JP4288884B2 - 1,2-dioxetane derivative, luminescent reagent, luminescent method and measuring method - Google Patents

Description

【０００９】
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ¹、Ｒ²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。また、Ｒ¹、Ｒ²は一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基を形成することもできる。Ｒ³はアルキル基又はアリール基であり、Ｒ³とＲ¹又はＲ²とが一体となってジオキセタン環とヘテロ原子を含む縮合環を形成してもよい。Ａｒは式（Ａ）
【００１０】
【化８】

【００１１】
（式中、Ｒ⁴はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ⁵Ｒ⁶Ｒ⁷）（ただし、Ｒ⁵、Ｒ⁶及びＲ⁷は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基又は−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ⁸（ただし、Ｒ⁸はアルキル基又はアリール基である。）で表される基である。Ｒ⁹及びＲ¹⁰は互いに独立に水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン原子であり、Ｘはハロゲン原子であり、Ｖは酸素原子又は硫黄原子である。）で表される基、又は式（Ｂ）
【００１２】
【化９】

【００１３】
（式中、Ｒ⁴は前記式（Ａ）のＲ⁴と同じである。Ｒ¹¹及びＲ¹²は互いに独立に水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン原子であり、Ｙはハロゲン原子であり、Ｗは酸素原子又は硫黄原子である。）で表される基である。）である。
【００１４】
また本発明は、上述の１，２−ジオキセタン誘導体を含有してなることを特徴とする化学発光試薬である。さらに本発明は、上述の１，２−ジオキセタン誘導体を分解し化学発光を生じさせることを特徴とする、発光方法である。更に本発明は、上述の発光方法を用いて、試料中の検出物質を測定することを特徴とする測定方法である。更に本発明は、１，２−ジオキセタン構造を有する化合物を、プロトン性溶媒中で他のエンハンサーの非共存下に発光させることを特徴とする発光方法である。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１５】
本明細書中で「アルキル基」とは、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０個の直鎖状、分枝鎖状または環状のアルキル基をいい、そのアルキル基は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルの直鎖の基及び前記のアルキル基が適宜分枝状に結合した基、またはそれらが環状となった基をいう。前記の有していてもよい置換基とは、例えば、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリール基等である。そのアルコキシル基としては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基等の炭素数１〜２０個のアルコキシル基が直鎖状又は分枝状に１〜５個結合したもの等を挙げることができる。また前記アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等の炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素基、及び、フリル、チエニル、ピリジル基等の環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。
【００１６】
また、本明細書中で「アルコキシル基」とは、前記したアルキル基に置換してもよいアルコキシル基と同じものを挙げることができ、「アリール基」とは、これも前記したアルキル基に置換してもよいアリール基と同じものを挙げることができる。さらに、本願明細書中で「多環式有機環基」とは、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルコキシ、ハロゲン及びハロ−Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキルの中から独立して選択した１〜１０個の基で任意に置換された炭素原子数６〜３０の多環式アルキレンであり、例えばアダマンチル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル等である。また、その多環式有機環基の任意の炭素にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、シアノ基、アミド基、アルコキシ基あるいはカルボキシル基が結合していても構わない。「アラルキルオキシ基」とは、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ基等の炭素数７〜２０の基であり、「ハロゲン原子」とはフッ素、塩素、臭素等である。
【００１７】
また一般式（Ｉ）において、Ｒ³とＲ¹またはＲ²とが一体となってジオキセタン環とヘテロ原子を含む縮合環を形成する場合としては、例えばジオキセタン環とフラン環との縮合環、またはジオキセタン環とピラン環との縮合環を例示することができる。
【００１８】
本発明においては、上記一般式（Ｉ）においてＡｒが式（ａ）
【００１９】
【化１０】

【００２０】
（式中、Ｒ⁴、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｘ及びＶは前記式（Ａ）のＲ⁴、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｘ及びＶと同じである。）で表される基、または式（ｂ）
【００２１】
【化１１】

【００２２】
（式中、Ｒ⁴、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｙ及びＷは前記式（Ｂ）のＲ⁴、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｙ及びＷと同じである。）で表される基であるものが好ましい。
【００２３】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ³とＲ¹又はＲ²とが一体となってジオキセタン環とフラン環の縮合環を形成している場合が好ましく、より好ましくは、Ｒ³と縮合環を形成していないＲ²又はＲ¹が炭素数３〜４のアルキル基である。中でも、一般式（Ｉ’）
【００２４】
【化１２】

【００２５】
（式中、Ｒ⁴は前記と同様）で表される化合物は、特に好ましいものである。
【００２６】
本発明の前記一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体は、一般式（ＩＩ）
【００２７】
【化１３】

【００２８】
（式中、Ｒ¹〜Ｒ³は一般式（Ｉ）のＲ¹〜Ｒ³と同じであり、Ｒ⁴¹はアルコキシル基又はアラルキルオキシ基である。また、（Ｒ⁴¹）Ａｒは、式（Ａ'）
【００２９】
【化１４】

【００３０】
（式中、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｘ及びＶは前記式（Ａ）のＲ⁹、Ｒ¹⁰、Ｘ及びＶと同じであり、Ｒ⁴¹は前記一般式（ＩＩ）のＲ⁴¹と同じである。）で表される基又は式（Ｂ'）
【００３１】
【化１５】

【００３２】
（式中、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｙ及びＷは前記式（Ｂ）のＲ¹¹、Ｒ¹²、Ｙ及びＷと同じであり、Ｒ⁴¹は前記一般式（ＩＩ）のＲ⁴¹と同じである。））で表されるＲ⁴¹で置換されたアリール基を有するエノールエーテル誘導体から下記反応式に従って製造することができる。
【００３３】
【化１６】

【００３４】
（式中、Ｒ¹〜Ｒ³及びＲ⁴¹は前記一般式（Ｉ）（ＩＩ）のＲ¹〜Ｒ³及びＲ⁴¹と同じである。Ｒ⁴²は−ＯＳｉ（Ｒ⁵Ｒ⁶Ｒ⁷）（ただし、Ｒ⁵、Ｒ⁶及びＲ⁷は前記と同じである。）で表される基又は式
【００３５】
【化１７】

【００３６】
（式中、Ｒ¹³及びＲ¹⁴はアルカリ金属、四級アンモニウム塩又はアルキル基であり、Ｒ¹³及びＲ¹⁴が一体となり環を形成してもよい基である。）で表される基である。一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の（ＨＯ）Ａｒで表される基は、一般式（ＩＩ）の置換基Ｒ⁴¹の位置と同じ位置にＯＨ基を有するものであり、一般式（ＩＶ）の（Ｒ⁴²）Ａｒは、一般式（ＩＩ）の置換基Ｒ⁴¹の位置と同じ位置に置換基Ｒ⁴²を有するものである。）
（第１工程）本工程は、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物の脱保護反応を行い一般式（ＩＩＩ）で表される化合物を製造するものである。脱保護反応に供する化合物としては、前記一般式（ＩＩ）（ここでＲ¹〜Ｒ³は前記と同じであり、Ｒ⁴¹はヒドロキシル基の保護基（好ましくは、メトキシ基又はベンジルオキシ基である。）である。）で表される化合物で、本反応は当業者に熟知された方法、即ちアルキルチオールのアニオンを反応させ行うかあるいは水素添加反応に付すことにより行うことができるが、どちらの反応を選択するかは脱保護すべき基により適宜選択すればよい。
【００３７】
（第２工程）本工程は、前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物に、シリルオキシ基あるいはリン酸基形成のため対応するハロゲン化トリアルキルシランあるいはハロゲン化ホスフェートを反応させ、一般式（ＩＶ）で表される化合物を製造するものである。本工程において、例えばリン酸基導入のためクロロエチレンホスフェートを反応させた場合には、シアン化ナトリウムでシアノエチルホスフェートのナトリウム塩に変換し、さらにシアノエチル基を脱離し、アンモニウムナトリウム塩に変換することができる。このアンモニウム ナトリウム塩は、例えば炭酸水素ナトリウムと反応させることにより容易にジナトリウム塩に変換できる。
【００３８】
（第３工程）本工程は一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される化合物を一重項酸素と反応させ、前記一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を製造するものである。一重項酸素との反応は、前記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表されるエノールエーテル誘導体を、メチレンブルー、ローズベンガル、テトラフェニルポルフィン（ＴＰＰ）等の光増感剤の共存下、酸素雰囲気の下で可視光照射を行うことにより達成される。このとき、溶媒はジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素又はメタノール、エタノール等のアルコール等を用いることができる。なお、反応は−８０℃〜室温で行うことが好ましい。
【００３９】
前記一般式（ＩＩ）で表されるエノールエーテル誘導体の製造方法は、例えば、下記の方法を挙げることができる。
【００４０】
【化１８】

【００４１】
（式中、Ｒ¹〜Ｒ³及びＲ⁴¹は前記一般式（Ｉ）（ＩＩ）のＲ¹〜Ｒ³及びＲ⁴¹と同じである。Ｒ¹⁵及びＲ¹⁶はアルキル基あるいはＲ¹⁵及びＲ¹⁶が一体となり環を形成してもよい基である。）
（第１Ａ工程）本工程は、一般式（１Ａ）で表される芳香族カルボン酸エステルと一般式（２Ａ）で表されるケトンとを反応させ、一般式（ＩＩ）で表されるエノールエーテル誘導体を製造するものである。反応はチタンの存在下に行うことを必須の要件とするものである。通常、チタンは塩化チタン等のハロゲン化チタンを水素化リチウムアルミニウム等の還元剤及びトリエチルアミン等の塩基を用いて還元状態を形成させ、反応に供することが好ましい。反応を行うにあたってはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の有機エーテル中で行うことができる。反応は０〜１００℃で進行するが、ＴＨＦの還流下に行うことが操作及び反応性の観点から好ましい。
【００４２】
（第１Ｂ工程）本工程は一般式（１Ｂ）で表されるアリールメチルホスホネートと前記一般式（２Ｂ）で表されるケトンとを反応させ前記一般式（ＩＩ）で表されるエノールエーテル誘導体を製造するものである。
【００４３】
前記一般式（１Ｂ）で表されるアリールメチルホスホネートは前記特公平５−４５５９０号に記載の方法に従い容易に製造することができる化合物である。ジイソプロピルアミンをブチルリチウム等を用いてリチウムアミドを形成させ、反応に供することが好ましい。反応を行うにあたってはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の有機エーテル中で行うことができる。反応は−７８℃〜室温で行うことが好ましい。
【００４４】
前記一般式（ＩＩ）で表される化合物がジヒドロフラン誘導体の場合の製造方法は、例えば、下記の方法を挙げることができる。
【００４５】
【化１９】

【００４６】
（式中、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²⁰、及びＲ²¹はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。またＲ¹⁸とＲ¹⁹、Ｒ²⁰とＲ²¹、Ｒ¹⁷とＲ¹⁹、Ｒ¹⁷とＲ²⁰、及びＲ¹⁸とＲ²⁰は一体となり、それぞれ独立に環状アルキル基を形成することができる。Ｒ⁴¹は前記と同じである。Ｒ²²はハロゲン原子、置換スルホニルオキシ基又はヒドロキシル基である。）。
【００４７】
（第１Ｃ工程）本工程は、前記一般式（１Ｃ）で表される化合物を前記一般式（２Ｃ）で表される化合物と反応させることによって前記一般式（３Ｃ）で表される化合物を製造するものである。反応は当業者に熟知された、いわゆる、ウィリアムソン合成により達成することができる。ここで、一般式（１Ｃ）で表される化合物の置換基Ｒ²²がハロゲン原子又は置換スルホニルオキシ基である場合は直接反応に付し、Ｒ²²がヒドロキシル基である場合には、一旦反応系中でハロゲン化トシル等によりスルホニルオキシ基に変換してから反応に付すことで本工程を達成することができる。
【００４８】
（第２Ｃ工程）本工程は、前記一般式（３Ｃ）で表される化合物を酸化することによって、前記一般式（４Ｃ）で表される化合物を製造するものである。本工程における酸化は、クロム系酸化剤又は活性化剤を用いることにより行うことができる。前記クロム系酸化剤としてはピリジニウムクロロクロメート（ＰＣＣ）、ピリジニウムジクロロクロメート（ＰＤＣ）等を用いることができ、この時、溶媒はジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素を用いることができる。また、前記活性化剤を用いる場合は、Ｐｙ・ＳＯ₃／トリエチルアミン／ＤＭＳＯ、Ａｃ₂Ｏ／ＤＭＳＯ系等のような溶媒との組み合わせで反応を行うことができる。
【００４９】
（第３Ｃ工程）本工程は、前記一般式（４Ｃ）で表される化合物を閉環させ、前記一般式（５Ｃ）で表される化合物を製造するものである。反応はリチウムジイソプロピルアミド等の２級アミンのリチウム塩又はｔ−ブトキシカリウム等の塩基を用いて行うものである。溶媒としては、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ等の有機溶媒を用いることができ、０℃〜室温で、１〜５時間反応を行うことが好ましい。
【００５０】
（第４Ｃ工程）本工程は、前記一般式（５Ｃ）で表される化合物を臭素化し、前記一般式（６Ｃ）で表される化合物を製造するものである。反応は、Ｎ−ブロモスクシンイミド等の臭素化剤を用いることにより達成される。溶媒としては、含水ＴＨＦ、ジオキサン、ＤＭＦ等の有機溶媒を用いて行うことができる。
【００５１】
（第５Ｃ工程）本工程は、前記一般式（６Ｃ）で表される化合物を脱水することによって、前記一般式（７Ｃ）で表される化合物を製造するものである。反応はピリジン等の塩基の存在下、塩化チオニルを作用させるか又はリン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の酸を触媒として用いることができる。溶媒としては、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素又はトルエン等の芳香族炭化水素を用いることができ、作用させる試薬によって、適宜選択することができる。
【００５２】
（第６Ｃ工程）本工程は前記一般式（７Ｃ）で表される化合物から前記一般式（ＩＩ’）で表される化合物を製造するものである。反応は前記一般式（７Ｃ）で表される化合物の臭素を置換することにより目的の置換基を導入した前記一般式（ＩＩ’）で表される化合物を製造するものである。置換アミノ基を導入するには、ブチルリチウム等のリチウム塩を用い、カルボキシル基を導入し、次いでカルボニルイミダゾールを縮合剤として用い、アミン又はアンモニアと反応させることによって行うことができる。さらに、上記反応によって製造されたアミドから、例えば、オキサゾリン環を有する化合物とするには、置換又は無置換のエタノールアミンを作用させることにより行うことができる。また、アシル基を導入するには、前記と同様にブチルリチウム等のリチウム塩を用い、Ｎ−メチルホルムアニリドと反応させるか又はアセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアルデヒドと反応させた後、二酸化マンガン等の酸化剤により、ヒドロキシルβ基を酸化させることによって達成される。ここで、アシル基を導入した化合物は、アシル基をヒドロキシイミノ基に変換し、そのジアニオンと相当するアミドまたはエステルを反応させ、脱水を経てイソオキサゾール環を形成できる。別の方法としては、アシル基を導入した化合物をβ−ジケトンタイプの置換基に変換し、そこにヒドロキシアミンを反応させイソオキサゾール環を形成できる。
【００５３】
前記一般式（ＩＩ）で表される化合物がジヒドロピラン誘導体の場合の製造方法は、例えば、下記の方法を挙げることができる。
【００５４】
【化２０】

【００５５】
（式中、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁸及びＲ²⁹はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。またＲ²⁴とＲ²⁵、Ｒ²⁶とＲ²⁷、Ｒ²⁸とＲ²⁹、Ｒ²³とＲ²⁴、Ｒ²³とＲ²⁶、Ｒ²³とＲ²⁸、Ｒ²⁴とＲ²⁶、Ｒ²⁴とＲ²⁸、及びＲ²⁶とＲ²⁸は一体となり、それぞれ独立に環状アルキル基を形成することができる。Ｒ⁴¹及びＲ²²は前記と同じである。）。
【００５６】
（第１Ｄ工程、第２Ｄ工程、第３Ｄ工程、第４Ｄ工程、第５Ｄ工程及び第６Ｄ工程）これらの工程によって前記一般式（７Ｄ）で表される化合物を製造する方法は、前記第１Ｃ工程、第２Ｃ工程、第３Ｃ工程、第４Ｃ工程、第５Ｃ工程及び第６Ｃ工程と同様にして達成することができる。
【００５７】
本発明の一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体は、アルカリ性条件下で化学発光を伴ってカルボニル化合物に分解するほか、アリールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等のエステラーゼ（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）、アルカリ性フォスファターゼ等の酵素、テトラブチルアンモニウムフルオライド等のフッ素化合物、酸性又はアミン化合物によって、化学発光を伴って分解する。
【００５８】
従って、一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体は化学発光試薬となる。この化学発光を伴う１，２−ジオキセタン誘導体の分解は、他のエンハンサーの共存下に行ってもよく、また他のエンハンサーの非共存下に行ってもよい。一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体は、化学発光を伴う分解がプロトン性溶媒中で行われても、かつ他のエンハンサーの非共存下で行われても高い発光量子収率を示すことが特徴の１つである。発光量子収率としては１％以上が好ましく、更に好ましくは１０％以上、とりわけ２０％以上のものが好ましい。
【００５９】
また本発明の化学発光試薬は、試料中の検出物質の濃度を求めることを目的とするあらゆる測定法に利用でき、例えば免疫測定法における免疫測定試薬として利用することができるほか、酵素検定法；化学検定法；ヌクレオチドプローブ法等にも用いることができる。
【００６０】
上記免疫測定法における検出物質としては、例えば、ｈＣＧ、ＴＳＨ、ＬＨ等のホルモン、ＡＦＰ、ＣＥＡ等の癌関連物質、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ等のウイルス抗原並びにその抗体及び核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）等を挙げることができる。
【００６１】
上記免疫測定法としては、例えば、上記のような検出物質に対する特異的結合性を有する物質に上記酵素をあらかじめ結合させておき、これと検出物質を含む試料を混合し、一定時間反応させて、試料中の検出物質とそれに結合性を有する物質とを結合させる工程、及び、結合したか又は結合しなかった結合性を有する物質の量を求める工程より行うことができる。前記結合したか又は結合しなかった結合性を有する物質の量を求める工程は、酵素と本発明の１，２−ジオキセタン誘導体とを反応させ、酵素量に比例して１，２−ジオキセタン誘導体からの発光強度が増大するので、この発光強度を測定することによって該物質の濃度を求めることができる。
【００６２】
本発明の１，２−ジオキセタン誘導体を含有する免疫測定試薬及びそれを用いた前記のような免疫測定も本発明の一つである。
【００６３】
本発明の一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体は、量子収率の高い安定な発光効率を示すことができ、かつ熱的安定性が高く、冷蔵保存によっては１年後に分解産物が全く見られない程安定な化合物である。よって、発光の測定を簡便に効率良く行うことができ、例えば、臨床検査の分野等で有用である。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例及び参考例により本発明を詳細に説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００６５】
（参考例１）
【００６６】
【化２１】

【００６７】
窒素雰囲気下、０℃で６０％水素化ナトリウム２．１２ｇ（５３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ８０ｍＬに懸濁した溶液にＤＭＦ１５ｍＬに溶解した２，２，４，４−テトラメチル−１，３−ペンタンジオール（化合物〔２〕）７．０５ｇ（４４．１ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下し、さらに３０分間撹拌した。この溶液に、ＤＭＦ１５ｍＬに溶解した３−メトキシベンジルクロライド（化合物〔１〕）９．０７ｇ（５７．９ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した後１２時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液に投じ酢酸エチルで抽出した。抽出層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウム乾燥後濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの１０：１混合溶媒で流しだしたところ１−（３−メトキシベンジルオキシ）−２，２，４，４−テトラメチル−３−ペンタノール（化合物〔３〕）を１０．７ｇ、収率８６．７％で無色油状物として得た。
【００６８】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０３（ｓ，９Ｈ），１．０４（ｓ，３Ｈ），１．０７（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４３（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ），６．８１−６．９１（ｍ，３Ｈ），７．２３−７．２８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ
ＩＲ（ｌｉｑｕｉｄ ｆｉｌｍ）；３５０２，２９５４，２８７０，１４８９，１４５７，１２６７，１０８０，１０５３ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；２８０（Ｍ⁺，２），１３５（３１），１２１（１００），１０７（８），９１（９），６９（１３），５５（１４）。
【００６９】
（参考例２）
【００７０】
【化２２】

【００７１】
窒素雰囲気下、室温でセライト９．９ｇおよび１−（３−メトキシベンジルオキシ）−２，２，４，４−テトラメチル−３−ペンタノール（化合物〔３〕）４．６１ｇ（１６．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン７５ｍＬに加え撹拌した。この溶液にＰＣＣ４．２６ｇ（１９．７ｍｍｏｌ）を加え７時間撹拌した後、ＰＣＣ８００ｍｇ（３．７１ｍｍｏｌ）をさらに加え一晩撹拌した。反応混合物にエーテルを加えセライト濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルカラムにかけヘキサンと酢酸エチルの１０：１の混合溶媒で流しだしたところ、１−（３−メトキシベンジルオキシ）−２，２，４，４−テトラメチル−３−ペンタノン（化合物〔４〕）を４．３２ｇ、収率９４．４％で無色油状物として得た。
【００７２】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．２３（ｓ，９Ｈ），１．２８（ｓ，６Ｈ），３．５０（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），４．４７（ｓ，２Ｈ），６．７８−６．８８（ｍ，３Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
ＩＲ（ｌｉｑｕｉｄ ｆｉｌｍ）；２９５９，２８７０，１６５８，１４８０，１４６６，１４５８，１２６７，１１０８，１０４９ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；２７８（Ｍ⁺，１００），２２２（５０），１２１（３１），９７（５），５５（８）。
【００７３】
（参考例３）
【００７４】
【化２３】

【００７５】
窒素雰囲気下、室温で無水ＴＨＦ１５ｍＬにジイソプロピルアミン１．５０ｍＬ（１１．４ｍｍｏｌ）および１．６Ｍブチルリチウムヘキサン溶液６．６０ｍＬ（１０．６ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。この溶液に−７８℃で、ＴＨＦ１０ｍＬに溶解した１−（３−メトキシベンジルオキシ）−２，２，４，４−テトラメチル−３−ペンタノン（化合物〔４〕）１．４８ｇ（５．３２ｍｍｏｌ）を加え２時間撹拌した。反応溶液を徐々に室温に昇温しながら３時間２０分間撹拌した。反応混合物を飽和食塩水に投じ酢酸エチルで抽出した。抽出層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウム乾燥後濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの１：２混合溶媒で流しだしたところ３−ｔ−ブチル−３−ヒドロキシ−２−（３−メトキシフェニル）−４，４−ジメチル−２，３，４，５−テトラヒドロフラン（化合物〔５〕）が１．３０ｇ、収率８７．８％で得られた。
融点；８３．０−８３．５℃（無色粒状晶、ヘキサンと酢酸エチルより再結晶）。
【００７６】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ０．９０（ｂｒｏａｄ ｓ，９Ｈ），１．１９（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），１．９２（ｓ，１Ｈ），３．８０（ｑ_AB，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），５．００（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝７．８ ａｎｄ ２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
ＩＲ（ｌｉｑｕｉｄ ｆｉｌｍ）；３４９３，２９６２，２８８１，１５９１，１４８１，１２７８，１０７０，１０４８ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；２７８（Ｍ⁺，１），２６０（２９），２４５（１００），２０３（１２），１８９（４５），１３５（５２），１２１（１０），１０７（１１），７７（９），５５（３３）。
【００７７】
（参考例４）
【００７８】
【化２４】

【００７９】
３−ｔ−ブチル−３−ヒドロキシ−２−（３−メトキシフェニル）−４，４−ジメチル−２，３，４，５−テトラヒドロフラン（化合物〔５〕）２．１６ｇ（７．７７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２０ｍＬとＨ₂Ｏ２ｍＬの混合溶媒に加え０℃で撹拌した。この溶液にＮＢＳ１．５４ｇ（８．６５ｍｍｏｌ）を加え徐々に室温にしながら一晩撹拌した後、さらにＮＢＳ１４０ｍｇ（０．７８７ｍｍｏｌ）を加え６時間撹拌した。反応混合物を飽和食塩水に投じ酢酸エチルで抽出した。抽出層をチオ硫酸ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウム乾燥後濃縮した。濃縮物を酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒より結晶化したところ、２−（４−ブロモ−３−メトキシフェニル）−３−ｔ−ブチル−３−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−２，３，４，５−テトラヒドロフラン（化合物〔６〕）が１．３２３ｇ、収率４７．７％で得られた。
【００８０】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ０．８９（ｓ，９Ｈ），１．２０（ｓ，３Ｈ），１．３８（ｓ，３Ｈ），１．９２（ｓ，１Ｈ），３．８０（ｑ_AB，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），４．９８（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝８．１ ａｎｄ ２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３５８（Ｍ⁺＋２，２．４），３５６（Ｍ⁺，２．５），３４０（１９），３３８（２０），３２５（７９），３２３（８４），２１５（７３），２１３（６７），２０１（１８），１９９（１９），１０９（１０），５５（１００）。
【００８１】
（参考例５）
【００８２】
【化２５】

【００８３】
室温、窒素雰囲気下で無水トルエン３０ｍＬに、４−ｔ−ブチル−５−（４−ブロモ−３−メトキシフェニル）−４−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−２，３，４，５−テトラヒドロフラン（化合物〔６〕）４．６８ｇ（１３ｍｍｏｌ）を加え、１０分撹拌した。この反応溶液にｐ−トルエンスルホン酸１水和物０．２７ｇ（１．４ｍｍｏｌ、０．１当量）を加え、１２０℃にして３０分撹拌した。反応溶液を室温まで戻し、これを酢酸エチルと飽和食塩水の混合溶液に投じ、抽出を行った。得られた有機層を飽和食塩水にて洗浄した。この有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥し、濃縮した。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの２：１混合溶媒にて流しだしたところ４−ｔ−ブチル−５−（４−ブロモ−３−メトキシフェニル）−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔７〕）を３．７８ｇ（１１．２ｍｍｏｌ）、収率８５％で無色油状物として得た。
【００８４】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０６（ｓ，９Ｈ），１．３３（ｓ，６Ｈ），３．８７（ｓ，２Ｈ），３．９（ｓ，３Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝７．９ ａｎｄ １．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
ＩＲ（ｌｉｑｕｉｄ ｆｉｌｍ）；２９５７，２８６６，１７３９，１６５０，１５７０，１４８０，１３９２，１２３７，１０４９，１０２５，７９５ｃｍ^-1Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３４０（Ｍ⁺＋２，２６），３３８（Ｍ⁺，２６），３２５（９７），３２３（１００），２８３（６），２８２（３），２８１（４），１８７（７），１８５（５），１７２（４），１７０（３），７７（７），５５（６７）。
【００８５】
（参考例６）
【００８６】
【化２６】

【００８７】
窒素雰囲気下、室温において、４−ｔ−ブチル−５−（４−ブロモ−３−メトキシフェニル）−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔７〕）５．０５ｇ（１４．８８ｍｍｏｌ）を溶かしたＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、−７８℃にて１．６３Ｍブチルリチウムヘキサン溶液（１０．５ｍＬ，１７．１ｍｍｏｌ）を加え、１５分撹拌した後、ヘキサンに溶解したアセトアルデヒド（１４．０ｍＬ，４５．１ｍｍｏｌ）を加え、３０分撹拌した。その反応溶液に少量のＨ₂０を滴下して反応を停止し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）で再度抽出を行い、先の有機層と合わせ、飽和食塩水（２００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残留物を淡黄色油状物（４．９３ｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの４：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の４−ｔ−ブチル−５−〔４−（１−ヒドロキシエチル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔８〕）を無色固体（３．７３ｇ，１２．２５ｍｍｏｌ，８２．３％）として得た。
【００８８】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０６（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，６Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８７（ｓ，２Ｈ），５．０８（ｐｅｎｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｓ，ｌＨ），６．９０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ２２．９，２７．４，３２．４，３２．５，４７．１，６６．３，８３．０，１１１．９，１２２．５，１２５．５，１２５．６，１３３．３，１３６．２，１４９．８，１５６．０ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；３４９１，２９６２，２８７０，１６５１，１６０４，１４６１，１４０２，１２２９，１１２９，１０８８，８５９ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３０４（Ｍ⁺，５），３０３（９），２８７（１９），２７１（１００），１７７（１４），１６１（６９），１４９（１０），１３５（１１），１１１（２３），５５（８８）。
【００８９】
（参考例７）
【００９０】
【化２７】

【００９１】
窒素雰囲気下、室温において、４−ｔ−ブチル−５−〔４−（１−ヒドロキシエチル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔８〕）（１．０２ｇ，３．３５１ｍｍｏｌ）を溶解させたＤＭＳＯ（１０ｍＬ）とＴＨＦ（５ｍＬ）の溶液に、トリエチルアミン（１．６５ｍＬ，１１．８ｍｍｏｌ）、ピリジン三酸化硫黄錯体（１．６０ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を加えて一時間撹拌した。その反応溶液を飽和食塩水（５０ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で再度抽出を行い先の有機層と合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残留物を淡黄色油状物（１．０２ｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの４：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の５−（４−アセチル−３−メトキシフェニル）−４−ｔ−ブチル−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔９〕）を無色固体（９４３ｍｇ，３．１１８ｍｍｏｌ，９３．０％）として得た。
【００９２】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０７（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，６Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝７．８ａｎｄ １．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ２７．３，３１．８，３２．４，３２．４，４７．３，５５．５，８３．８，１１３．１，１２２．４，１２６．４，１２７．７，１２９．９，１４１．８，１４８．８，１５８．４，１９９．４ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；２９５７，２８６８，１６７６，１６００，１５６０，１４６３，１４０１，１２３２，１０５３ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３０２（Ｍ⁺，２７），２８７（１００），２３１（４０），２０３（１４），１７７（７８），１４９（９），１３５（６），５５（４８）。
【００９３】
（参考例８）
【００９４】
【化２８】

【００９５】
室温にて５−（４−アセチル−３−メトキシフェニル）−４−ｔ−ブチル−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔９〕）（１．３５ｇ，４．４６４ｍｍｏｌ）を溶かしたエタノール（１５ｍＬ）溶液に、炭酸水素ナトリウム（５６２ｍｇ，６．６９ｍｍｏｌ）を加えた後、塩酸ヒドロキシルアミン（４７２ｍｇ，６．７９ｍｍｏｌ）を加え、９０℃にして３０分還流した。その反応溶液を飽和食塩水（５０ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で再度抽出を行い、先の有機層と合わせ飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残留物を淡黄色固体（１．３８ｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの４：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の４−ｔ−ブチル−５−〔４−（１−ヒドロキシイミノエチル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１０〕）を無色固体（１．１１ｇ，３．４９７ｍｍｏｌ，７８．３％）として得た。
【００９６】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０７（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，６Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝７．６ａｎｄ １．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２３−７．２７（ｍ，１Ｈ），７．８１（ｂｒ−ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１５．１，２７．４，３２．４，３２．５，４７．２，５５．５，８３．１，１１２．６，１２２．３，１２５．９，１２６．４，１２８．８，１３８．１，１４９．５，１５６．５，１５６．９ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；３２２８，２９６３，２８６５，１６０２，１５６１，１３９６，１３１１，１２２６，１０５１，９３０ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３１７（Ｍ⁺，２９），３０２（１００），２８６（３２），２７０（１３），２６０（１０），２４６（１８），２３０（１１），２１４（１４），１９２（１４），１７６（７），５７（４）。
【００９７】
（参考例９）
【００９８】
【化２９】

【００９９】
窒素雰囲気下、室温において、４−ｔ−ブチル−５−〔４−（１−ヒドロキシイミノエチル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１０〕）（９８０ｍｇ，３．０８７ｍｍｏｌ）を溶かしたＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を、−７８℃にて１．６１Ｍブチルリチウムヘキサン溶液（４．２０ｍＬ，６．７６ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌した。そこにトリフルオロ酢酸Ｓ−エチルエステル（０．５０ｍＬ，８．９０ｍｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻して一昼夜撹拌した。その反応溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で再度、抽出を行い、先の有機層と合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残留物を淡黄色油状物（１．２５ｍｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの４：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−５−ヒドロキシイソオキサゾリン−３−イル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１１〕）を無色固体（８４１ｍｇ，２．０３４ｍｍｏ１，６５．９％）として得た。
【０１００】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０７（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，６Ｈ），３．４９（ｂｒ−ｓ，１Ｈ），３．６３（ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．０ａｎｄ １．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ２７．３，３２．５，３２．５，４５．４，４７．３，５５．６，８３．１，１０３．１（ｑ，Ｊ＝３３．７Ｈｚ），１１３．０，１１６．４，１２２．０（ｄ，Ｊ＝２８３．３Ｈｚ），１２２．８，１２６．７，１２８．７，１４０．１，１４８．５，１５５．７，１５７．０ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；３３２９，２９６２，２８７３，１６０５，１４６６，１４１０，１１８５，１０５０，１００５，８６０ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；４１３（Ｍ⁺，２９），３９８（１００），３８０（２８），３４２（２６），３２４（１２），２８８（３５），２７０（６０），２１４（２２），１６０（２２），５７（８）。
【０１０１】
（参考例１０）
【０１０２】
【化３０】

【０１０３】
室温において、４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−５−ヒドロキシイソオキサゾリン−３−イル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１１〕）（９２２ｍｇ，２．２３０ｍｍｏｌ）を溶かしたトルエン（１０ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（４５．８ｍｇ，０．２４１ｍｍｏｌ）を加え、１３０℃にして１時間還流した。その反応溶液を飽和重曹水（５０ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で再度、抽出を行い、先の有機層と合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残留物を淡黄色固体（９３０ｍｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの４：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１２〕）を無色固体（７４８ｍｇ，１．９８３ｍｍｏ１，８８．９％）として得た。
【０１０４】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０９（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ），３．９０（ｓ，２Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝７．８ａｎｄ １．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝０．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ２７．４，３２．５，３２．５，４７．３，５５．７，８３．６，１０６．８（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），１１３．０，１１５．８，１１８．０（ｄ，Ｊ＝２６９．８Ｈｚ），１２２．９，１２６．４，１２８．８，１４０．２，１４８．８，１５６．６．１５７．８（ｑ，Ｊ＝４２．０Ｈｚ），１５９．８ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；２９６１，２８７０，１６０６，１４５０，１３１３，１１７８，１１５２，１０５２，９６７，８３４ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３９５（Ｍ⁺，２２），３８０（１００），３４５（１６），３３８（１９），３２４（２５），２７０（５３），２４４（１０），２２８（７），２１４（９），１６０（１３），１４９（１０），５７（１５）。
【０１０５】
（参考例１１）
【０１０６】
【化３１】

【０１０７】
窒素雰囲気下、０℃において、水素化ナトリウム６０％、１３５ｍｇ（３．３８ｍｍｏｌ）を懸濁させたＤＭＦ（３ｍＬ）にエタンチオール（０．４０ｍＬ，５．４０ｍｍｏｌ）を加え、１５分間撹拌した。その反応溶液に４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−メトキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１２〕）（６６４ｍｇ，１．６７９ｍｍｏｌ）を溶解させたＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を滴下し、１４０℃にして１時問加熱した。その反応溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で再度、抽出を行い、先の有機層と合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残留物を淡黄色固体（６７１ｍｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンと酢酸エチルの４：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１３〕）を無色固体（５３３ｍｇ，１，３９８ｍｍｏｌ，８３．３％）として得た。
【０１０８】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０８（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，６Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝８．１ａｎｄ１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），１０．６（ｓ，１Ｈ）
ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ２７．３，３２．５，３２．５，４７．４，８３．３，１０９．２，１１８．７（ｑ，Ｊ＝２６６．８Ｈｚ），１１９．１，１２１．６，１２６．０，１２７．５（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），１３８．４（ｑ，Ｊ＝４４．５Ｈｚ），１４２．１，１４８．４，１５７．３，１６３．
０ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；３３５５，３１４８，２９６０，２８６８，１６２９，１５７６，１４９４，１３３０，１１７９，１１４７，１０５２，７６５ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；３８１（Ｍ⁺，６１），３６６（１００），３２４（６），３１０（８８），２７８（１１），２５６（８５），２２８（１８），２００（１７），５７（１９）。
【０１０９】
（実施例１）
【０１１０】
【化３２】

【０１１１】
酸素雰囲気下、０℃において、４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１３〕）（８０．０ｍｇ，０．２０９８ｍｍｏｌ）を溶かしたＣＨ₂Ｃ１₂（５ｍＬ）溶液に、ＴＰＰ（２．１ｍｇ）を加えた後、ナトリウムランプを照射し、３０分撹拌した。その反応溶液を濃縮し、残留物を緑色固体（８１．２ｍｇ）として得た。これをシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンとジエチルエーテルの２０：１混合溶媒にて流しだしたところ、目的の４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタン（化合物〔１４〕）を淡黄色固体（７５．３ｍｇ，０．１８２２ｍｍｏｌ，８６．８％）として得た。
【０１１２】
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１．０２（ｓ，９Ｈ），１．１７（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．３ａｎｄ１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），１０．６７（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；δ１８．５，２５．１，２７．０，３６．８，４５．７，８０．５，１０５．４，１１０．３，１１５．９，１１７．９，１１８．７（ｑ，Ｊ＝２６７．０Ｈｚ），１１９．７，１２６．０，１２７．５（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），１３８．７（ｑ，Ｊ＝４４．５Ｈｚ），１４１．８，
１５７．３，１６２．７ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）；３１４４，２９７５，２８９８，１６１３，１５５０，１４９４，１３７１，１３３１，１２１９，１１４９，１０３５，９５９，８７２ｃｍ^-1
Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ，％）；４１３（Ｍ⁺，１），３８１（１３），３６６（２０），３５７（２８），３２８（７），２７３（３３），２５６（１００），２２８（１３），２００（１４），５７（２５）。
【０１１３】
（実施例２）
実施例１で得られた４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタン（化合物〔１４〕）の１．００×１０^-5Ｍアセトニトリル溶液１ｍＬを、テトラブチルアンモニウムフルオライドの１．００×１０^-2Ｍ ＤＭＳＯ溶液２ｍＬに４０℃で加え、そのときの発光を蛍光分析計で測定した。このときの発光量子収率は０．４４と見積もられ、発光の半減期は１４００秒、λ_maxは４８１ｎｍであった。
【０１１４】
（実施例３）
実施例１で得られた４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタン（化合物〔１４〕）の１．００×１０^-4Ｍアセトニトリル溶液１ｍＬを、水酸化ナトリウムの０．１Ｎ溶液２ｍＬに４０℃で加え、そのときの発光を蛍光分析計で測定した。このときの発光量子収率は０．３９と見積もられ、発光の半減期は２７００秒、λ_maxは４７９ｎｍであった。
【０１１５】
（実施例４）
実施例１で得られた４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタン（化合物〔１４〕）の１．００×１０^-3Ｍアセトニトリル溶液０．１ｍＬを、水酸化ナトリウムの０．１Ｎ溶液２ｍＬ＋蒸留水０．９ｍＬに４０℃で加え、そのときの発光を蛍光分析計で測定した。このときの発光量子収率は０．２４と見積もられ、発光の半減期は１２００秒、λ_maxは４７６ｎｍであった。
【０１１６】
（参考例１２）
【０１１７】
【化３３】

【０１１８】
窒素雰囲気下、０℃において、ジクロロメタン３０ｍＬにピリジン１．８４ｍＬ（２２．８ｍｍｏｌ）を加え、さらにオキシ塩化リン１．３３ｍＬ（１４．３ｍｍｏｌ）を加え１５分間攪拌した。その反応溶液に４−ｔ−ブチル−５−〔４−（５−トリフルオロメチル−３−イソオキサゾリル）−３−ヒドロキシフェニル〕−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロフラン（化合物〔１３〕）（１．４４ｇ，３．７８ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（１２ｍＬ）溶液を滴下し、０℃にして２時問攪拌し、さらに徐々に室温に戻して一昼夜攪拌した。
【０１１９】
反応溶液をふたたび０℃に冷却し、ピリジン３．６８ｍＬ（４５．５ｍｍｏｌ）を加え、さらにエチレンシアノヒドリン３．２０ｍＬ（４７．３ｍｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻して一昼夜攪拌した。その反応溶液を純水（５０ｍＬ）に投じ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出を行った。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で再度、抽出を行い、先の有機層と合わせ、純水（１００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮したところ、目的の、リン酸−５−（３−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロフラン−２−イル）−２−(５−トリフルオロメチルイソオキサゾール−３−イル）フェニルエステル ビス−（２−シアノエチル）エステル（化合物〔１５〕）を淡黄色油状物（２．１０ｇ，３．７０ｍｍｏｌ，９８．１％）として得た。
【０１２０】
¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ）；δ１．０８（ｓ，９Ｈ），１．３５（ｓ，６Ｈ），２．８０（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｄｄ，１Ｈ），７．５３（ｄ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ），８．０９（ｄｄ，１Ｈ），ｐｐｍ。
【０１２１】
（参考例１３）
【０１２２】
【化３４】

【０１２３】
室温において、リン酸−５−（３−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロフラン−２−イル）−２−(５−トリフルオロメチルイソオキサゾール−３−イル）フェニルエステル ビス−（２−シアノエチル）エステル（化合物〔１５〕）（１．２０ｇ，２．１１ｍｍｏｌ）を溶かしたメタノール（４０ｍＬ）溶液に２８％ナトリウムメチラート・メタノール溶液（１．６ｍＬ）加え１時間３０分攪拌した。その反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２．０ｍＬ）加え、さらに３０分攪拌後、濃縮することにより白色の固体を得た。この固体にメタノール（２０ｍＬ）を加え、不溶物を濾過にて取り除いた。濾液を濃縮したところ、目的の、リン酸モノ−［５−（３−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロフラン−２−イル）−２−(５−トリフルオロメチルイソオキサゾール−３−イル）フェニル］エステル ジナトリウム塩（化合物〔１６〕）を白色固体（０．６９ｇ，１．３７ｍｍｏｌ，６４．５％）として得た。
【０１２４】
¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）；δ１．１１（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，６Ｈ），３．８３（ｓ，２Ｈ），６．９８（ｄｄ，１Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ），７．８５（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ），ｐｐｍ。
【０１２５】
（実施例５）
【０１２６】
【化３５】

【０１２７】
酸素雰囲気下、０℃において、リン酸モノ−［５−（３−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロフラン−２−イル）−２−(５−トリフルオロメチルイソオキサゾール−３−イル）フェニル］エステル ジナトリウム塩（化合物〔１６〕）（６５．０ｍｇ，０．１２９ｍｍｏｌ）を溶かしたメタノール（４ｍＬ）とジクロロメタン（１５ｍＬ）の混合溶液に、ＴＰＰ（２．０ｍｇ）を加えた後、ナトリウムランブを照射し、２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、濃縮物にメタノールを加えて不溶物を０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製のフィルターで濾過し、再度濃縮した。濃縮物を純水（１．５ｍｌ）に溶解し、ポリマー系逆相Ｃ１８の分取用カラムを用いてＨＰＬＣにかけ、水とアセトニトリルで溶出させた画分を凍結乾燥したところ、目的の、リン酸モノ−［５−（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプト−１−イル）−２−(５−トリフルオロメチルイソオキサゾール−３−イル）フェニル］エステル ジナトリウム塩（化合物〔１７〕）を白色固体（５２．０ｍｇ，０．０９７ｍｍｏｌ，７５．３％）として得た。
【０１２８】
¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）；δ１．０４（ｓ，９Ｈ），１．１４（ｓ，３Ｈ），１．４４（ｓ，３Ｈ），３．８３（ｄ，１Ｈ），４．４９（ｄ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ），７．９１（ｄｄ，１Ｈ），８．３５（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１２９】
【発明の効果】
本発明の１，２−ジオキセタン誘導体（Ｉ）は、量子収率の高い安定な発光を示すことができ、かつ熱的安定性が高いため冷蔵保存によっては１年後に分解産物が全く見られないほど安定な化合物である。よって、発光の測定を簡便に効率良く行うことができ、例えば、臨床検査の分野等で有用である。また本発明の１，２−ジオキセタン誘導体（Ｉ）は、高い熱的安定性と高い発光効率を併せ持つだけでなく、プロトン性溶媒中においてエンハンサー自体及びエンハンサーを加える操作等を省くことができるため費用、時間の節約をすることができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to 1,2-dioxetane derivatives. The 1,2-dioxetane derivative of the present invention is a compound capable of inducing chemiluminescence, and can be used as a substrate for immunoassay, for example.
[0002]
[Prior art]
Various 1,2-dioxetane derivatives have been conventionally synthesized, and in particular, a compound having a spiroadamantyl group bonded to the 3-position is known to be useful as a chemiluminescent substrate (for example, Japanese Patent Publication No. 5-21918). Gazette and Japanese Patent Publication No. 5-45590). Further, as compounds already produced by the present inventors, compounds described in JP-A-8-245615, JP-A-8-169885, and JP-A-8-165287 are known. However, these 1,2-dioxetane derivatives have low thermal stability. Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-216887 discloses a compound having improved thermal stability.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, various studies have been made on 1,2-dioxetane derivatives, and various compounds have been created. However, in order to apply in the field of clinical tests, etc., the compound itself is stable, easy to handle, and requires properties such as being able to emit light with high efficiency, and is a compound that is superior to conventional compounds The creation of was desired.
[0004]
In addition, conventional compounds including the compounds described in JP-A-9-216887 have a significantly reduced luminous efficiency in aqueous protic solvents and are actually used for immunoassay in clinical tests. However, when the measurement condition was a protic solvent, it was not possible to obtain a strength sufficient for practical use. Therefore, at the time of measurement, a substance that enhances luminescence other than the 1,2-dioxetane derivative must be present as an enhancer.
[0005]
Enhancers include cationic surfactants (eg cetyltrimethylammonium bromide, cetyldimethylbenzylammonium chloride), water-soluble polymerized quaternary onium salts [quaternary ammonium salts, quaternary sulfonium salts, quaternary phosphonium salts. Including. For example, poly (vinyl benzyl dimethyl benzyl ammonium chloride), poly (vinyl benzyl trimethyl ammonium chloride), poly (vinyl benzyl tributyl ammonium chloride)], natural polymers (such as mammalian serum albumin, immunoglobulin, serum lipoprotein, etc.) It was used. However, when these were used, caution was required in handling such as increased viscosity. Therefore, it is more useful if there is a compound that can exhibit high luminous efficiency without using an enhancer even in a protic solvent.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Under the circumstances as described above, the present inventors have intensively studied to create a compound that is superior to conventional compounds, and as a result, the isoxazole ring represented by the above formulas (A) and (B), etc. The present invention was completed by finding that a 1,2-dioxetane derivative having an aromatic ring substituent bonded to a hetero five-membered ring exhibits high luminous efficiency even in a protic solvent such as water without using an enhancer. is there.
[0007]
That is, the present invention relates to the general formula (I)
[0008]
[Chemical 7]

[0009]
1,2-dioxetane derivatives represented by the formula:¹, R²Are each independently a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group. R¹, R²Can be combined to form a cyclic or polycyclic organic ring group that is spiro-bonded to the dioxetane ring. R^ThreeIs an alkyl group or an aryl group, R^ThreeAnd R¹Or R²And a dioxetane ring and a condensed ring containing a hetero atom may be formed together. Ar is the formula (A)
[0010]
[Chemical 8]

[0011]
(Wherein R^FourIs a hydroxyl group, an alkoxyl group, an aralkyloxy group, -OSi (R^FiveR⁶R⁷) (However, R^Five, R⁶And R⁷Are independently an alkyl group or an aryl group. ), A phosphate group or -S (C = O) R⁸(However, R⁸Is an alkyl group or an aryl group. ). R⁹And R^TenAre each independently a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen atom, X is a halogen atom, and V is an oxygen atom or a sulfur atom. Or a group represented by formula (B)
[0012]
[Chemical 9]

[0013]
(Wherein R^FourIs R in the formula (A)^FourIs the same. R¹¹And R¹²Are each independently a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen atom, Y is a halogen atom, and W is an oxygen atom or a sulfur atom. ). ).
[0014]
The present invention also provides a chemiluminescent reagent comprising the above-described 1,2-dioxetane derivative. Furthermore, the present invention is a luminescence method characterized by decomposing the aforementioned 1,2-dioxetane derivative to cause chemiluminescence. Furthermore, the present invention is a measurement method characterized in that a detection substance in a sample is measured using the above-described light emitting method. Furthermore, the present invention is a light-emitting method characterized by causing a compound having a 1,2-dioxetane structure to emit light in a protic solvent in the absence of another enhancer. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0015]
In the present specification, the “alkyl group” refers to a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent. Methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, icosanyl and the above alkyl groups are appropriately separated. A group bonded in a branched manner or a group in which they are cyclic. Examples of the substituent which may be included include a hydroxyl group, an alkoxyl group, and an aryl group. Examples of the alkoxyl group include straight-chain alkoxy groups having 1 to 20 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy, methoxyethoxy, methoxypropoxy, ethoxyethoxy, ethoxypropoxy, and methoxyethoxyethoxy groups. Examples thereof include those in which 1 to 5 chains or branches are bonded. Examples of the aryl group include aromatic hydrocarbon groups having 6 to 20 carbon atoms such as phenyl and naphthyl groups, and 1 to 5 nitrogen atoms and oxygen in the ring such as furyl, thienyl and pyridyl groups. Examples include heteroaryl groups having an atom or a sulfur atom.
[0016]
In the present specification, the “alkoxyl group” can include the same alkoxy groups that may be substituted with the above-described alkyl group, and the “aryl group” is also substituted with the above-described alkyl group. The same thing as the aryl group which may be mentioned can be mentioned. Further, in the present specification, “polycyclic organic ring group” means C₁~ C_TenAlkyl, C₁~ C_TenAlkoxy, halogen and halo-C₁~ C_TenA polycyclic alkylene having 6 to 30 carbon atoms optionally substituted with 1 to 10 groups independently selected from alkyl, such as an adamantyl group, bicyclo [2.2.1] heptyl, etc. is there. In addition, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a cyano group, an amide group, an alkoxy group, or a carboxyl group may be bonded to any carbon of the polycyclic organic ring group. The “aralkyloxy group” is a group having 7 to 20 carbon atoms such as benzyloxy or phenethyloxy group, and the “halogen atom” is fluorine, chlorine, bromine or the like.
[0017]
In the general formula (I), R^ThreeAnd R¹Or R²And a dioxetane ring and a heteroatom-containing condensed ring can be exemplified as a condensed ring of a dioxetane ring and a furan ring, or a condensed ring of a dioxetane ring and a pyran ring.
[0018]
In the present invention, Ar in the general formula (I) is represented by the formula (a)
[0019]
[Chemical Formula 10]

[0020]
(Wherein R^Four, R⁹, R^Ten, X and V are R in the formula (A)^Four, R⁹, R^Ten, X and V are the same. Or a group represented by formula (b)
[0021]
Embedded image

[0022]
(Wherein R^Four, R¹¹, R¹², Y and W are R in the formula (B)^Four, R¹¹, R¹², Y and W are the same. ) Are preferred.
[0023]
In the above general formula (I), R^ThreeAnd R¹Or R²And a dioxetane ring and a furan ring to form a condensed ring, more preferably R^ThreeR not forming a condensed ring with²Or R¹Is an alkyl group having 3 to 4 carbon atoms. Among them, the general formula (I ′)
[0024]
Embedded image

[0025]
(Wherein R^FourAre the same as those described above.
[0026]
The 1,2-dioxetane derivative represented by the general formula (I) of the present invention is represented by the general formula (II)
[0027]
Embedded image

[0028]
(Wherein R¹~ R^ThreeIs R in the general formula (I)¹~ R^ThreeAnd R⁴¹Is an alkoxyl group or an aralkyloxy group. Also, (R⁴¹) Ar represents the formula (A ′)
[0029]
Embedded image

[0030]
(Wherein R⁹, R^Ten, X and V are R in the formula (A)⁹, R^Ten, X and V and R⁴¹Is R in the general formula (II)⁴¹Is the same. Or a group represented by formula (B ′)
[0031]
Embedded image

[0032]
(Wherein R¹¹, R¹², Y and W are R in the formula (B)¹¹, R¹², Y and W and R⁴¹Is R in the general formula (II)⁴¹Is the same. R represented by))⁴¹It can be produced from an enol ether derivative having an aryl group substituted with the following reaction formula.
[0033]
Embedded image

[0034]
(Wherein R¹~ R^ThreeAnd R⁴¹Is R in the general formulas (I) and (II)¹~ R^ThreeAnd R⁴¹Is the same. R⁴²Is -OSi (R^FiveR⁶R⁷) (However, R^Five, R⁶And R⁷Is the same as above. ) Or a group represented by
[0035]
Embedded image

[0036]
(Wherein R¹³And R¹⁴Is an alkali metal, quaternary ammonium salt or alkyl group, R¹³And R¹⁴Are groups that may form a ring together. ). The group represented by (HO) Ar of the compound represented by the general formula (III) is a substituent R of the general formula (II).⁴¹Having an OH group at the same position as that of (R) in the general formula (IV)⁴²) Ar is a substituent R of the general formula (II)⁴¹Substituent R at the same position as⁴²It is what has. )
(First Step) In this step, the compound represented by the general formula (III) is produced by deprotecting the compound represented by the general formula (II). Examples of the compound used for the deprotection reaction include the aforementioned general formula (II) (where R¹~ R^ThreeIs the same as above and R⁴¹Is a hydroxyl-protecting group (preferably a methoxy group or a benzyloxy group). This reaction can be carried out by a method familiar to those skilled in the art, that is, by reacting with an alkylthiol anion or by subjecting it to a hydrogenation reaction. May be appropriately selected depending on the group to be deprotected.
[0037]
(Second Step) In this step, the compound represented by the general formula (III) is reacted with a corresponding halogenated trialkylsilane or halogenated phosphate to form a silyloxy group or a phosphate group, and the general formula (IV ) Is produced. In this step, for example, when chloroethylene phosphate is reacted for the introduction of a phosphate group, it may be converted to sodium salt of cyanoethyl phosphate with sodium cyanide, and the cyanoethyl group may be eliminated and converted to ammonium sodium salt. it can. This ammonium sodium salt can be easily converted to a disodium salt by, for example, reacting with sodium hydrogen carbonate.
[0038]
(Third Step) In this step, the compound represented by the general formula (II), (III) or (IV) is reacted with singlet oxygen, and the 1,2-dioxetane derivative represented by the general formula (I) is used. Is to be manufactured. In the reaction with singlet oxygen, the enol ether derivative represented by the general formula (II), (III) or (IV) is used in combination with a photosensitizer such as methylene blue, rose bengal, tetraphenylporphine (TPP). This is achieved by performing visible light irradiation under an oxygen atmosphere. At this time, the solvent may be a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane, dichloroethane, or carbon tetrachloride, or an alcohol such as methanol or ethanol. The reaction is preferably performed at −80 ° C. to room temperature.
[0039]
Examples of the method for producing the enol ether derivative represented by the general formula (II) include the following methods.
[0040]
Embedded image

[0041]
(Wherein R¹~ R^ThreeAnd R⁴¹Is R in the general formulas (I) and (II)¹~ R^ThreeAnd R⁴¹Is the same. R¹⁵And R¹⁶Is an alkyl group or R¹⁵And R¹⁶Are groups that may form a ring together. )
(Step 1A) In this step, an aromatic carboxylic acid ester represented by the general formula (1A) is reacted with a ketone represented by the general formula (2A), and the enol ether represented by the general formula (II) A derivative is produced. The reaction must be carried out in the presence of titanium. Usually, titanium is preferably subjected to a reaction by forming a reduced state of titanium halide such as titanium chloride using a reducing agent such as lithium aluminum hydride and a base such as triethylamine. The reaction can be carried out in an organic ether such as tetrahydrofuran (THF). The reaction proceeds at 0 to 100 ° C., but it is preferable to carry out the reaction under reflux of THF from the viewpoint of operation and reactivity.
[0042]
(Step 1B) In this step, the arylmethylphosphonate represented by the general formula (1B) is reacted with the ketone represented by the general formula (2B) to produce the enol ether derivative represented by the general formula (II). To manufacture.
[0043]
The arylmethylphosphonate represented by the general formula (1B) is a compound that can be easily produced according to the method described in the above Japanese Patent Publication No. 5-45590. It is preferable to form a lithium amide from diisopropylamine using butyllithium or the like and use it for the reaction. The reaction can be carried out in an organic ether such as tetrahydrofuran (THF). The reaction is preferably performed at −78 ° C. to room temperature.
[0044]
Examples of the production method when the compound represented by the general formula (II) is a dihydrofuran derivative can include the following methods.
[0045]
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[0046]
(Wherein R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, R²⁰And R^{twenty one}Are each independently a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group. Also R¹⁸And R¹⁹, R²⁰And R^{twenty one}, R¹⁷And R¹⁹, R¹⁷And R²⁰And R¹⁸And R²⁰Can be united and can independently form a cyclic alkyl group. R⁴¹Is the same as above. R^{twenty two}Is a halogen atom, a substituted sulfonyloxy group or a hydroxyl group. ).
[0047]
(Step 1C) In this step, the compound represented by the general formula (3C) is produced by reacting the compound represented by the general formula (1C) with the compound represented by the general formula (2C). To do. The reaction can be achieved by the so-called Williamson synthesis familiar to those skilled in the art. Here, the substituent R of the compound represented by the general formula (1C)^{twenty two}Is a halogen atom or a substituted sulfonyloxy group, it is directly subjected to the reaction, R^{twenty two}In the case where is a hydroxyl group, this step can be achieved by converting it into a sulfonyloxy group with a tosyl halide or the like in the reaction system and then subjecting it to a reaction.
[0048]
(Step 2C) In this step, the compound represented by the general formula (4C) is produced by oxidizing the compound represented by the general formula (3C). The oxidation in this step can be performed by using a chromium-based oxidant or an activator. As the chromium-based oxidizing agent, pyridinium chlorochromate (PCC), pyridinium dichlorochromate (PDC) or the like can be used. At this time, a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane can be used as the solvent. When the activator is used, Py · SO_Three/ Triethylamine / DMSO, Ac₂The reaction can be performed in combination with a solvent such as an O / DMSO system.
[0049]
(Step 3C) In this step, the compound represented by the general formula (4C) is cyclized to produce the compound represented by the general formula (5C). The reaction is carried out using a secondary amine lithium salt such as lithium diisopropylamide or a base such as t-butoxy potassium. As the solvent, an organic solvent such as THF or DMSO can be used, and the reaction is preferably performed at 0 ° C. to room temperature for 1 to 5 hours.
[0050]
(Step 4C) In this step, the compound represented by the general formula (5C) is brominated to produce the compound represented by the general formula (6C). The reaction is accomplished by using a brominating agent such as N-bromosuccinimide. As a solvent, it can carry out using organic solvents, such as hydrous THF, a dioxane, and DMF.
[0051]
(Step 5C) In this step, the compound represented by the general formula (7C) is produced by dehydrating the compound represented by the general formula (6C). In the reaction, thionyl chloride is allowed to act in the presence of a base such as pyridine, or an acid such as phosphoric acid or p-toluenesulfonic acid can be used as a catalyst. As the solvent, a halogenated hydrocarbon such as methylene chloride or an aromatic hydrocarbon such as toluene can be used, and it can be appropriately selected depending on the reagent to act.
[0052]
(Step 6C) In this step, the compound represented by the general formula (II ') is produced from the compound represented by the general formula (7C). The reaction is to produce the compound represented by the general formula (II ′) into which the target substituent is introduced by substituting bromine of the compound represented by the general formula (7C). The substituted amino group can be introduced by using a lithium salt such as butyl lithium, introducing a carboxyl group, and then reacting with amine or ammonia using carbonylimidazole as a condensing agent. Furthermore, from the amide produced by the above reaction, for example, to obtain a compound having an oxazoline ring, it can be carried out by allowing a substituted or unsubstituted ethanolamine to act. In order to introduce an acyl group, a lithium salt such as butyl lithium is used in the same manner as described above, and reacted with N-methylformanilide or reacted with an aldehyde such as acetaldehyde or benzaldehyde, and then oxidized with manganese dioxide or the like. This is accomplished by oxidizing the hydroxyl β group with an agent. Here, a compound into which an acyl group has been introduced can form an isoxazole ring through dehydration by converting the acyl group into a hydroxyimino group and reacting the dianion with the corresponding amide or ester. As another method, the compound into which an acyl group is introduced can be converted into a β-diketone type substituent, and a hydroxylamine can be reacted therewith to form an isoxazole ring.
[0053]
Examples of the production method when the compound represented by the general formula (II) is a dihydropyran derivative can include the following methods.
[0054]
Embedded image

[0055]
(Wherein R^{twenty three}, R^{twenty four}, R^{twenty five}, R²⁶, R²⁷, R²⁸And R²⁹Are each independently a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group. Also R^{twenty four}And R^{twenty five}, R²⁶And R²⁷, R²⁸And R²⁹, R^{twenty three}And R^{twenty four}, R^{twenty three}And R²⁶, R^{twenty three}And R²⁸, R^{twenty four}And R²⁶, R^{twenty four}And R²⁸And R²⁶And R²⁸Can be united and can independently form a cyclic alkyl group. R⁴¹And R^{twenty two}Is the same as above. ).
[0056]
(1D process, 2D process, 3D process, 4D process, 5D process and 6D process) The method for producing the compound represented by the general formula (7D) by these processes is the 1C process. , 2C process, 3C process, 4C process, 5C process and 6C process.
[0057]
The 1,2-dioxetane derivative represented by the general formula (I) of the present invention is decomposed to a carbonyl compound with chemiluminescence under alkaline conditions, and esterases (carboxylate ester hydrolase) such as aryl esterase and acetylcholinesterase. It is decomposed with chemiluminescence by an enzyme such as alkaline phosphatase, a fluorine compound such as tetrabutylammonium fluoride, an acid or an amine compound.
[0058]
Therefore, the 1,2-dioxetane derivative represented by the general formula (I) becomes a chemiluminescent reagent. The decomposition of the 1,2-dioxetane derivative accompanied with chemiluminescence may be performed in the presence of another enhancer or in the absence of another enhancer. The 1,2-dioxetane derivative represented by the general formula (I) has a high emission quantum yield even when decomposition involving chemiluminescence is carried out in a protic solvent and in the absence of other enhancers. One of the features is to show the rate. The light emission quantum yield is preferably 1% or more, more preferably 10% or more, and particularly preferably 20% or more.
[0059]
Further, the chemiluminescent reagent of the present invention can be used in any measurement method for the purpose of determining the concentration of a detection substance in a sample. For example, it can be used as an immunoassay reagent in an immunoassay, as well as an enzyme assay method; It can also be used for chemical assay; nucleotide probe method and the like.
[0060]
Examples of the detection substance in the immunoassay include hormones such as hCG, TSH, and LH, cancer-related substances such as AFP and CEA, virus antigens such as HIV and HTLV-I, and antibodies and nucleic acids (DNA, RNA) thereof. Can be mentioned.
[0061]
As the immunoassay, for example, the enzyme is previously bound to a substance having specific binding properties to the detection substance as described above, and the sample containing the detection substance is mixed and reacted for a certain period of time, This can be carried out by a step of binding the detection substance in the sample and a substance having binding properties thereto, and a step of determining the amount of the binding substance that is bound or not bound. The step of determining the amount of the bound or unbound substance having the binding property comprises reacting the enzyme with the 1,2-dioxetane derivative of the present invention, and from the 1,2-dioxetane derivative in proportion to the amount of the enzyme. Therefore, the concentration of the substance can be determined by measuring the emission intensity.
[0062]
The immunoassay reagent containing the 1,2-dioxetane derivative of the present invention and the immunoassay using the same are also included in the present invention.
[0063]
The 1,2-dioxetane derivative represented by the general formula (I) of the present invention can exhibit a stable emission efficiency with a high quantum yield and has high thermal stability, and after 1 year depending on refrigeration storage. It is a compound that is so stable that no degradation products are found. Therefore, the measurement of luminescence can be performed simply and efficiently, and is useful, for example, in the field of clinical examinations.
[0064]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Reference Examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0065]
(Reference Example 1)
[0066]
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[0067]
2,2,4,4-tetramethyl-1,3-pentanediol dissolved in 15 mL of DMF in a solution of 2.12 g (53.0 mmol) of 60% sodium hydride suspended in 80 mL of DMF at 0 ° C. under a nitrogen atmosphere Compound [2]) 7.05 g (44.1 mmol) was added dropwise over 30 minutes, and the mixture was further stirred for 30 minutes. To this solution, 9.07 g (57.9 mmol) of 3-methoxybenzyl chloride (compound [1]) dissolved in 15 mL of DMF was added dropwise over 30 minutes, followed by stirring for 12 hours. The reaction mixture was poured into a saturated aqueous ammonium chloride solution and extracted with ethyl acetate. The extract layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated. The concentrate was applied to a silica gel column and poured into a 10: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate. As a result, 1- (3-methoxybenzyloxy) -2,2,4,4-tetramethyl-3-pentanol (compound [ 3]) as a colorless oil in a yield of 86.7%.
[0068]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.03 (s, 9H), 1.04 (s, 3H), 1.07 (s, 3H), 3.23 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 3.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.41 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.43 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 4. 48 (s, 2H), 6.81-6.91 (m, 3H), 7.23-7.28 (m, 1H) ppm
IR (liquid film); 3502, 2954, 2870, 1489, 1457, 1267, 1080, 1053 cm^-1
Mass (m / z,%); 280 (M⁺2), 135 (31), 121 (100), 107 (8), 91 (9), 69 (13), 55 (14).
[0069]
(Reference Example 2)
[0070]
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[0071]
9.9 g of Celite and 4.61 g (16.5 mmol) of 1- (3-methoxybenzyloxy) -2,2,4,4-tetramethyl-3-pentanol (compound [3]) at room temperature under a nitrogen atmosphere Was added to 75 mL of dichloromethane and stirred. To this solution, 4.26 g (19.7 mmol) of PCC was added and stirred for 7 hours, and then 800 mg (3.71 mmol) of PCC was further added and stirred overnight. Ether was added to the reaction mixture, and the mixture was filtered through celite. The filtrate was concentrated, applied to a silica gel column and poured out with a 10: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate. As a result, 1- (3-methoxybenzyloxy) -2,2,4,4-tetramethyl-3-pentanone ( Compound [4]) was obtained as a colorless oil in an amount of 4.32 g and a yield of 94.4%.
[0072]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.23 (s, 9H), 1.28 (s, 6H), 3.50 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 4.47 (s, 2H), 6.78 −6.88 (m, 3H), 7.23 (t, J = 8.1 Hz, 1H) ppm
IR (liquid film); 2959, 2870, 1658, 1480, 1466, 1458, 1267, 1108, 1049 cm^-1
Mass (m / z,%); 278 (M⁺, 100), 222 (50), 121 (31), 97 (5), 55 (8).
[0073]
(Reference Example 3)
[0074]
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[0075]
Under a nitrogen atmosphere, 1.50 mL (11.4 mmol) of diisopropylamine and 6.60 mL (10.6 mmol) of 1.6 M butyl lithium hexane solution were added to 15 mL of anhydrous THF at room temperature, and the mixture was stirred for 30 minutes. To this solution, 1.48 g (5.32 mmol) of 1- (3-methoxybenzyloxy) -2,2,4,4-tetramethyl-3-pentanone (compound [4]) dissolved in 10 mL of THF at −78 ° C. And stirred for 2 hours. The reaction solution was stirred for 3 hours and 20 minutes while gradually warming to room temperature. The reaction mixture was poured into saturated brine and extracted with ethyl acetate. The extract layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated. The concentrate was applied to a silica gel column and poured out with a 1: 2 mixed solvent of hexane and ethyl acetate to find 3-t-butyl-3-hydroxy-2- (3-methoxyphenyl) -4,4-dimethyl-2,3. , 4,5-tetrahydrofuran (compound [5]) was obtained with a yield of 87.8%.
Melting point: 83.0-83.5 ° C. (colorless granular crystals, recrystallized from hexane and ethyl acetate).
[0076]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 0.90 (broad s, 9H), 1.19 (s, 3H), 1.39 (s, 3H), 1.92 (s, 1H), 3.80 (q_AB, J = 8.1 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 5.00 (s, 1H), 6.80 (dd, J = 7.8 and 2.4 Hz, 1H), 7.10 (D, J = 2.4 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.21 (t, J = 7.8 Hz, 1H) ppm
IR (liquid film); 3493, 2962, 2881, 1591, 1481, 1278, 1070, 1048 cm^-1
Mass (m / z,%); 278 (M⁺, 1), 260 (29), 245 (100), 203 (12), 189 (45), 135 (52), 121 (10), 107 (11), 77 (9), 55 (33).
[0077]
(Reference Example 4)
[0078]
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[0079]
3-t-butyl-3-hydroxy-2- (3-methoxyphenyl) -4,4-dimethyl-2,3,4,5-tetrahydrofuran (compound [5]) (2.16 g, 7.77 mmol) in THF (20 mL) And H₂It added at the mixed solvent of O2mL, and stirred at 0 degreeC. To this solution, 1.54 g (8.65 mmol) of NBS was added and stirred overnight while gradually reaching room temperature, and then 140 mg (0.787 mmol) of NBS was further added and stirred for 6 hours. The reaction mixture was poured into saturated brine and extracted with ethyl acetate. The extract layer was washed successively with aqueous sodium thiosulfate solution and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. When the concentrate was crystallized from a mixed solvent of ethyl acetate and hexane, 2- (4-bromo-3-methoxyphenyl) -3-t-butyl-3-hydroxy-4,4-dimethyl-2,3,4 , 5-tetrahydrofuran (compound [6]) was obtained in 1.323 g, yield 47.7%.
[0080]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 0.89 (s, 9H), 1.20 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.92 (s, 1H), 3.80 (q_AB, J = 8.3 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 4.98 (s, 1H), 7.02 (dd, J = 8.1 and 2.0 Hz, 1H), 7.12. (D, J = 2.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H) ppm
Mass (m / z,%); 358 (M⁺+2, 2.4), 356 (M⁺2.5), 340 (19), 338 (20), 325 (79), 323 (84), 215 (73), 213 (67), 201 (18), 199 (19), 109 (10) 55 (100).
[0081]
(Reference Example 5)
[0082]
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[0083]
To 30 mL of anhydrous toluene at room temperature under a nitrogen atmosphere, 4-t-butyl-5- (4-bromo-3-methoxyphenyl) -4-hydroxy-3,3-dimethyl-2,3,4,5-tetrahydrofuran ( 4.68 g (13 mmol) of compound [6]) was added and stirred for 10 minutes. To this reaction solution, 0.27 g (1.4 mmol, 0.1 equivalent) of p-toluenesulfonic acid monohydrate was added, and the mixture was stirred at 120 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was returned to room temperature, and this was poured into a mixed solution of ethyl acetate and saturated brine to perform extraction. The obtained organic layer was washed with saturated brine. The organic layer was dried over magnesium sulfate and concentrated. When this was applied to a silica gel column and poured out with a 2: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, 4-t-butyl-5- (4-bromo-3-methoxyphenyl) -3,3-dimethyl-2,3 -Dihydrofuran (compound [7]) was obtained as a colorless oil in 3.78 g (11.2 mmol), yield 85%.
[0084]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.06 (s, 9H), 1.33 (s, 6H), 3.87 (s, 2H), 3.9 (s, 3H), 6.79 (dd, J = 7.9 and) 1.6 Hz, 1 H), 6.82 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.49 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) ppm
IR (liquid film); 2957, 2866, 1739, 1650, 1570, 1480, 1392, 1237, 1049, 1025, 795 cm^-1Mass (m / z,%); 340 (M⁺+2, 26), 338 (M⁺26), 325 (97), 323 (100), 283 (6), 282 (3), 281 (4), 187 (7), 185 (5), 172 (4), 170 (3), 77 (7), 55 (67).
[0085]
(Reference Example 6)
[0086]
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[0087]
Under a nitrogen atmosphere at room temperature, 5.05 g (14. 4-t-butyl-5- (4-bromo-3-methoxyphenyl) -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [7]). (88 mmol) in THF (50 mL) solution was added 1.63 M butyllithium hexane solution (10.5 mL, 17.1 mmol) at −78 ° C., stirred for 15 minutes, and then acetaldehyde (14. 0 mL, 45.1 mmol) was added and stirred for 30 minutes. A small amount of H is added to the reaction solution.₂The reaction was stopped by adding 0 dropwise, poured into a saturated aqueous ammonium chloride solution (100 mL), and extracted with ethyl acetate (100 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (100 mL), combined with the previous organic layer, and washed with saturated brine (200 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give a residue as a pale yellow oil (4.93 g). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 4: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, the desired 4-t-butyl-5- [4- (1-hydroxyethyl) -3-methoxyphenyl] -3 was obtained. , 3-Dimethyl-2,3-dihydrofuran (Compound [8]) was obtained as a colorless solid (3.73 g, 12.25 mmol, 82.3%).
[0088]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.06 (s, 9H), 1.34 (s, 6H), 1.49 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 2.60 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.87 (s, 2H), 5.08 (pent, J = 6.2 Hz, 1H), 6.79 (s, lH), 6.90 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.28 (d, J = 7.6 Hz, 1 H) ppm
¹³CNMR (125 MHz, CDCl_Three); Δ 22.9, 27.4, 32.4, 32.5, 47.1, 66.3, 83.0, 111.9, 122.5, 125.5, 125.6, 133.3 136.2, 149.8, 156.0 ppm
IR (KBr); 3491, 2962, 2870, 1651, 1604, 1461, 1402, 1229, 1129, 1088, 859 cm^-1
Mass (m / z,%); 304 (M⁺5), 303 (9), 287 (19), 271 (100), 177 (14), 161 (69), 149 (10), 135 (11), 111 (23), 55 (88).
[0089]
(Reference Example 7)
[0090]
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[0091]
4-t-butyl-5- [4- (1-hydroxyethyl) -3-methoxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [8]) (at room temperature under nitrogen atmosphere) To a solution of DMSO (10 mL) and THF (5 mL) in which 1.02 g, 3.351 mmol) was dissolved, triethylamine (1.65 mL, 11.8 mmol), pyridine sulfur trioxide complex (1.60 g, 10.1 mmol) And stirred for 1 hour. The reaction solution was poured into saturated brine (50 mL) and extracted with ethyl acetate (50 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (50 mL), combined with the previous organic layer, and washed with saturated brine (100 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give a residue as a pale yellow oil (1.02 g). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 4: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, the desired 5- (4-acetyl-3-methoxyphenyl) -4-tert-butyl-3,3-dimethyl- 2,3-Dihydrofuran (compound [9]) was obtained as a colorless solid (943 mg, 3.118 mmol, 93.0%).
[0092]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.07 (s, 9H), 1.34 (s, 6H), 2.61 (s, 3H), 3.89 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 6.89 (D, J = 1.3 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 7.8 and 1.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H) ppm
¹³CNMR (100 MHz, CDCl_Three); Δ 27.3, 31.8, 32.4, 32.4, 47.3, 55.5, 83.8, 113.1, 122.4, 126.4, 127.7, 129.9, 141.8, 148.8, 158.4, 199.4 ppm
IR (KBr); 2957, 2868, 1676, 1600, 1560, 1463, 1401, 1232, 1053 cm^-1
Mass (m / z,%); 302 (M⁺27), 287 (100), 231 (40), 203 (14), 177 (78), 149 (9), 135 (6), 55 (48).
[0093]
(Reference Example 8)
[0094]
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[0095]
At room temperature, 5- (4-acetyl-3-methoxyphenyl) -4-tert-butyl-3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [9]) (1.35 g, 4.464 mmol) was added. Sodium bicarbonate (562 mg, 6.69 mmol) was added to the dissolved ethanol (15 mL) solution, and then hydroxylamine hydrochloride (472 mg, 6.79 mmol) was added, followed by refluxing at 90 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was poured into saturated brine (50 mL) and extracted with ethyl acetate (50 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (50 mL), combined with the previous organic layer, and washed with saturated brine (100 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give a residue as a pale yellow solid (1.38 g). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 4: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, the desired 4-t-butyl-5- [4- (1-hydroxyiminoethyl) -3-methoxyphenyl]- 3,3-Dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [10]) was obtained as a colorless solid (1.11 g, 3.497 mmol, 78.3%).
[0096]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.07 (s, 9H), 1.34 (s, 6H), 2.22 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.88 (s, 2H), 6.83 (D, J = 1.4 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 7.6 and 1.4 Hz, 1H), 7.23-7.27 (m, 1H), 7.81 (br-s) , 1H) ppm
¹³CNMR (125 MHz, CDCl_Three); Δ 15.1, 27.4, 32.4, 32.5, 47.2, 55.5, 83.1, 112.6, 122.3, 125.9, 126.4, 128.8, 138.1, 149.5, 156.5, 156.9 ppm
IR (KBr); 3228, 2963, 2865, 1602, 1561, 1396, 1311, 1226, 1051, 930 cm^-1
Mass (m / z,%); 317 (M⁺29), 302 (100), 286 (32), 270 (13), 260 (10), 246 (18), 230 (11), 214 (14), 192 (14), 176 (7), 57 (4).
[0097]
(Reference Example 9)
[0098]
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[0099]
4-t-butyl-5- [4- (1-hydroxyiminoethyl) -3-methoxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [10]) at room temperature under nitrogen atmosphere To a THF (10 mL) solution in which (980 mg, 3.087 mmol) was dissolved, a 1.61 M butyllithium hexane solution (4.20 mL, 6.76 mmol) was added at −78 ° C., and the mixture was stirred for 5 minutes. Trifluoroacetic acid S-ethyl ester (0.50 mL, 8.90 mmol) was added thereto, and the mixture was gradually returned to room temperature and stirred for a whole day and night. The reaction solution was poured into a saturated aqueous ammonium chloride solution (50 mL) and extracted with ethyl acetate (50 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (50 mL), combined with the previous organic layer, and washed with saturated brine (100 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give a residue as a pale yellow oil (1.25 mg). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 4: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, the desired 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-5-hydroxyisoxazoline-3] was obtained. -Yl) -3-methoxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [11]) was obtained as a colorless solid (841 mg, 2.034 mmol, 65.9%).
[0100]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.07 (s, 9H), 1.34 (s, 6H), 3.49 (br-s, 1H), 3.63 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 3.84 ( d, J = 18.8 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.89 (s, 2H), 6.86 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 8.0and 1.4 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H) ppm
¹³CNMR (100 MHz, CDCl_Three); Δ 27.3, 32.5, 32.5, 45.4, 47.3, 55.6, 83.1, 103.1 (q, J = 33.7 Hz), 113.0, 116.4 , 122.0 (d, J = 283.3 Hz), 122.8, 126.7, 128.7, 140.1, 148.5, 155.7, 157.0 ppm
IR (KBr); 3329, 2962, 2873, 1605, 1466, 1410, 1185, 1050, 1005, 860 cm^-1
Mass (m / z,%); 413 (M⁺29), 398 (100), 380 (28), 342 (26), 324 (12), 288 (35), 270 (60), 214 (22), 160 (22), 57 (8).
[0101]
(Reference Example 10)
[0102]
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[0103]
4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-5-hydroxyisoxazolin-3-yl) -3-methoxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran at room temperature P-Toluenesulfonic acid monohydrate (45.8 mg, 0.241 mmol) was added to a toluene (10 mL) solution in which (Compound [11]) (922 mg, 2.230 mmol) was dissolved. Refluxed. The reaction solution was poured into saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (50 mL) and extracted with ethyl acetate (50 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (50 mL), combined with the previous organic layer, and washed with saturated brine (100 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give a residue as a pale yellow solid (930 mg). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 4: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, the desired 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3- Methoxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [12]) was obtained as a colorless solid (748 mg, 1.983 mmol, 88.9%).
[0104]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.09 (s, 9H), 1.36 (s, 6H), 3.90 (s, 2H), 3.93 (s, 3H), 6.95 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 7.8 and 1.2 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.8 Hz, 1H) ppm
¹³CNMR (100 MHz, CDCl_Three); Δ 27.4, 32.5, 32.5, 47.3, 55.7, 83.6, 106.8 (d, J = 1.7 Hz), 113.0, 115.8, 118.0 (D, J = 269.8 Hz), 122.9, 126.4, 128.8, 140.2, 148.8, 156.6.157.8 (q, J = 42.0 Hz), 159.8 ppm
IR (KBr); 2961, 2870, 1606, 1450, 1313, 1178, 1152, 1052, 967, 834 cm^-1
Mass (m / z,%); 395 (M⁺22), 380 (100), 345 (16), 338 (19), 324 (25), 270 (53), 244 (10), 228 (7), 214 (9), 160 (13), 149 (10), 57 (15).
[0105]
(Reference Example 11)
[0106]
Embedded image

[0107]
Under nitrogen atmosphere, at 0 ° C., ethanethiol (0.40 mL, 5.40 mmol) was added to DMF (3 mL) in which sodium hydride 60%, 135 mg (3.38 mmol) was suspended, and the mixture was stirred for 15 minutes. To the reaction solution, 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3-methoxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [12] ) (664 mg, 1.679 mmol) dissolved in DMF (3 mL) was added dropwise and heated to 140 ° C. for 1 hour. The reaction solution was poured into a saturated aqueous ammonium chloride solution (50 mL) and extracted with ethyl acetate (50 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (50 mL), combined with the previous organic layer, and washed with saturated brine (100 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to give a residue as a pale yellow solid (671 mg). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 4: 1 mixed solvent of hexane and ethyl acetate, the desired 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3- Hydroxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [13]) was obtained as a colorless solid (533 mg, 1,398 mmol, 83.3%).
[0108]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ1.08 (s, 9H), 1.34 (s, 6H), 3.89 (s, 2H), 6.95 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1H), 7.06 ( d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 10.6 (s, 1H)
ppm
¹³CNMR (100 MHz, CDCl_Three); Δ 27.3, 32.5, 32.5, 47.4, 83.3, 109.2, 118.7 (q, J = 266.8 Hz), 119.1, 121.6, 126.0 , 127.5 (d, J = 3.3 Hz), 138.4 (q, J = 44.5 Hz), 142.1, 148.4, 157.3, 163.
0 ppm
IR (KBr); 3355, 3148, 2960, 2868, 1629, 1576, 1494, 1330, 1179, 1147, 1052, 765 cm^-1
Mass (m / z,%); 381 (M⁺, 61), 366 (100), 324 (6), 310 (88), 278 (11), 256 (85), 228 (18), 200 (17), 57 (19).
[0109]
Example 1
[0110]
Embedded image

[0111]
In an oxygen atmosphere at 0 ° C., 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3-hydroxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran ( Compound [13]) (80.0 mg, 0.2098 mmol) dissolved in CH₂C1₂After adding TPP (2.1 mg) to the (5 mL) solution, the solution was irradiated with a sodium lamp and stirred for 30 minutes. The reaction solution was concentrated to give a residue as a green solid (81.2 mg). When this was applied to a silica gel column and poured out with a 20: 1 mixed solvent of hexane and diethyl ether, the desired 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3- Hydroxyphenyl] -4,4-dimethyl-2,6,7-trioxabicyclo [3.2.0] heptane (compound [14]) as a pale yellow solid (75.3 mg, 0.1822 mmol, 86.8% ).
[0112]
¹HNMR (400 MHz, CDCl_Three); Δ 1.02 (s, 9H), 1.17 (s, 3H), 1.39 (s, 3H), 3.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 8.3 and 1.5 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 1) .5 Hz, 1 H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 10.67 (s, 1 H) ppm
¹³CNMR (100 MHz, CDCl_Three); Δ 18.5, 25.1, 27.0, 36.8, 45.7, 80.5, 105.4, 110.3, 115.9, 117.9, 118.7 (q, J = 267.0 Hz), 119.7, 126.0, 127.5 (d, J = 2.5 Hz), 138.7 (q, J = 44.5 Hz), 141.8,
157.3, 162.7 ppm
IR (KBr); 3144, 2975, 2898, 1613, 1550, 1494, 1371, 1331, 1219, 1149, 1035, 959, 872 cm^-1
Mass (m / z,%); 413 (M⁺, 1), 381 (13), 366 (20), 357 (28), 328 (7), 273 (33), 256 (100), 228 (13), 200 (14), 57 (25).
[0113]
(Example 2)
4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3-hydroxyphenyl] -4,4-dimethyl-2,6,7-trioxa obtained in Example 1 1.00 × 10 of bicyclo [3.2.0] heptane (compound [14])^-Five1 mL of M acetonitrile solution was added to 1.00 × 10 4 of tetrabutylammonium fluoride.^-2It added to 2 mL of M DMSO solutions at 40 degreeC, and the light emission at that time was measured with the fluorescence spectrometer. The quantum yield of light emission at this time is estimated to be 0.44, the half-life of light emission is 1400 seconds, λ_maxWas 481 nm.
[0114]
(Example 3)
4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3-hydroxyphenyl] -4,4-dimethyl-2,6,7-trioxa obtained in Example 1 1.00 × 10 of bicyclo [3.2.0] heptane (compound [14])^-Four1 mL of M acetonitrile solution was added to 2 mL of 0.1N sodium hydroxide solution at 40 ° C., and luminescence at that time was measured with a fluorescence analyzer. The quantum yield of light emission at this time is estimated to be 0.39, the half-life of light emission is 2700 seconds, λ_maxWas 479 nm.
[0115]
(Example 4)
4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3-hydroxyphenyl] -4,4-dimethyl-2,6,7-trioxa obtained in Example 1 1.00 × 10 of bicyclo [3.2.0] heptane (compound [14])^-30.1 mL of M acetonitrile solution was added at 40 ° C. to 2 mL of 0.1N sodium hydroxide solution and 0.9 mL of distilled water, and the luminescence at that time was measured with a fluorescence analyzer. At this time, the emission quantum yield is estimated to be 0.24, the half-life of emission is 1200 seconds, λ_maxWas 476 nm.
[0116]
(Reference Example 12)
[0117]
Embedded image

[0118]
Under nitrogen atmosphere, at 0 ° C., 1.84 mL (22.8 mmol) of pyridine was added to 30 mL of dichloromethane, and further 1.33 mL (14.3 mmol) of phosphorus oxychloride was added and stirred for 15 minutes. 4-t-butyl-5- [4- (5-trifluoromethyl-3-isoxazolyl) -3-hydroxyphenyl] -3,3-dimethyl-2,3-dihydrofuran (compound [13]) was added to the reaction solution. ) (1.44 g, 3.78 mmol) in dichloromethane (12 mL) was added dropwise, stirred at 0 ° C. for 2 hours, gradually warmed to room temperature and stirred overnight.
[0119]
The reaction solution was cooled again to 0 ° C., 3.68 mL (45.5 mmol) of pyridine was added, 3.20 mL (47.3 mmol) of ethylene cyanohydrin was further added, and the mixture was gradually returned to room temperature and stirred overnight. The reaction solution was poured into pure water (50 mL) and extracted with ethyl acetate (50 mL). The aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (50 mL), combined with the previous organic layer, and washed with pure water (100 mL × 3). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to obtain the target 5- (3-tert-butyl-4,4-dimethyl-4,5-dihydrofuran-2-yl) -2- (5) phosphate. -Trifluoromethylisoxazol-3-yl) phenyl ester Bis- (2-cyanoethyl) ester (compound [15]) was obtained as a pale yellow oil (2.10 g, 3.70 mmol, 98.1%).
[0120]
¹HNMR (500 MHz, CDCl_Three ); Δ 1.08 (s, 9H), 1.35 (s, 6H), 2.80 (m, 4H), 3.90 (s, 2H), 4.45 (m, 4H), 7.33 (Dd, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.63 (d, 1H), 8.09 (dd, 1H), ppm.
[0121]
(Reference Example 13)
[0122]
Embedded image

[0123]
Phosphoric acid-5- (3-tert-butyl-4,4-dimethyl-4,5-dihydrofuran-2-yl) -2- (5-trifluoromethylisoxazol-3-yl) phenyl ester at room temperature 28% sodium methylate / methanol solution (1.6 mL) was added to a solution of bis- (2-cyanoethyl) ester (compound [15]) (1.20 g, 2.11 mmol) dissolved in methanol (40 mL) for 1 hour 30 minutes. Stir. A saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (2.0 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 30 minutes and concentrated to obtain a white solid. Methanol (20 mL) was added to the solid, and insoluble materials were removed by filtration. When the filtrate was concentrated, the target mono- [5- (3-t-butyl-4,4-dimethyl-4,5-dihydrofuran-2-yl) -2- (5-trifluoromethylisophosphate) was obtained. Oxazol-3-yl) phenyl] ester disodium salt (compound [16]) was obtained as a white solid (0.69 g, 1.37 mmol, 64.5%).
[0124]
¹HNMR (500 MHz, CD_ThreeOD); δ 1.11 (s, 9H), 1.34 (s, 6H), 3.83 (s, 2H), 6.98 (dd, 1H), 7.78 (d, 1H), 7. 85 (d, 1H), 8.05 (d, 1H), ppm.
[0125]
(Example 5)
[0126]
Embedded image

[0127]
Mono- [5- (3-t-butyl-4,4-dimethyl-4,5-dihydrofuran-2-yl) -2- (5-trifluoromethylisoxazole) phosphate at 0 ° C. in an oxygen atmosphere -3-yl) phenyl] ester disodium salt (compound [16]) (65.0 mg, 0.129 mmol) dissolved in methanol (4 mL) and dichloromethane (15 mL) was mixed with TPP (2.0 mg). After the addition, it was irradiated with sodium lamp and stirred for 2 hours. The reaction mixture was concentrated, methanol was added to the concentrate, and the insoluble material was filtered through a 0.45 μm polytetrafluoroethylene filter and concentrated again. The concentrate was dissolved in pure water (1.5 ml) and subjected to HPLC using a polymer reverse phase C18 preparative column, and the fraction eluted with water and acetonitrile was lyophilized to obtain the desired phosphoric acid. Mono- [5- (5-t-butyl-4,4-dimethyl-2,6,7-trioxabicyclo [3.2.0] hept-1-yl) -2- (5-trifluoromethyliso Oxazol-3-yl) phenyl] ester disodium salt (compound [17]) was obtained as a white solid (52.0 mg, 0.097 mmol, 75.3%).
[0128]
¹HNMR (500 MHz, CD_ThreeOD); δ 1.04 (s, 9H), 1.14 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 3.83 (d, 1H), 4.49 (d, 1H), 7. 33 (dd, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.91 (dd, 1H), 8.35 (d, 1H) ppm.
[0129]
【The invention's effect】
The 1,2-dioxetane derivative (I) of the present invention can exhibit stable luminescence with a high quantum yield and has high thermal stability, so that no degradation products are seen after one year depending on refrigeration storage. It is a very stable compound. Therefore, the measurement of luminescence can be performed simply and efficiently, and is useful, for example, in the field of clinical examinations. In addition, the 1,2-dioxetane derivative (I) of the present invention has not only high thermal stability and high luminous efficiency, but also eliminates the operation of adding the enhancer itself and the enhancer in a protic solvent. Can save you time.

Claims (7)

The compound is of the formula (I ′)

(In the formula, R ⁴ is a hydroxyl group, an aralkyloxy group having 7 to 20 carbon atoms , —OSi (R ⁵ R ⁶ R ⁷ ) (where R ⁵ , R ⁶ and R ⁷ have a substituent independently of each other). A linear alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a branched alkyl group, a cyclic alkyl group, an aromatic hydrocarbon group having 6 to 20 carbon atoms, or 1 in the ring. A heteroaryl group having ˜5 nitrogen atoms, oxygen atoms or sulfur atoms ), and 1 to 5 alkoxy groups having 1 to 20 carbon atoms bonded to each other on a straight chain or on a branch. Group , phosphate group , or —S (C═O) R ⁸ (wherein R ⁸ is an optionally substituted linear alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, branched alkyl group) 1-5 groups, cyclic alkyl groups, the number 6-20 aromatic hydrocarbon group having a carbon or a ring, Nitrogen atom, the 1,2-dioxetane derivative represented by is a group represented by a is) heteroaryl group) having an oxygen atom or a sulfur atom. A chemiluminescent reagent comprising the 1,2-dioxetane derivative according to claim 1. A luminescent method comprising decomposing the 1,2-dioxetane derivative according to claim 1 to cause chemiluminescence. 4. The method of claim 3, wherein chemiluminescence is produced in the absence of other enhancers. A measurement method comprising measuring a detection substance in a sample using the luminescence method according to claim 3. A light-emitting method comprising causing the compound having a 1,2-dioxetane structure according to claim 1 to emit light in a protic solvent in the absence of another enhancer. The method according to claim 6, wherein the emission quantum yield is 1% or more.