JP2005040019A

JP2005040019A - Gene participating in acetic acid tolerance, acetic acid bacterium bred by using the same gene and method for producing vinegar using the same acetic acid bacterium

Info

Publication number: JP2005040019A
Application number: JP2003200671A
Authority: JP
Inventors: Koichi Kondo; 康一近藤; Masako Furusato; 正子古里
Original assignee: Mizkan Group Corp
Current assignee: Mizkan Group Corp
Priority date: 2003-07-23
Filing date: 2003-07-23
Publication date: 2005-02-17

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new gene participating in acetic acid tolerance of an acetic acid bacterium and to provide a method for improving the acetic acid tolerance of a microorganism, especially the acetic acid bacterium using the gene and a method for efficiently producing vinegar at a higher acetic acid concentration using the acetic acid bacterium having improved acetic acid tolerance. <P>SOLUTION: The new gene having functions to improve the acetic acid tolerance from the practical acetic acid bacterium belonging to the genus Gluconacetobacter is cloned by a method for obtaining a gene proliferating even in a culture medium at an acetic acid concentration in which proliferation cannot usually be carried out from a chromosomic DNA library of the acetic acid bacterium. In a transformant in which the gene is transferred into the acetic acid bacterium, the acetic acid tolerance is remarkably improved. When the transformant is aerobically cultured in the presence of ethanol, the proliferation induction phase can be shortened and even the proliferation rate can be improved. Furthermore, the final ultimate acetic acid concentration can remarkably be improved. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物に由来する酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）及びグルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する
【０００２】
【従来の技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
【０００３】
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００４】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００５】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
【０００７】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍＩＦＯ３２８８）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００９】
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させ得る機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また、取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【００１０】
【特許文献１】
特開平３−２１９８７８号公報
【００１１】
【特許文献２】
特開平２−２３６４号公報
【００１２】
【特許文献３】
特開昭６０−９４８９号公報
【００１３】
【特許文献４】
特開昭６０−９４８８号公報
【００１４】
【非特許文献１】
「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１７２巻、ｐ．２０９６〜２１０４、１９９０年」
【００１５】
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７６巻、ｐ．２７０〜２７５、１９９３年」
【００１６】
【非特許文献３】
「セルロース（Ｃｅｌｌｕｓｏｓｅ）」、１５３〜１５８、１９８９年
【００１７】
【非特許文献４】
「アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、５５巻、ｐ．１７１〜１７６、１９８９年」
【００１８】
【非特許文献５】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５２巻、ｐ．３１２５〜３１２９、１９８８年」
【００１９】
【非特許文献６】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、４９巻、ｐ．２０９１〜２０９７、１９８５年」
【００２０】
【非特許文献７】
「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５８巻、ｐ．９７４〜９７５、１９９４年」
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来より酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。しかし、酢酸耐性にすぐれた酢酸菌が開発されれば、従来より高濃度の酢酸発酵が行われ、高濃度酢酸、高濃度食酢の効率的製造が可能となることから、本発明者らは、再度、酢酸菌の酢酸耐性の向上を遺伝子レベルで解明することとした。
【００２２】
そして本発明者らは、各方面から検討した結果、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが重要であるとの観点にたち、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを新規技術課題として新たに設定した。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する従来得ることができなかった新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
【００２４】
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
【００２５】
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常１％程度の酢酸の存在下でしか生育できない株を、２％の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
【００２６】
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニングすることにはじめて成功した。
【００２７】
得られた酢酸耐性遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいて、ホモロジー検索した結果、アミノ酸レベルでヘムＣとの結合配列が存在し、クリィーベロミセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）のシトクロムＣ１遺伝子とアミノ酸レベルで３４．０％、根粒細菌メソリゾビウム・ロッティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ）のシトクロムＣ１遺伝子とアミノ酸レベルで３２．７％の相同性を示すことから、酢酸菌のシトクロムＣ１タンパク質をコードする遺伝子であることが推定された。
【００２８】
しかし、取得された酢酸菌のシトクロムＣ１遺伝子は、酵母などのほかの微生物で見出されているシトクロムＣ１遺伝子とは相同性が極めて低かったことから、他のシトクロムＣ１遺伝子とある程度似ているものの酢酸菌に特異的な新規なシトクロムをコードする新規遺伝子であることを見出した。
【００２９】
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上し、その結果、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合に、増殖誘導期が短縮する上に、増殖速度、生酸速度が向上すると共に、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなどを見出し、更に該タンパク質のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列の決定にも成功し、本発明を完成するに至った。
【００３０】
すなわち本発明は、次のような実施態様を包含するものである。
（１）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＣＣＲ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００３１】
（２）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＣＣＲをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００３２】
（３）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すＤＮＡである上記（２）に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５４８〜１４１７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５４８〜１４１７からなる塩基配列又はその一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３３】
（４）上記（２）、又は（３）に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、酢酸耐性が増強された微生物。
（５）微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする上記（４）に記載の微生物。
【００３４】
（６）上記（４）に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【００３５】
（７）上記（２）、又は（３）に記載のＤＮＡを含んだ組換えプラスミドｐＣＣＲ。
【００３６】
（８）上記（７）に記載の組換えプラスミドｐＣＣＲの内、少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでなる組換えプラスミドであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＵＦ１０６にこれらのＤＮＡ断片を挿入してなるプラスミドｐＣＣＲ。
【００３７】
（９）上記（８）に記載の組換えプラスミドｐＣＣＲをアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）に導入してなる形質転換体。
【００３８】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４０】
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、クリィーベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）やメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）のシトクロムＣ１とある程度の相同性を有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を有する配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調整要素、及び該遺伝子の構造部分を含む。更に詳細には、本発明は酢酸耐性遺伝子に関するものであって、本酢酸耐性遺伝子は、酢酸耐性に関与する遺伝子を指し、更に具体的には、少なくとも（ｉ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、又は、（ｉｉ）それに含まれ、ＣＣＲタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から選ばれる少なくともひとつを包含するものである。
【００４１】
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
【００４２】
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特許文献３）に開示された方法により取得する。
【００４３】
次に、得られた染色体ＤＮＡから酢酸耐性遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々のＤＮＡ断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例のおいても、Ｓａｕ３ＡＩを用いた。
【００４４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００４５】
次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００４６】
得られた組換えＤＮＡを用いて、通常は寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ１０２３株（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＮｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託）を形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。そこで生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで酢酸耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００４７】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、その内、塩基番号５４８〜１４１７からなる塩基配列はコーディング領域である。
【００４８】
配列番号１に示す塩基配列（図６、図７）もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列（図３：塩基番号５４８〜１４１７に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、アミノ酸配列レベルでシトクロームＣとの結合配列が存在し、クリィーベロミセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）のシトクロムＣ１遺伝子とアミノ酸レベルで３４．０％、根粒細菌メソリゾビウム・ロッティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ）のシトクロムＣ１遺伝子とアミノ酸レベルで３２．７％の相同性を示すことから、酢酸菌のシトクロムタンパク質をコードする遺伝子であることが推定された。しかし、いずれも相同性は極めて低いものであり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。なお、上記のシトクロムＣ１遺伝子が、酢酸耐性と関係していることは全く知られていない。
【００４９】
さらに、本発明のＤＮＡは、すでに取得されている酢酸菌の酢酸耐性遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）や酢酸耐性を増強する機能を有するＡＤＨ遺伝子などとも異なる新規な酢酸耐性を増強する機能を有する新規遺伝子であると同定された。
【００５０】
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
【００５１】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００５２】
本発明の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の酢酸耐性を増強する機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
【００５３】
このような酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００５４】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００５５】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号５４８〜１４１７からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００５６】
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌は、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属細菌である。
【００５７】
アセトバクター属細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＮｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。
【００５８】
また、グルコンアセトバクター属細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、現在特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託されているアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株やグルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｕｒｏｐａｅｕｓＤＳＭ６１６０）が例示される。
【００５９】
酢酸耐性の増強は、例えば酢酸耐性遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
【００６０】
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐性を増強することができる。
【００６１】
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００６２】
マルチコピーベクターとしては、大腸菌−酢酸菌シャトルベクター、例えばｐＵＦ１０６（例えば、非特許文献３参照）やｐＭＶ２４（例えば、非特許文献４参照）やｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献４参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、非特許文献５参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。大腸菌−酢酸菌シャトルベクターとしては、大腸菌と酢酸菌の双方において増幅し得るものであれば市販品を含めてすべてのものが適宜使用可能である。
【００６３】
組換えプラスミド（組換えＤＮＡ）の構築は、常法によればよく、例えば、構造遺伝子又はそれを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等常法にしたがって増幅し、一方、マルチコピーベクターも、常法にしたがってエシェリヒア・コリＪＭ１０９、同ＨＢ１０１等で増幅しておき、両者を常法にしたがって制限酵素によって切断し、Ｔ４リガーゼを用いて連結すればよく、このようにして、組換えプラスミド（組換えＤＮＡ）ｐＣＣＲを構築することができる。
【００６４】
例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）の酢酸耐性遺伝子の構造遺伝子又はそれを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等常法にしたがって増幅しておき、一方、シャトルベクターｐＵＦ１０６をエシェリヒア・コリＪＭ１０９で増幅し、適当な制限酵素で切断、混合し、Ｔ４リガーゼを用いて連結処理を行うことにより、組換えプラスミド（組換えＤＮＡ）ｐＣＣＲを構築することができる。
【００６５】
このようにして構築した組換えＤＮＡは、酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭＢＰ−２０８７）に導入して宿主を形質転換し、常法により形質転換体を得ることができる。
【００６６】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシウム法（例えば、非特許文献６参照）やエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献７参照）等によって行なうことができる。
【００６７】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００６８】
（３）食酢製造法
上記のようにして、酢酸耐性遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であって、アルコール酸化能を有するものをアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。
【００６９】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００７０】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
【００７１】
（４）本発明の実施態様
また、本発明に係るＯＲＦ又はそれを含有する酢酸耐性遺伝子は、その配列が明らかにされており（配列番号１：図６、図７）、また、遺伝子源としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株がＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託されているので、本発明に係る遺伝子のＤＮＡは容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、本発明に係るＯＲＦ又はそれを含有する酢酸耐性遺伝子を、酢酸菌で自律複製可能なベクターにのせかえ、これを酢酸菌に導入し、これを培養することにより酢酸含量の高い食酢を容易に製造することができる。
【００７２】
更にまた、上記したようにそしてまた後記する実施例からも明らかなように、酢酸耐性遺伝子源の寄託、ＰＣＲの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託その他が明らかにされており、いずれも入手ないし操作、処理が容易であるので、実施例にしたがって各操作、処理を行えば、目的とする酢酸耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより高濃度の酢酸を製造することができる。したがって、この点からしても、本発明の実施は容易である。
【００７３】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００７４】
【実施例】
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
【００７５】
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（６，０００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特許文献３に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００７６】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００７７】
（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）に形質転換した。
その後、形質転換されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地で、３０℃で４日間培養した。
【００７８】
そこで生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約１．７ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されたプラスミドが回収でき、このプラスミドをｐＳａｕ１０５と命名した。
さらに、２％酢酸を含むＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にするＤＮＡ断片は、ｐＳａｕ１０５にクローン化された約１．７ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片中の、約１．１ｋｂｐのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ断片であることが確認できた。
【００７９】
このようにして通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００８０】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００８１】
配列番号１記載の塩基配列（図６、図７）中には、塩基番号５４８から塩基番号１４１７にかけて、配列番号２に記載したような２９０個のアミノ酸（図３）をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。
【００８２】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
【００８３】
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記の様にしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）由来の酢酸耐性遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６（例えば、非特許文献３参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩ切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＣＣＲを作製した。ｐＣＣＲに挿入された増幅断片の概略を図１に示した。
【００８４】
ＰＣＲ法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図４）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図５）に示す）を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した
【００８５】
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃２分を１サイクルとして、３０サイクル行った。
【００８６】
このｐＣＣＲをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献７参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００８７】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００８８】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＣＣＲを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＵＦ１０６のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００８９】
具体的には、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地と、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地のそれぞれに、ｐＣＣＲを有する形質転換株とシャトルベクターｐＵＦ１０６を有する元株を接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００９０】
その結果、図２に示すように、酢酸を含有しない培地では形質転換株及び元株はほぼ同様の増殖が可能であったのに対し、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００９１】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、更に、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
【００９２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓａｕ３ＡＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＳａｕ１０５）の制限酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びｐＣＣＲへの挿入断片の概略図。
【図２】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図面。
【図３】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来酢酸耐性遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４】プライマー１を示す。
【図５】プライマー２を示す。
【図６】本酢酸耐性遺伝子の塩基配列（配列番号１）を示す。
【図７】同上続きを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene encoding a protein having a function of enhancing the acetic acid resistance derived from a microorganism, a microorganism having an amplified copy number thereof, in particular, an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter and Gluconacetobacter And a method for efficiently producing vinegar containing high concentrations of acetic acid using these microorganisms
[Prior art]
Acetic acid bacteria are microorganisms widely used for vinegar production, and particularly acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter are used for industrial acetic acid fermentation.
[0003]
In acetic acid fermentation, ethanol in the medium is oxidized by acetic acid bacteria and converted to acetic acid. As a result, acetic acid accumulates in the medium, but acetic acid is also inhibitory to acetic acid bacteria. As the concentration of acetic acid increases and the concentration of acetic acid in the medium increases, the growth ability and fermentation ability of acetic acid bacteria gradually decrease.
[0004]
Therefore, in acetic acid fermentation, it is required that growth ability and fermentation ability do not decrease even at higher acetic acid concentrations, that is, to develop acetic acid bacteria with strong acetic acid resistance. As one means, genes involved in acetic acid resistance are required. Attempts have been made to clone (acetic acid resistant gene) and to breed and improve acetic acid bacteria using the acetic acid resistant gene.
[0005]
As for the knowledge about the acetic acid resistance gene of acetic acid bacteria so far, a cluster is formed as a complementary gene that can restore acetic acid sensitivity by mutating the acetic acid resistance of acetic acid bacteria of Acetobacter genus. Three genes (aarA, aarB, aarC) have been cloned (see, for example, Non-Patent Document 1).
[0006]
Among them, the aarA gene is a gene encoding citrate synthase, and the aarC gene was estimated to be an enzyme encoding an enzyme related to acetic acid utilization, but the function of the aarB gene is unknown. (For example, refer nonpatent literature 2).
[0007]
A transformant obtained by cloning a gene fragment containing these three acetate resistance genes into a multicopy plasmid and transforming it into an Acetobacter acetic subspecies zylinum IFO3288 (Acetobacteraceti subsp. Xylinum IFO3288) strain is In addition, the improvement level of acetic acid resistance was only slight, and it was unclear as to whether or not there was an improvement in performance in actual acetic acid fermentation (see, for example, Patent Document 1).
[0008]
On the other hand, an example has been disclosed in which the final acetic acid concentration has been improved in acetic acid fermentation by introducing a gene encoding membrane-bound aldehyde dehydrogenase (ALDH) cloned from acetic acid bacteria into acetic acid bacteria. (For example, refer to Patent Document 2). However, since ALDH is an enzyme having a function of oxidizing aldehyde and not directly related to acetic acid resistance, it cannot be determined that the gene encoding ALDH is truly an acetic acid resistance gene.
[0009]
From such a situation, a novel acetic acid resistant gene encoding a protein having a function capable of improving acetic acid resistance at a practical level is obtained, and acetic acid bacteria having stronger acetic acid resistance are obtained using the obtained acetic acid resistant gene. It was hoped to breed.
[0010]
[Patent Document 1]
JP-A-3-21878
[Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 2-2364
[Patent Document 3]
JP-A-60-9489
[Patent Document 4]
JP 60-9488 A [0014]
[Non-Patent Document 1]
“Journal of Bacteriology, 172, p. 2096-2104, 1990”
[0015]
[Non-Patent Document 2]
“Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 76, p. 270-275, 1993”
[0016]
[Non-Patent Document 3]
“Cellulose”, 153-158, 1989.
[Non-Patent Document 4]
"Applied and Environmental Microbiology, 55, p. 171-176, 1989"
[0018]
[Non-Patent Document 5]
“Agricultural and Biological Chemistry, 52, p. 3125-3129, 1988”
[0019]
[Non-Patent Document 6]
“Agricultural and Biological Chemistry, vol. 49, p. 2091-2097, 1985”
[0020]
[Non-Patent Document 7]
"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 58, p. 974-975, 1994"
[0021]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, there has been no report on a case where acetic acid resistance of acetic acid bacteria has been elucidated at the gene level and a practical acetic acid bacteria having high acetic acid resistance has been successfully developed. However, if acetic acid bacteria with excellent acetic acid resistance are developed, acetic acid fermentation at a higher concentration is performed than before, and high-concentration acetic acid and high-concentration vinegar can be efficiently produced. Again, we decided to elucidate the improvement in acetic acid resistance of acetic acid bacteria at the gene level.
[0022]
And as a result of examining from various directions, the present inventors obtained a novel acetic acid resistant gene encoding a protein having a function capable of improving acetic acid resistance at a practical level, and using the obtained acetic acid resistant gene, In view of the importance of breeding acetic acid bacteria having strong acetic acid resistance, providing a new gene involved in acetic acid resistance derived from microorganisms belonging to acetic acid bacteria, and using the gene, acetic acid of microorganisms A novel method for improving resistance, particularly a method for improving acetic acid resistance of microorganisms belonging to acetic acid bacteria, and a method for efficiently producing vinegar with higher acetic acid concentration using acetic acid bacteria having improved acetic acid resistance. Newly set as a technical issue.
[0023]
[Means for Solving the Problems]
The inventors hypothesized that acetic acid bacteria that can grow and ferment in the presence of acetic acid have genes involved in specific acetic acid resistance that do not exist in other microorganisms. If used, it is possible to improve the acetic acid resistance of microorganisms more than before, and furthermore, it will be possible to develop an efficient production method of new vinegar that could not be obtained conventionally, containing high concentration of acetic acid. I got a new idea.
[0024]
As a conventional method for obtaining an acetic acid resistant gene, a method for cloning a gene that complements an acetic acid-sensitive mutant strain of acetic acid bacteria is generally used.
[0025]
However, it is difficult to find an industrially useful acetic acid resistant gene by such a method, and as a result of intensive studies, the present inventors have found that the acetic acid bacterial chromosome is a method for finding an acetic acid resistant gene from acetic acid bacteria. A DNA library is constructed, and the chromosomal DNA library is transformed into acetic acid bacteria. A gene that can grow only in the presence of about 1% acetic acid can be grown in the presence of 2% acetic acid. Developed a method to obtain by screening.
[0026]
By this method, we succeeded in cloning a novel acetic acid resistance gene having a function of improving acetic acid resistance at a practical level from glucoconacetobacter acetic acid bacteria actually used in vinegar production.
[0027]
As a result of homology search in the DDBJ / EMBL / Genbank and SWISS-PROT / PIR, the obtained acetic acid resistance gene has a binding sequence with heme C at the amino acid level, and Kleyveromyces marxianus Since it shows 34.0% homology with the cytochrome C1 gene at the amino acid level and 32.7% at the amino acid level with the cytochrome C1 gene of the nodule bacterium Mesohizobium loti, it encodes the cytochrome C1 protein of acetic acid bacteria. It was estimated to be a gene.
[0028]
However, the cytochrome C1 gene of the acetic acid bacterium obtained has a very low homology with the cytochrome C1 gene found in other microorganisms such as yeast, so that it is somewhat similar to other cytochrome C1 genes. It was found to be a novel gene encoding a novel cytochrome specific to acetic acid bacteria.
[0029]
In addition, in the transformed strain in which the gene was linked to a plasmid vector and transformed into acetic acid bacteria and the copy number was amplified, the acetic acid resistance was remarkably improved, and as a result, the transformed strain was transformed in the presence of ethanol. In the case of aeration culture, the growth induction period is shortened, the growth rate and the raw acid rate are improved, and the final concentration of acetic acid is significantly improved. The base sequence of the gene DNA coding for was successfully determined, and the present invention was completed.
[0030]
That is, the present invention includes the following embodiments.
(1) Protein CCR shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having
[0031]
(2) DNA of a gene encoding the protein CCR shown in (A) or (B) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having
[0032]
(3) DNA of the gene as described in said (2) which is DNA shown in following (A) or (B).
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 548 to 1417 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence consisting of base numbers 548 to 1417 or a base sequence that can be a probe prepared from a part thereof. And a DNA encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
[0033]
(4) A microorganism in which acetic acid resistance is enhanced by amplification of the intracellular copy number of the DNA according to (2) or (3).
(5) The microorganism according to (4) above, wherein the microorganism is an Acetobacter genus or an Acetobacter acetic acid bacterium.
[0034]
(6) A method for producing vinegar characterized by culturing a microorganism capable of oxidizing alcohol among the microorganisms described in (4) above in a medium containing alcohol to produce and accumulate acetic acid in the medium.
[0035]
(7) A recombinant plasmid pCCR containing the DNA according to (2) or (3) above.
[0036]
(8) A recombinant plasmid comprising a DNA fragment having at least the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing among the recombinant plasmid pCCR described in (7) above, for example, acetic acid bacteria-E. Coli shuttle Plasmid pCCR obtained by inserting these DNA fragments into a vector (multicopy vector) pUF106.
[0037]
(9) Recombinant plasmid pCCR described in (8) above was converted into Acetobacter acetici No. A transformant introduced into 1023 (FERM BP-2287).
[0038]
According to the present invention, resistance to acetic acid can be imparted to and enhanced against microorganisms. And in the microorganisms which have alcohol oxidizing ability, especially acetic acid bacteria, the tolerance with respect to acetic acid improves notably, and the capability to accumulate | store acetic acid of high concentration in a culture medium efficiently can be provided.
[0039]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0040]
(1) DNA of the present invention
The DNA of the present invention has a certain degree of homology with the cytochrome C1 of the genus Kluyveromyces and Mesorhizobium, and has the function of improving acetate resistance, and the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 It includes a base sequence capable of encoding a protein having a sequence, and includes a regulatory element of the base sequence and a structural portion of the gene. More specifically, the present invention relates to an acetic acid resistance gene, and the acetic acid resistance gene refers to a gene involved in acetic acid resistance. More specifically, at least (i) shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. DNA having a base sequence, or (ii) at least one selected from the base sequence of a gene contained therein and encoding a CCR protein.
[0041]
The DNA of the present invention can be obtained from the chromosomal DNA of Gluconacetobacter entaniii as follows.
[0042]
First, a chromosomal DNA library of Glucon Acetobacter enterii, for example, Acetobacter altoacetylenes MH-24 strain (deposited as FERM BP-491 at the Patent Organism Depositary) is prepared. Chromosomal DNA is obtained by a method disclosed in a conventional method (for example, Patent Document 3).
[0043]
Next, a chromosomal DNA library is prepared in order to isolate an acetic acid resistance gene from the obtained chromosomal DNA. First, chromosomal DNA is partially decomposed with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various DNA fragments. A wide variety of restriction enzymes can be used by adjusting the cleavage reaction time to adjust the degree of cleavage. For example, Sau3AI is digested by acting on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C. or higher, preferably 37 ° C., at an enzyme concentration of 1 to 10 units / ml for various times (1 minute to 2 hours). In the examples described later, Sau3AI was used.
[0044]
Next, the cleaved chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in acetic acid bacteria to produce recombinant DNA. Specifically, a restriction enzyme that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme Sau3AI used for the cleavage of chromosomal DNA, such as BamHI, is heated at a temperature of 30 ° C. and at an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml for 1 hour. As described above, the vector DNA is completely digested by acting on the vector DNA, and then cleaved and cleaved.
[0045]
Next, the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above and the cleaved vector DNA were mixed, and T4 DNA ligase was added to this at a temperature of 4 to 16 ° C. and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml for 1 hour or more. , Preferably 6-24 hours to obtain recombinant DNA.
[0046]
Using the resulting recombinant DNA, acetic acid bacteria that cannot normally grow on an agar medium in the presence of acetic acid at a concentration higher than 1%, for example, Acetobacter aceti No. 1023 A strain (deposited as FERMBP-2287 at the Patent Organism Depositary) is transformed, and then applied to agar medium containing 2% acetic acid and cultured. The resulting colonies are inoculated into a liquid medium and cultured, and a plasmid is recovered from the resulting cells to obtain a DNA fragment containing an acetic acid resistance gene.
[0047]
Specific examples of the DNA of the present invention include DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Among them, the base sequence consisting of base numbers 548 to 1417 is a coding region.
[0048]
The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 6 and 7) or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (FIG. 3: corresponding to nucleotide numbers 548 to 1417) is searched for homology in DDBJ / EMBL / Genbank and SWISS-PROT / PIR As a result, there was a binding sequence with cytochrome C at the amino acid sequence level, and 34.0% of the cytochrome C1 gene and amino acid level of Kluyveromyces marxianus, Mesohizobium loti (Mesohizobium loti). Since it showed 32.7% homology with the cytochrome C1 gene at the amino acid level, it was presumed to be a gene encoding cytochrome protein of acetic acid bacteria. However, the homology was extremely low in all cases, and it was obvious that these genes were novel different from these genes. It is not known at all that the above cytochrome C1 gene is related to acetic acid resistance.
[0049]
Furthermore, the DNA of the present invention has a function of enhancing a novel acetic acid resistance, which is different from the acetic acid resistance genes (aarA, aarB, aarC) of acetic acid bacteria already acquired and an ADH gene having a function of enhancing acetic acid resistance. Identified as a novel gene.
[0050]
Since the base sequence of the DNA of the present invention has been clarified, for example, a polymerase chain using, as a template, a genomic DNA of Acetobacter glucosacetobacter enterii as a template and using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a primer -It can also be obtained by reaction (PCR reaction) or by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a probe.
[0051]
Oligonucleotides can be synthesized according to a conventional method using, for example, various commercially available DNA synthesizers. The PCR reaction is performed using a thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems, TaqDNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the like. Can be carried out according to the standard method.
[0052]
The DNA encoding the protein having a function of enhancing the acetate resistance of the present invention has one or several amino acids deleted at one or a plurality of positions as long as the function of enhancing the acetate resistance of the encoded protein is not impaired. It may encode a protein with substitutions, insertions or additions.
[0053]
In such a DNA encoding a protein that is substantially the same as a protein having a function of enhancing acetate resistance, an amino acid at a specific site is deleted, substituted, inserted, or added, for example, by site-directed mutagenesis. Thus, it can also be obtained by modifying the base sequence. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
[0054]
In addition, it is generally known that the amino acid sequence of a protein and the base sequence that encodes it are slightly different between species, strains, mutants, and variants, so that DNA encoding substantially the same protein Can be obtained from all species of acetic acid bacteria, especially species, strains, mutants and variants of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter.
[0055]
Specifically, from Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid bacteria, or mutated Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid bacteria, natural mutants or variants thereof, for example, to SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing By isolating a DNA encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance by hybridizing under stringent conditions with a DNA having the base sequence consisting of base sequence numbers 548 to 1417 among the described base sequences In addition, DNA encoding a protein substantially identical to the protein can be obtained. The stringent condition referred to here is a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, DNAs with high homology, for example, DNAs having homology of 70% or more hybridize and DNA with lower homology than that. Examples include conditions that do not hybridize with each other, or normal hybridization washing conditions, such as conditions in which washing is performed at 60 ° C. with a salt concentration corresponding to 0.1% SDS with 1 × SSC.
[0056]
(2) Acetic acid bacterium according to the present invention The acetic acid bacterium according to the present invention refers to a bacterium belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter, and is an Acetobacter bacterium and a glucone Acetobacter bacterium having enhanced acetic acid resistance.
[0057]
Specific examples of the Acetobacter bacterium include Acetobacter aceti, and Acetobacter aceti no. 1023 (Acetobacteraceti No. 1023) strain (deposited as FERM BP-2287 at the Patent Organism Depositary) is exemplified.
[0058]
In addition, examples of the genus Gluconacetobacter include Gluconacetobacter entaniii, and Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes) currently deposited as FERM BP-491 in the Patent Biological Depositary Center. MH-24) strain and Gluconacetobacter europaeus DSM 6160 (Gluconacetobacter europaeus DSM 6160) are exemplified.
[0059]
Enhancement of acetate resistance is obtained by, for example, amplifying the intracellular copy number of an acetate resistance gene or ligating a DNA fragment containing the structural gene of the gene to a promoter sequence that functions efficiently in Acetobacter bacteria. The resulting recombinant DNA can be used to enhance by transforming Acetobacter bacteria.
[0060]
Further, the promoter sequence of the gene on the chromosomal DNA may be another promoter sequence that functions efficiently in bacteria of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter, such as the ampicillin resistance gene of plasmid pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.) of E. coli. Acetate resistance can also be enhanced by substituting promoter sequences derived from microorganisms other than acetic acid bacteria such as promoters of each gene such as the kanamycin resistance gene of plasmid pACYC177, the chloramphenicol resistance gene of plasmid pACYC184, and the β-galactosidase gene. Can do.
[0061]
Amplification of the intracellular copy number of the gene can be carried out by introducing a multicopy vector carrying the gene into a cell of an Acetobacter bacterium. That is, it can be carried out by introducing a plasmid, transposon or the like carrying the gene into a bacterial cell belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter.
[0062]
Examples of multi-copy vectors include E. coli-acetic acid shuttle vectors such as pUF106 (for example, see Non-patent Document 3), pMV24 (for example, see Non-Patent Document 4), pTA5001 (A), and pTA5001 (B) (for example, Patent Documents). 4), and pMVL1 (for example, see Non-Patent Document 5), which is a chromosome integration type vector. Examples of transposons include Mu and IS1452. Any Escherichia coli-acetic acid bacteria shuttle vector can be used as appropriate as long as it can be amplified in both E. coli and acetic acid bacteria.
[0063]
A recombinant plasmid (recombinant DNA) may be constructed by a conventional method. For example, a structural gene or a DNA fragment containing the same is amplified according to a conventional method such as a PCR method. Therefore, it is sufficient to amplify with Escherichia coli JM109, HB101, etc., cut both with a restriction enzyme according to a conventional method, and ligate using T4 ligase. Thus, a recombinant plasmid (recombinant DNA) is obtained. pCCR can be constructed.
[0064]
For example, a structural gene of an acetic acid resistance gene of Acetobacter altoacetylenes MH-24 (FERM BP-491) or a DNA fragment containing the gene is amplified according to a conventional method such as a PCR method, while the shuttle vector pUF106 is escherichia -Recombinant plasmid (recombinant DNA) pCCR can be constructed by amplifying with coli JM109, cleaving with an appropriate restriction enzyme, mixing, and performing ligation using T4 ligase.
[0065]
The recombinant DNA constructed in this way is acetic acid bacteria such as Acetobacter aceti no. It is introduced into strain 1023 (FERM BP-2087) and the host is transformed, and a transformant can be obtained by a conventional method.
[0066]
DNA can be introduced into an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter by the calcium chloride method (for example, see Non-Patent Document 6) or the electroporation method (for example, see Non-Patent Document 7). .
[0067]
In acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter having alcohol oxidizing ability, when the acetic acid resistance is enhanced as described above, the production amount and production efficiency of acetic acid can be increased.
[0068]
(3) Vinegar production method As described above, a bacterium belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter whose acetic acid resistance is selectively enhanced by amplifying the copy number of the acetic acid resistance gene, and having an ability to oxidize alcohol The vinegar can be efficiently produced by cultivating a medium having an alcohol in an alcohol-containing medium and accumulating and acetic acid in the medium.
[0069]
The acetic acid fermentation in the production method of the present invention may be performed in the same manner as the conventional vinegar production method by the fermentation method of acetic acid bacteria. The medium used for acetic acid fermentation contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, ethanol, and if necessary, if it contains an appropriate amount of nutrient source required for growth by the strain used, it can be a synthetic medium or a natural medium. But it ’s okay.
Examples of the carbon source include various carbohydrates including glucose and sucrose, and various organic acids. As the nitrogen source, natural nitrogen sources such as peptone and fermented bacterial cell decomposition products can be used.
[0070]
Cultivation is performed under aerobic conditions such as stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture, and the culture temperature is usually 30 ° C. The pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7, preferably in the range of 2.7 to 6.5, and can be prepared with various acids, various bases, buffers and the like. Usually, acetic acid at a high concentration accumulates in the medium by culturing for 1 to 21 days.
[0071]
(4) Embodiments of the Present Invention The sequence of the ORF according to the present invention or the acetic acid resistance gene containing the same has been clarified (SEQ ID NO: 1, FIG. 6 and FIG. 7). Since the Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain has been deposited as FERM BP-491, the DNA of the gene according to the present invention can be easily obtained. The implementation of the present invention is easy. Then, if desired, the ORF according to the present invention or an acetic acid resistant gene containing the ORF is replaced with a vector capable of autonomous replication in acetic acid bacteria, which is introduced into acetic acid bacteria and cultured for acetic acid. High-content vinegar can be easily produced.
[0072]
Furthermore, as described above and also from the examples described later, the deposition of acetate-resistant gene sources, the mode of PCR, the preparation of plasmid vectors, recombinant plasmids, the deposition of host bacteria, etc. have been clarified. Since each of them is easy to obtain, operate, and process, the target acetic acid resistant transformant can be obtained by performing each operation and process according to the Examples. By using this, a high concentration can be obtained. Acetic acid can be produced. Therefore, the present invention is easy to implement from this point.
[0073]
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
[0074]
【Example】
Example 1 Cloning of Acetic Acid Resistance Gene from Glucon Acetobacter enterii and Determination of Base Sequence and Amino Acid Sequence
(1) Preparation of chromosomal DNA library 6% acetic acid of Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), which is one strain of Gluconacetobacter entaniii Shaking culture was performed at 30 ° C. in YPG medium (3% glucose, 0.5% yeast extract, 0.2% polypeptone) supplemented with 4% ethanol. After culture, the culture solution was centrifuged (6,000 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells. Chromosomal DNA was prepared from the obtained cells by the method disclosed in Patent Document 3.
[0076]
The chromosomal DNA obtained as described above was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI (manufactured by Takara Bio Inc.), and the E. coli-acetic acid shuttle vector pUF106 was completely digested with the restriction enzyme BamHI and cleaved. An appropriate amount of these DNAs was mixed and ligated using a ligation kit (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2, manufactured by Takara Bio Inc.) to construct a chromosomal Acetobacter / Centani chromosomal DNA library.
[0077]
(2) Cloning of acetic acid resistance gene The chromosomal Acetobacter chromosomal DNA library obtained as described above is usually Acetobacter aceti No. No. 1 which can be grown on an agar medium only to an acetic acid concentration of about 1%. 1023 strain (FERM BP-2287) was transformed.
Thereafter, transformed Acetobacter aceti no. The strain 1023 was cultured on a YPG agar medium containing 2% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin at 30 ° C. for 4 days.
[0078]
The resulting colonies were inoculated and cultured in a YPG medium containing 100 μg / ml ampicillin, and the plasmid was recovered from the resulting cells. As a result, the approximately 1.7 kbp Sau3AI fragment shown in FIG. 1 was cloned. The plasmid could be recovered and this plasmid was named pSau105.
Furthermore, Acetobacter aceti No. 2 in YPG agar medium containing 2% acetic acid. It was confirmed that the DNA fragment enabling the growth of strain 1023 was an approximately 1.1 kbp SmaI-EcoRV fragment in the approximately 1.7 kbp Sau3AI fragment cloned into pSau105.
[0079]
In this way, Acetobacter aceti No. 1 which can usually grow on an agar medium only to an acetic acid concentration of about 1%. An acetic acid resistant gene fragment that enables the 1023 strain to grow even on an agar medium containing 2% acetic acid was obtained.
[0080]
(3) Determination of the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment The cloned Sau3AI fragment was determined by the Sanger dideoxy chain termination method, and as a result, the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 was determined. . Sequencing was performed for the entire region of both DNA strands, with all breakpoints overlapping.
[0081]
In the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 6 and 7), an open reading frame encoding 290 amino acids (FIG. 3) as described in SEQ ID NO: 2 from base number 548 to base number 1417 The presence of (ORF) was confirmed.
[0082]
(Example 2) Enhancement of acetic acid resistance in a transformed strain transformed with an acetic acid resistant gene derived from Gluconacetobacter enterii
(1) Transformation into Acetobacter aceti Acetic acid resistance gene derived from the Acetobacter altoacetylenes MH-24 strain (FERM BP-491) cloned as described above, Amplification was performed by PCR using KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.). An acetic acid bacterium-Escherichia coli shuttle vector pUF106 (see, for example, Non-patent Document 3) was cleaved with the restriction enzyme EcoRI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and a plasmid pCCR was prepared by inserting the amplified DNA fragment at that site. An outline of the amplified fragment inserted into pCCR is shown in FIG.
[0084]
The PCR method was performed as follows. That is, genomic DNA derived from the above-mentioned acetic acid bacteria was used as a template, primer 1 (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 4)) and primer 2 (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 5)) as primers. The PCR method was carried out under the following conditions:
That is, the PCR method was performed 30 cycles, with 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes as one cycle.
[0086]
This pCCR was designated as Acetobacter aceti no. The strain 1023 was transformed by electroporation (for example, see Non-Patent Document 7). Transformants were selected on YPG agar medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin and 2% acetic acid.
[0087]
About the ampicillin resistant transformant grown on the selective medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the plasmid carrying the acetate resistant gene was retained.
[0088]
(2) Acetic acid resistance of transformed strain About the ampicillin resistant transformed strain having the plasmid pCCR obtained as described above, the growth in YPG medium to which acetic acid was added was carried out using the original strain acetoacetate into which only the shuttle vector pUF106 was introduced. Bacter aceti no. Comparison with 1023 strain.
[0089]
Specifically, 100 ml of YPG medium containing 3% ethanol and 100 μg / ml ampicillin, and 100 ml YPG medium containing 3% ethanol, 3% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin, respectively, were transformed with pCCR. The strain and the original strain having the shuttle vector pUF106 were inoculated, cultured at 30 ° C. with shaking (150 rpm), and the growth of the transformed strain and the original strain in an acetic acid-added medium was measured by measuring the absorbance at 660 nm.
[0090]
As a result, as shown in FIG. 2, in the medium containing no acetic acid, the transformed strain and the original strain were able to grow in the same manner, whereas in the medium supplemented with 3% acetic acid and 3% ethanol, the trait was The transformed strain can grow, whereas the former strain Acetobacter aceti No. It was confirmed that the strain 1023 could not grow, and the acetic acid resistance enhancing function of the acetic acid resistance gene was confirmed.
[0091]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel gene involved in acetic acid resistance is provided, and further, a breeding strain capable of producing vinegar having a higher acetic acid concentration with high efficiency can be obtained using the gene. It has become possible to provide a method for producing vinegar having a higher acetic acid concentration with higher efficiency.
[0092]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a restriction map of a gene fragment (pSau105) derived from Gluconacetobacter enterii cloned using Sau3AI, the location of an acetate-resistant gene, and a schematic diagram of an insert fragment into pCCR.
FIG. 2 is a drawing showing the culture process of a transformant obtained by amplifying the copy number of an acetic acid resistance gene derived from Gluconacetobacter enterii.
FIG. 3 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the protein encoded by the acetic acid resistance gene derived from Gluconacetobacter enterii.
FIG. 4 shows primer 1.
FIG. 5 shows primer 2.
FIG. 6 shows the base sequence (SEQ ID NO: 1) of this acetic acid resistance gene.
FIG. 7 shows the continuation of the above.

Claims

Protein CCR shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having

DNA of a gene encoding the protein CCR shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A function comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and enhancing acetate resistance A protein having

The DNA of the gene according to claim 2, which is the DNA shown in (A) or (B) below.
(A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 548 to 1417 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence consisting of base numbers 548 to 1417 or a base sequence that can be a probe prepared from a part thereof. And a DNA encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.

A microorganism whose acetate resistance is enhanced by amplification of the intracellular copy number of the DNA of claim 2 or claim 3.

The microorganism according to claim 4, wherein the microorganism is an acetobacter genus or an acetic acid bacterium of the genus Glucon acetobacter.

6. A method for producing vinegar, comprising culturing a microorganism capable of oxidizing alcohol among the microorganisms according to claim 4 or 5 in a medium containing alcohol to produce and accumulate acetic acid in the medium. .

A recombinant plasmid pCCR comprising the DNA according to claim 2 or 3.