては、α１→４グルコシド結合を有するポリサッカライドまたはオリゴサッカライド、例えば澱粉やその分解物、加工物やマルトース、マルトオリゴ糖などの資化し得るマルトオリゴ糖が挙げられる。中でも、マルトース、マルトオリゴ糖などが好ましい。その他に、リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺等の無機塩や、さらに有機微量栄養源を適宜培地中に添加することもできる。
【００３４】
［糖転移酵素をコードする遺伝子の発現／糖転移酵素の製造］
１）発現ベクター
本発明による糖転移酵素をコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクターの形態として宿主細胞の形質転換を行なえば、宿主細胞において本発明による糖転移酵素を産生させることができる。
【００３５】
従って、本発明によれば、さらに本発明による糖転移酵素をコードする遺伝子を含んだＤＮＡ分子、特に発現ベクターが提供される。このＤＮＡ分子は、ベクター分子に本発明による糖転移酵素をコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることが出きる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。
【００３６】
本発明によるＤＮＡ分子の作成は、前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌに記載の方法に準じて行なうことが出きる。
【００３７】
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ、ｐＵＣ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩＰ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ系（特開平４−２１８３８２号公報に記載）などが挙げられる。
【００３８】
このプラスミドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することができる。
【００３９】
さらに、本発明による発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、糖転移酵素遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有しているのが好ましい。
【００４０】
プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、SPAC等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、酸性フォスファターゼ（PHO）、ガラクトース遺伝子（GAL）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（GAP）等のプロモーターが好ましく用いることができる。配列番号２に示しているアミノ酸配列のアミノ酸番号１番から９１６番までの配列にはシグナルペプチド（アミノ酸番号１番〜２５番）を含んでおり、後記する実施例で示すようにこの配列をそのまま、酵母由来のプロモーター、ターミネーターに挿入し酵母に導入して分泌発現をさせることが出きる。シグナルペプチドの使用は、培養上清からの精製も容易になるので好ましい。また、シグナルペプチドを酵母由来のもの（たとえばインベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ-ファクターシグナルなど）に置き換えることも好ましい。また、大腸菌においては、一般に慣用されるlacプロモーターを用いたところ目的の酵素は発現されなかったが、プロモーターとしてラクトースオペロン（lac ）、トリプトファンオペロン（trp ）等を用い、シャペロニンを同時に発現させる等の工夫をすれば発現が可能になることも考えられる。
【００４１】
２）形質転換体／培養
本発明によれば、更に上記の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入した形質転換細胞、および形質転換細胞を培養して培養物から糖転移酵素を得る糖転移酵素の製造法が提供される。
【００４２】
形質転換細胞の培養は、使用宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができ、通常１〜４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に糖転移酵素が生成蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的であり、たとえば遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【００４３】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Candida utilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia Pastoris）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはパチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いることが好ましい。該属には蛋白質を菌体外へ分泌する株（たとえば、パチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、酵母や糸状菌がより好ましく、特にピチア・パストリス（Pichia Pastoris）やリゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）が好ましい。後記する実施例に示すように、ピチア・パストリス（Pichia Pastoris）やリゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）を宿主としてこの遺伝子を発現させたところ、培地及びペリプラズム中に高い酵素活性が認められた。
【００４４】
かくして調製された形質転換体の産生する組換え糖転移酵素の単離・精製には、公知の分離、精製方法を適当に組み合わせて行なうことが出きる。これらの分離、精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。具体的には、例えば実施例７に記載のように糖転移酵素を精製できるが、一般的な分離・精製法に関しては例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【００４５】
［α−１，３−結合を分子内に含む糖類の製造］
本発明によれば、上記の組換え糖転移酵素を用いたα−１，３−結合を分子内に含む糖類、特にニゲロース等のオリゴ糖の製造方法が提供される。すなわち、本発明によるオリゴ糖の製造法は、上述のような本発明による糖転移酵素を、澱粉およびその分解物から選択される基質に作用させることを特徴とするものである。ここで澱粉の分解物とは、アミロース及びアミロペクチンの分解物の他、マルトオリゴ糖等をも包含するものである。基質としては澱粉、アミロースおよび／またはアミロペクチンの分解物、マルトオリゴ糖等をそれぞれ単独で用いても構わないが、α−１，３−結合を分子内に含むニゲロース等のオリゴ糖の製造法の好ましい態様によれば、本発明による組換え糖転移酵素とデンプン分解物、更に好ましくはマルトオリゴ糖と混合し、接触させることにより、α−１，３−結合を分子内に含むオリゴ糖（通常は種々の重合度の混合物）を効率よく製造することができる。
【００４６】
本発明の糖転移酵素の好ましい基質であるデンプン分解物のグルコース重合度は特に制限されないが、たとえば、α−１，３−結合を分子内に含むオリゴ糖をシロップとして使用するのが一般的である食品の場合には、重合度は２〜１０程度、特定重合度・高純度品を使用することを要求される医薬用途の場合には、所望のオリゴ糖重合度・純度に適した基質の重合度・種類を選択すれば良い。
【００４７】
本発明の糖転移酵素と基質との混合割合は、酵素の形態（乾物、溶液など）やその他の反応条件によって大きく変化するが、通常糖転移酵素１Ｕに対して基質０．０００５〜０．５ｇ、好ましくは糖転移酵素１Ｕに対して基質０．００１〜０．１ｇである。また反応条件に関しては、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９、温度３０〜６５℃、好ましくは４０〜６０℃、反応時間３〜９６時間、好ましくは１２〜４８時間である。
【００４８】
基本的には、得られるオリゴ糖の重合度は、糖受容体となる基質のグルコース重合度に依存し、重合度の大きい基質を使用しても反応時間を長くすれば重合度の小さいオリゴ糖を得ることもできるが、重合度の小さいオリゴ糖を糖受容体として含む基質を使用すれば、短時間でより効率的にα−１，３−結合含有の低重合オリゴ糖を得ることができることはいうまでもない。
【００４９】
生成したα−１，３−結合を分子内に含む目的のオリゴ糖は、通常の糖の分離精製法、たとえば脱色、脱塩、濃縮糖を適宜組み合わせることにより精製することができる。オリゴ糖の分離・精製の一般的方法に関しては、例えば澱粉・関連糖質実験法（学会出版センター）等を参照することができる。
【００５０】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは本発明を更に具体的に説明するためのものであり、本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。また、操作手順は特に記載しない限りMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、 Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の方法に従った。また、以下の実施例に於て使用される本発明糖転移酵素に特異的な活性測定方法は、本発明者らが以前用いた方法に従った（特開平７−５９５５９号公報）。この活性測定方法の概要を示せば、以下の通りである。
【００５１】
＜ＨＰＬＣを用いた糖転移酵素の測定方法＞
特開平７−５９５５９号公報に従い、酵素液０．２ｍＬに対して２％マルトース（20mM リン酸ナトリウム pH7.0に溶解したもの）０．４ｍＬと４０℃で１時間反応させた。１００℃５分で反応を停止した後、３０Ｕ/ｍＬのグルコアミラーゼ（生化学工業、１Ｍ酢酸ナトリウムpH4.5に溶解したもの）０．１ｍＬと４０℃、２時間反応させた。このサンプルについても１００℃、５分で反応を停止した後、以下の条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：Aminex HPX-42A（Bio-Rad）
移動相：超純水カラム温度：８０℃
流速：0.6ml/min.
検出器：ＲＩ
上記条件下で、ピーク面積で全糖中１％のニゲロシルグルコースを生成する酵素濃度を、１Ｕ／ｍＬと便宜的に定義した。
【００５２】
＜本酵素のα-グルコシターゼとしての活性測定方法＞
特開平７−５９５５９号公報と同様に行なった。即ち、試験管にあらかじめ１．０ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０、および０．５ｍＬの基質溶液（２０ｍＭＰＮＰＧ（シグマ）水溶液）を加え３７℃、５分間加熱を行なった。その後、酵素溶液０．５ｍＬを加え３７℃で１５分間反応させた後、２．０ｍＬの０．２ＭＮａ₂ＣＯ₃溶液を加えて反応を停止させた。この溶液について４００ｎｍの吸収の変化を測定し生成したp-ニトロフェノールの量を測定し、１分間に１μＭのp-ニトロフェノールを生成する活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【００５３】
［実施例１］糖転移酵素の精製および部分アミノ酸配列の決定
菌体の培養、および酵素精製は以下の方法で行った。
（１）菌体の培養
コーンスターチ（日本食品化工(株)製）０.５％（w/v）、シェフトンD（シェフィールド製）０.７５％（w/v）、リン酸水素二カリウム０.１％（w/v）、炭酸ナトリウム１.０％（w/v）および水からなる液体培地をｐH８.０に調整し、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、アクレモニウム・インプリカタム（Acremonium implicatum） IFO30538株を接種し、２８℃、１３０rpmで２４時間培養したものを種培養液とした。
【００５４】
上記と同じ組成の培養液を４L調製し、５L容三角フラスコに１Lずつ入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液５％（v/v）を接種し、２８℃、１３０rpmで９６時間培養した。除菌した培養液中の本酵素活性は、０.００３単位／ｍｌであった。
【００５５】
（２）酵素の精製
（１）で得られた培養液を、４℃の冷却下で、１００００rpmで遠心分離して、菌体を除いた上清約４Lを得た。この上清をPM−１０膜（ミリポア製）を用いて２００ｍｌまで濃縮し、２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.０）にて緩衝化したDEAE−トヨパール６５０Mを充填したカラム（２.６φ×４５ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて未吸着のタンパク質が溶出し終わるまで洗浄した。その後、０→１Mの食塩濃度のリニアグラディエントにて酵素を溶出した。得られた活性画分を、２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.０）、続いて２M硫安を含む同緩衝液に対して透析し、PM−１０膜を用いて１０ｍｌまで濃縮した。この酵素溶液を２M硫安を含む２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.０）にて緩衝化したブチル−トヨパール６５０Mを充填したカラム（１.６φ×６０ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて未吸着のタンパク質が溶出し終わるまで洗浄した。その後、２→０Mの硫安濃度のリニアグラディエントにて酵素を溶出した。活性画分を回収し、２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.０）に対して透析した後、PM−１０膜を用いて２ｍｌまで濃縮した。この酵素溶液を２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.０）にて緩衝化したトヨパールHW−５５Fを充填したカラム（１.６φ×９５ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて酵素を溶出した。活性画分を回収し、PM−１０膜を用いて２ｍｌまで濃縮し、精製酵素標品とした。得られた精製酵素標品の総活性量は５.６単位、比活性は８．０単位／ｍｇタンパク質であった。
得られた精製酵素標品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のタンパク質染色バンドを示し、高度に精製された標品であることを示した。
【００５６】
アクレモニウム・インプリカタム（Acremonium implicatum） IFO30538株の糖転移酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥでヘテロダイマーであり、分子量は約６００００と約５１０００であった。糖転移酵素の部分アミノ酸配列分析をリジルエンドペプチダーゼにより消化後、逆相液体高速クロマトグラフィーを用い各ペプチドを分離し、またＮ末端アミノ酸配列分析をエドマン分解の方法により行なった。約100μｇの精製酵素をマイクロチューブ中にとり乾燥し、これに110ｍｇの尿素加え、さらに２５μＬの10mMのＥＤＴＡを含む0.5M トリス緩衝液ｐＨ７.５を直接加え、２分間激しく撹拌した。この操作を尿素が溶解するまで繰り返した。尿素溶解後、全量を３００μＬになるよう10mMのＥＤＴＡを含む0.5M トリス緩衝液ｐＨ７．５で調整し、これに３．２μＬの２−メルカプトエタノールを加え、一晩マイクロチューブのヘッドスペースを窒素ガスで置換する。
【００５７】
これに、4.8μＬの４−ビニルピリジンを加え、さらに暗所にて2時間ヘッドスペースを窒素ガスで置換する。2μＬの酢酸を加えペプチドの修飾反応を止める。得られた反応用液を一晩透析により、20ｍＭトリス緩衝液 pH8.0に置換する。この溶液を乾燥後、これに37ｍｇの尿素を加え、100μＬの0.1M トリス緩衝液(ｐＨ8.0)で尿素を完全に溶解する。ここに200pmolのリジルエンドペプチダーゼを加え、37℃でペプチドを消化させ、24時間後さらに同量のリジルエンドペプチダーゼを加え、37℃、24時間ペプチドを消化させた。
【００５８】
その消化物をＣ１８カラム（資生堂 CAPCELL PAK C₁₈ Φ4.6X150mm ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離し、7種類のペプチド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒としてはＡ溶媒（０.１％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒（０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル/ 精製水８：２）を用い、溶出はＢ溶媒に関し、０〜１００％の直線濃度勾配で１ｍＬ/ｍｉｎの流速で９０分間溶出させることにより行なった。得られた断片化ペプチド（AC-64, AC-66, AC-67, AC-69, AC-72, AC-74, AC-76）についてのアミノ酸配列決定試験を、気相ペプチドシークエンサーProcise 491（アプライドバイオシステム）を用いマニュアルに従って自動エドマン分解法により行なった。
【００５９】
以下に得られた部分アミノ酸配列を記す。
AC-64： AIDIRYRLLDYMYTA
AC-66： ACNAYGDDLEELILE
AC-67： YWNNEFALFFDKDEG
AC-69： YGYRDVFEVAEVVY
AC-72： VRALVDHLHENDQH
AC-74： PAVAYVESDT
AC-76： VGXXLGDNLSNXXQYXE
なお、AC-64, AC-67, AC-72, AC-74の部分アミノ酸配列を基にそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを設計した。
【００６０】
実施例
１．全RNAの単離およびPoly(A)⁺RNAの精製
上記（１）に記載されている方法に従いアクレモニウム（Acremonium）の菌体を取得した。菌体２０ｇを液体窒素により凍結した後RNA Extraction Kit（PharmaciaBiotech）を用いてトータルRNAを抽出した。
【００６１】
0.2mgの全RNA 50μlに等量のElution buffer(20mM Tris-HCl pH7.5, 2mM EDTA, 0.2% SDS)を加えた後、100μlのOligotex dT30〈Super〉(宝酒造)を加え、65℃、5分間保持し、さらに氷中にて3分間保持した。20μlの5M NaClを加え、37℃にて10分間保持した後、遠心分離し沈殿を250μlのWash buffer(10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.1％ SDS, 0.5M NaCl)で懸濁した。遠心分離後、沈殿を100μlのTE緩衝液で懸濁し、65℃にて10分間、さらに氷中にて3分間保持した。遠心分離後、上清をエタノール沈殿し、得られた沈殿を風乾後10μlの水に溶解させた。
【００６２】
２．RT−PCR(Reverse Transcription PCR)
アクレモニウム（Acremonium）の菌体より精製したPoly(A)⁺RNA 500ngからSUPERSCRIPT Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(LIFETECHNOLOGIES)を使用し、逆転写反応を行った。ただし、oligo-d(T) primerの代わりに3'-A P (5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')を用いた。
【００６３】
３．３'−RACE法（rapid amplification of cDNA 3'-end）
3'−RACEは、Frohman, M.A.らの方法に従い行った(M.A.Frohman, M.K.Dush, and G.R.Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998-9002(1988))。鋳型として実施例2のRT-PCR産物を、プライマーとしてAC-64p（センスプライマー, 5'- tatagccaggcaaacattccc-3'）3'-AUAP(abridged universal amplification primer、5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')および3'-A Pを使用し、94℃, 1分間−50℃, 2分間−72℃, 3分間の反応を30サイクル行った。その結果、約2000bpのcDNA断片が増幅した。本断片をFRAG１と命名し塩基配列の解析を行った。
【００６４】
４．５'−RACE法（rapid amplification of cDNA 5'-end）
5'−RACEは、Frohman, M.A.らの方法に従い行った(M.A.Frohman, M.K.Dush, and G.R.Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998-9002(1988))。mRNAを15ユニットのterminal transferase（Invitrogen）と添付緩衝液を用いて、ｍRNAの5'側にオリゴ(dT)を付加した。これを鋳型に5'-AUAP(5'-GACTCGAGTCGACATCG-3')および5'-A P(5'-GACTCGAGTCGACATCGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')をセンスプライマーとして、 AC-67ｐRV (5'- tagggcgaattcgttgttcca -3')をアンチセンスプライマーとして行った。その結果、約1.3kbの増幅断片FRAG-2を得，塩基配列の解析を行った。上記プライマーを用いた5'-RACEの条件を以下に示す。ＰＣＲの条件は９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分で３０サイクル行なった。
【００６５】
５．アクレモニウム（Acremonium）由来α−グルコシダーゼ cDNAの取得
アクレモニウム（Acremonium）より精製したPoly(A)⁺RNA 500ngを鋳型として、5'-RACEで得られた塩基配列から設計したAC-1p(5'-gtcgacgtcgaccgataactgtct-3')およびAUAPをプライマーとしてRT−PCRを行ったところ、約3000bpのｃDNAを得た。本cDNAの塩基配列を解析したところ、全塩基配列は2978bpであり、103bpの5'非翻訳領域と127bpの3'非翻訳領域が存在していた。得られた塩基配列より、タンパク質のアミノ酸配列は916残基であった。また、得られた塩基配列は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−グルコシダーゼと約47％、シゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）由来と45％のホモロジーが確認されたことから、このｃDNAをアクレモニウム（Acremonium）由来のα−グルコシダーゼ遺伝子と同定した。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アクレモニウム・インプリカタム(Acremonium implicatum )α-グルコシダーゼ cDNAの遺伝子の制限酵素地図。
【図２】アクレモニウム・インプリカタム(Acremonium implicatum )からのα-グルコシダーゼ cDNAのクローニングストラティジー。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to α-1,3-bond, or α-1,3- and α-1,4-linked glucose to a sugar receptor by acting on a substrate selected from starch and degradation products thereof. More specifically, it relates to a glycosyltransferase gene that catalyzes transfer. More specifically, for example, a glucose unit is α-1 at the 3rd position of the non-reducing terminal glucose part of a substrate selected from starch and its degradation products. , 3-linked saccharides, and α-1,3-linked saccharides, especially oligosaccharides such as nigerose (3-O-α-D-glucopyranosyl glucose). The present invention relates to an active glycosyltransferase gene.
[0002]
Furthermore, the present invention provides a recombinant plasmid containing the gene, an organism transformed with the plasmid (microorganism, animal or plant cell, etc.), a method for producing a glycosyltransferase using the transformant, and the recombinant enzyme. The present invention relates to a method for producing saccharides, particularly a method for producing nigerooligosaccharides such as nigerose, nigerosyl glucose, nigerosyl maltose and the like, and the transferase obtained by gene recombination.
[0003]
The glycosyltransferase of the present invention is an industrially important enzyme for producing a saccharide having an α-1,3-linkage in the molecule, particularly a nigerooligosaccharide, and the transformant obtained by the present invention uses this enzyme. Produced in significant amounts, it greatly contributes to the industry (food, medicine, etc.) using these enzymes.
[0004]
[Prior art]
Oligosaccharides have been conventionally used in applications such as sweeteners, pharmaceuticals, enzyme assay substrates, and various chemical intermediates, depending on the constituent monosaccharide, binding mode, and steric structure. In addition to natural products, oligosaccharides such as maltooligosaccharides, isomaltooligosaccharides, fructooligosaccharides, and coupling sugars have been developed so far.
[0005]
In recent years, α-1,3-bonds such as nigerose (3-O-α-D-glucopyranosyl glucose) and nigerosyl glucose (3-O-α-D-glucopyranosyl maltose) are incorporated into the molecule. It has been clarified that the nigerooligosaccharide possessed has physiological activities such as immunostimulatory activity (Patent Document 1). Moreover, attention is also paid to the use as a functional food material (Patent Document 2), and an inexpensive supply of the present sugar is desired.
[0006]
Conventionally, it has been known that α-1,3-linked oligosaccharides are contained in alcohol, honey, bean juice, beer and the like, but there are very few in nature. As a method for producing this sugar, a method of partial acid hydrolysis of nigeran containing 3-O-α-D-glucopyranosylglucose contained in the mycelium of Aspergillus niger as a constituent sugar, or α There is known a method of enzymatic degradation of a special polysaccharide erucinane having a -1,3-bond and an α-1,4-linkage produced by microorganisms belonging to the genus Elsinoe with α-amylase (Patent Document 3). The cheap supply of sugar has not been reached. In addition, regarding attempts to obtain this sugar enzymatically or chemically from commonly available substrates such as starch degradation products, very little sugar is produced in the condensation and transfer reactions with known α-glucosidases. (Non-Patent Document 1) Although there is an academic report on the production of nigerose from maltose by the enzyme of Aspergillus oryzae, the production amount was small and practical value was small.
[0007]
By the way, the present inventors firstly hydrolyzed a substrate selected from a certain strain belonging to the genus Acremonium, from cordobiose, nigerose, starch, and a degradation product thereof, but sucrose and trehalose were substantially And glycosyltransferase that selectively catalyzes the glucose transfer reaction to α-1,3-linkage or the glucose transfer reaction of α-1,3- and α-1,4-linkage. Proposing a method for producing an oligosaccharide such as nigerose containing α-1,3-linkage in a high yield by acting on an appropriate substrate, particularly maltooligosaccharide, using the enzyme. (Patent Document 4).
[0008]
For mass production of oligosaccharides such as nigerose, it is desired to obtain a large amount of this enzyme. Conventional strain breeding methods are mainly limited to methods for selecting mutants of glycosyltransferase-producing bacteria obtained by ultraviolet rays or mutagens, so it may be difficult to isolate stable mutants. . Moreover, in the case of breeding by the conventional method, unfavorable phenotypic changes are often accompanied.
[0009]
[Patent Document 1]
JP-A-9-52834
[Patent Document 2]
JP-A-3-22958
[Patent Document 3]
JP 55-19004 A
[Non-Patent Document 1]
Fujimoto, H., Nishida, H., and Ajisaka, K.,: Agric. Biol. Chem., 52, 1345-, 1988.
[Patent Document 4]
JP-A-7-59559
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
For mass production of the above glycosyltransferase, it is desired to obtain the gene of this enzyme and to produce it by genetic engineering. Furthermore, if a gene can be obtained, a highly active enzyme can be obtained by creating a mutant. Furthermore, using protein engineering techniques, heat resistance and pH resistance are improved, and the reaction rate is increased. Enzymes can also be expected.
[0011]
Under such circumstances, as a result of extensive research, the present inventors have found that glucose transfer of α-1,3-bonds to sugar receptors or α-1,3- and α-1,4-bonds is not possible. Based on the partial amino acid sequence information of the glycosyltransferase that catalyzes glucose transfer, a gene encoding the enzyme is obtained from cDNA prepared from Acremonium implicatum IFO30538. Succeeded and succeeded in expression in microorganisms such as yeast. The present invention has been completed based on these findings. Accordingly, the present invention provides a gene for the enzyme. Furthermore, a recombinant vector containing the gene, an organism transformed with the vector, a recombinant glycosyltransferase using the transformant and a method for producing the same, an α1 → 3 linkage using the recombinant glycosyltransferase The present invention provides a method for producing saccharides, particularly nigerooligosaccharides, in the molecule.
[0012]
The present invention is as follows.
(Claim 1) The following (a) or (b)DA gene consisting of NA.
(A) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or DNA consisting of the base sequence of base sequence numbers 104 to 2851 shown in SEQ ID NO: 1.
(b) (a) Hybridized under stringent conditions with DNA having a sequence complementary to the DNA shown in FIG. 5) and α-1,3-linked glucose transfer to the sugar receptor or α-1,3- and α-1 A DNA sequence that encodes a protein having glycosyltransferase activity that catalyzes 4-linked glucose transfer.
(Claim 2) (a) or (b) according to claim 1DA recombinant vector containing a gene consisting of NA.
(Claim 3) The recombinant vector according to claim 2, wherein the vector functions in yeast.
(Claim 4) The recombination according to claim 3, wherein the vector that functions in yeast is a vector that functions in a host belonging to the genus Pichia (genus Pichia), Saccharomyces (genus Saccharomyces) or Schizosaccharomyces (genus Schizosaccharomyces). vector.
(5) The recombinant vector according to (2), wherein the vector is a vector that functions in mold.
(Claim 6) The recombinant vector according to claim 5, wherein the fungus-functional vector is a vector that functions in Rhizopus niveus or Rhizopus delmar.
(7) A transformant comprising the recombinant vector according to any one of (2) to (6).
(8) The transformant according to (7), wherein the host is a microorganism, yeast or mold.
(Claim 9) The transformant according to claim 7, wherein the host is yeast and the recombinant vector is the recombinant vector according to claim 3 or 4.
(Claim 10) The transformant according to claim 7, wherein the host is mold, and the recombinant vector is the recombinant vector according to claim 5 or 6.
(Claim 11) The transformant according to any one of claims 7 to 10 is cultured, and α-1,3-linked glucose transfer to a sugar receptor or α-1,3- and α- A method for producing an enzyme, comprising collecting a protein having glycosyltransferase activity that catalyzes 1,4-linked glucose transfer.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The glycosyltransferase gene according to the present invention has a glycosyltransferase activity that catalyzes α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-linked glucose transfer to a sugar receptor. It is a gene that encodes a protein it has. Furthermore, a protein (glycosyltransferase) having this transferase activity hydrolyzes a substrate selected from cordobiose, nigerose, starch and its degradation product, but does not substantially hydrolyze sucrose or trehalose. More specifically, the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 916 of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 916 (the amino acid sequence or one or more amino acid sequences thereof) An amino acid substitution, deletion, insertion or addition), and, for example, a glucose unit is α-positioned at the 3-position of the non-reducing terminal glucose part of a substrate selected from starch and its degradation products. 1. Activity of producing oligosaccharides such as nigerose (3-O-α-D-glucopyranosylglucose) having 1,3-linked glycosyltransferase activity and α-1,3-linked in the molecule It is a DNA sequence encoding a glycosyltransferase.
[0014]
The vector (plasmid) according to the present invention is a recombinant plasmid containing the above DNA sequence, and the transformant according to the present invention is a cell (microorganism, animal or plant cell, etc.) transformed with the above recombinant plasmid.
[0015]
The method for producing a glycosyltransferase according to the present invention comprises culturing the above-described transformed cell, and acting on a substrate selected from starch and a degradation product thereof from the culture to produce α-1 to a sugar receptor. , 3-bond glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-bond glucose transfer catalyzed protein transfer.
[0016]
The recombinant glycosyltransferase according to the present invention is an expression product of the above gene. That is, the glycosyltransferase according to the present invention has an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 916 of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 916, and starch and It acts on a substrate selected from the degradation products to catalyze α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-linked glucose transfer to a sugar receptor. It is a protein having glycosyltransferase activity.
[0017]
Furthermore, in the method for producing a saccharide containing α-1,3-linkage in the molecule, particularly a nigerooligosaccharide according to the present invention, the above recombinant glycosyltransferase is contacted with a substrate selected from starch and a degradation product thereof. The process of making it include.
[0018]
[Glycosyltransferase gene]
As described above, the glycosyltransferase gene according to the present invention acts on a substrate selected from starch and its degradation product to α-1,3- (or α-1,3- and a partial amino acid sequence of a glycosyltransferase that catalyzes a transfer reaction to α-1,3-linkage, which is a DNA sequence encoding a protein having glycosyltransferase activity that catalyzes glucose transfer of α-1,4-) bond Based on the information, we succeeded in obtaining the gene encoding the enzyme from the cDNA prepared from Acremonium implicatum IFO30538, and producing it in microorganisms such as yeast. It was determined by success.
[0019]
[Cloning of glycosyltransferase gene]
Glycosyltransferases that produce α-1,3-linkages (or α-1,3- and α-1,4-linkages) obtained from Acremonium are each composed of two subunits with different molecular weights. It has been made clear. When a gene encoding a specific protein is isolated, it is possible to determine a partial amino acid sequence of the protein and to isolate a mixed oligonucleotide composed of its degenerate codons as a probe from a gene library. It is also possible to isolate by PCR as performed in the present invention. However, when the enzyme is a hetero-oligomer molecule composed of two types of subunits as in this enzyme, the two subunits may be independently encoded by different genes. Moreover, even if they are derived from one gene, it is impossible to predict the structure such as the positional relationship of the regions encoding the two subunits in the structural gene.
[0020]
The present inventors first revealed a peptide map of the enzyme. Several partial amino acid sequences were determined. Furthermore, after obtaining partial fragments by PCR using genomic DNA as a template, primers were designed based on the fragment information. Successful cloning of cDNA using RT-PCR and RACE (Rapid Amplify cDNA end) methods using the designed primers, and analysis of the gene structure indicates that these two subunits are encoded by the same gene. Was revealed. That is, a glycosyltransferase that produces an α1 → 3 linkage was produced as a single polypeptide from the gene that encodes it.
[0021]
[DNA fragment containing gene encoding glycosyltransferase]
A specific example of a DNA fragment containing a gene encoding a glycosyltransferase according to the present invention is a DNA fragment represented by the restriction enzyme map shown in FIG.
This fragment is isolated by RT-PCR, RACE (Rapid Amplify cDNA end) method using a cell belonging to the genus Acremonium Acremonium, more preferably mRNA prepared from Acremonium implicatum IFO30538 can do. The glycosyltransferase gene according to the present invention is an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 916 or amino acid numbers 26 to 916 of SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence deduced from the glycosyltransferase gene and the base sequence of DNA encoding the same). Or a DNA sequence encoding a protein having the amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence and having the above-mentioned enzyme activity.
[0022]
According to a preferred embodiment of the present invention, preferred specific examples of the DNA sequence encoding the glycosyltransferase according to the present invention include the 104th to 2851st positions of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (amino acid numbers 1 to 2 in SEQ ID NO: 2). (Corresponding to amino acid numbers 26 to 916 in SEQ ID NO: 2).
[0023]
Furthermore, preferred specific examples of the DNA sequence encoding the glycosyltransferase according to the present invention include DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or the base sequence of base sequence numbers 179 to 2851 represented by SEQ ID NO: 1. Which is hybridized under stringent conditions with a DNA having a sequence complementary to the DNA consisting of α-1,3-linked glucose transfer to a sugar receptor or α-1,3- and α-1, A DNA sequence encoding a protein having glycosyltransferase activity that catalyzes 4-linked glucose transfer can be mentioned.
[0024]
The present invention also relates to a DNA comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 179 to 2851 represented by SEQ ID NO: 1 as a DNA complementary to a DNA sequence encoding a glycosyltransferase. Hybridization with DNA consisting of a base sequence under stringent conditions, and α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-linked glucose transfer to a sugar receptor A DNA sequence encoding a protein having glycosyltransferase activity that catalyzes.
[0025]
In the present invention, stringent conditions refer to conditions in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, there is a condition in which DNAs having 90% or more homology hybridize and lower DNAs do not hybridize..
[0026]
Given the amino acid sequence of a protein, the base sequence encoding it can be determined with reference to a so-called codon table. Therefore, various base sequences encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be appropriately selected. In a preferred embodiment of the present invention, the DNA sequence encoding the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 916 or 26 to 916 of SEQ ID NO: 2 is from the 104th to 2851th or 179 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Except for the portion having the 2851 sequence and the portion where the degenerate codon is used, the nucleotide sequence has the same nucleotide sequence and encodes the amino acid, and one or more ( For example, it includes a base sequence in which one or several codons are substituted, deleted, inserted or added. Since the nucleotide sequence of the DNA fragment having the nucleotide sequence Nos. 104 to 2851 or 179 to 2851 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 has been determined, one means for obtaining the DNA fragment is a means for nucleic acid synthesis. Techniques For example, using a DNA / RNA synthesizer (Model 392, Applied Biosystems), it can be produced according to the method described in the manual. This sequence can be obtained from the aforementioned cells belonging to the genus Acremonium, more preferably Acremonium implicatum IFO30538, using genetic engineering techniques. For example, it can be preferably carried out by the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Specific methods are described in detail in the examples described below.
[0027]
[Glycosyltransferase]
The glycosyltransferase according to the present invention has the following activity. That is, a substrate selected from cordierbiose, nigerose, starch, and degradation products thereof hydrolyzes, but sucrose and trehalose do not substantially hydrolyze. Furthermore, it has an activity of catalyzing, with high selectivity, α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-linked glucose transfer to a sugar receptor. α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-bonded glucose transfer substantially does not occur, if any, very little. Depending on the reaction conditions, only α-1,3-bond glucose transfer may be catalyzed, and α-1,3- and α-1,4-bond glucose transfer may be catalyzed.
[0028]
More specifically, for example, a glucose unit is α-1,3-linked to form an α-1,3-bond at the 3-position of the non-reducing terminal glucose part of a substrate selected from starch and its degradation products. It is characterized by the activity of producing oligosaccharides such as nigerose (3-O-α-D-glucopyranosyl glucose) contained in the molecule. Therefore, the glycosyltransferase according to the present invention generates oligosaccharides such as nigerose (3-O-α-D-glucopyranosyl glucose) containing α-1,3-linkage in the molecule from starch and its degradation products. can do.
[0029]
The amino acid sequence of the glycosyltransferase according to one embodiment of the present invention specifically includes the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 916 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or one or more amino acid sequences in the amino acid sequence It is intended to include modified sequences in which amino acid insertions, substitutions, deletions, or additions at both ends have been made, and which still retain the glycosyltransferase activity described above. The retention of glycosyltransferase activity in the modified sequence is such that, in an actual usage mode using the activity, the polypeptide having all the sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be used in substantially the same manner under the same conditions. It is said that the activity of is maintained. It is clear that such a modified sequence can be selected and produced without particular difficulty by those skilled in the art with reference to the sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[0030]
Furthermore, according to another aspect of the present invention, there is provided an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 916 in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. This sequence is obtained when the peptide present in No. 1 to 25 is cleaved during the process of secretion of the enzyme into the medium, and the enzyme recovered in the medium is a natural product. Even if it is a recombinant, it substantially contains this sequence (including the modified sequence). Therefore, the amino acid sequence of the glycosyltransferase according to another aspect of the present invention is the amino acid sequence of amino acid numbers 26 to 916 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, or one or more amino acids in the amino acid sequence Including a modified sequence that has been inserted, substituted, or deleted, or added to both ends and that still retains the glycosyltransferase activity described above.
[0031]
In addition, when the gene of the present invention is secreted and expressed in yeast as described later, this enzyme protein is obtained in a form in which a sugar chain is bound, and can be made into an enzyme protein without a sugar chain by cleavage of the sugar chain, These are also included in the enzyme of the present invention as long as they retain glycosyltransferase activity.
[0032]
In culturing the cells of Acremonium imuplicatum IFO30538, the cells may be inoculated into the medium and cultured according to a conventional method. The medium preferably contains appropriate amounts of assimilating carbon and nitrogen sources. The carbon source nitrogen source is not particularly limited, and examples thereof include corn gluten, soybean flour, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, peptone, meat extract and the like.
[0033]
On the other hand, examples of the carbon source include polysaccharides or oligosaccharides having an α1 → 4 glucoside bond, such as starch and its degradation products, processed products, malto-oligosaccharides such as malt oligosaccharides and the like. Of these, maltose, maltooligosaccharide and the like are preferable. In addition, phosphoric acid, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Na⁺, K⁺Inorganic salts such as these and organic trace nutrient sources can be added to the medium as appropriate.
[0034]
[Expression of gene encoding glycosyltransferase / production of glycosyltransferase]
1) Expression vector
A DNA molecule that encodes a glycosyltransferase according to the present invention can be replicated in a host cell, or can be integrated into a chromosome and in a state in which the gene can be expressed, particularly in the form of an expression vector of a host cell. If transformed, the glycosyltransferase according to the present invention can be produced in the host cell.
[0035]
Accordingly, the present invention further provides a DNA molecule, particularly an expression vector, containing a gene encoding the glycosyltransferase according to the present invention. This DNA molecule can be obtained by incorporating a DNA fragment encoding the glycosyltransferase according to the present invention into a vector molecule. According to a preferred embodiment of the invention, this vector is a plasmid.
[0036]
Preparation of DNA molecules according to the present invention can be performed according to the method described in the above-mentioned Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
[0037]
The vector used in the present invention can be appropriately selected from viruses, plasmids, cosmid vectors, etc., taking into account the type of host cell to be used. For example, when the host cell is Bacillus subtilis, a pUB-type plasmid, when E. coli is used, a λ phage-type bacteriophage, pBR, a pUC-type plasmid, when yeast is a YEp, YCp-type, YIP-type vector, or pLeu4, Examples thereof include pPPLeu4 and pJPLeu systems (described in JP-A-4-218382).
[0038]
This plasmid preferably contains a selectable marker for the transformant, and a drug resistance marker or an auxotrophic marker gene can be used as the selectable marker.
[0039]
Furthermore, the DNA molecule as an expression vector according to the present invention has a DNA sequence necessary for the expression of a glycosyltransferase gene, for example, a transcriptional control signal such as a promoter, terminator, ribosome binding site, transcription termination signal, translational control signal, etc. It is preferable.
[0040]
Promoters include subtilisin and SPAC promoters in Bacillus subtilis, alcohol dehydrogenase (ADH), acid phosphatase (PHO), galactose gene (GAL), glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene (GAP) in yeast, etc. These promoters can be preferably used. The sequence from amino acid No. 1 to No. 916 of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2 contains a signal peptide (amino acid No. 1 to No. 25), and this sequence is left as it is as shown in Examples described later. It can be inserted into a yeast-derived promoter or terminator and introduced into yeast for secretory expression. Use of a signal peptide is preferable because purification from the culture supernatant is facilitated. It is also preferable to replace the signal peptide with one derived from yeast (for example, invertase signal, acid phosphatase signal, λ-factor signal, etc.). In addition, in Escherichia coli, the target enzyme was not expressed when the commonly used lac promoter was used. However, the lactose operon (lac), tryptophan operon (trp), etc. were used as the promoter to simultaneously express chaperonin. If devised, expression may be possible.
[0041]
2) Transformant / culture
According to the present invention, there are further provided a transformed cell in which the above expression vector is introduced into an appropriate host cell, and a method for producing a glycosyltransferase for culturing the transformed cell to obtain a glycosyltransferase from the culture.
[0042]
For the culture of the transformed cells, a general method can be used for the host cells to be used, and glycosyltransferase is usually produced and accumulated in the intracellular or extracellular culture by culturing for about 1 to 4 days. Regarding culture conditions (medium, pH, temperature, etc.), for example, generally 25 to 37 ° C. for bacteria, 25 to 30 ° C. for yeast, and 37 ° C. for eukaryotic cells. For example, a gene expression experiment manual (Kodansha) Etc. can be referred to.
[0043]
Host cells include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris, and other yeasts, Rhizopus niveus, Rhizopus delemar and higher eukaryotes (such as CHO cells) can be used. As the Bacillus subtilis, it is preferable to use a microorganism belonging to the genus Bacillus. It is known that the genus includes strains (eg, Bacillus subtilis) that secrete proteins out of the cell. In addition, strains that hardly secrete protease are also known, and such strains are preferably used as hosts. In the present invention, yeast, filamentous fungi or bacteria are preferred as the host cell, but yeast and filamentous fungi are more preferred, and Pichia Pastoris and Rhizopus delemar are particularly preferred. As shown in Examples described later, when this gene was expressed using Pichia Pastoris or Rhizopus delemar as a host, high enzyme activity was observed in the medium and periplasm.
[0044]
Isolation and purification of the recombinant glycosyltransferase produced by the transformant thus prepared can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. As separation and purification methods, for example, a method using a difference in solubility such as salt precipitation or solvent precipitation, or a difference in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, or SDS-polyacryl electrophoresis is used. Methods, methods utilizing charge differences such as ion exchange chromatography, methods utilizing hydrophobic differences such as hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography, and isoelectric points such as isoelectric focusing. For example, a method of using the difference. Specifically, for example, glycosyltransferase can be purified as described in Example 7. For general separation / purification methods, for example, basic experimental methods for proteins / enzymes (Nanedo) can be referred to.
[0045]
[Production of saccharide containing α-1,3-bond in the molecule]
According to the present invention, there is provided a method for producing a saccharide containing α-1,3-linkage in the molecule, particularly an oligosaccharide such as nigerose, using the above recombinant glycosyltransferase. That is, the oligosaccharide production method according to the present invention is characterized in that the glycosyltransferase according to the present invention as described above is allowed to act on a substrate selected from starch and a degradation product thereof. Here, the degradation product of starch includes malto-oligosaccharide and the like in addition to degradation products of amylose and amylopectin. As a substrate, starch, amylose and / or degradation product of amylopectin, malto-oligosaccharide, etc. may be used alone, but preferred is a method for producing oligosaccharides such as nigerose containing α-1,3-linkage in the molecule. According to an embodiment, the oligosaccharides containing α-1,3-links in the molecule (usually various kinds) are mixed by contacting the recombinant glycosyltransferase according to the present invention with a starch degradation product, more preferably malto-oligosaccharide, and bringing them into contact. Of the polymerization degree) can be efficiently produced.
[0046]
The degree of glucose polymerization of the starch degradation product, which is a preferred substrate for the glycosyltransferase of the present invention, is not particularly limited. For example, oligosaccharides containing α-1,3-linkages in the molecule are generally used as syrups. In the case of certain foods, the degree of polymerization is about 2 to 10, and in the case of pharmaceutical use that requires the use of a specific degree of polymerization / high purity product, a substrate suitable for the desired degree of oligosaccharide polymerization / purity What is necessary is just to select a polymerization degree and a kind.
[0047]
The mixing ratio of the glycosyltransferase and the substrate of the present invention varies greatly depending on the form of the enzyme (dry matter, solution, etc.) and other reaction conditions, but usually 0.0005 to 0.5 g of substrate per 1 U of glycosyltransferase. Preferably, the substrate is 0.001 to 0.1 g with respect to 1 U of glycosyltransferase. Regarding the reaction conditions, the pH is usually 4 to 10, preferably 6 to 9, the temperature 30 to 65 ° C., preferably 40 to 60 ° C., the reaction time 3 to 96 hours, preferably 12 to 48 hours.
[0048]
Basically, the degree of polymerization of the resulting oligosaccharide depends on the glucose polymerization degree of the substrate that is the sugar acceptor. Even if a substrate with a high degree of polymerization is used, the oligosaccharide with a low degree of polymerization can be obtained by extending the reaction time. However, if a substrate containing an oligosaccharide having a low degree of polymerization as a sugar acceptor is used, a low-polymerization oligosaccharide containing an α-1,3-linkage can be obtained more efficiently in a short time. Needless to say.
[0049]
The produced oligosaccharide containing the α-1,3-bond in the molecule can be purified by appropriately combining conventional sugar separation and purification methods such as decolorization, desalting, and concentrated sugar. For a general method for separating and purifying oligosaccharides, for example, starch and related carbohydrate experimental methods (Academic Publishing Center) can be referred to.
[0050]
【Example】
Examples of the present invention will be shown below, but these are for more specifically explaining the present invention, and the present invention is not limited to the scope of the following examples. Unless otherwise specified, the operating procedures were the same as those described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). In addition, the activity measurement method specific to the glycosyltransferase of the present invention used in the following examples was in accordance with the method previously used by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open No. 7-59559). The outline of this activity measurement method is as follows.
[0051]
<Measurement method of glycosyltransferase using HPLC>
According to JP-A-7-59559, 0.2 mL of enzyme solution was reacted with 0.4 mL of 2% maltose (dissolved in 20 mM sodium phosphate pH 7.0) at 40 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped at 100 ° C. for 5 minutes, and then reacted with 0.1 mL of 30 U / mL glucoamylase (dissolved in Seikagaku Corporation, 1M sodium acetate pH 4.5) at 40 ° C. for 2 hours. This sample was also analyzed by HPLC under the following conditions after stopping the reaction at 100 ° C. for 5 minutes.
Column: Aminex HPX-42A (Bio-Rad)
Mobile phase: Ultrapure water Column temperature: 80 ° C
Flow rate: 0.6ml / min.
Detector: RI
The enzyme concentration that produces 1% nigerosyl glucose in the total sugar in the peak area under the above conditions was defined as 1 U / mL for convenience.
[0052]
<Method for measuring activity of this enzyme as α-glucosidase>
This was carried out in the same manner as in JP-A-7-59559. That is, 1.0 mL of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 and 0.5 mL of a substrate solution (20 mM PNPG (Sigma) aqueous solution) were added to the test tube in advance and heated at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 0.5 mL of the enzyme solution was added and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and then 2.0 mL of 0.2 M Na.₂CO_ThreeThe solution was added to stop the reaction. The amount of p-nitrophenol produced was measured by measuring the change in absorption at 400 nm for this solution, and the activity to produce 1 μM p-nitrophenol per minute was defined as 1 unit.
[0053]
[Example 1] Purification of glycosyltransferase and determination of partial amino acid sequence
Cell culture and enzyme purification were performed by the following methods.
(1) Culture of bacterial cells
Corn starch (manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) 0.5% (w / v), Shefton D (manufactured by Sheffield) 0.75% (w / v), dipotassium hydrogen phosphate 0.1% (w / v) Then, a liquid medium consisting of sodium carbonate 1.0% (w / v) and water was adjusted to pH 8.0, and 100 ml was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. This cooled liquid medium was inoculated with Acremonium implicatum strain IFO30538 and cultured at 28 ° C. and 130 rpm for 24 hours to prepare a seed culture solution.
[0054]
4 L of a culture solution having the same composition as described above was prepared, 1 L was placed in a 5 L Erlenmeyer flask, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. The cooled liquid medium was inoculated with 5% (v / v) seed culture and cultured at 28 ° C. and 130 rpm for 96 hours. The enzyme activity in the sterilized culture broth was 0.003 units / ml.
[0055]
(2) Enzyme purification
The culture solution obtained in (1) was centrifuged at 10000 rpm under cooling at 4 ° C. to obtain about 4 L of supernatant from which the cells were removed. The supernatant was concentrated to 200 ml using a PM-10 membrane (Millipore) and packed with DEAE-Toyopearl 650M buffered with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) (2.6 φ × 45 cm). And washed with the same buffer until the unadsorbed protein was completely eluted. Thereafter, the enzyme was eluted with a linear gradient having a salt concentration of 0 → 1M. The obtained active fraction was dialyzed against 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), followed by the same buffer containing 2 M ammonium sulfate, and concentrated to 10 ml using a PM-10 membrane. This enzyme solution was placed on a column (1.6φ × 60 cm) packed with butyl-Toyopearl 650M buffered with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 2M ammonium sulfate, and unadsorbed protein was added in the same buffer. Washed until elution was complete. Thereafter, the enzyme was eluted with a linear gradient of 2 → 0M ammonium sulfate concentration. The active fraction was collected, dialyzed against 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), and then concentrated to 2 ml using a PM-10 membrane. This enzyme solution was placed on a column (1.6φ × 95 cm) packed with Toyopearl HW-55F buffered with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), and the enzyme was eluted with the same buffer. The active fraction was collected and concentrated to 2 ml using a PM-10 membrane to obtain a purified enzyme preparation. The obtained purified enzyme preparation had a total activity of 5.6 units and a specific activity of 8.0 units / mg protein.
The obtained purified enzyme preparation showed a single protein staining band in polyacrylamide gel electrophoresis, indicating that it was a highly purified preparation.
[0056]
Acremonium implicatum IFO30538 strain glycosyltransferase was a heterodimer by SDS-PAGE, and the molecular weight was about 60000 and about 51000. After partial digestion of glycosyltransferase with lysyl endopeptidase, each peptide was separated using reverse-phase liquid high-performance chromatography, and N-terminal amino acid sequence analysis was performed by the Edman degradation method. About 100 μg of the purified enzyme was placed in a microtube and dried, 110 mg of urea was added thereto, and then 0.5 μM Tris buffer pH 7.5 containing 25 μL of 10 mM EDTA was directly added thereto, followed by vigorous stirring for 2 minutes. This operation was repeated until the urea was dissolved. After urea dissolution, adjust the volume to 300 μL with 0.5 M Tris buffer pH 7.5 containing 10 mM EDTA, add 3.2 μL of 2-mercaptoethanol to this, and overnight the microtube headspace with nitrogen gas Replace with.
[0057]
To this, 4.8 μL of 4-vinylpyridine is added, and the head space is replaced with nitrogen gas in the dark for 2 hours. 2 μL of acetic acid is added to stop the peptide modification reaction. The resulting reaction solution is dialyzed overnight and replaced with 20 mM Tris buffer pH 8.0. After drying this solution, 37 mg of urea is added thereto, and urea is completely dissolved with 100 μL of 0.1 M Tris buffer (pH 8.0). 200 pmol of lysyl endopeptidase was added thereto, and the peptide was digested at 37 ° C. After 24 hours, the same amount of lysyl endopeptidase was added to digest the peptide at 37 ° C. for 24 hours.
[0058]
C18 column (Shiseido CAPCELL PAK C₁₈ Separation was performed by reversed-phase high performance liquid chromatography using Φ4.6 × 150 mm) to obtain 7 types of peptide fragments. As a peptide elution solvent, solvent A (0.1% trifluoroacetic acid) and solvent B (acetonitrile / purified water 8: 2 containing 0.1% trifluoroacetic acid) were used. The elution was carried out with a linear concentration gradient of 90% for 90 minutes at a flow rate of 1 mL / min. The amino acid sequencing test for the obtained fragmented peptides (AC-64, AC-66, AC-67, AC-69, AC-72, AC-74, AC-76) was conducted using the gas phase peptide sequencer Procise 491 ( Applied Biosystem) and the automated Edman degradation method according to the manual.
[0059]
The partial amino acid sequences obtained are shown below.
AC-64: AIDIRYRLLDYMYTA
AC-66: ACNAYGDDLEELILE
AC-67: YWNNEFALFFDKDEG
AC-69: YGYRDVFEVAEVVY
AC-72: VRALVDHLHENDQH
AC-74: PAVAYVESDT
AC-76: VGXXLGDNLSNXXQYXE
A sense primer and an antisense primer were designed based on partial amino acid sequences of AC-64, AC-67, AC-72, and AC-74, respectively.
[0060]
Example
1. Total RNA isolation and Poly (A)⁺RNA purification
Acremonium cells were obtained according to the method described in (1) above. 20 g of cells were frozen with liquid nitrogen, and then total RNA was extracted using RNA Extraction Kit (PharmaciaBiotech).
[0061]
After adding an equal volume of Elution buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.2% SDS) to 50 μl of 0.2 mg of total RNA, add 100 μl of Oligotex dT30 <Super> (Takara Shuzo) at 65 ° C., 5 Held for 3 minutes and further on ice for 3 minutes. Add 20 μl of 5 M NaCl, hold at 37 ° C. for 10 minutes, then centrifuge and suspend the precipitate in 250 μl Wash buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5 M NaCl) . After centrifugation, the precipitate was suspended in 100 μl of TE buffer and kept at 65 ° C. for 10 minutes and further on ice for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant was ethanol precipitated, and the resulting precipitate was air-dried and dissolved in 10 μl of water.
[0062]
2. RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
Poly (A) purified from Acremonium cells⁺Reverse transcription reaction was performed from 500 ng of RNA using SUPERSCRIPT Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (LIFETECHNOLOGIES). However, 3′-AP (5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ′) was used instead of oligo-d (T) primer.
[0063]
3.3'-RACE method (rapid amplification of cDNA 3'-end)
3′-RACE was performed according to the method of Frohman, M.A. et al. (M.A.Frohman, M.K.Dush, and G.R.Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998-9002 (1988)). RT-PCR product of Example 2 as a template, AC-64p (sense primer, 5'-tatagccaggcaaacattccc-3 ') 3'-AUAP (abridged universal amplification primer, 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3') and 3 'as primers Using -AP, 30 cycles of reaction at 94 ° C., 1 minute −50 ° C., 2 minutes −72 ° C., 3 minutes were performed. As a result, a cDNA fragment of about 2000 bp was amplified. This fragment was named FRAG1 and analyzed for its nucleotide sequence.
[0064]
4.5'-RACE method (rapid amplification of cDNA 5'-end)
5′-RACE was performed according to the method of Frohman, M.A. et al. (M.A.Frohman, M.K.Dush, and G.R.Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998-9002 (1988)). mRNA was added with oligo (dT) on the 5 ′ side of mRNA using 15 units of terminal transferase (Invitrogen) and an attached buffer. Using this as a template, 5'-AUAP (5'-GACTCGAGTCGACATCG-3 ') and 5'-AP (5'-GACTCGAGTCGACATCGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3') as sense primers and AC-67pRV (5'-tagggcgaattcgttgttcca-3 ') This was done as a sense primer. As a result, an amplified fragment FRAG-2 of about 1.3 kb was obtained and the nucleotide sequence was analyzed. The conditions for 5′-RACE using the above primers are shown below. PCR was performed at 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute for 30 cycles.
[0065]
5). Acremonium-derived α-glucosidase cDNA
Poly (A) purified from Acremonium⁺RT-PCR was carried out using 500 ng of RNA as a template and AC-1p (5'-gtcgacgtcgaccgataactgtct-3 ') and AUAP designed from the base sequence obtained by 5'-RACE, and a cDNA of about 3000 bp was obtained. It was. When the nucleotide sequence of this cDNA was analyzed, the total nucleotide sequence was 2978 bp, and a 103 bp 5 ′ untranslated region and a 127 bp 3 ′ untranslated region were present. From the obtained base sequence, the amino acid sequence of the protein was 916 residues. In addition, since the obtained base sequence was found to be approximately 47% with α-glucosidase derived from Aspergillus niger and 45% homologous with Shizosaccharomyces pombe, this cDNA was confirmed. Was identified as an α-glucosidase gene derived from Acremonium.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a restriction map of a gene of Acremonium implicatum α-glucosidase cDNA.
FIG. 2. Cloning strategy of α-glucosidase cDNA from Acremonium implicatum.

Claims

A gene comprising the following DNA ( a ) or ( b ):
(A) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing DNA or the nucleotide sequence of nucleotide SEQ ID NO: 104 to 2851 shown in SEQ ID NO: 1 DNA,.
( B) Hybridizing under stringent conditions with DNA having a sequence complementary to the DNA shown in (a ), and α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3 to the sugar receptor DNA encoding a heterodimeric protein having glycosyltransferase activity that catalyzes glucose transfer of-and α-1,4-linkages.

A recombinant vector comprising the gene comprising the DNA of ( a ) or ( b ) according to claim 1.

The recombinant vector according to claim 2, wherein the vector is a vector that functions in yeast.

The recombinant vector according to claim 3, wherein the vector that functions in yeast is a vector that functions in a host belonging to the genus Pichia (genus Pichia), the genus Saccharomyces (genus Saccharomyces), or the genus Schizosaccharomyces (genus Schizosaccharomyces).

The recombinant vector according to claim 2, wherein the vector is a vector that functions in mold.

6. The recombinant vector according to claim 5, wherein the fungus-functioning vector is a vector that functions in Rhizopus niveus or Rhizopus delmar.

A transformant comprising the recombinant vector according to any one of claims 2 to 6.

The transformant according to claim 7, wherein the host is a microorganism, yeast, or mold.

The transformant according to claim 7, wherein the host is yeast and the recombinant vector is the recombinant vector according to claim 3 or 4.

The transformant according to claim 7, wherein the host is mold, and the recombinant vector is the recombinant vector according to claim 5 or 6.

A transformant according to any one of claims 7 to 10 is cultured, and α-1,3-linked glucose transfer or α-1,3- and α-1,4-binding to a sugar receptor. A method for producing an enzyme, comprising collecting a protein having a glycosyltransferase activity that catalyzes glucose transfer.