JP2005013081A

JP2005013081A - Protein pvdc, its gene, microorganism having high acetic acid resistance and method for producing vinegar using the microorganism

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Publication number: JP2005013081A
Application number: JP2003181968A
Authority: JP
Inventors: Noriko Ando; 記子安藤
Original assignee: Mizkan Group Corp
Current assignee: Mizkan Group Corp
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2005-01-20

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To elucidate protein for enhancing acetic acid resistance in a gene level, to obtain a microorganism that has high acetic acid resistance and efficiently produces high-concentration acetic acid and to provide a method for efficiently producing vinegar having a high acetic acid concentration by using the microorganism. <P>SOLUTION: The protein PVDC is obtained. The DNA of a gene encoding the protein PVDC is obtained. The microorganism having high acetic acid resistance is obtained by amplifying the copy number of the DNA in the microbial cell. The method for producing vinegar comprises culturing the microorganism that has alcohol oxidation ability among the microorganisms in an alcohol-containing medium and forming and accumulating acetic acid in the medium. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質ＰＶＤＣ、その遺伝子、高度な酢酸耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法に関し、詳しくは、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＰＶＤＣ、該タンパク質ＰＶＤＣをコードする遺伝子のＤＮＡ、該ＤＮＡを含むプラスミド、高度な酢酸耐性を有し高濃度の酢酸を効率良く生産することが可能な微生物、及び該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
工業的な食酢製造においては、微生物による酢酸発酵が利用されている。このような微生物はアルコール酸化能を有し、一般に酢酸菌と呼ばれる。酢酸菌の中でも特に、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌は、工業的な酢酸発酵に広く利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換されるが、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになる。蓄積した酢酸は、酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、工業的な食酢製造においては、より高い酢酸濃度においても増殖能力や発酵能力が低下しない酢酸菌、すなわち高度な酢酸耐性を有する酢酸菌を開発することが求められている。その一手段として、酢酸耐性に関与し、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質の遺伝子（酢酸耐性遺伝子）のクローニングや、その酢酸耐性遺伝子を用いた酢酸菌の育種並びに改良が試みられている。
【０００３】
酢酸耐性遺伝子に関するこれまでの知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子、すなわちクラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）のクローニングに関するものがある（例えば、非特許文献１参照）。３つの遺伝子のうち、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
これらの３つの遺伝子を含む遺伝子断片を、マルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍＩＦＯ３２８８）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性が僅かしか向上せず、また実際の酢酸発酵における酢酸耐性能力については不明であった（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を、酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵における最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
しかし、ＡＬＤＨは、アルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００５】
【特許文献１】
特開平３−２１９８７８号公報
【特許文献２】
特開平２−２３６４号公報
【非特許文献１】
「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、１７２巻，２０９６−２１０４，１９９０年」
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７６巻、２７０−２７５，１９９３年」
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用性のある酢酸菌の開発に成功した例は、未だ報告されていない。
そこで、本発明の目的は、第一に酢酸菌の酢酸耐性の向上を図るため、酢酸耐性を増強するタンパク質を遺伝子レベルにおいて解明することである。さらに、本発明の別の目的は、当該タンパク質をコードする酢酸耐性増強遺伝子を取得するとともに、この遺伝子を用いて高度な酢酸耐性を有し、高濃度の酢酸を効率良く生産することが可能な微生物を取得すること、並びに当該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ね、その過程において、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立てた。そして、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を付与し、増強させることができ、さらにはそのような微生物を用いて、従来得ることができなかったような高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を開発することも可能になるとの新規着想を得た。
【０００８】
前記従来技術における酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
しかし、本発明者らは、この方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、他の取得方法を検討した。その結果、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換することにより、通常は１％程度の酢酸の存在下でしか生育できない酢酸菌を２％の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この取得方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで増強する機能を有する新規なタンパク質ＰＶＤＣの遺伝子（酢酸耐性増強遺伝子）をコードするＤＮＡをクローニングすることにはじめて成功した。
【０００９】
得られた酢酸耐性増強遺伝子のコーディング領域は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）で見出されているピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質やバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）で見出されているインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質とある程度の相同性を有するが、その相同性の程度は低いことから、酢酸菌に特異的なタンパク質遺伝子であって、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質とある程度似ている新規なタンパク質をコードする遺伝子であることが推定された。
【００１０】
また、酢酸耐性増強遺伝子をコードするＤＮＡのコピー数を増幅させてなる微生物は、酢酸耐性が顕著に増強するので、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、請求項１記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＰＶＤＣを提供するものである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１２】
請求項２記載の本発明は、前記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＰＶＤＣをコードする遺伝子のＤＮＡを提供するものである。
請求項３記載の本発明は、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡを提供するものである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列又は前記塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１３】
請求項４記載の本発明は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物を提供するものである。
請求項５記載の本発明は、微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項４に記載の微生物を提供するものである。
【００１４】
請求項６記載の本発明は、請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法を提供するものである。
【００１５】
本発明によれば、酢酸耐性を増強する機能を有する新規なタンパク質及びその遺伝子のＤＮＡが提供され、さらに該ＤＮＡを用いて、より高濃度の酢酸を効率良く生産可能な微生物を取得することができ、該微生物を用いることにより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質ＰＶＤＣ
本発明のタンパク質ＰＶＤＣは、請求項１に記載するように、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１７】
ここで、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）で見出されているピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質やバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）で見出されているインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質のアミノ酸配列とある程度の相同性を有するが、その相同性の程度は低いことから、酢酸菌に特異的なタンパク質であって、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質とある程度似ている新規なタンパク質であることが推定された。
すなわち、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてアミノ酸配列レベルでホモロジー検索すると、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）で見出されているピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質と３８％の、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）で見出されているインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質と３６％の相同性を有する。
【００１８】
本発明のタンパク質ＰＶＤＣは、上述のように、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよいが、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質、（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質であっても良い。
【００１９】
このような、タンパク質（Ｂ）は、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように改変することによっても取得され得る。また、従来知られている突然変異処理によっても取得することができるし、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。取得方法の詳細については、酢酸耐性を増強する機能を有することの確認のための手段を含めて、後述の（２）本発明のＤＮＡについての説明において詳細に説明する。
【００２０】
このような本発明のタンパク質ＰＶＤＣは、微生物、例えばアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属又はグルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酢酸菌、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＮｏ．１０２３）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍＩＦＯ３２８８）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＩＦＯ３２８３）株、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｕｒｏｐａｅｕｓＤＳＭ６１６０）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）に存在し、特にアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託）に存在する。
【００２１】
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、請求項２に記載するように、上記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＰＶＤＣをコードする遺伝子のＤＮＡである。具体的には、請求項３に記載するように、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列又は前記塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、本発明のＤＮＡが、塩基配列の調整要素及び該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。
【００２２】
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）から次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託）の染色体ＤＮＡを取得する。染色体ＤＮＡの取得は、例えば特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により行なうことができる。
【００２３】
次に、得られた染色体ＤＮＡから本発明の酢酸耐性を向上させる遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。
すなわち、まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。制限酵素としては、幅広い種類の酵素が使用でき、使用する酵素に応じて切断反応時間などを調節し、切断の程度を調節する。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではＳａｕ３ＡＩを用いた。
【００２４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結する。
ベクターＤＮＡに染色体ＤＮＡ断片を連結させるためには、制限酵素等を用いてベクターＤＮＡを切断開裂させておく必要がある。制限酵素としては、上記ＤＮＡ断片混合物を得る際に用いた制限酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡＩ）と相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ）を用いることができる。ＢａｍＨＩを用いた場合、温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００２５】
切断開裂されたベクターＤＮＡを、染色体ＤＮＡ断片混合物と混合し、これにＴ_４ＤＮＡリガーゼを作用させて、目的の組換えＤＮＡ（ＤＮＡライブラリー）を得ることができる。なお、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼの作用条件としては、例えば、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間とすることができる。
【００２６】
こうして得られた組換えＤＮＡ（ＤＮＡライブラリー）から、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的には前記ＤＮＡ（ａ）を選抜する。
選抜は、酢酸耐性の増強機能により行なうことができる。例えば、寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では通常増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＮｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託）を組換えＤＮＡを用いて形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。そこで生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで、目的のＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
こうして（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡを得ることができる。ここで、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列は、コーディング領域であり、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、コーディング領域に対応したものである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のピルビン酸デカルボキシラーゼとアミノ酸配列レベルで３８％の、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼとアミノ酸配列レベルで３６％の相同性を有しているが、その相同性の程度はきわめて低いことから、酢酸菌に特異的なタンパク質遺伝子であって、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質とある程度似ている新規なタンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたものである。この点については、（１）本発明のタンパク質ＰＶＤＣの項で既に説明した通りである。
なお、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質遺伝子が、酢酸耐性と関係していることは従来全く知られていなかったことであり、本発明者が初めて見出したものである。
【００２８】
さらに、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的には前記ＤＮＡ（ａ）は、すでに取得されている酢酸菌の酢酸耐性遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）や酢酸耐性を増強する機能を有するＡＤＨ遺伝子などとも異なる新規な酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子であると同定された。
【００２９】
このような、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡの製造は、上述の方法に限定されず、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって得ることができる。また、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
ここで、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３０】
本発明のＤＮＡは、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列を含むＤＮＡであるが、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質、すなわち（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするものであっても良い。
このような、タンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするように、塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のようなタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、既知の突然変異処理によっても取得することができる。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間で僅かに異なることが知られているので、タンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から上記のようなタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００３１】
また、係るタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列又は前記塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして得ることができる。
例えば、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種、より具体的にはアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらを自然に、若しくは人工的に変異処理して得られる変異体（変異株或いは変種）から、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１からなる塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによって得ることができる。
【００３２】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１ＸＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６０℃で洗浄が行なわれる条件などが挙げられる。
【００３３】
酢酸耐性を増強する機能を有することの確認は、例えば、後述の実施例で説明するように、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）に目的のＤＮＡを形質転換し、酢酸を２％含む培地で培養し、増殖可能かどうかを調べることにより行なうことができる。
【００３４】
（３）本発明の微生物
本発明の微生物は、請求項４に記載するように、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物である。
【００３５】
このような微生物として、アルコール酸化能を有する酢酸菌が挙げられ、中でも、請求項５に記載のアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌は、酢酸の生産量及び生産効率を増大させることができる点で好ましい。
係る高度な酢酸耐性を有する微生物の取得に用いる酢酸菌は、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であり、アセトバクター属の酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＮｏ．１０２３）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍＩＦＯ３２８８）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＩＦＯ３２８３）株を用いることができる。
また、グルコンアセトバクター属の酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｕｒｏｐａｅｕｓＤＳＭ６１６０）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託）を用いることができる。
【００３６】
本発明の高度な酢酸耐性を有する微生物は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が、好ましくは２回以上、より好ましくは３〜２０回増幅されてなる微生物である。
微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数を増幅する方法としては、例えば、該遺伝子の構造遺伝子（配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５〜１７４１番目の塩基配列部分）を含むＤＮＡ断片を、対象である微生物中で効率よく機能するプロモーター配列、例えば、酢酸菌のアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７５巻、６８５７−６８６６、１９９３年」参照）、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど対象微生物以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えて得られる組換えＤＮＡを用いて、微生物を形質転換する方法によっても良い。
【００３７】
その他、請求項２又は３に記載のＤＮＡを含むマルチコピーベクターを微生物の細胞に導入する方法によっても良い。
ここで、マルチコピーベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン等が挙げられる。
プラスミドとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）１５３−１５８，１９８９年」参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ），５２巻，ｐ．３１２５−３１２９，１９８８年」参照）も用いることができる。
トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００３８】
マルチコピーベクターの微生物の細胞への導入は、塩化カルシウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ），４９巻，ｐ．２０９１−２０９７，１９８５年」参照）、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），５８巻，ｐ．９７４−９７５，１９９４年」参照）等によって行なうことができる。
【００３９】
（４）本発明の食酢の製造方法
本発明の食酢の製造方法は、請求項６に記載するように、請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法である。
【００４０】
この方法は、従来の酢酸菌による発酵方法と同様に行なえば良い。アルコールを含有する培地とは、エタノール等のアルコールと、炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地であり、いわゆる酢酸発酵の際に用いられる培地と同様の組成のものを使用することができる。必要に応じて、使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸等を用いることができる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００４１】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の常法に従って、好気的条件下で行なうことができる。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、通常は３０℃とすることができる。
培地のｐＨは通常２．５〜７．０の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種の酸、塩基、緩衝液等によって適宜調整することができる。
このように、本発明においては、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることができ、通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸を生成蓄積せしめることができる。
【００４２】
以上、本発明のタンパク質ＰＶＤＣ又は酢酸耐性増強遺伝子は、それらの遺伝子源であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株が特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託されているので、本発明に係る遺伝子のＤＮＡは容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、本発明のタンパク質ＰＶＤＣ又は酢酸耐性増強遺伝子を、酢酸菌で自律複製可能なベクターに乗せ換え、これを酢酸菌に導入し、該酢酸菌を培養することにより酢酸含量の高い食酢を容易に製造することができる。
【００４３】
さらに、上記したように本発明のタンパク質ＰＶＤＣ又は酢酸耐性増強遺伝子のクローニングやＰＣＲの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託、その他が開示若しくは実施されており、いずれも入手ないし操作、処理が容易に行なえるので、実施例を参考にして各操作、処理を行なえば、目的とする酢酸耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより高濃度の酢酸を製造することができる。
【００４４】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１（酢酸耐性増強遺伝子のクローニング）
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０〜３３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００Ｘｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ない沈殿物を得た。沈殿物をＵＣ緩衝液に溶解させ、エチジウムブロマイドを加え、さらに塩化セシウムを加えて密度を１．５７に合わせ、密度勾配遠心分離を行なった。その後、遠心チューブに３６５ｎｍの紫外線を照射し、染色体バンドの下に現れるバンドをプラスミド分画として分取した。分画液をイソプロパノールで処理し、エチジウムブロマイドを除き、ＴＥ緩衝液に対して透析した。これをプラスミド混在養液とした。
【００４５】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４６】
（２）酢酸耐性増強遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までの条件下でしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）に形質転換した。
その後、形質転換されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＹＰＧ寒天培地で、３０℃にて４日間培養した。
【００４７】
次に、生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。その結果、約３．５ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されたプラスミドを回収できた。このプラスミドを、ｐＰＶＤＣ−１と命名した。
さらに、２％酢酸を含むＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にするＤＮＡ断片は、ｐＰＶＤＣ−１にクローン化された約３．５ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片中の約２．４ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片であることが確認できた。
このようにして、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株から、２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性増強遺伝子断片を取得した。
【００４８】
（３）酢酸耐性増強遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片中のＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。なお、塩基配列の決定は、ＤＮＡ２本鎖の両方の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
その結果、配列表の配列番号１記載の塩基配列が決定された。配列表の配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号６５〜１７４１にかけて、配列表の配列番号２記載のアミノ酸５５８個からなるアミノ酸配列をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。図１に、得られた酢酸耐性増強遺伝子の制限酵素地図及びプラスミドｐＰＶＤＣ−１への挿入断片の概略を示す。
【００４９】
実施例２（酢酸耐性増強遺伝子による形質転換）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記実施例１のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）由来の酢酸耐性増強遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）１５３−１５８，１９８９年」参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ_４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を、ベクター中に存在するｌａｃプロモーターによってＯＲＦの発現可能な方向に挿入して、ｐＰＶＤＣを作製した。ｐＰＶＤＣに挿入された増幅断片の概略を、図１に示した。
【００５０】
ＰＣＲ法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１及びプライマー２を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。プライマー１及び２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号３及び４に示すとおりである。
ＰＣＲ法のサイクルは、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃２分を１サイクルとして、３０サイクルとした。
【００５１】
このｐＰＶＤＣを、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），５８巻，ｐ．９７４−９７５，１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００５２】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００５３】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＰＶＤＣを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地で通気培養した場合の生育状態を、シャトルベクターｐＵＦ１０６のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
具体的には、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ寒天培地と、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地のそれぞれに、ｐＰＶＤＣを有する形質転換株とシャトルベクターｐＵＦ１０６を有する元株を接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより比較した。酢酸を含む培地における元株及び形質転換株の増殖量の経時的変化を濁度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）で測定した結果を図２に示す。
【００５４】
その結果、酢酸を含有しない培地では形質転換株及び元株はほぼ同様の増殖が可能であった。しかし、図２から明らかな通り、酢酸を含む培地では、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株であるアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性増強遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性を増強する機能を有する新規なタンパク質及びその遺伝子のＤＮＡが提供され、該ＤＮＡを用いて、より高濃度の酢酸を効率良く生産可能な微生物を取得することができる。さらに、該微生物を使用した高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
【００５６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酢酸耐性増強遺伝子の制限酵素地図及びプラスミドｐＰＶＤＣ−１への挿入断片の概略を示した図である。
【図２】酢酸を含む培地における元株及び形質転換株の増殖量の経時的変化を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein PVDC, a gene thereof, a microorganism having high acetic acid resistance, and a method for producing vinegar using the microorganism, and more specifically, a protein PVDC having a function of enhancing acetic acid resistance and the protein PVDC are encoded. The present invention relates to a gene DNA, a plasmid containing the DNA, a microorganism capable of efficiently producing a high concentration of acetic acid having high acetic acid resistance, and a method for efficiently producing a vinegar having a high acetic acid concentration using the microorganism. .
[0002]
[Prior art]
In industrial vinegar production, acetic acid fermentation by microorganisms is used. Such microorganisms have alcohol oxidizing ability and are generally called acetic acid bacteria. Among acetic acid bacteria, in particular, acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter are widely used for industrial acetic acid fermentation.
In acetic acid fermentation, ethanol in the medium is oxidized by acetic acid bacteria and converted into acetic acid. As a result, acetic acid accumulates in the medium. Accumulated acetic acid is also inhibitory to acetic acid bacteria, and as the acetic acid accumulation amount increases and the acetic acid concentration in the medium increases, the acetic acid bacteria growth ability and fermentation ability gradually decrease.
Therefore, in industrial vinegar production, it is required to develop an acetic acid bacterium that does not decrease its ability to grow or ferment even at a higher acetic acid concentration, that is, an acetic acid bacterium having high acetic acid resistance. As one means, cloning of a protein gene (acetic acid resistant gene) involved in acetic acid resistance and having a function of enhancing acetic acid resistance, breeding and improvement of acetic acid bacteria using the acetic acid resistant gene has been attempted.
[0003]
Previous knowledge of acetic acid resistance genes includes three genes that form clusters, ie complementary genes that can restore acetic acid-sensitive strains by mutating the acetic acid resistance of acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter. There is one related to cloning of (aarA, aarB, aarC) (for example, see Non-Patent Document 1). Of the three genes, the aarA gene is a gene that encodes citrate synthase, and the aarC gene is presumed to be an enzyme that encodes an enzyme involved in the utilization of acetic acid. Was unknown (for example, refer nonpatent literature 2).
A transformant obtained by cloning a gene fragment containing these three genes into a multicopy plasmid and transforming into a strain of Acetobacter aceti subspecies zylinum IFO3288 (Acetobacteraceti subsp. Xylinum IFO3288), The acetic acid resistance was only slightly improved, and the acetic acid resistance ability in actual acetic acid fermentation was unknown (for example, see Patent Document 1).
[0004]
On the other hand, an example has been disclosed in which improvement of the final acetic acid concentration in acetic acid fermentation has been confirmed by introducing a gene encoding membrane-bound aldehyde dehydrogenase (ALDH) cloned from acetic acid bacteria into acetic acid bacteria. (For example, refer to Patent Document 2).
However, since ALDH is an enzyme having a function of oxidizing aldehyde and not directly related to acetic acid resistance, it cannot be determined that the gene encoding ALDH is truly an acetic acid resistance gene.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-3-21878 [Patent Document 2]
JP-A-2-2364 [Non-Patent Document 1]
“Journal of Bacteriology”, 172, 2096-2104, 1990 ”
[Non-Patent Document 2]
“Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 76, 270-275, 1993”
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, there has been no report yet of a case where acetic acid resistance of acetic acid bacteria has been elucidated at the gene level and a practical acetic acid bacteria having high acetic acid resistance has been successfully developed.
Therefore, an object of the present invention is to first elucidate a protein that enhances acetic acid resistance at the gene level in order to improve acetic acid resistance of acetic acid bacteria. Furthermore, another object of the present invention is to obtain an acetic acid resistance enhancing gene encoding the protein, and to use this gene to have a high acetic acid resistance and to efficiently produce a high concentration of acetic acid. It is to obtain a microorganism and to provide a method for efficiently producing vinegar having a high acetic acid concentration using the microorganism.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made extensive studies to achieve the above object, and in the process, acetic acid bacteria that can grow and ferment even in the presence of acetic acid have specific acetic acid resistance that does not exist in other microorganisms. Hypothesized that there is a gene involved in. And if such a gene is used, the acetic acid tolerance of microorganisms can be imparted and enhanced more than before, and furthermore, such microorganisms can be used to produce vinegar with a high acetic acid concentration that could not be obtained conventionally. I got a new idea that it would be possible to develop efficient manufacturing methods.
[0008]
As a method for obtaining an acetic acid resistant gene in the prior art, a method of cloning a gene that complements an acetic acid-sensitive mutant of acetic acid bacteria is generally used.
However, the present inventors considered that it is difficult to find an industrially useful acetate-resistant gene by this method, and studied other acquisition methods. As a result, by constructing a chromosomal DNA library of acetic acid bacteria and transforming the chromosomal DNA library into acetic acid bacteria, the acetic acid bacteria that can usually grow only in the presence of about 1% acetic acid are transformed into 2% acetic acid. We have developed a method for obtaining genes by screening for genes that can grow in the presence of.
By this acquisition method, a novel protein PVDC gene (acetic acid resistance enhancing gene) having a function of enhancing acetic acid tolerance at a practical level from the acetic acid bacteria of the genus Acetobacter and Gluconacetobacter genus actually used in vinegar production The first successful cloning of DNA encoding
[0009]
The coding region of the resulting acetic acid resistance enhancing gene is composed of pyruvate decarboxylase protein found in Clostridium acetobutylicum and indole-3-pyruvic acid found in Bacillus cereus. It has a certain degree of homology with decarboxylase protein, but its degree of homology is low, so it encodes a novel protein gene that is specific to acetic acid bacteria and somewhat similar to pyruvate decarboxylase protein It was estimated to be a gene.
[0010]
In addition, a microorganism obtained by amplifying the copy number of DNA encoding an acetic acid resistance enhancing gene has a markedly enhanced acetic acid resistance, and thus it has been found that vinegar with a high acetic acid concentration can be efficiently produced, and the present invention has been completed. It came to do.
[0011]
That is, this invention of Claim 1 provides the protein PVDC shown in the following (A) or (B).
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having
[0012]
The present invention according to claim 2 provides DNA of a gene encoding the protein PVDC shown in (A) or (B).
The present invention according to claim 3 provides the DNA of the gene according to claim 2, which is the DNA shown in the following (a) or (b).
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 65 to 1741 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 65 to 1741 or a DNA having a nucleotide sequence that can be a probe prepared from at least a part of the nucleotide sequence, and stringent conditions DNA encoding a protein that hybridizes underneath and has a function of enhancing acetic acid resistance.
[0013]
The present invention according to claim 4 provides a microorganism having high acetate resistance, wherein the copy number of the DNA according to claim 2 or 3 in the microorganism cell is amplified.
The present invention according to claim 5 provides the microorganism according to claim 4, wherein the microorganism is an acetic acid bacterium of the genus Acetobacter or Glucon acetobacter.
[0014]
The present invention according to claim 6 is characterized in that the microorganism having the ability to oxidize alcohol among the microorganisms according to claim 4 or 5 is cultured in a medium containing alcohol and acetic acid is produced and accumulated in the medium. A method for producing vinegar is provided.
[0015]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel protein which has a function which enhances an acetic acid tolerance, and DNA of the gene are provided, Furthermore, microorganisms which can produce a higher concentration acetic acid efficiently can be obtained using this DNA. It is possible to provide a method for producing vinegar having a high acetic acid concentration with high efficiency by using the microorganism.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Protein PVDC of the present invention
As described in claim 1, the protein PVDC of the present invention is a protein shown in the following (A) or (B).
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having
[0017]
Here, (A) the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is found in pyruvate decarboxylase protein and Bacillus cereus found in Clostridium acetobutylicum. It has a certain degree of homology with the amino acid sequence of the indole-3-pyruvate decarboxylase protein that has been released, but the degree of homology is low. It was estimated to be a novel protein that resembles the protein to some extent.
That is, when a homology search at the amino acid sequence level in DDBJ / EMBL / Genbank and SWISS-PROT / PIR, 38% of Bacillus cereus (Bacillus cereus) is found with pyruvate decarboxylase protein found in Clostridium acetobutylicum. cereus) with 36% homology with the indole-3-pyruvate decarboxylase protein.
[0018]
As described above, the protein PVDC of the present invention may be a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the (A) Sequence Listing, but (B) the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. A protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of 1 or several, preferably 1 to 5 amino acids, and having a function of enhancing acetic acid resistance, (A) The protein may be substantially the same protein as.
[0019]
Such a protein (B) is substituted or deleted by 1 or several, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, for example, by site-directed mutagenesis. It can also be obtained by modifying the amino acid sequence to include an insertion, addition or inversion. It can also be obtained by conventionally known mutation treatments, and can be obtained from all acetic acid bacteria, especially from the species, strains, mutants, and variants of the genus Acetobacter and Gluconacetobacter. The details of the acquisition method will be described in detail in (2) the description of the DNA of the present invention described later, including means for confirming that it has a function of enhancing acetic acid resistance.
[0020]
Such a protein PVDC of the present invention is a microorganism, for example, an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or Gluconacetobacter, specifically, for example, Acetobacter aceti no. 1023 strain (Acetobacter acetici No. 1023) (deposited as FERM BP-2287 in the Patent Organism Depositary), Acetobacter aceti subspecies zylinum IFO3288 (Acetobacter acetic subsp. aceti IFO 3283) strain, Gluconacetobacter europaeus DSM6160 (Gluconacetobacter europaeus DSM6160), Gluconacetobacter entaniii, especially Acetobacter altoacetoacetoaceto etigenes MH-24) strain (deposited as FERM BP-491 at the Patent Organism Depositary).
[0021]
(2) DNA of the present invention
As described in claim 2, the DNA of the present invention is a DNA of a gene encoding the protein PVDC shown in the above (A) or (B). Specifically, as described in claim 3, it is a DNA shown in the following (a) or (b).
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 65 to 1741 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 65 to 1741 or a DNA having a nucleotide sequence that can be a probe prepared from at least a part of the nucleotide sequence, and stringent conditions DNA encoding a protein that hybridizes underneath and has a function of enhancing acetic acid resistance.
Needless to say, the DNA of the present invention may contain a base sequence regulatory element and a structural portion of the gene.
[0022]
(A) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, specifically, (a) consisting of base numbers 65 to 1741 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing DNA containing the base sequence can be obtained from Gluconacetobacter entanii as follows.
First, chromosomal DNA of Glucon Acetobacter enterii, for example, Acetobacter altoacetylenes MH-24 strain (deposited as FERM BP-491 in the Patent Organism Depositary) is obtained. Chromosomal DNA can be obtained, for example, by the method disclosed in JP-A-60-9489.
[0023]
Next, a chromosomal DNA library is prepared in order to isolate the gene that improves the acetic acid resistance of the present invention from the obtained chromosomal DNA.
That is, first, chromosomal DNA is partially decomposed with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various chromosomal DNA fragments. A wide variety of enzymes can be used as restriction enzymes, and the degree of cleavage is adjusted by adjusting the cleavage reaction time and the like according to the enzyme used. For example, Sau3AI is digested by acting on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C. or higher, preferably 37 ° C., at an enzyme concentration of 1 to 10 units / ml for various times (1 minute to 2 hours). In the examples described later, Sau3AI was used.
[0024]
Next, the cleaved chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in acetic acid bacteria.
In order to link a chromosomal DNA fragment to vector DNA, it is necessary to cleave and cleave the vector DNA using a restriction enzyme or the like. As a restriction enzyme, a restriction enzyme (for example, BamHI) that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme (for example, Sau3AI) used in obtaining the DNA fragment mixture can be used. In the case of using BamHI, the DNA is completely digested by acting on the vector DNA for 1 hour or more under conditions of a temperature of 30 ° C. and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml, and then cleaved.
[0025]
The cleaved and cleaved vector DNA is mixed with a chromosomal DNA fragment mixture, and T ₄ DNA ligase is allowed to act on the mixture to obtain the desired recombinant DNA (DNA library). The working conditions of T ₄ DNA ligase can be, for example, 1 hour or more, preferably 6 to 24 hours under conditions of a temperature of 4 to 16 ° C. and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml.
[0026]
From the recombinant DNA (DNA library) thus obtained, a gene encoding the protein (A), specifically, the DNA (a) is selected.
The selection can be performed by an acetic acid resistance enhancement function. For example, acetic acid bacteria that cannot normally grow on an agar medium in the presence of acetic acid at a concentration higher than 1%, such as Acetobacter aceti No. A strain 1023 (Acetobacter acetici No. 1023) (deposited as FERM BP-2287 at the Patent Organism Depositary) is transformed with the recombinant DNA, and then applied to agar medium containing 2% acetic acid and cultured. The resulting colonies are inoculated into a liquid medium and cultured, and the plasmid is recovered from the resulting bacterial cells, whereby the target DNA can be obtained.
[0027]
Thus, (A) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, specifically, (a) among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, from base numbers 65 to 1741 DNA containing the nucleotide sequence can be obtained. Here, among the base sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the base sequence consisting of base numbers 65 to 1741 is a coding region, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing corresponds to the coding region. Is.
(A) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, specifically, (a) consisting of base numbers 65 to 1741 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing The DNA containing the nucleotide sequence was found to be 38% at the amino acid sequence level with Pyruvate decarboxylase from Clostridium acetobutylicum, and at 36% at the amino acid sequence level from Bacillus cereus indole-3-pyruvate decarboxylase. % Homology, but the degree of homology is so low that it encodes a novel protein gene that is specific to acetic acid bacteria and is somewhat similar to pyruvate decarboxylase protein gene It is intended that has been estimated that. About this point, it is as having already demonstrated in the term of (1) protein PVDC of this invention.
The fact that the pyruvate decarboxylase protein gene is related to acetic acid resistance has never been known so far, and was first discovered by the present inventors.
[0028]
Furthermore, the gene encoding the protein (A), specifically, the DNA (a) has a function of enhancing the acetic acid resistance genes (aarA, aarB, aarC) and acetic acid resistance of acetic acid bacteria already obtained. It was identified as a novel gene having a function of enhancing acetic acid resistance, which is different from the ADH gene.
[0029]
Such a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, specifically, (a) among the base sequences described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the base number 65 The production of DNA containing a base sequence consisting of ˜1741 is not limited to the above-mentioned method. For example, the genomic DNA of Acetobacter gluconeacetobacter enterii is used as a template, and an oligonucleotide synthesized based on the base sequence is used as a primer. Can be obtained by polymerase chain reaction (PCR reaction). It can also be obtained by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a probe.
Here, the synthesis of the oligonucleotide used as a primer can be synthesized according to a conventional method using, for example, various commercially available DNA synthesizers. The PCR reaction is carried out using a thermal cycler Gene Amp PCR System 2400 manufactured by Applied Biosystems, TaqDNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the like. Can be carried out according to the standard method.
[0030]
The DNA of the present invention comprises (A) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, specifically, (a) among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. A DNA comprising a nucleotide sequence consisting of Nos. 65 to 1741, (B) substitution or deletion of one or several, preferably 1 to 5, amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID No. 2 in the sequence listing; It may be an amino acid sequence containing an insertion, addition, or inversion, and may encode a protein having a function of enhancing acetate resistance, that is, a protein substantially the same as the protein of (A).
Such a DNA encoding the protein (B) is substituted by 1 or several, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing by, for example, site-directed mutagenesis. It can also be obtained by modifying the base sequence so as to encode a protein consisting of an amino acid sequence containing a deletion, insertion, addition or inversion. The DNA encoding the protein (B) as described above can also be obtained by a known mutation treatment.
In general, it is known that the amino acid sequence of a protein and the base sequence of DNA encoding the same are slightly different between species, strains, mutants, and variants. Therefore, the DNA encoding the protein (B) is: It is possible to obtain DNA encoding the protein (B) as described above from all acetic acid bacteria, in particular from species, strains, mutants, and variants of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter.
[0031]
The DNA encoding the protein (B) was prepared from the base sequence consisting of base numbers 65 to 1741 or at least a part of the base sequence among the base sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence table (b). It can be obtained as DNA encoding a protein that hybridizes with a DNA having a base sequence that can serve as a probe under stringent conditions and has a function of enhancing acetic acid resistance.
For example, acetic acid bacteria in general, especially Acetobacter or Gluconacetobacter species, strains, mutants, variants, more specifically Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid bacteria, these naturally or artificially It can be a probe prepared from at least a part of the base sequence consisting of base numbers 65 to 1741 out of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing from a mutant (mutant strain or variant) obtained by mutation treatment It can be obtained by hybridizing with DNA of a base sequence under stringent conditions.
[0032]
The stringent condition referred to here is a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, DNAs with high homology, for example, DNAs having homology of 70% or more hybridize and DNA with lower homology than that. Examples include conditions where they do not hybridize with each other, or normal hybridization washing conditions, for example, conditions where washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 0.1% SDS in 1XSSC.
[0033]
Confirmation of having a function of enhancing acetic acid resistance is, for example, as described in Examples below, Acetobacter aceti No. which can usually grow only up to about 1% acetic acid concentration on an agar medium. The target DNA can be transformed into strain 1023 (FERM BP-2287), cultured in a medium containing 2% acetic acid, and examined for its ability to grow.
[0034]
(3) Microorganism of the present invention As described in claim 4, the microorganism of the present invention has a high acetic acid resistance obtained by amplifying the copy number of the DNA according to claim 2 or 3 in a microbial cell. It is a microorganism.
[0035]
Examples of such microorganisms include acetic acid bacteria having an ability to oxidize alcohol. Among them, the acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter according to claim 5 can increase the production amount and production efficiency of acetic acid. It is preferable in that it can be performed.
The acetic acid bacterium used for obtaining the microorganism having high acetic acid resistance is an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter, and examples of the acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter include Acetobacter acetic Specifically, for example, Acetobacter aceti No. Strain 1023 (Acetobacter acetici No. 1023) (deposited as FERM BP-2287 in the Patent Organism Depositary), Acetobacter aceti subspecies zylinum IFO3288 (Acetobacter acetic subsp. Acetii IFO 3283) strain can be used.
Examples of the acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconacetobacter include Gluconacetobacter europaeus DSM6160 (Gluconacetobacter europaeus DSM6160), Gluconacetobacter enteranii, and specifically, for example, Acetobacter Genenes MH-24 strain (Acetobacter altoacetigenes MH-24) (deposited as FERM BP-491 at the Patent Organism Depositary) can be used.
[0036]
The microorganism having high acetic acid resistance according to the present invention is a microorganism in which the copy number of the DNA according to claim 2 or 3 in the microorganism cell is preferably amplified twice or more, more preferably 3 to 20 times. .
Examples of a method for amplifying the copy number of the DNA according to claim 2 or 3 in a microbial cell include, for example, the structural gene of the gene (base numbers 65 to 1741 among the base sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). DNA fragment containing the second base sequence part) is a promoter sequence that functions efficiently in the target microorganism, such as alcohol dehydrogenase of acetic acid bacteria (for example, “Journal of Bacteriology 175, 6857-6866, 1993 ”), the ampicillin resistance gene of plasmid pBR322 of E. coli, the kanamycin resistance gene of plasmid pACYC177, the chloramphenicol resistance gene of plasmid pACYC184, the β-galactosidase gene, etc. A method of transforming a microorganism using a recombinant DNA obtained by substituting a promoter sequence derived from a microorganism other than the target microorganism such as lomotor may be used.
[0037]
In addition, a method of introducing a multicopy vector containing the DNA of claim 2 or 3 into a microorganism cell may be used.
Here, examples of the multicopy vector include a plasmid and a transposon.
Examples of the plasmid include pUF106 (see, for example, “Cellulose 153-158, 1989”), pTA5001 (A), and pTA5001 (B) (see, for example, JP-A-60-9488). Further, pMVL1 (see, for example, “Agricultural and Biological Chemistry,” 52, p. 3125-3129, 1988), which is a chromosome integration type vector, can also be used.
Examples of transposons include Mu and IS1452.
[0038]
The introduction of multicopy vectors into cells of microorganisms can be carried out by the calcium chloride method (see, for example, “Agricultural and Biological Chemistry”, 49, p. 2091-2097, 1985), An electroporation method (for example, see “Bioscience, Biotechnology and Biochemistry”, Vol. 58, p. 974-975, 1994) or the like.
[0039]
(4) Method for producing vinegar according to the present invention The method for producing vinegar according to the present invention comprises, as described in claim 6, a microorganism having the ability to oxidize alcohol among the microorganisms according to claim 4 or 5. It is a method for producing vinegar characterized by culturing in a medium containing it and acetic acid being produced and accumulated in the medium.
[0040]
This method may be performed in the same manner as the conventional fermentation method using acetic acid bacteria. The medium containing alcohol is a medium containing alcohol such as ethanol, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, etc., and a medium having the same composition as the medium used in so-called acetic acid fermentation can be used. . If necessary, a synthetic medium or a natural medium may be used as long as it contains an appropriate amount of nutrients required by the strain used for growth.
As the carbon source, various carbohydrates including glucose and sucrose, various organic acids, and the like can be used. As the nitrogen source, natural nitrogen sources such as peptone and fermented bacterial cell decomposition products can be used.
[0041]
Cultivation can be performed under aerobic conditions according to conventional methods such as stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture. The culture temperature can be 20 to 40 ° C, preferably 25 to 35 ° C, and usually 30 ° C.
The pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7.0, preferably in the range of 2.7 to 6.5, and can be appropriately adjusted with various acids, bases, buffers and the like.
In this way, in the present invention, acetic acid can be produced and accumulated in a medium containing alcohol, and usually a high concentration of acetic acid is produced and accumulated in the medium by culturing for 1 to 21 days. It can be shown.
[0042]
As described above, the protein PVDC or acetic acid resistance-enhancing gene of the present invention has been deposited as FERM BP-491 in the Patent Organism Depository Center with the Acetobacter altoacetylenes MH-24 strain as its gene source. Therefore, the DNA of the gene according to the present invention can be easily obtained, and those skilled in the art can easily implement the present invention. Then, if desired, the protein PVDC of the present invention or the acetic acid resistance enhancing gene is transferred to a vector capable of autonomous replication in acetic acid bacteria, introduced into acetic acid bacteria, and cultured to acetic acid content. Can be produced easily.
[0043]
Furthermore, as described above, cloning of the protein PVDC or acetate-resistance-enhancing gene of the present invention, PCR mode, preparation of plasmid vectors, recombinant plasmids, deposit of host bacteria, etc. have been disclosed or practiced. Since the operation and treatment can be easily performed, the target acetic acid resistant transformant can be obtained by performing each operation and treatment with reference to the Examples, and by using this, a high concentration of acetic acid can be produced. can do.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
Example 1 (Cloning of acetic acid resistance enhancing gene)
(1) Preparation of chromosomal DNA library 6% of Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), which is one strain of Gluconacetobacter entaniii In YPG medium (containing 3% glucose, 0.5% yeast extract and 0.2% polypeptone) supplemented with acetic acid and 4% ethanol, shaking culture was performed at 30 ° C. for 240 to 336 hours.
After completion of the culture, the culture solution was centrifuged (7,500 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells. Chromosomal DNA was prepared from the obtained cells by the method disclosed in JP-A-60-9489. That is, after washing the cells with TE buffer, the TES buffer solution was added to suspend the cells, lysozyme solution was added and allowed to stand, and EDTA solution was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction, sodium lauryl sulfate was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes. Then, brine was added, and the mixture was allowed to stand at 0 ° C. overnight. Next, centrifugation was performed to obtain a supernatant. Polyethylene glycol 6000 was added to the supernatant and allowed to stand overnight at 4 ° C., followed by centrifugation to obtain a precipitate. The precipitate was dissolved in UC buffer, ethidium bromide was added, cesium chloride was further added to adjust the density to 1.57, and density gradient centrifugation was performed. Then, the ultraviolet light of 365 nm was irradiated to the centrifuge tube, and the band which appeared under a chromosome band was fractionated as a plasmid fraction. The fraction was treated with isopropanol to remove ethidium bromide and dialyzed against TE buffer. This was used as a plasmid mixed nutrient solution.
[0045]
The chromosomal DNA obtained as described above was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI (manufactured by Takara Bio Inc.), and the E. coli-acetic acid shuttle vector pUF106 was completely digested with the restriction enzyme BamHI and cleaved. A suitable amount of these DNAs were mixed and ligated using a ligation kit (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2, manufactured by Takara Bio Inc.) to construct a chromosomal DNA library of Acetobacter altoacetogenes MH-24.
[0046]
(2) Cloning of acetic acid tolerance enhancing gene The chromosomal DNA library of Acetobacter altoacetogenes MH-24 obtained as described above is usually only available on an agar medium up to an acetic acid concentration of about 1%. Acetobacter aceti no. 1023 strain (FERM BP-2287) was transformed.
Thereafter, transformed Acetobacter aceti no. Strain 1023 was cultured at 30 ° C. for 4 days on a YPG agar medium supplemented with 2% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin.
[0047]
Next, the resulting colonies were inoculated and cultured in a YPG medium containing 100 μg / ml ampicillin, and the plasmid was recovered from the resulting cells. As a result, it was possible to recover the plasmid in which the Sau3AI fragment of about 3.5 kbp was cloned. This plasmid was named pPVDC-1.
Furthermore, Acetobacter aceti No. 2 in YPG agar medium containing 2% acetic acid. It was confirmed that the DNA fragment enabling the growth of strain 1023 was an approximately 2.4 kbp EcoRV-PstI fragment in the approximately 3.5 kbp Sau3AI fragment cloned into pPVDC-1.
In this way, Acetobacter aceti No. 1 which can usually grow on an agar medium only to an acetic acid concentration of about 1%. From the strain 1023, an acetic acid resistance-enhancing gene fragment that enables growth on an agar medium containing 2% acetic acid was obtained.
[0048]
(3) Determination of the base sequence and amino acid sequence of the acetic acid resistance enhancing gene The EcoRV-PstI fragment in the cloned Sau3AI fragment was inserted into the SmaI-PstI cleavage site of pUC19. The dideoxy chain termination method. The nucleotide sequence was determined for the entire region of both DNA double strands so that all the breakpoints overlapped.
As a result, the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was determined. The presence of an open reading frame (ORF) encoding an amino acid sequence consisting of 558 amino acids described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is confirmed from base numbers 65 to 1741 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It was done. FIG. 1 shows a restriction map of the resulting acetate resistance enhancing gene and an outline of the inserted fragment into plasmid pPVDC-1.
[0049]
Example 2 (Transformation with an acetic acid resistance enhancing gene)
(1) Transformation to Acetobacter aceti Acetic acid resistance derived from Acetobacter altoacetigenes MH-24 (FERM BP-491) cloned as in Example 1 above The enhanced gene was amplified by PCR using KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.). Acetic acid bacteria-Escherichia coli shuttle vector pUF106 (see, for example, “Cellulose 153-158, 1989”) was cleaved with restriction enzyme EcoRI, blunt-ended with T ₄ DNA polymerase, and the amplified DNA fragment was placed at that site. The pPVDC was prepared by inserting the lac promoter in the vector in the direction in which ORF can be expressed. An outline of the amplified fragment inserted into pPVDC is shown in FIG.
[0050]
The PCR method was performed as follows. That is, the PCR method was performed using the genomic DNA derived from the acetic acid bacterium as a template, primers 1 and 2 as primers, and the following conditions. The base sequences of primers 1 and 2 are as shown in SEQ ID NOS: 3 and 4 in the sequence listing, respectively.
The cycle of the PCR method was 30 cycles, with 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 2 minutes as one cycle.
[0051]
This pPVDC was designated as Acetobacter aceti No. The strain 1023 was transformed by electroporation (see “Bioscience, Biotechnology and Biochemistry”, 58, p. 974-975, 1994). Transformants were selected on YPG agar medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin and 2% acetic acid.
[0052]
About the ampicillin resistant transformant grown on the selective medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the plasmid carrying the acetic acid resistance enhancing gene was retained.
[0053]
(2) Acetic acid resistance of transformant About the ampicillin resistant transformant having the plasmid pPVDC obtained as described above, the growth state when aerated in YPG medium supplemented with acetic acid was determined using only the shuttle vector pUF106. Former strain Acetobacter aceti No. Comparison with 1023 strain.
Specifically, 100 ml of YPG agar medium containing 3% ethanol and 100 μg / ml ampicillin and 100 ml YPG medium containing 3% ethanol, 3% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin were each transformed with pPVDC. The strain and the original strain having the shuttle vector pUF106 were inoculated, cultured at 30 ° C. with shaking (150 rpm), and the growth of the transformed strain and the original strain in an acetic acid-added medium was measured by measuring the absorbance at 660 nm. FIG. 2 shows the results of measuring changes over time in the amounts of growth of the original strain and the transformed strain in a medium containing acetic acid by turbidity (OD).
[0054]
As a result, in the medium containing no acetic acid, the transformed strain and the original strain were able to grow in substantially the same manner. However, as is clear from FIG. 2, in the medium containing acetic acid, the transformed strain can grow, whereas Acetobacter aceti No. It was confirmed that the strain 1023 could not grow and the function of enhancing acetate resistance by the acetate resistance enhancing gene was confirmed.
[0055]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel protein having a function of enhancing acetic acid resistance and a DNA of the gene are provided, and a microorganism capable of efficiently producing a higher concentration of acetic acid can be obtained using the DNA. Furthermore, it has become possible to provide a method for producing a highly acetic acid vinegar using the microorganism with high efficiency.
[0056]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing a restriction enzyme map of an acetic acid resistance enhancing gene of the present invention and an outline of an inserted fragment into a plasmid pPVDC-1.
FIG. 2 is a graph showing changes over time in the amounts of growth of the original strain and the transformed strain in a medium containing acetic acid.

Claims

Protein PVDC shown in the following (A) or (B).
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having

DNA of a gene encoding the protein PVDC shown in the following (A) or (B).
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having

The DNA of the gene according to claim 2, which is DNA shown in the following (a) or (b).
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 65 to 1741 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 65 to 1741 or a DNA having a nucleotide sequence that can be a probe prepared from at least a part of the nucleotide sequence, and stringent conditions DNA encoding a protein that hybridizes underneath and has a function of enhancing acetic acid resistance.

A microorganism having high acetic acid resistance, wherein the copy number of the DNA according to claim 2 or 3 is amplified in a microbial cell.

The microorganism according to claim 4, wherein the microorganism is an Acetobacter or Glucon Acetobacter acetic acid bacterium.

6. A method for producing vinegar, comprising culturing a microorganism capable of oxidizing alcohol among the microorganisms according to claim 4 or 5 in a medium containing alcohol to produce and accumulate acetic acid in the medium.