JP4312608B2 - Squalene-hopene cyclase gene of acetic acid bacteria, acetic acid bacteria bred using the gene, and method of producing vinegar using the acetic acid bacteria - Google Patents

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Description

発明の属する技術分野
本発明は、微生物に由来する酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属(Acetobacter)及びグルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
従来の技術
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子(酢酸耐性遺伝子)をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する3つの遺伝子(aarA、aarB、aarC)がクローニングされていた(例えば、非特許文献1参照)。
この内、aarA遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、aarC遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、aarB遺伝子については機能が不明であった(例えば、非特許文献2参照)。
これらの3つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムIFO3288(Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO3288)株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった(例えば、特許文献1参照)。
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素(ALDH)をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている(例えば、特許文献2参照)。しかし、ALDHはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ALDHをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
特許文献1
特開平3−219878号公報
特許文献2
特開平2−2364号公報
特許文献3
特開昭60−9489号公報
特許文献4
特開昭60−9488号公報
非特許文献1
「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)」、172巻,2096−2104,1990年」
非特許文献2
「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング(Journal of Fermentation and Bioengineering),76巻,270−275頁,1993年」
非特許文献3
「マイクロバイオロジー(Microbiology),143巻,1235−1242,1997年」
非特許文献4
「アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー(Applied of Environment and Microbiology)55巻,171−176,1989年」
非特許文献5
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry),52巻,p.3125−3129,1988年」
非特許文献6
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry),49巻,p.2091−2097,1985年」
非特許文献7
「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー(Bioscience,Biotechnology and Biochemistry),58巻,p.974−975,1994年」
非特許文献8
「カナディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー(Canadian Journal of Biochemistry and Physiology),37巻,911−917,1959年」
非特許文献9
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry),226巻,497−509,1957年」
非特許文献10
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry),272巻,9809−9817,1997年」
非特許文献11
「ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),98巻,327−331,1985年」
発明が解決しようとする課題
以上のように、従来より酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。しかし、酢酸耐性にすぐれた酢酸菌が開発されれば、従来よりも高濃度の酢酸発酵が行われ、高濃度酢酸もろみ、高濃度食酢の効率的製造が可能となることから、本発明者らは、再度、酢酸菌の酢酸耐性の向上を遺伝子レベルで解明することとした。
そして本発明者らは、各方面から検討した結果、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが重要であるとの観点にたち、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規なスクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを新規技術課題として新たに設定した。
課題を解決するための手段
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する従来得ることができなかった新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸菌の染色体DNAライブラリーを構築し、この染色体DNAライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常寒天培地上で1%の酢酸の存在下でしか生育できない株を、2%の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニングすることにはじめて成功した。
得られた酢酸耐性遺伝子は、DDBJ/EMBL/Genbank検索の結果、根粒菌などで見出されているスクアレン−ホペンサイクラーゼと称される一群のタンパク質の遺伝子とある程度の相同性を示し、酢酸菌のスクアレン−ホペンサイクラーゼをコードする遺伝子であると推定された。
また、アミノ酸配列レベルでSWISS−PROT/PIRで検索した結果からも、スクアレン−ホペンサイクラーゼ中に保存されるモチーフ(DXDDTA)(例えば、非特許文献3参照)を有しており、酢酸菌のスクアレン−ホペンサイクラーゼをコードする遺伝子であると考えられた。
しかし、取得された酢酸菌のスクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子は、根粒菌などの他の微生物で見出されている既知のスクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子とは相同性がきわめて低かったことから、他のスクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子とある程度は似ているものの酢酸菌に特異的な新規タンパク質(以下、タンパク質SHCということもある)をコードする新規遺伝子であることを見出した。
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質転換株においては、その脂質組成において代謝産物であるテトラヒドロキシバクテリオホパンの組成比が増大することから、該遺伝子が酢酸菌のスクアレン−ホペンサイクラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認されると同時に、顕著に酢酸耐性が向上することが確認された。
さらに、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合に、増殖誘導期が短縮する上に、増殖速度、生酸速度が向上し、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなどを見出し、更に該タンパク質のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子DNAの塩基配列の決定にも成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の実施態様は、下記のとおりである。
(1)下記の(A)、又は(B)に示すタンパク質SHC。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(2)下記の(A)、又は(B)に示すタンパク質SHCをコードする遺伝子のDNA。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(3)下記の(a)、又は(b)に示すDNAである上記(2)に記載の遺伝子のDNA。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号406〜2436からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号406〜2436からなる塩基配列又はその一部を有するプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
(4)上記(2)、又は(3)に記載のDNAの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、酢酸耐性が増強された微生物。
(5)微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする上記(4)に記載の微生物。
(6)上記(4)、又は(5)に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法、及び、それによって得られた酢酸含量が高い(10〜16%)新規な食酢。
(7)少なくとも上記(2)、又は(3)に記載のDNAを含んだ組換えプラスミドpUSHC(FERM BP−7933)。
(8)少なくとも配列表の配列番号1に示す塩基配列を有するDNA断片を含んでなる組換えプラスミドであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター(マルチコピーベクター)pMV24にこのDNA断片を挿入してなるプラスミドpSHC、及び/又は、このプラスミドpSHCをアセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)No.1023(FERM BP−2287)に導入してなる形質転換体。
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
発明の実施の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明のDNA
本発明のDNAは、スクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子の活性領域を持ち、スクアレン−ホペンサイクラーゼ活性を有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を有する配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調整要素、及び該遺伝子の構造部分を含む。
本発明のDNAは、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の染色体DNAから次のようにして取得することができる。まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH−24)株(FERM BP−491)の染色体DNAライブラリーを調製する。なお、染色体DNAは、例えば特許文献3に開示された方法により取得する。
次に、得られた染色体DNAから酢酸耐性遺伝子を単離するために、染色体DNAライブラリーを作製する。まず、染色体DNAを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Sau3AIを温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度1〜10ユニット/mlで様々な時間(1分〜2時間)、染色体DNAに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではBamHIを用いた。
次いで、切断された染色体DNA断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えDNAを作製する。具体的には、染色体DNAの切断に用いた制限酵素BamHIと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHIを温度30℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で、1時間以上ベクターDNAに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
次に、上記のようにして得た染色体DNA断片混合物と切断開裂されたベクターDNAを混合し、これにT4DNAリガーゼを温度4〜16℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で1時間以上、好ましくは6〜24時間作用させて組換えDNAを得る。
得られた組換えDNAを用いて、通常は寒天培地上で1%までの酢酸濃度でしか増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ1023株(Acetobacter aceti No.1023)株(FERM BP−2287)を形質転換し、2%酢酸含有寒天培地に塗布して、培養する。生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで酢酸耐性遺伝子を含むDNA断片を得ることができる。
本発明のDNAとして、具体的には、配列表の配列番号1の塩基配列を有するDNAが挙げられるが、その内、塩基番号406〜2436からなる塩基配列はコーディング領域である。
配列番号1に示す塩基配列及び配列番号2に示すアミノ酸配列(図4、図5:塩基番号406〜2436に対応)は、DDBJ/EMBL/Genbank及びSWISS−PROT/PIRにおいてホモロジー検索をしたところ、アミノ酸配列レベルでブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrizobium japonicum)のSHC遺伝子と54.2%、リゾビウム・スピシーズ(Rizobium sp)のSHC遺伝子とも53.5%の相同性を有することが分かったが、いずれも50%台の低い相同性であり、これらのタンパク質をコードする遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。なお、上記のSHC遺伝子は、酢酸耐性と関係していることは全く知られていない。
さらに、本発明のDNAは、すでに取得されている酢酸菌の酢酸耐性遺伝子(aarA、aarB、aarC)や酢酸耐性を増強する機能を有するADH遺伝子などとも異なる新規な酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子であると同定された。
本発明のDNAは、その塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムDNAを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR反応)によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のDNA合成機を用いて定法に従って合成できる。また、PCR反応は、アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystems)製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System2400を用い、TaqDNAポリメラーゼ(宝酒造社製)やKOD−Plus−(東洋紡績社製)などを使用して、定法に従って行なうことができる。
本発明の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNAは、コードされるタンパク質の酢酸耐性を増強する機能が損なわれない限り、1又は複数の位置で1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
このような酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加又は逆位されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたDNAは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号406〜2436からなる塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNAを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば1×SSCで0.1%SDSに相当する塩濃度で60℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
(2)本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属細菌である。
アセトバクター属細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)が挙げられ、アセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)が例示される。
また、グルコンアセトバクター属細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)が挙げられ、現在特許生物寄託センターにFERM BP−491として寄託されているアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH−24)株が例示される。
酢酸耐性の増強は、例えば酢酸耐性遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むDNA断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えDNAを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
また、染色体DNA上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドpBR322のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドpACYC177のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドpACYC184のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐性を増強することができる。
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
マルチコピーベクターとしては、pMV24(例えば、非特許文献4参照)やpTA5001(A)、pTA5001(B)(例えば、特許文献4参照)などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるpMVL1(例えば、非特許文献5参照)も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、MuやIS1452などが挙げられる。
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのDNAの導入は、塩化カルシウム法(例えば、非特許文献6参照)やエレクトロポレーション法(例えば、非特許文献7参照)等によって行なうことができる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
(3)食酢製造法
上記のようにして、酢酸耐性遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であってアルコール酸化能を有するものを、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常30℃で行なう。培地のpHは通常2.5〜7の範囲であり、2.7〜6.5の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常1〜21日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
(4)本発明の実施態様
また、本発明に係るORF又はそれを含有する酢酸耐性遺伝子(配列番号1)を大腸菌ベクターpUC19に挿入してなる組換えプラスミドpUSHCは、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP−7933として平成14年(2002年)3月1日に寄託されているので、本発明に係る遺伝子のDNAはこの組換えプラスミドから容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、常法にしたがって、SHC遺伝子を取り出して適当なベクターに挿入し、これを酢酸菌に導入し、これを培養することにより酢酸含量の高い食酢を容易に製造することができる。
更にまた、上記したようにそしてまた後記する実施例からも明らかなように、酢酸耐性遺伝子源の寄託番号、PCRの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託番号その他が具体化され明らかにされており、いずれも、入手ないし操作、処理が容易であるので、本明細書に記載した実施例にしたがって各操作、処理を行えば、目的とする酢酸耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することによって高濃度の酢酸を含む食酢を製造することができる。したがって、この点からしても、本発明の実施は容易である。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例
(実施例1)グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
(1)染色体DNAライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の1株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH−24)株(FERM BP−491)を6%酢酸、4%エタノールを添加したYPG培地(3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.2%ポリペプトン)で30℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離(7,500×g、10分)し、菌体を得た。得られた菌体より、特許文献3に開示された方法により、染色体DNAを調製した。
上記のようにして得られた染色体DNA及び大腸菌−酢酸菌シャトルベクターpMV24を、制限酵素BamHI(宝酒造社製)で切断した。これらのDNAを適量ずつ混合し、ライゲーションキット(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2,宝酒造社製)を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体DNAライブラリーを構築した。
(2)酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体DNAライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度1%程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチNo.1023株に形質転換し、2%酢酸、100μg/mlのアンピシリンを含むYPG寒天培地にて、30℃で4日間培養した。
生じたコロニーを100μg/mlのアンピシリン含むYPG培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図1に示した約5kbpのBamHI断片がクローン化されたプラスミドが回収でき、このプラスミドをpB1と命名した。さらに2%酢酸を含有するYPG寒天培地でアセトバクター・アセチNo.1023株を生育可能にするDNA断片は、pB1にクローン化された約5kbpのBamHI断片中の約2.7kbpのBamHI−PstI断片であることが確認できた。
このようにして通常は寒天培地上で酢酸濃度1%程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチNo.1023株を2%酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
(3)クローン化されたDNA断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたBamHI−PstI断片を大腸菌ベクターpUC19のBamHI−PstI部位に挿入した組換えプラスミドpUSHC(FERM BP−7933)を作製した。このプラスミドを用いて、クローン化されたBamHI−PstI断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した。その結果、配列番号1に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
配列番号1記載の塩基配列中には、塩基番号406から塩基番号2436にかけて、配列番号2に記載したような677個のアミノ酸(図4、図5)をコードするオープンリーディング・フレーム(ORF)の存在が確認され、スクアレン−ホペンサイクラーゼの活性保存領域であるDXDDTAモチーフも、アミノ酸番号415からアミノ酸番号420にかけて存在する事が確認され、この遺伝子をSHC遺伝子と命名した。
(実施例2)グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
(1)アセトバクター・アセチへの形質転換
グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の1株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH−24)株(FERM BP−491)由来の酢酸耐性遺伝子を含むDNA断片をPCR法により増幅し、その結果得られた増幅断片をBamHI−EcoRIで切断し、この断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターpMV24(例えば、非特許文献4参照)の制限酵素BamHI−EcoRI切断部位に挿入したプラスミドpSHCを作製した。pSHCに挿入された増幅断片の概略を図1に示した。
PCR法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムDNAを用い、プライマーとしてプライマー1(その塩基配列を配列番号3(図6)に示す)及びプライマー2(その塩基配列を配列番号4(図7)に示す)を用い、下記するPCR条件にて、PCR法を実施した。
PCR条件は、94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 2分を1サイクルとして、30サイクル行なった。
このpSHCをアセトバクター・アセチNo.1023株にエレクトロポレーション法(例えば、非特許文献7参照)によって形質転換した。形質転換株は100μg/mlのアンピシリン及び2%の酢酸を添加したYPG寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、SHC遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
(2)形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドpSHCを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したYPG培地での生育を、シャトルベクターpMV24のみを導入した元株アセトバクター・アセチNo.1023株と比較した。
具体的には、酢酸3%、エタノール3%、アンピシリン100μg/mlを含む100mlのYPG培地にて、30℃で振とう培養(150rpm)を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を660nmにおける吸光度を測定することで比較した。
その結果、図2に示すように、元株と形質転換株は、酢酸を含有しないエタノール3%添加YPG培地ではほぼ同様の増殖を示したのに対して、3%酢酸と3%エタノールを添加した培地では形質転換株だけが増殖可能であり、元株アセトバクター・アセチNo.1023株では増殖できなかったことが確認でき、SHC遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
(3)形質転換株の温度耐性
前記(1)で得られたプラスミドpSHCを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、培養温度を変化させたYPG培地での生育を、シャトルベクターpMV24のみを導入した元株アセトバクター・アセチNo.1023株と比較した。
具体的には、2Lのミニジャー(千代田製作所製:TBR−2−1)を用いて、酢酸1%、エタノール4%、アンピシリン100μg/mlを含む1LのYPG培地にて、30℃、400rpm、0.20vvmの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度3%程度まで発酵させた。その後、200mlの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、新たに酢酸、エタノール、アンピシリン100μg/mlを含有するYPG培地を800ml添加し、酢酸1%でエタノール4%の濃度に調製して、培養温度は33℃に上げて再び発酵を開始した。
さらに発酵が進行し、培地中の酢酸濃度が3%程度になったところで、再び培養液の取り出しと、培地の再添加を行い、さらに培養温度を36℃に上げて同様に発酵させ、さらに同様にして、培養温度を1℃ずつ上げて酢酸発酵を実施した。
そして、菌体増殖を660nmにおける吸光度を測定し、酢酸発酵度合を培養液中の酢酸濃度を測定して、比較した。
その結果、図3に示すように、形質転換株では40℃での酢酸発酵、菌体増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチNo.1023では37℃までしか酢酸発酵、菌体増殖は確認されず、SHC遺伝子の温度耐性増強機能が確認できた。
(実施例3)グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のSHC遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験と脂質分析
(1)酢酸発酵試験
実施例2で得られたプラスミドpSHCを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターpMV24のみを有する元株アセトバクター・アセチNo.1023株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、5Lのミニジャー(三ツワ理化学工業社製;KMJ−5A)を用いて、酢酸1%、エタノール4%、アンピシリン100μg/mlを含む2.5LのYPG培地にて、30℃、400rpm、0.20vvmの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度3%まで発酵させた。その後、700mlの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った700mlに対して酢酸、エタノール、アンピシリン100μg/mlを含む1.8LのYPG培地を添加して、酢酸3%、エタノール4%の濃度に調製し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が1%を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表1にまとめた。

Figure 0004312608
表1の結果から、形質転換株の方が、最終到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度、増殖誘導期の何れにおいても、顕著に優れていることが確認できた。
(2)菌体の脂質組成分析
プラスミドpSHCを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターpMV24のみを有する元株アセトバクター・アセチNo.1023と菌体の脂質組成を測定し、比較した。
具体的には、前記(1)において、元株で最終酸度9.5%まで発酵させた発酵液と、形質転換株で最終酸度11.2%まで発酵させた発酵液を、それぞれ遠心分離(7,500×g、10分間)して菌体を得た。得られた菌体を50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)で3回洗浄した。その後直ちに、ブライ−ダイヤー法(例えば、非特許文献8参照)に従って全脂質を抽出した。
全脂質中のリン脂質リンはリン脂質−テストワコー(和光純薬工業社製)を用いて定量し、テトラヒドロキシバクテリオホパンは以下の方法に従って分析を行ない、リン脂質リン当たりの比で算出した。
すなわち、全脂質を0.4Nのメタノール性水酸化ナトリウムに懸濁し、37℃にて2時間保持した。反応物からフォルチ分配(例えば、非特許文献9参照)で有機層を回収し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固後、適量のクロロホルム−メタノール(2:1、v/v)混液に溶解してアルカリ安定脂質を調製した。
このようにして得られたアルカリ安定脂質をNagiecらの方法(例えば、非特許文献10参照)でベンゾイル誘導体化処理し、Kitoらの方法(例えば、非特許文献11参照)で未反応物を除去した。
精製されたベンゾイル誘導体化物をロータリーエバポレーターで濃縮乾固後、ヘキサン−イソプロパノール(100:1.5、v/v)に溶解させて高速液体クロマトグラフィー分析(島津製作所製;SHIMADZU LC−6A)に供した。カラムはLiChrospher 100 CN(Merck社製;4×250)を用い、ヘキサン−イソプロパノール(100:1.5、v/v)を流速1ml/minで溶出させ、検出波長は230nmとした。以上の分析結果を表2にまとめた。
Figure 0004312608
表2の結果から、形質転換株では、SHCの代謝産物であるTHBHが元株に対して1.28倍高くなっており、クローニングしたSHC遺伝子はスクアレン−ホペンサイクラーゼをコードすることが確認された。
(実施例4)グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
(1)アセトバクター・アルトアセトゲネスへの形質転換
実施例2で得られたプラスミドpSHCをグルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の1株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH−24)株(FERM BP−491)にエレクトロポレーション法(例えば、非特許文献7参照)によって形質転換した。形質転換株は100μg/mlのアンピシリン及び4%の酢酸と4%のエタノールを添加した0.55%の寒天を含んだYPG寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、SHC遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
(1)酢酸発酵試験
実施例2で得られたプラスミドpSHCを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターpMV24のみを有する元株アセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、5Lのミニジャー(三ツワ理化学工業社製;KMJ−5A)を用いて、酢酸4%、エタノール4%、アンピシリン100μg/mlを含む2.5LのYPG培地にて、30℃、500rpm、0.20vvmの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度6.3%まで発酵させた。その後、700mlの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った700mlに対して酢酸、エタノール、アンピシリン100μg/mlを含む1.8LのYPG培地を添加して、酢酸5.5%、エタノール4%の濃度に調製し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が1%を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表3にまとめた。
Figure 0004312608
表3の結果から、形質転換株の方が、最終到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度の何れにおいても、顕著に優れていることが確認できた。
発明の効果
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【配列表】
Figure 0004312608
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【図面の簡単な説明】
図1 BamHIを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片(pB1)の制限酵素地図とSHC遺伝子の位置、及びpSHCへの挿入断片の概略図。
図2 SHC遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図面。
図3 SHC遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の温度変化と酢酸発酵経過を示す図面。
図4 本酢酸耐性遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
図5 同上続きを示す。
図6 プライマー1を示す。
図7 プライマー2を示す。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene encoding a protein having a function of enhancing the acetic acid resistance derived from a microorganism, a microorganism having an amplified copy number thereof, in particular, an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter and Gluconacetobacter And a method for efficiently producing vinegar containing high concentrations of acetic acid using these microorganisms.
Conventional technology
Acetic acid bacteria are microorganisms widely used for vinegar production, and particularly acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter are used for industrial acetic acid fermentation.
In acetic acid fermentation, ethanol in the medium is oxidized by acetic acid bacteria and converted to acetic acid. As a result, acetic acid accumulates in the medium, but acetic acid is also inhibitory to acetic acid bacteria. As the acetic acid concentration increases and the acetic acid concentration in the medium increases, the growth ability and fermentation ability of acetic acid bacteria gradually decrease.
Therefore, in acetic acid fermentation, it is required that growth ability and fermentation ability do not decrease even at higher acetic acid concentrations, that is, to develop acetic acid bacteria with strong acetic acid resistance. As one means, genes involved in acetic acid resistance are required. Attempts have been made to clone (acetic acid resistant gene) and to breed and improve acetic acid bacteria using the acetic acid resistant gene.
As for the knowledge about the acetic acid resistance gene of acetic acid bacteria so far, a cluster is formed as a complementary gene that can restore acetic acid sensitivity by mutating the acetic acid resistance of acetic acid bacteria of Acetobacter genus. Three genes (aarA, aarB, aarC) have been cloned (see, for example, Non-Patent Document 1).
Among them, the aarA gene is a gene encoding citrate synthase, and the aarC gene was estimated to be an enzyme encoding an enzyme related to acetic acid utilization, but the function of the aarB gene is unknown. (For example, refer nonpatent literature 2).
A transformant obtained by cloning a gene fragment containing these three acetate resistance genes into a multicopy plasmid and transforming into a strain of Acetobacter acetic subspecies zylinum IFO3288 (Acetobacteraceti subsp. Xylinum IFO3288) is In addition, the improvement level of acetic acid resistance was only slight, and it was unclear as to whether or not there was an improvement in performance in actual acetic acid fermentation (see, for example, Patent Document 1).
On the other hand, an example has been disclosed in which the final acetic acid concentration has been improved in acetic acid fermentation by introducing a gene encoding membrane-bound aldehyde dehydrogenase (ALDH) cloned from acetic acid bacteria into acetic acid bacteria. (For example, refer to Patent Document 2). However, since ALDH is an enzyme having a function of oxidizing aldehyde and not directly related to acetic acid resistance, it cannot be determined that the gene encoding ALDH is truly an acetic acid resistance gene.
Patent Document 1
JP-A-3-21878
Patent Document 2
JP-A-2-2364
Patent Document 3
JP 60-9489 A
Patent Document 4
Japanese Patent Laid-Open No. 60-9488
Non-patent document 1
“Journal of Bacteriology”, 172, 2096-2104, 1990 ”
Non-Patent Document 2
"Journal of Fermentation and Bioengineering, 76, 270-275, 1993"
Non-Patent Document 3
"Microbiology, 143, 1235-1242, 1997"
Non-Patent Document 4
“Applied of Environment and Microbiology, Vol. 55, 171-176, 1989”
Non-Patent Document 5
“Agricultural and Biological Chemistry, 52, p. 3125-3129, 1988”
Non-Patent Document 6
“Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 49, p.2091-2097, 1985”
Non-Patent Document 7
“Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 58, p. 974-975, 1994”
Non-Patent Document 8
“Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, Vol. 37, 911-917, 1959,” Canadian Journal of Biochemistry and Physiology.
Non-patent document 9
"Journal of Biological Chemistry, 226, 497-509, 1957"
Non-Patent Document 10
"Journal of Biological Chemistry, 272, 9809-9817, 1997"
Non-Patent Document 11
"Journal of Biochemistry, Vol. 98, 327-331, 1985"
Problems to be solved by the invention
As described above, there has been no report on a case where acetic acid resistance of acetic acid bacteria has been elucidated at the gene level and a practical acetic acid bacteria having high acetic acid resistance has been successfully developed. However, if acetic acid bacteria with excellent acetic acid resistance are developed, acetic acid fermentation at a higher concentration than before will be performed, so that high concentration acetic acid will be crushed and efficient production of high concentration vinegar becomes possible. Again, we decided to elucidate the improvement in acetic acid resistance of acetic acid bacteria at the gene level.
And as a result of examining from various directions, the present inventors obtained a novel acetic acid resistant gene encoding a protein having a function capable of improving acetic acid resistance at a practical level, and using the obtained acetic acid resistant gene, In view of the importance of breeding acetic acid bacteria having strong acetic acid resistance, to provide a novel squalene-hopene cyclase gene involved in acetic acid resistance derived from microorganisms belonging to acetic acid bacteria, and the gene For improving the acetic acid tolerance of microorganisms using a bacterium, especially for improving the acetic acid tolerance of microorganisms belonging to acetic acid bacteria, and further for efficiently producing vinegar with higher acetic acid concentration using acetic acid bacteria having improved acetic acid resistance Is newly set as a new technical issue.
Means for solving the problem
The inventors hypothesized that acetic acid bacteria that can grow and ferment in the presence of acetic acid have genes involved in specific acetic acid resistance that do not exist in other microorganisms. If used, it is possible to improve the acetic acid resistance of microorganisms more than before, and furthermore, it will be possible to develop an efficient production method of new vinegar that could not be obtained conventionally, containing high concentration of acetic acid. I got a new idea.
As a conventional method for obtaining an acetic acid resistant gene, a method for cloning a gene that complements an acetic acid-sensitive mutant strain of acetic acid bacteria is generally used.
However, it is difficult to find an industrially useful acetic acid resistant gene by such a method, and as a result of intensive studies, the present inventors have found that the acetic acid bacterial chromosome is a method for finding an acetic acid resistant gene from acetic acid bacteria. A DNA library is constructed, the chromosomal DNA library is transformed into acetic acid bacteria, and a strain that can grow only in the presence of 1% acetic acid on an agar medium can be grown in the presence of 2% acetic acid. We have developed a method for obtaining genes by screening them.
By this method, we succeeded in cloning a novel acetic acid resistance gene having a function of improving acetic acid resistance at a practical level from glucoconacetobacter acetic acid bacteria actually used in vinegar production.
The obtained acetic acid resistance gene shows a certain degree of homology with a group of proteins called squalene-hopene cyclase found in rhizobia as a result of DDBJ / EMBL / Genbank search. It was presumed to be a gene encoding fungal squalene-hopene cyclase.
Further, from the result of searching by SWISS-PROT / PIR at the amino acid sequence level, it has a motif (DXDDTA) conserved in squalene-hopene cyclase (for example, see Non-patent Document 3), and acetic acid bacteria Of squalene-hopene cyclase.
However, since the obtained squalene-hopene cyclase gene of acetic acid bacteria was extremely low in homology with known squalene-hopene cyclase genes found in other microorganisms such as rhizobia, It was found to be a novel gene encoding a novel protein specific to acetic acid bacteria (hereinafter also referred to as protein SHC) although it is somewhat similar to other squalene-hopene cyclase genes.
In addition, in a transformed strain in which the gene is linked to a plasmid vector and transformed into acetic acid bacteria to amplify the copy number, the composition ratio of the metabolite tetrahydroxybacteriophane increases in the lipid composition. From this, it was confirmed that the gene was a gene encoding a protein having squalene-hopene cyclase activity of acetic acid bacteria, and at the same time, it was confirmed that the acetic acid resistance was remarkably improved.
Furthermore, it has been found that when the transformed strain is aerated in the presence of ethanol, the growth induction period is shortened, the growth rate and the raw acid rate are improved, and the final concentration of acetic acid is significantly improved. Furthermore, the present inventors have succeeded in determining the amino acid sequence of the protein and the base sequence of the gene DNA encoding the protein, thereby completing the present invention.
That is, the embodiment of the present invention is as follows.
(1) Protein SHC shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having
(2) DNA of a gene encoding the protein SHC shown in (A) or (B) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having
(3) DNA of the gene as described in said (2) which is DNA shown in the following (a) or (b).
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 406 to 2436 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it hybridizes with a probe having a base sequence consisting of base numbers 406 to 2436 or a part thereof under stringent conditions, and has acetic acid resistance. DNA encoding a protein having a function of enhancing.
(4) A microorganism in which acetic acid resistance is enhanced by amplification of the intracellular copy number of the DNA according to (2) or (3).
(5) The microorganism according to (4) above, wherein the microorganism is an Acetobacter genus or an Acetobacter acetobacterium.
(6) The microorganism according to (4) or (5) above, wherein an microorganism capable of oxidizing alcohol is cultured in a medium containing alcohol to produce and accumulate acetic acid in the medium. A method for producing vinegar, and a novel vinegar having a high acetic acid content (10 to 16%) obtained thereby.
(7) A recombinant plasmid pUSHC (FERM BP-7933) containing at least the DNA according to (2) or (3) above.
(8) A recombinant plasmid comprising a DNA fragment having at least the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, for example, by inserting this DNA fragment into an acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector (multicopy vector) pMV24 The plasmid pSHC and / or this plasmid pSHC is designated as Acetobacter acetici No. A transformant introduced into 1023 (FERM BP-2287).
According to the present invention, resistance to acetic acid can be imparted to and enhanced against microorganisms. And in the microorganisms which have alcohol oxidizing ability, especially acetic acid bacteria, the tolerance with respect to acetic acid improves notably, and the capability to accumulate | store acetic acid of high concentration in a culture medium efficiently can be provided.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) DNA of the present invention
The DNA of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, which has an active region of the squalene-hopene cyclase gene, has squalene-hopene cyclase activity, and has a function of improving acetic acid resistance. Including a base sequence capable of encoding a protein having a regulatory element of the base sequence and a structural portion of the gene.
The DNA of the present invention can be obtained from the chromosomal DNA of Gluconacetobacter entaniii as follows. First, a chromosomal DNA library of Glucon Acetobacter enterii, for example, Acetobacter altoacetylenes MH-24 (FERM BP-491) strain is prepared. Chromosomal DNA is obtained by the method disclosed in Patent Document 3, for example.
Next, a chromosomal DNA library is prepared in order to isolate an acetic acid resistance gene from the obtained chromosomal DNA. First, chromosomal DNA is partially decomposed with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments. A wide variety of restriction enzymes can be used by adjusting the cleavage reaction time to adjust the degree of cleavage. For example, Sau3AI is digested by acting on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C. or higher, preferably 37 ° C., at an enzyme concentration of 1 to 10 units / ml for various times (1 minute to 2 hours). In the examples described later, BamHI was used.
Next, the cleaved chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in acetic acid bacteria to produce a recombinant DNA. Specifically, a restriction enzyme that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme BamHI used for the cleavage of the chromosomal DNA, such as BamHI, is heated for 1 hour under conditions of a temperature of 30 ° C. and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml. As described above, the vector DNA is completely digested by acting on the vector DNA and cleaved and cleaved.
Next, the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above and the cleaved vector DNA were mixed, and this was mixed with T4 DNA ligase at a temperature of 4 to 16 ° C. and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml for 1 hour. As described above, the recombinant DNA is obtained by preferably acting for 6 to 24 hours.
Using the resulting recombinant DNA, acetic acid bacteria that can usually only grow on an agar medium with an acetic acid concentration of up to 1%, for example, Acetobacter acetici No. 1023 strain (FERM BP) -2287) is transformed, applied to an agar medium containing 2% acetic acid, and cultured. The resulting colony is inoculated into a liquid medium and cultured, and a plasmid is recovered from the resulting bacterial cells to obtain a DNA fragment containing an acetic acid resistance gene.
Specific examples of the DNA of the present invention include DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Among them, the base sequence consisting of base numbers 406 to 2436 is a coding region.
When the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (corresponding to FIGS. 4 and 5: base numbers 406 to 2436) were subjected to homology search in DDBJ / EMBL / Genbank and SWISS-PROT / PIR, At the amino acid sequence level, it was found that the SHC gene of Bradyrizobium japonicum had 54.2% homology with the SHC gene of 54.2% and Rhizobium sp. It was clear that all of them had a low homology of the order of 50% and were novel different from the genes encoding these proteins. It is not known at all that the above SHC gene is related to acetic acid resistance.
Furthermore, the DNA of the present invention has a function of enhancing a novel acetic acid resistance, which is different from the acetic acid resistance genes (aarA, aarB, aarC) of acetic acid bacteria already acquired and an ADH gene having a function of enhancing acetic acid resistance. Identified as a gene.
Since the base sequence of the DNA of the present invention has been clarified, for example, a polymerase chain using, as a template, a genomic DNA of Acetobacter glucosacetobacter enterii as a template and using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a primer -It can also be obtained by reaction (PCR reaction) or by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a probe.
Oligonucleotides can be synthesized according to a conventional method using, for example, various commercially available DNA synthesizers. The PCR reaction is carried out using a thermal cycler Gene Amp PCR System 2400 manufactured by Applied Biosystems, TaqDNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the like. Can be done according to
The DNA encoding the protein having a function of enhancing the acetate resistance of the present invention has one or several amino acids deleted at one or a plurality of positions as long as the function of enhancing the acetate resistance of the encoded protein is not impaired. It may encode a protein with substitutions, insertions or additions.
A DNA encoding a protein that is substantially the same as a protein having a function of enhancing acetic acid resistance is deleted, substituted, inserted, added or inverted by a site-directed mutagenesis method, for example. It can also be obtained by modifying the base sequence as described above. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
In addition, it is generally known that the amino acid sequence of a protein and the base sequence that encodes it are slightly different between species, strains, mutants, and variants, so that DNA encoding substantially the same protein Can be obtained from all species of acetic acid bacteria, especially species, strains, mutants and variants of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter.
Specifically, from Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid bacteria, or mutated Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid bacteria, natural mutants or variants thereof, for example, to SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing By isolating a DNA encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance by hybridizing with a DNA having the base sequence consisting of base sequence numbers 406 to 2436 among the described base sequences under stringent conditions In addition, DNA encoding a protein substantially identical to the protein can be obtained. The stringent condition referred to here is a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, DNAs with high homology, for example, DNAs having homology of 70% or more hybridize and DNA with lower homology than that. Examples include conditions that do not hybridize with each other, or normal hybridization washing conditions, such as conditions in which washing is performed at 60 ° C. with a salt concentration corresponding to 0.1% SDS with 1 × SSC.
(2) Acetic acid bacteria of the present invention
The acetic acid bacteria of the present invention refer to bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon Acetobacter, and are Acetobacter bacteria and Glucon Acetobacter bacteria having enhanced acetic acid resistance.
Specific examples of the Acetobacter bacterium include Acetobacter aceti, and Acetobacter aceti no. 1023 (Acetobacteraceti No. 1023) strain (deposited as FERM BP-2287 at the Patent Organism Depositary) is exemplified.
In addition, examples of the genus Gluconacetobacter include Gluconacetobacter entaniii, and Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes) currently deposited as FERM BP-491 in the Patent Biological Depositary Center. The MH-24) strain is exemplified.
Enhancement of acetate resistance is obtained by, for example, amplifying the intracellular copy number of an acetate resistance gene or ligating a DNA fragment containing the structural gene of the gene to a promoter sequence that functions efficiently in Acetobacter bacteria. The resulting recombinant DNA can be used to enhance by transforming Acetobacter bacteria.
In addition, the promoter sequence of the gene on the chromosomal DNA is replaced with other promoter sequences that function efficiently in bacteria of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter, such as the ampicillin resistance gene of plasmid pBR322 of Escherichia coli, the kanamycin resistance gene of plasmid pACYC177. Furthermore, acetic acid resistance can also be enhanced by replacing with a promoter sequence derived from a microorganism other than acetic acid bacteria, such as the promoter of each gene such as the chloramphenicol resistance gene and β-galactosidase gene of the plasmid pACYC184.
Amplification of the intracellular copy number of the gene can be carried out by introducing a multicopy vector carrying the gene into a cell of an Acetobacter bacterium. That is, it can be carried out by introducing a plasmid, transposon or the like carrying the gene into a bacterial cell belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter.
Examples of the multicopy vector include pMV24 (for example, see Non-patent Document 4), pTA5001 (A), pTA5001 (B) (for example, see Patent Document 4), and the like, and pMVL1 (for example, non-patent document) that is a chromosome integration type vector. (See Patent Document 5). Examples of transposons include Mu and IS1452.
DNA can be introduced into an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter by the calcium chloride method (for example, see Non-Patent Document 6) or the electroporation method (for example, see Non-Patent Document 7). .
In acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter having alcohol oxidizing ability, when the acetic acid resistance is enhanced as described above, the production amount and production efficiency of acetic acid can be increased.
(3) Vinegar production method
As described above, an acetic acid resistant bacterium belonging to the genus Acetobacter or Glucon Acetobacter that has selectively enhanced acetic acid resistance by amplifying the copy number of the acetic acid resistance gene, which contains alcohol, By culturing in a medium and acetic acid is produced and accumulated in the medium, vinegar can be produced efficiently.
The acetic acid fermentation in the production method of the present invention may be carried out in the same manner as the conventional vinegar production method by the fermentation method of acetic acid bacteria. The medium used for acetic acid fermentation contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, ethanol, and if necessary, if it contains an appropriate amount of nutrients required for growth by the strain used, it can be a synthetic medium or a natural medium. But it ’s okay.
Examples of the carbon source include various carbohydrates including glucose and sucrose, and various organic acids. As the nitrogen source, natural nitrogen sources such as peptone and fermented bacterial cell decomposition products can be used.
Cultivation is performed under aerobic conditions such as stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture, and the culture temperature is usually 30 ° C. The pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7, preferably in the range of 2.7 to 6.5, and can be prepared with various acids, various bases, buffers and the like. Usually, acetic acid at a high concentration accumulates in the medium by culturing for 1 to 21 days.
(4) Embodiment of the present invention
In addition, the recombinant plasmid pUSHC obtained by inserting the ORF according to the present invention or an acetic acid resistance gene (SEQ ID NO: 1) containing the ORF into the E. coli vector pUC19 is the sixth in the center of 1-1-1 Higashi 1-chome Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. Since it has been deposited on March 1, 2002 as FERM BP-7933 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary, DNA of the gene according to the present invention can be easily obtained from this recombinant plasmid. Those skilled in the art can easily implement the present invention. Then, if desired, the vinegar with a high acetic acid content can be easily produced by taking out the SHC gene and inserting it into an appropriate vector, introducing it into acetic acid bacteria, and culturing it, if desired. Can do.
Furthermore, as described above and also clearly from the examples described later, the accession number of the acetate resistant gene source, the mode of PCR, the preparation of the plasmid vector, the recombinant plasmid, the accession number of the host fungus, etc. are embodied. Since all of them are easy to obtain, operate, and process, the target acetic acid resistant transformant can be obtained by performing each operation and process according to the examples described in this specification. By using this, vinegar containing high concentration of acetic acid can be produced. Therefore, the present invention is easy to implement from this point.
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
Example
(Example 1) Cloning of acetic acid resistance gene from Gluconacetobacter enterii and determination of base sequence and amino acid sequence
(1) Preparation of chromosomal DNA library
YPG medium supplemented with 6% acetic acid and 4% ethanol of Acetobacter altoacetogenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-491), which is a strain of Gluconacetobacter entaniii (3% glucose, 0.5% yeast extract, 0.2% polypeptone) was cultured with shaking at 30 ° C. After culturing, the culture solution was centrifuged (7,500 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells. Chromosomal DNA was prepared from the obtained cells by the method disclosed in Patent Document 3.
The chromosomal DNA and Escherichia coli-acetic acid shuttle vector pMV24 obtained as described above were digested with the restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo). An appropriate amount of these DNAs were mixed and ligated using a ligation kit (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2, Takara Shuzo Co., Ltd.) to construct a chromosomal Acetobacter enterani chromosomal DNA library.
(2) Cloning of acetic acid resistance gene
Glucon Acetobacter entaniii chromosomal DNA library obtained as described above is usually Acetobacter aceti No. which can only grow to an acetic acid concentration of about 1% on an agar medium. The strain 1023 was transformed and cultured on a YPG agar medium containing 2% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin at 30 ° C. for 4 days.
The resulting colonies were inoculated and cultured in a YPG medium containing 100 μg / ml ampicillin, and the plasmid was recovered from the resulting cells. As a result, the plasmid in which the BamHI fragment of about 5 kbp shown in FIG. 1 was cloned could be recovered. This plasmid was designated pB1. Furthermore, in APG medium containing 2% acetic acid, Acetobacter aceti no. It was confirmed that the DNA fragment enabling the growth of strain 1023 was an approximately 2.7 kbp BamHI-PstI fragment in the approximately 5 kbp BamHI fragment cloned into pB1.
In this way, Acetobacter aceti No. 1 which can usually grow on an agar medium only to an acetic acid concentration of about 1%. An acetic acid resistant gene fragment that enables the 1023 strain to grow even on an agar medium containing 2% acetic acid was obtained.
(3) Determination of the base sequence of the cloned DNA fragment
A recombinant plasmid pUSHC (FERM BP-7933) was prepared by inserting the cloned BamHI-PstI fragment into the BamHI-PstI site of the E. coli vector pUC19. Using this plasmid, the base sequence of the cloned BamHI-PstI fragment was determined by the Sanger dideoxy chain termination method. As a result, the base sequence described in SEQ ID NO: 1 was determined. Sequencing was performed for the entire region of both DNA strands, with all breakpoints overlapping.
In the base sequence described in SEQ ID NO: 1, an open reading frame (ORF) encoding 677 amino acids (FIGS. 4 and 5) as shown in SEQ ID NO: 2 from base number 406 to base number 2436 is shown. It was confirmed that the DXDDTA motif, which is an active conserved region of squalene-hopene cyclase, was also present from amino acid number 415 to amino acid number 420, and this gene was named SHC gene.
(Example 2) Enhancement of acetic acid resistance in a transformant transformed with an acetic acid resistant gene derived from Gluconacetobacter enterii
(1) Transformation to Acetobacter aceti
A DNA fragment containing an acetic acid resistant gene derived from Acetobacter altoacetogenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-491), which is one strain of Gluconacetobacter entaniii, by PCR. Amplification is performed, and the resulting amplified fragment is cleaved with BamHI-EcoRI. This fragment is inserted into the restriction enzyme BamHI-EcoRI cleavage site of the acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector pMV24 (see, for example, Non-Patent Document 4). Was made. An outline of the amplified fragment inserted into pSHC is shown in FIG.
The PCR method was performed as follows. That is, genomic DNA derived from the above-mentioned acetic acid bacteria was used as a template, primer 1 (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 6)) and primer 2 (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 7)) as primers. The PCR method was carried out under the following PCR conditions.
PCR conditions were 30 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes.
This pSHC was designated as Acetobacter aceti No. The strain 1023 was transformed by electroporation (for example, see Non-Patent Document 7). Transformants were selected on YPG agar medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin and 2% acetic acid.
About the ampicillin resistant transformant grown on the selective medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the plasmid carrying the SHC gene was retained.
(2) Acetic acid resistance of transformed strains
The ampicillin resistant transformant having the plasmid pSHC obtained as described above was grown on a YPG medium supplemented with acetic acid. The original strain Acetobacter aceti No. 1 into which only the shuttle vector pMV24 was introduced was used. Comparison with 1023 strain.
Specifically, shaking culture (150 rpm) was performed at 30 ° C. in 100 ml of YPG medium containing 3% acetic acid, 3% ethanol, and 100 μg / ml ampicillin. Growth was compared by measuring absorbance at 660 nm.
As a result, as shown in FIG. 2, the original strain and the transformed strain showed almost the same growth in the YPG medium containing 3% ethanol without acetic acid, whereas 3% acetic acid and 3% ethanol were added. Only the transformed strain can grow on the prepared medium, and the former strain Acetobacter aceti No. It was confirmed that the strain 1023 could not grow, and the function of enhancing the acetate resistance of the SHC gene was confirmed.
(3) Temperature tolerance of transformed strains
For the ampicillin resistant transformant having the plasmid pSHC obtained in (1) above, the growth on the YPG medium with the culture temperature changed was performed using the former strain Acetobacter aceti No. 1 into which only the shuttle vector pMV24 was introduced. Comparison with 1023 strain.
Specifically, using a 2 L mini jar (manufactured by Chiyoda Manufacturing Co., Ltd .: TBR-2-1) in 1 L YPG medium containing 1% acetic acid, 4% ethanol, and 100 μg / ml ampicillin, 30 ° C., 400 rpm, 0 The culture was aerated and stirred at 20 vvm and fermented to an acetic acid concentration of about 3%. Thereafter, 200 ml of the culture solution is left in the mini jar, and the culture solution is taken out. Then, 800 ml of YPG medium containing 100 μg / ml of acetic acid, ethanol and ampicillin is newly added, and the concentration is adjusted to 4% ethanol with 1% acetic acid. The culture temperature was raised to 33 ° C. and fermentation was started again.
Further, when the fermentation progresses and the acetic acid concentration in the medium becomes about 3%, the culture solution is taken out again, the medium is added again, the culture temperature is raised to 36 ° C., and the same fermentation is performed. Then, acetic acid fermentation was performed by increasing the culture temperature by 1 ° C.
Then, the cell growth was measured by measuring the absorbance at 660 nm, and comparing the degree of acetic acid fermentation by measuring the concentration of acetic acid in the culture solution.
As a result, as shown in FIG. 3, the transformed strain was capable of acetic acid fermentation and cell growth at 40 ° C., whereas the former strain Acetobacter aceti No. In 1023, acetic acid fermentation and cell growth were confirmed only up to 37 ° C., and the temperature tolerance enhancement function of the SHC gene was confirmed.
(Example 3) Acetic acid fermentation test and lipid analysis of transformant transformed with SHC gene derived from Glucon Acetobacter enterii
(1) Acetic acid fermentation test
For the ampicillin resistant transformant having the plasmid pSHC obtained in Example 2, the original strain Acetobacter aceti No. 1 having only the shuttle vector pMV24 was used. The 1023 strain was compared with the acetic acid fermentation ability.
Specifically, in a 2.5 L YPG medium containing 1% acetic acid, 4% ethanol, and 100 μg / ml ampicillin, using a 5 L mini jar (manufactured by Mitsuwa Chemical Co., Ltd .; KMJ-5A), 30 ° C. The culture was aerated and stirred at 400 rpm and 0.20 vvm, and fermented to an acetic acid concentration of 3%. Thereafter, 700 ml of the culture solution was left in the mini jar, and the culture solution was taken out. To the remaining 700 ml, 1.8 L of YPG medium containing acetic acid, ethanol, and ampicillin 100 μg / ml was added, and 3% acetic acid, ethanol 4 The acetic acid fermentation of the transformed strain and the original strain was continued by adding the ethanol so that the ethanol concentration in the medium was maintained at 1%. The performance was compared. The results are summarized in Table 1.
Figure 0004312608
From the results in Table 1, it was confirmed that the transformed strain was remarkably superior in any of the final concentration of acetic acid, specific growth rate, raw acid rate, and growth induction period.
(2) Lipid composition analysis of bacterial cells
For the ampicillin resistant transformant having the plasmid pSHC, the original strain Acetobacter aceti No. 1 having only the shuttle vector pMV24 is used. The lipid composition of 1023 and the bacterial cells were measured and compared.
Specifically, in (1), the fermentation liquid fermented to the final acidity of 9.5% with the original strain and the fermentation liquid fermented to the final acidity of 11.2% with the transformed strain were centrifuged ( (7,500 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells. The obtained bacterial cells were washed 3 times with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Immediately thereafter, total lipids were extracted according to the Briyer method (for example, see Non-Patent Document 8).
Phospholipid phosphorus in total lipid was quantified using Phospholipid-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and tetrahydroxybacterial hopane was analyzed according to the following method and calculated as a ratio per phospholipid phosphorus. .
That is, the total lipid was suspended in 0.4N methanolic sodium hydroxide and kept at 37 ° C. for 2 hours. The organic layer is recovered from the reaction product by forti partitioning (for example, see Non-Patent Document 9), concentrated to dryness with a rotary evaporator, and dissolved in an appropriate amount of chloroform-methanol (2: 1, v / v) mixture to stabilize the alkali. Lipids were prepared.
The alkali-stable lipid thus obtained is subjected to benzoyl derivatization by the method of Nagiec et al. (For example, see Non-patent Document 10), and unreacted substances are removed by the method of Kito et al. (For example, see Non-Patent Document 11). did.
The purified benzoyl derivatized product is concentrated to dryness with a rotary evaporator, dissolved in hexane-isopropanol (100: 1.5, v / v) and subjected to high performance liquid chromatography analysis (manufactured by Shimadzu Corporation; SHIMADZU LC-6A). did. The column was LiChrosphere 100 CN (Merck; 4 × 250), and hexane-isopropanol (100: 1.5, v / v) was eluted at a flow rate of 1 ml / min, and the detection wavelength was 230 nm. The above analysis results are summarized in Table 2.
Figure 0004312608
From the results in Table 2, it was confirmed that THBH, which is a metabolite of SHC, was 1.28 times higher in the transformed strain than the original strain, and the cloned SHC gene encoded squalene-hopene cyclase. It was done.
(Example 4) Enhancement of acetic acid resistance in a transformant transformed with an acetic acid resistant gene derived from Gluconacetobacter enterii
(1) Transformation to Acetobacter altoacetogenes
The plasmid pSHC obtained in Example 2 was electroporated into an Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), which is one strain of Gluconacetobacter entaniii. Transformation method (see, for example, Non-Patent Document 7). Transformants were selected on YPG agar medium containing 0.55% agar supplemented with 100 μg / ml ampicillin and 4% acetic acid and 4% ethanol.
About the ampicillin resistant transformant grown on the selective medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the plasmid carrying the SHC gene was retained.
(1) Acetic acid fermentation test
The ampicillin resistant transformant having the plasmid pSHC obtained in Example 2 was compared with the former strain Acetobacter altoacetogenes MH-24 having only the shuttle vector pMV24 in terms of acetic acid fermentation ability.
Specifically, in a 2.5 L YPG medium containing 4% acetic acid, 4% ethanol, and 100 μg / ml ampicillin using a 5 L mini jar (manufactured by Mitsuwa Riken Kogyo; KMJ-5A), 30 ° C. The culture was aerated and stirred at 500 rpm and 0.20 vvm, and fermented to an acetic acid concentration of 6.3%. Thereafter, 700 ml of the culture broth was left in the mini jar, and the culture broth was taken out. To the remaining 700 ml, 1.8 L of YPG medium containing acetic acid, ethanol and ampicillin 100 μg / ml was added to obtain 5.5% acetic acid, Adjust the concentration of ethanol to 4%, start acetic acid fermentation again, and continue aeration and agitation culture while adding ethanol so that the ethanol concentration in the medium is maintained at 1%. The acetic acid fermentability was compared. The results are summarized in Table 3.
Figure 0004312608
From the results in Table 3, it was confirmed that the transformed strain was remarkably superior in any of the final concentration of acetic acid, specific growth rate, and raw acid rate.
The invention's effect
According to the present invention, a novel gene involved in acetic acid resistance is provided, and further, a breeding strain capable of producing vinegar having a higher acetic acid concentration with high efficiency can be obtained using the gene. A method for producing vinegar with high acetic acid concentration with high efficiency could be provided.
[Sequence Listing]
Figure 0004312608
Figure 0004312608
Figure 0004312608
Figure 0004312608
Figure 0004312608
Figure 0004312608

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a restriction map of a gene fragment (pB1) derived from Gluconacetobacter enterii cloned using BamHI, the position of the SHC gene, and a schematic diagram of the inserted fragment into pSHC.
FIG. 2 is a drawing showing the culture progress of a transformed strain in which the copy number of the SHC gene is amplified.
FIG. 3 is a drawing showing the temperature change and the course of acetic acid fermentation of a transformant obtained by amplifying the SHC gene copy number.
FIG. 4 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the protein encoded by this acetic acid resistance gene.
Fig. 5 shows the continuation of the above.
FIG. 6 shows primer 1.
FIG. 7 shows primer 2.

Claims (7)

下記の(A)、又は(B)に示すタンパク質SHC。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
Protein SHC shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and having a function of enhancing acetate resistance .
下記の(A)、又は(B)に示すタンパク質SHCをコードする遺伝子のDNA。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
DNA of a gene encoding the protein SHC shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and having a function of enhancing acetate resistance .
下記の(a)、又は(b)に示すDNAである請求項2に記載の遺伝子のDNA。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号406〜2436からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号406〜2436からなる塩基配列プローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって得られ、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質SHCをコードするDNA。
The DNA of the gene according to claim 2, which is the DNA shown in (a) or (b) below.
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 406 to 2436 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of the nucleotide numbers 406 to 2436 obtained by hybridization under stringent conditions using as a probe, and the acid resistance A DNA encoding a protein SHC having a function of enhancing.
請求項2、又は請求項3に記載のDNAの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、酢酸耐性が増強されたことを特徴とするアセトバクター属細菌アセトバクター・アセチ4. Acetobacter bacterium Acetobacter aceti , wherein acetic acid resistance is enhanced by amplification of the intracellular copy number of the DNA of claim 2 or 3. アセトバクター・アセチNo.1023(FERM BP−2287)の形質転換株であることを特徴とする請求項4に記載の細菌 Acetobacter aceti no. The bacterium according to claim 4, which is a transformed strain of 1023 (FERM BP-2287) . 請求項4、又は請求項5に記載の細菌のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。6. A method for producing vinegar comprising culturing a bacterium having an ability to oxidize an alcohol among a bacterium according to claim 4 or 5 in a medium containing alcohol to produce and accumulate acetic acid in the medium. . 少なくとも請求項2、又は請求項3に記載のDNAを含んだ組換えプラスミドpUSHC(FERM BP−7933)。A recombinant plasmid pUSHC (FERM BP-7933) comprising at least the DNA of claim 2 or claim 3.
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