JP4304064B2 - 遺伝子修飾された環状ヌクレオチド作動性イオンチャンネル及びその使用方法 - Google Patents
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Description
(i)cAMPに関する類似の高い又はより高い感受性、
(ii)cAMPに関する類似の高い又はより高い感受性又は
(iii)cAMPに関する類似の高い又はより高い感受性及び付加的に高い又はより高い選択性
を有する別の遺伝子修飾されたCNGチャネルを製造でき、かつ使用できる。
(i)リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの、細胞内cAMP濃度を調節する膜局在のGタンパク質結合型受容体(GPCR)に対する作用を調査するため
(ii)アクチベーター及びインヒビターの、cAMPを合成又は加水分解するエフェクタータンパク質(酵素)に対する作用を調査するため
(iii)アクチベーター及びインヒビターの、同様に調節されてcAMP−シグナル伝達カスケードに連動する別のタンパク質に対する作用を調査するため、また
(iv)GPCR、エフェクタータンパク質又はcAMP−シグナル伝達カスケードに関連している別のタンパク質の特性を調査するために使用できる。
T537M−突然変異体を2.7μMのcAMPによって(図1C)、T537V−突然変異体を34μMのcAMPによって(図3C)、かつ野生型を80μMのcAMPによって(図1C、3C)半値活性化させる。野生型と比較して、T537M−突然変異体はcAMPに関して約30倍だけ、T537V−突然変異体はcAMPに関して約3倍だけ感受性である。T537S−突然変異体と比較してT537M−突然変異体はcAMPに関して約5倍だけ感受性であり、一方でT537V−突然変異体はcAMPに関してT537S−突然変異体よりも約2.5倍だけ感受性が低い。
遺伝的に活発化された(genetisch motivierter)CNGチャネルの部位特異的突然変異誘発による製造
ウシ由来のCNGチャネルのα3−サブユニットに関するcDNAを適当な制限エンドヌクレアーゼ(EcoRV及びNsiI)を用いてプラスミドpCHOLF102(Altenhofen W, Ludwig J, Eismann E, Kraus W, Boenigk W und Kaupp UB.(1991) Control of ligand specificity in cyclic nucleotide−gated channels from rod photoreceptors and olfactory epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9868−9872)から切り出し、pcDNAlamp(Invitrogen)中にクローニングした。このプラスミドをpcA−bolfと表す。このcDNA断片を次いでEcoRV及びXbaIを介してpcDNA3誘導体中にクローニングした。このプラスミドをpc3−bolfと表す。
5′−CGACGCATGGCGAACATCCGCAGTCT−3′
T537V−α3−サブユニットの製造のための突然変異誘発プライマーは以下の配列(SEQ ID NO8)を有していた:
5′−CGACGCGTCGCGAACATCCGCAGTCT−3′
まず前記の突然変異誘発プライマー及びリバースプライマー#1817(5′−TTGGCTGCAGCTATTATGGCTTCTCGGCAG−3′)(SEQ ID NO9)でのPCRをpc3−bolf上で実施した。100μlのPCR混合物は10ngの鋳型DNA、1.5mMのMgCl2を含むTaqポリメラーゼ用の1×PCRバッファー、200μMのdNTP、1UのTaqポリメラーゼ及びそれぞれ150ngの両者のプライマーを含有していた。PCR条件は以下の通りである:94℃での2分間の変性、引き続き94℃で45秒、46℃で45秒、72℃で45秒を25サイクル。
cDNAクローンの単離
CRFレセプターのクローニングのためにプライマー#843(5′−AGCGGGATCCACCATGGGACGGCGCCCGCA−3′)(SEQ ID NO11)及び#842(5′−GGCCTGGAGCTCACACTG−3′)(SEQ ID NO12)でのPCRをラット下垂体の第一鎖cDNA上で実施した。100μlのPCR混合物は10ngの第一鎖cDNA、1.5mMのMgCl2を含むTaqポリメラーゼ用の1×PCRバッファー、200μMのdNTP、1UのTaqポリメラーゼ及びそれぞれ150ngの両者のプライマーを含有していた。PCR条件は以下の通りである:94℃での2分間の変性、引き続き94℃で45秒、56℃で45秒、72℃で75秒を44サイクル。
HEK293細胞における異種発現及び安定な細胞株の製造
HEK293細胞における一過性発現をBaumann A, Frings S, Godde M, Seifert R及びKaupp UB.著(1994) Primary structure and functional expression of a Drosophila cyclic nucleotide−gated channel present in eyes and antennae.EMBO J., 13, 5040−5050に記載されるように実施した。電気生理学的特性決定のために、これらの細胞をトランスフェクションの翌日に、ポリ−L−リシンで被覆されているガラスプレート上に移した。電気生理学的調査を次いでその翌日に実施した。
電気生理学
遺伝子修飾されたCNGチャネル及び野生型のCNGチャネルをそれぞれHEK293細胞中で異種発現させた(Baumann A, Frings S, Godde M, Seifert R und Kaupp UB.(1994) Primary structure and functional expression of a Drosophila cyclic nucleotide−gated channel present in eyes and antennae.EMBO J., 13, 5040−5050)。遺伝子修飾されたCNGチャネルの電気生理学的特性決定を電圧クランプ条件下にパッチ−クランプ法で実施した。チャネルの活性化特性を測定し、かつ野生型のチャネルの特性と比較した(図1〜4):
遺伝子修飾されたCNGチャネル又は野生型のCNGチャネルを安定に発現する細胞からインサイドアウト−パッチを切り取った。この膜パッチを浴溶液(Badloesung)中の種々の濃度の環状ヌクレオチドで洗浄(umspuelt)した。このパッチ上に、0mVの保持電圧(保持電位)から出発して、−100mV〜+100mV間のいくつかの試験電圧に20mVのステップ幅で、電圧ジャンプ(Spannungsspruenge)を施した。電流を標準的方法で検知し、かつ分析した。
蛍光光学的測定
細胞内Ca2+濃度の蛍光測定を96個のウェルを有するマルチウェル中で実施した(図5A〜5G)。細胞を測定の1時間前にCa2+感受性蛍光色素Fluo−4で負荷した。負荷溶液は120mMのNaCl、3mMのKCl、50mMのグルコース、10mMのHepes(pH7.4)、3mMのMgCl2及び4μMのFluo4−AM(Molecular Probes)を含有していた。測定溶液は120mMのNaCl、3mMのKCl、50mMのグルコース、10mMのHepes(pH7.4)及び3mMのCaCl2を含有していた。アゴニスト、アンタゴニスト、酵素アクチベーター又は酵素インヒビターの添加後に蛍光強度の経時変化を蛍光リーダ(FLUOstar、BMG−Labtechnologies)で確認した。励起波長は485nmであった。発光波長は520nmであった。
Claims (33)
- SEQ ID NO2による野生型と比較して、cGMPに対するよりも、cAMPに対する高い感受性及び/又はcAMPに対する高い選択性を有するように、ウシ由来のα3−サブユニット中のトレオニンT537に相当する位置におけるアミノ酸がメチオニン又はバリンによって置換されているサブユニットからなる遺伝子修飾された環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル(CNGチャネル)。
- ウシ及び/又は別の生物由来のCNGチャネルのサブユニットを有することを特徴とする、請求項1記載の遺伝子修飾されたCNGチャネル。
- 同じサブユニットからなるホモオリゴマー構造又は種々のサブユニットからなるヘテロオリゴマー構造を有することを特徴とする、請求項1又は請求項2記載の遺伝子修飾されたCNGチャネル。
- 少なくとも1つの他の遺伝子修飾を有する、請求項1から3までのいずれか1項記載の遺伝子修飾されたCNGチャネル。
- キメラサブユニットを含有することを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項記載の遺伝子修飾されたCNGチャネル。
- サブユニットにおいて、ウシ由来のα3−サブユニット中のトレオニンT537に相当するアミノ酸をメチオニン又はバリンで置換することを特徴とする、CNGチャネルの製造方法。
- 細胞内cAMP濃度の測定のための、請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルの使用方法。
- リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの、Gタンパク質結合型レセプターに対する作用並びにアクチベーター及びインヒビターの、細胞内cAMP濃度を調節する別のタンパク質に対する作用の測定のための、請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルの使用方法。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルのサブユニットをコードすることを特徴とする、修飾された核酸。
- 請求項9記載の核酸を含有することを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネル、請求項9記載の修飾された核酸又は請求項10記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、細胞株。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルを発現できることを特徴とする、請求項11記載の細胞株。
- 細胞内cAMP濃度を調節するタンパク質を、請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルと一緒に異種共発現できることを特徴とする、請求項11又は12記載の細胞株。
- Gタンパク質結合型レセプター、ホスホジエステラーゼ、アデニル酸シクラーゼを、請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルと一緒に異種共発現できることを特徴とする、請求項11から13までのいずれか1項記載の細胞株。
- 請求項10記載の発現ベクターで形質転換させることを特徴とする、細胞株の製造方法。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載のCNGチャネルの遺伝子を発現ベクターにクローニングし、引き続き細胞株の形質転換を実施することを特徴とする、請求項15記載の製造方法。
- 真核生物のCHO細胞株、COS細胞株又はSF9細胞株を異種発現系として使用することを特徴とする、請求項15又は16記載の製造方法。
- ヒト胚腎臓(HEK)293細胞株を異種発現系として使用することを特徴とする、請求項15又は16記載の製造方法。
- 請求項10記載の発現ベクターで形質転換させることを含み、タンパク質を安定に又は一過性に発現させることを特徴とする、請求項11から14までのいずれか1項記載の細胞株の製造方法。
- 請求項10記載の発現ベクターで形質転換させることを含み、タンパク質の1つを安定に発現させ、かつ別のタンパク質を一過性に発現させることを特徴とする、請求項13又は14記載の細胞株の製造方法。
- 細胞内Ca2+濃度の測定のための、請求項11から14までのいずれか1項記載の細胞株の使用方法。
- 蛍光光学的方法による測定を実施することを特徴とする、請求項21記載の使用方法。
- 蛍光を発するCa2+指示薬を使用することを特徴とする、請求項21又は22記載の使用方法。
- 発光光学的方法による測定を実施することを特徴とする、請求項21記載の使用方法。
- 発光するアポエクオリン又はそのアイソフォームを使用すること特徴とする、請求項21又は24記載の使用方法。
- Ca2+濃度の測定をキュベット測定装置又はCa2+イメージング装置中で実施することを特徴とする、請求項21から25までのいずれか1項記載の使用方法。
- Ca2+濃度の測定を蛍光リーダもしくは発光リーダ中で実施することを特徴とする、請求項21から26までのいずれか1項記載の使用方法。
- マルチウェルプレートを使用することを特徴とする、請求項21から27までのいずれか1項記載の使用方法。
- 接着性細胞又は懸濁液中の細胞を使用することを特徴とする、請求項21から28までのいずれか1項記載の使用方法。
- 細胞内cAMP濃度を高める又は低下させる医薬品作用物質又は薬理物質の特性決定のための、請求項21から29までのいずれか1項記載の使用方法。
- GPCR、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は細胞内cAMP濃度を調節する別のタンパク質の特性決定のための、請求項21から29までのいずれか1項記載の使用方法。
- 高スループット(HTS)又は超高スループット(UHTS)で作業することを特徴とする、請求項30又は31記載の使用方法。
- 実時間内での測定を実施することを特徴とする、請求項21から32までのいずれか1項記載の使用方法。
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