JP4288571B2 - 標的物質の生理的機能を解析する方法 - Google Patents
標的物質の生理的機能を解析する方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的物質の生理的機能を光照射によって不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法、その解析方法に用いられる光増感剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、標的タンパク質の機能部位を時空間的に不活性化して、そのタンパク質の機能性部位またはその機能を特定することによって、そのタンパク質の機能解析を行なう方法として、発色団補助光不活性化法（Chromophore-assisted lightinactivation；ＣＡＬＩ）が知られている（特開２０００−２０６１１６号公報（特許文献１）、特表２００２−５３１８１０号公報（特許文献２）など参照）。これらの特許文献には、ＣＡＬＩにおいては、マラカイトグリーン、ローダミン誘導体、フルオレセイン誘導体等が光増感剤として使用され得ることが開示されている。ＣＡＬＩにおいて使用される光増感剤としては、マラカイトグリーンより、フルオレセイン誘導体が好適であることも知られている（Proc. Nat., Acad. Sci. USA, Vol.95, pp.4293-4298, April 1988 Biophysics（非特許文献１）参照）。そして、光増感剤としてフルオレセインを用いる場合は、一重項酸素が標的タンパク質の標的部位の機能破壊に寄与していることが知られている（Proteomics 2002, 2, 247-255（非特許文献２）参照）。
【０００３】
一方、種々のフルオレセイン誘導体における、一重項酸素の産生については、Photochemistry and Photobiology, Vo.37, No.3, pp271-278, 1983（非特許文献３）に記載されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２０６１１６号公報
【特許文献２】
特表２００２−５３１８１０号公報
【非特許文献１】
Proc. Nat., Acad. Sci. USA, Vol.95, pp.4293-4298, April 1988 Biophysics
【非特許文献２】
Proteomics 2002, 2, 247-255
【非特許文献３】
Photochemistry and Photobiology, Vo.37, No.3, pp271-278, 1983
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記文献に記載されるように、従来は光照射依存的な生体機能の時空間的な破壊の為に、マラカイトグリーンやフルオレセインが光増感剤として用いられてきた。しかし、これらの物質を用いると単位光照射当たりに産生する活性酸素の量が少ないため、光照射の量を多くするか、あるいは照射時間を長くする必要があった。従って、従来の光増感剤を用いると強光照射自身による光毒性が懸念されたり、より短い時間分解能が要求される生体機能解析研究を行なうことが出来なかった。ゆえに、より短くより弱い光照射で生体機能の時空間的な破壊を行なうことができる解析方法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもので、本発明の第１の態様によれば、標的物質の生理的機能を不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）：
【化３】
（式中、Ｑはこの化合物を標的物質と結合させるための基である）
で表される光活性化合物を標的物質に結合し、該標的物質と該光活性化合物を含む複合体を形成する工程、及び
（ｂ）得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質の機能、あるいは、その光活性化合物が結合した部位における標的物質の機能を不活性化する工程を含む上記標的物質の生理的機能を解析する方法が提供される。光活性化合物と標的物質との結合は、直接、あるいは該標的物質に結合し得るパートナー物質を介して行われる。
【０００７】
本発明の第２の態様によれば、式（Ｉ）で表される光活性化合物を含む、標的物質の機能を不活性化させるための光増感剤が提供される。上記式（Ｉ）中、Ｑは、例えば、−Ａ−Ｑ1で表される、パートナー物質と結合し得る基であり、ここで、Ａは化学結合又は鎖中に、炭素、酸素及び窒素から選択される１〜９個の原子を含むスペーサー基であり、そしてＱ1はイソシアネート基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。より好適なＱは、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基又はマレイミド基である。
【０００８】
上記式（Ｉ）の化合物は、フルオレセイン誘導体の１つであるテトラブロモフルオレセイン（以下、「エオシン」ともいう）にパートナー物質と結合し得る基を結合させた光活性化合物である。多くのフルオレセイン誘導体が光増感剤として用いられ得ることは知られていたが、本発明者らは、それらのフルオレセイン誘導体の中でエオシンが予期された以上の一重項酸素産生量を示すことを見出して、本発明を完成させたものである。後述の実施例に示すように、実際にアントラセン−９，１０−ジプロピオニック酸（anthracene-9,10-dipuropionic acid）を一重項酸素のプローブとしてフルオレセインとエオシンの一重項酸素産生活性を測定したところ、驚くべきことに、フルオレセインに最適な４８８nmで励起しているにもかかわらず、エオシンはフルオレセインよりも２．５倍程度、単位光照射当たりの産生量が多いことが確認されている。実際にβ−ガラクトシダーゼに対する抗体をエオシンでラベルしたものをβ−ガラクトシダーゼと結合させると５１５ｎｍの光照射によりβ―ガラクトシダーゼ活性を約３．５倍減弱させることができることも確認されている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
【００１０】
本発明の第１の態様は、標的物質の生理的機能を不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）で表される光活性化合物を標的物質に、直接、あるいはその標的物質と結合し得るパートナー物質を介してその標的物質に結合して、該標的物質と該光活性化合物との複合体、あるいは該標的物質と該パートナー物質と該光活性化合物との複合体を形成する工程、及び
（ｂ）得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質の機能、あるいは、その光活性化合物が結合した部位における標的物質の機能を不活性化する工程を含む上記標的物質の生理的機能を解析する方法に関する。
【００１１】
本発明の好ましい態様においては、上記工程（ａ）において、式（Ｉ）で表される光活性化合物を、標的物質のパートナー物質を介して標的物質に結合して、該標的物質と、該パートナー物質と、該光活性化合物との複合体を形成する。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物は、光増感剤であるエオシンに、これを標的物質に結合させるための基「Ｑ」を結合させた化合物である。Ｑは、エオシンを標的物質に直接的に、又は後述のパートナー物質等を介して間接的に結合させるための基であり、この目的を達成する限り、特に限定されるものではない。Ｑは、例えば、−Ａ−Ｑ1であり、ここで、Ａは化学結合又は鎖中に、炭素、酸素及び窒素から選択される１〜９個（通常は１〜６個）の原子を含むスペーサー基であり、そしてＱ1はイソシアネート基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。スペーサー基「Ａ」は、より好ましくは、化学結合、１〜６個（通常２〜４個）の炭素原子のアルキレン、−ＣＯＮＨＣＨ2−、−ＮＨ(ＣＯＮＨＣＨ2−)x、−ＮＨＣＳ(ＮＨＣＨ2ＣＯ)xＮＨＣＨ2−（ここでｘは１乃至３である）などである。より好適なＱは、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基又はマレイミド基である。なお、標的物質がアミノ基を有する場合は、Ｑとして、例えば、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基などが選択される。また標的物質がメルカプト基を有する場合は、Ｑとして、例えば、マレイミド基、ヨードアセトアミド基が選択される。このような結合基及びスペーサー基については、例えば、特開平５−３１０８００号公報、特表平８−５０５１２１号公報などの記載が参照される。なお、エオシン及びそのイソチオシアネート体は公知であり、市販されている。上記置換基「Ｑ」を有するエオシン誘導体は、当業者に公知の手法で合成することができる。
【００１３】
本発明の方法において、標的物質とは、その生理的機能を解明する対象となる生体分子をいい、特にこれらに限定されないが、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、シグナル伝達物質などが挙げられる。特に、本発明の方法が標的とする物質は、タンパク質であり、酵素、受容体タンパク質、リガンドタンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写制御タンパク質、骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、スキャホールドタンパク質等が好適なターゲットとして例示される。
【００１４】
本発明で用いられるパートナー物質は、本発明の方法において対象となる標的物質に結合し得る物質をいう。本発明で用いられるパートナー物質は、特にこれらに限定されないが、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、その他標的タンパク質に結合し得る化合物（例えば、受容体に結合するリガンド、酵素に結合する基質、イノシトール三リン酸などの受容体に結合し得るシグナル伝達物質）などが挙げられる。パートナー物質は、特開２０００−２０６１１６号公報に開示されているように、１段階選択（ＤＥ１９８０２５７６．９号明細書を参照）、ファージディスプレイ(phage display)(Cwirla, S.E. et al. 1997, Science 273, 464-471)、プラスミド上のペプチド(Stricker, N.L.et al. 1997, Nature Biotechnology 15, 336-342)、ＳＩＰ(Spada, S. et al.1997, Biol. Chem. 378, 445-456)、ＣＬＡＰ(Malmborg, A.-C. et al. 1997,JMB 273, 544-551)、リボソーム／ポリソームディスプレイ(Kawasaki, G. 1991,国際特許出願ＷＯ９１／０５０５８号明細書；Hanes, J. & Pluckthun, A. 1997, PNAS 94, 4937-4942)またはＳＥＬＥＸ(Tuerk, C. & Gold, L. 1990, Science 249, 505-510)などの技術を利用して、組合せライブラリーから選択することもできる。このようなライブラリーとしては、例えば、タンパク質ライブラリー、ペプチドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、ｍＲＮＡライブラリー、有機分子とのライブラリー、免疫グロブリンスーパーファミリーとのｓｃＦｖライブラリー、タンパク質ディスプレーライブラリーなどが挙げられる。 なお、本発明の好ましい態様では、前記標的物質が酵素などのタンパク質であり、前記パートナー物質がそのタンパク質に結合し得る抗体、ｓｃＦｖまたはＦａｂである。
【００１５】
上記工程（ａ）においては、上記のような光活性化合物（Ｌ）を、標的物質に結合するパートナー物質（Ｐ）、例えば抗体を介して、標的物質（Ｔ）、例えばタンパク質に結合させて、それらが結合した複合体（Ｌ−Ｐ−Ｔ）を形成する。このような複合体（Ｌ−Ｐ−Ｔ）の形成は、パートナー物質（Ｐ）と光活性物質（Ｌ）とを結合させてから、これに標的物質（Ｔ）を結合させて行なうこともできるし、標的物質（Ｔ）とパートナー物質（Ｐ）を結合させてから、光活性物質（Ｌ）を結合させることによって行なうこともできる。
なお、上記工程（ａ）においては、光活性化合物を標的タンパク質に直接結合させることもできる。この場合は、光活性化合物を側鎖に持つ非天然アミノ酸を標的タンパク質の特異的な部位に導入する方法として、４塩基コドン又は５塩基コドンを利用することができる（T. Hohsaka, Biochemistry 2001, 40, p11060-11064等参照）。この場合、光活性化合物とそれを側鎖にもつアミノ酸のＣαとの間には前述のスペーサー基「Ａ」が介在してもよい。
【００１６】
この複合体の形成は、標的物質の生理的機能が損なわれないような条件で行われる。このような条件は、標的物質及びパートナー物質などの性質を理解している当業者であれば、適宜、個別に設定できるものである。例えば、標的物質がタンパク質の場合は、複合体形成が生じてもそのタンパク質が変性されないような条件下で、両者が接触される。その条件は標的タンパク質の細胞環境の生理学的条件に対応することが好ましい。
【００１７】
次いで、上記工程（ｂ）においては、ＣＡＬＩ技術を用いて、得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質、あるいは、光活性化合物が結合した部位の標的物質の機能を直接かつ特異的に不活性化する（PNAS,85,5454-5458,1988；Trends in Cell Biology,6,442-445,1996参照）。すなわち、本発明の光活性化合物の吸収波長である、４８０〜５４０ｎｍの波長の光を照射すると、この光は光活性化合物に吸収されて、一重項酸素（singlet oxygen）を産生し、約１０〜５０Åの半径で光増感剤に結合された標的物質（例えば、タンパク質）あるいはその機能性部位を選択的に不活化する。なお、エオシンの吸収極大（ｍａｘλ）は、水中で、５１７ｎｍであり、エタノール中で、５２３ｎｍである（Photochemistry and Photobiology, Vo.37, No.3, pp271-278, 1983参照）。不活性化に必要な照射量は、例えば、０．１Ｊ/cm2から１０Ｊ/cm2、好ましくは０．５から２Ｊ/cm2である。照射光の種類は、特にこれに限定されないが、例えば、キセノンアーク光、水銀アーク光、ハロゲンランプ、タングステンランプ、色素レーザーやアルゴンレーザー(488または514.5nmライン)、Nd:YAGレーザーの２倍波（532nm）などを用いることができる。
【００１８】
このようにして、標的物質自体あるいは標的物質の特定部位を不活性化することによって、その標的物質の生理的機能を解析することができる。例えば、このような不活性化によって、タンパク質の機能性部位の同定、その機能性部位の機能の確認、リガンドの機能の確認、機能性部位のタンパク質寿命に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質動態に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質フォールディングに及ぼす影響の確認などを行なうことができる。なお、本発明の解析方法は、インビトロおよびインビボアッセイに、また細胞内外の標的分子に利用可能である。
【００１９】
例えば、不活化されたタンパク質の機能性部位の特定は、特表２００２−５３１８１０号公報に記載のように、不活性化されたタンパク質を断片化し、質量スペクトル測定に供することによって可能である。
【００２０】
具体的には、不活性化されたタンパク質は、特定の位置で切断するプロテアーゼを用いて断片化する。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパインなどが挙げられる。タンパク質の化学的切断は、例えば臭化シアン（Ｍｅｔに特異的）、３―ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＮＰＳ−スカトール；Ｔｒｐに特異的）、２−ニトロ−５−チオシアナト安息香酸（Ｃｙｓに特異的）およびＦｅ−ＥＤＴＡによっても行なうことができる。
【００２１】
切断された断片混合物は電気泳動により分別され、次いで、質量スペクトル測定および未処理標的タンパク質との比較により、不活性化された部位を特定することができる。標的タンパク質がＣＡＬＩにより不活化されるとすぐに、タンデム質量スペクトル測定によって、不活化に関与している不活化タンパク質の変性アミノ酸を特定することができる（Rapid Commun.Mass Spectrom.,11,1015-1024,1997；Rapid Commun.Mass Spectrom.,11,1067-1075,1997参照）。質量スペクトル測定による分析は、種々の公知の手法で、例えば、ナノ電子スプレー（Wilm.M.and Mann,M.,Anal.Chem.68,1-8,1996）、マトリックス介助レーザー脱着およびイオン化（ＭＡＬＤＩ）（Siuzdak,G.Mass Spectrometry for Biotechnology,Academic Press Inc.1996）を含めた電子スプレーのようなイオン化源を用いて（Chapman,J.R.,et al.,Methods in Molecular biology,61,JR Chapman editor,Humana Press Inv.Totowa NJ,USA,1996）、またはトリプル、四重極、飛行時間型、磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴および四重極イオン捕捉のような質量分析の組合せを用いて行なうことができる。
なお、上記分析方法の詳細、あるいはこれを自動化した装置については、特表２００２−５３１８１０号公報の記載が参照される。
【００２２】
また、特開２０００−２０６１１６号公報には、ＣＡＬＩ技術を用いた標的リガンドの機能を確認する方法が記載されており、本発明の方法は、そのようなリガンド機能確認法にも応用することができる。
さらに、本発明に係る光増感剤は、効率良く一重項酸素を産生するので、光力学療法用治療薬としての応用も考えられる（特表２０００−５００７４１号公報参照）。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
【００２４】
実験例１： 一重項酸素発生量の比較
アントラセン−９，１０−ジプロピオニック酸(Molecular Probe)と各色素（エオシン、フルオレセインをそれぞれ100μＭになるようにPBS(-)に溶解し100μＬとした。参考のため、各色素の構造式を次に示す。
【００２５】
次いで、得られた各試料について、テラサキプレート(Nalge Nunc)の2穴に20μｌずつ分注し、一方の試料に2W/cm2の488nm レーザー光(Sapphire, Coherent)を60秒照射した。光照射した試料としていない試料それぞれにPBS(-)を300μＬ加えて、石英ガラスキュベットに移し、蛍光光度計（日立）を用いて、380nm励起による430nmの蛍光を測定した。なお、アントラセン−９，１０−ジプロピオニック酸は380nm励起により430nmを極大ピークとする蛍光を発するが、一重項酸素により、酸化され無蛍光性となる。一重項酸素の測定はこの原理に基づいている。
【００２６】
このようにして得られた結果を図１に示す。なお、図１に示すグラフは光照射していない試料の蛍光強度を100%とした時の光照射した試料の蛍光強度を示す。対照として色素を含まない試料を用いた(コントロール)。同様の実験を３回行ない平均値および標準誤差を求めた。図１に示されるように、フルオレセインに最適な４８８nmで励起しているにもかかわらず、エオシンはフルオレセインと比較すると、２．５倍効率よく一重項酸素を発生することが確認された。
【００２７】
実施例１及び比較例１： β−ガラクトシダーゼの不活性化
抗β―ガラクトシダーゼ抗体を濃度が80μg/ｍＬになるように0.5M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH9.5)に溶解した後、40μg/ｍＬのエオシンイソチオシアネート（EITC： Molecular Probe；実施例１）またはフルオレセインイソチオシアネート（FITC： Molecular Probe；比較例１）を加え、遮光し30分インキュベートした。試料をPD-10 プレパックカラム(amasham pharmacia biotech)を用いてゲルろ過し、色素標識された試料を回収した。抗ウサギIgG抗体も同様にFITCにより標識した。β―ガラクトシダーゼ(10μg/ｍＬ)、色素標識された抗β―ガラクトシダーゼ抗体(200μg/ｍＬ)、BSA(120μg/ｍＬ)を含むPBS(-)溶液をテラサキプレート(Nalge Nunc)の2穴に15μＬずつ分注し、一方の試料に2W/cm2の488nm レーザー光(Sapphire, Coherent)を60秒照射した。
【００２８】
β―ガラクトシダーゼ活性は、レポーター溶解バッファー（Reporter Lysis Buffer）を用いたβ―ガラクトシダーゼ・エンザイムアッセイシステム(Promega)を用いて測定した。対照として色素標識されていない抗β―ガラクトシダーゼ抗体およびフルオレセイン標識抗ウサギIgG抗体を用いた。同様の実験を３回行ない平均値および標準誤差を求めた。得られた結果を図２に示す。図２に示すグラフは、光照射していない試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を100%とした時の光照射した試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を示す。なお、図中、（１）は抗β―ガラクトシダーゼ抗体、（２）はフルオレセイン標識抗β―ガラクトシダーゼ抗体、（３）はエオシン標識抗β―ガラクトシダーゼ抗体、（４）はフルオレセイン標識抗ウサギIgG抗体の場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
【００２９】
図２に示されるグラフから明らかなように、エオシンでラベルされた抗β―ガラクトシダーゼ抗体を結合させたβ―ガラクトシダーゼ（実施例１）は、フルオレセインでラベルした場合（比較例１）に比較して、β−ガラクトシダーゼ活性を約３．５倍減弱させたことが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標的物質の生理的機能を光照射によって不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する改良された方法及びその方法に用いられる光増感剤が提供される。本発明の方法では、単時間の光照射あるいは強度の弱い光照射で足りるので、従来法と比較して光毒性による心配がないという利点がある。また、本発明の方法は、より短い時間分解能が要求される生体機能解析研究にも有効に用いることができるという利点もある。
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実験例１における、光照射していない試料の蛍光強度を100%とした時の光照射した試料の蛍光強度を示す。
【図２】図２は、実施例１及び比較例１における、光照射していない試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を100%とした時の光照射した試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的物質の生理的機能を光照射によって不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法、その解析方法に用いられる光増感剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、標的タンパク質の機能部位を時空間的に不活性化して、そのタンパク質の機能性部位またはその機能を特定することによって、そのタンパク質の機能解析を行なう方法として、発色団補助光不活性化法（Chromophore-assisted lightinactivation；ＣＡＬＩ）が知られている（特開２０００−２０６１１６号公報（特許文献１）、特表２００２−５３１８１０号公報（特許文献２）など参照）。これらの特許文献には、ＣＡＬＩにおいては、マラカイトグリーン、ローダミン誘導体、フルオレセイン誘導体等が光増感剤として使用され得ることが開示されている。ＣＡＬＩにおいて使用される光増感剤としては、マラカイトグリーンより、フルオレセイン誘導体が好適であることも知られている（Proc. Nat., Acad. Sci. USA, Vol.95, pp.4293-4298, April 1988 Biophysics（非特許文献１）参照）。そして、光増感剤としてフルオレセインを用いる場合は、一重項酸素が標的タンパク質の標的部位の機能破壊に寄与していることが知られている（Proteomics 2002, 2, 247-255（非特許文献２）参照）。
【０００３】
一方、種々のフルオレセイン誘導体における、一重項酸素の産生については、Photochemistry and Photobiology, Vo.37, No.3, pp271-278, 1983（非特許文献３）に記載されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２０６１１６号公報
【特許文献２】
特表２００２−５３１８１０号公報
【非特許文献１】
Proc. Nat., Acad. Sci. USA, Vol.95, pp.4293-4298, April 1988 Biophysics
【非特許文献２】
Proteomics 2002, 2, 247-255
【非特許文献３】
Photochemistry and Photobiology, Vo.37, No.3, pp271-278, 1983
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記文献に記載されるように、従来は光照射依存的な生体機能の時空間的な破壊の為に、マラカイトグリーンやフルオレセインが光増感剤として用いられてきた。しかし、これらの物質を用いると単位光照射当たりに産生する活性酸素の量が少ないため、光照射の量を多くするか、あるいは照射時間を長くする必要があった。従って、従来の光増感剤を用いると強光照射自身による光毒性が懸念されたり、より短い時間分解能が要求される生体機能解析研究を行なうことが出来なかった。ゆえに、より短くより弱い光照射で生体機能の時空間的な破壊を行なうことができる解析方法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもので、本発明の第１の態様によれば、標的物質の生理的機能を不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）：
【化３】
で表される光活性化合物を標的物質に結合し、該標的物質と該光活性化合物を含む複合体を形成する工程、及び
（ｂ）得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質の機能、あるいは、その光活性化合物が結合した部位における標的物質の機能を不活性化する工程を含む上記標的物質の生理的機能を解析する方法が提供される。光活性化合物と標的物質との結合は、直接、あるいは該標的物質に結合し得るパートナー物質を介して行われる。
【０００７】
本発明の第２の態様によれば、式（Ｉ）で表される光活性化合物を含む、標的物質の機能を不活性化させるための光増感剤が提供される。上記式（Ｉ）中、Ｑは、例えば、−Ａ−Ｑ1で表される、パートナー物質と結合し得る基であり、ここで、Ａは化学結合又は鎖中に、炭素、酸素及び窒素から選択される１〜９個の原子を含むスペーサー基であり、そしてＱ1はイソシアネート基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。より好適なＱは、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基又はマレイミド基である。
【０００８】
上記式（Ｉ）の化合物は、フルオレセイン誘導体の１つであるテトラブロモフルオレセイン（以下、「エオシン」ともいう）にパートナー物質と結合し得る基を結合させた光活性化合物である。多くのフルオレセイン誘導体が光増感剤として用いられ得ることは知られていたが、本発明者らは、それらのフルオレセイン誘導体の中でエオシンが予期された以上の一重項酸素産生量を示すことを見出して、本発明を完成させたものである。後述の実施例に示すように、実際にアントラセン−９，１０−ジプロピオニック酸（anthracene-9,10-dipuropionic acid）を一重項酸素のプローブとしてフルオレセインとエオシンの一重項酸素産生活性を測定したところ、驚くべきことに、フルオレセインに最適な４８８nmで励起しているにもかかわらず、エオシンはフルオレセインよりも２．５倍程度、単位光照射当たりの産生量が多いことが確認されている。実際にβ−ガラクトシダーゼに対する抗体をエオシンでラベルしたものをβ−ガラクトシダーゼと結合させると５１５ｎｍの光照射によりβ―ガラクトシダーゼ活性を約３．５倍減弱させることができることも確認されている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
【００１０】
本発明の第１の態様は、標的物質の生理的機能を不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）で表される光活性化合物を標的物質に、直接、あるいはその標的物質と結合し得るパートナー物質を介してその標的物質に結合して、該標的物質と該光活性化合物との複合体、あるいは該標的物質と該パートナー物質と該光活性化合物との複合体を形成する工程、及び
（ｂ）得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質の機能、あるいは、その光活性化合物が結合した部位における標的物質の機能を不活性化する工程を含む上記標的物質の生理的機能を解析する方法に関する。
【００１１】
本発明の好ましい態様においては、上記工程（ａ）において、式（Ｉ）で表される光活性化合物を、標的物質のパートナー物質を介して標的物質に結合して、該標的物質と、該パートナー物質と、該光活性化合物との複合体を形成する。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物は、光増感剤であるエオシンに、これを標的物質に結合させるための基「Ｑ」を結合させた化合物である。Ｑは、エオシンを標的物質に直接的に、又は後述のパートナー物質等を介して間接的に結合させるための基であり、この目的を達成する限り、特に限定されるものではない。Ｑは、例えば、−Ａ−Ｑ1であり、ここで、Ａは化学結合又は鎖中に、炭素、酸素及び窒素から選択される１〜９個（通常は１〜６個）の原子を含むスペーサー基であり、そしてＱ1はイソシアネート基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される。スペーサー基「Ａ」は、より好ましくは、化学結合、１〜６個（通常２〜４個）の炭素原子のアルキレン、−ＣＯＮＨＣＨ2−、−ＮＨ(ＣＯＮＨＣＨ2−)x、−ＮＨＣＳ(ＮＨＣＨ2ＣＯ)xＮＨＣＨ2−（ここでｘは１乃至３である）などである。より好適なＱは、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基又はマレイミド基である。なお、標的物質がアミノ基を有する場合は、Ｑとして、例えば、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基などが選択される。また標的物質がメルカプト基を有する場合は、Ｑとして、例えば、マレイミド基、ヨードアセトアミド基が選択される。このような結合基及びスペーサー基については、例えば、特開平５−３１０８００号公報、特表平８−５０５１２１号公報などの記載が参照される。なお、エオシン及びそのイソチオシアネート体は公知であり、市販されている。上記置換基「Ｑ」を有するエオシン誘導体は、当業者に公知の手法で合成することができる。
【００１３】
本発明の方法において、標的物質とは、その生理的機能を解明する対象となる生体分子をいい、特にこれらに限定されないが、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、シグナル伝達物質などが挙げられる。特に、本発明の方法が標的とする物質は、タンパク質であり、酵素、受容体タンパク質、リガンドタンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写制御タンパク質、骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、スキャホールドタンパク質等が好適なターゲットとして例示される。
【００１４】
本発明で用いられるパートナー物質は、本発明の方法において対象となる標的物質に結合し得る物質をいう。本発明で用いられるパートナー物質は、特にこれらに限定されないが、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、その他標的タンパク質に結合し得る化合物（例えば、受容体に結合するリガンド、酵素に結合する基質、イノシトール三リン酸などの受容体に結合し得るシグナル伝達物質）などが挙げられる。パートナー物質は、特開２０００−２０６１１６号公報に開示されているように、１段階選択（ＤＥ１９８０２５７６．９号明細書を参照）、ファージディスプレイ(phage display)(Cwirla, S.E. et al. 1997, Science 273, 464-471)、プラスミド上のペプチド(Stricker, N.L.et al. 1997, Nature Biotechnology 15, 336-342)、ＳＩＰ(Spada, S. et al.1997, Biol. Chem. 378, 445-456)、ＣＬＡＰ(Malmborg, A.-C. et al. 1997,JMB 273, 544-551)、リボソーム／ポリソームディスプレイ(Kawasaki, G. 1991,国際特許出願ＷＯ９１／０５０５８号明細書；Hanes, J. & Pluckthun, A. 1997, PNAS 94, 4937-4942)またはＳＥＬＥＸ(Tuerk, C. & Gold, L. 1990, Science 249, 505-510)などの技術を利用して、組合せライブラリーから選択することもできる。このようなライブラリーとしては、例えば、タンパク質ライブラリー、ペプチドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、ｍＲＮＡライブラリー、有機分子とのライブラリー、免疫グロブリンスーパーファミリーとのｓｃＦｖライブラリー、タンパク質ディスプレーライブラリーなどが挙げられる。 なお、本発明の好ましい態様では、前記標的物質が酵素などのタンパク質であり、前記パートナー物質がそのタンパク質に結合し得る抗体、ｓｃＦｖまたはＦａｂである。
【００１５】
上記工程（ａ）においては、上記のような光活性化合物（Ｌ）を、標的物質に結合するパートナー物質（Ｐ）、例えば抗体を介して、標的物質（Ｔ）、例えばタンパク質に結合させて、それらが結合した複合体（Ｌ−Ｐ−Ｔ）を形成する。このような複合体（Ｌ−Ｐ−Ｔ）の形成は、パートナー物質（Ｐ）と光活性物質（Ｌ）とを結合させてから、これに標的物質（Ｔ）を結合させて行なうこともできるし、標的物質（Ｔ）とパートナー物質（Ｐ）を結合させてから、光活性物質（Ｌ）を結合させることによって行なうこともできる。
なお、上記工程（ａ）においては、光活性化合物を標的タンパク質に直接結合させることもできる。この場合は、光活性化合物を側鎖に持つ非天然アミノ酸を標的タンパク質の特異的な部位に導入する方法として、４塩基コドン又は５塩基コドンを利用することができる（T. Hohsaka, Biochemistry 2001, 40, p11060-11064等参照）。この場合、光活性化合物とそれを側鎖にもつアミノ酸のＣαとの間には前述のスペーサー基「Ａ」が介在してもよい。
【００１６】
この複合体の形成は、標的物質の生理的機能が損なわれないような条件で行われる。このような条件は、標的物質及びパートナー物質などの性質を理解している当業者であれば、適宜、個別に設定できるものである。例えば、標的物質がタンパク質の場合は、複合体形成が生じてもそのタンパク質が変性されないような条件下で、両者が接触される。その条件は標的タンパク質の細胞環境の生理学的条件に対応することが好ましい。
【００１７】
次いで、上記工程（ｂ）においては、ＣＡＬＩ技術を用いて、得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質、あるいは、光活性化合物が結合した部位の標的物質の機能を直接かつ特異的に不活性化する（PNAS,85,5454-5458,1988；Trends in Cell Biology,6,442-445,1996参照）。すなわち、本発明の光活性化合物の吸収波長である、４８０〜５４０ｎｍの波長の光を照射すると、この光は光活性化合物に吸収されて、一重項酸素（singlet oxygen）を産生し、約１０〜５０Åの半径で光増感剤に結合された標的物質（例えば、タンパク質）あるいはその機能性部位を選択的に不活化する。なお、エオシンの吸収極大（ｍａｘλ）は、水中で、５１７ｎｍであり、エタノール中で、５２３ｎｍである（Photochemistry and Photobiology, Vo.37, No.3, pp271-278, 1983参照）。不活性化に必要な照射量は、例えば、０．１Ｊ/cm2から１０Ｊ/cm2、好ましくは０．５から２Ｊ/cm2である。照射光の種類は、特にこれに限定されないが、例えば、キセノンアーク光、水銀アーク光、ハロゲンランプ、タングステンランプ、色素レーザーやアルゴンレーザー(488または514.5nmライン)、Nd:YAGレーザーの２倍波（532nm）などを用いることができる。
【００１８】
このようにして、標的物質自体あるいは標的物質の特定部位を不活性化することによって、その標的物質の生理的機能を解析することができる。例えば、このような不活性化によって、タンパク質の機能性部位の同定、その機能性部位の機能の確認、リガンドの機能の確認、機能性部位のタンパク質寿命に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質動態に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質フォールディングに及ぼす影響の確認などを行なうことができる。なお、本発明の解析方法は、インビトロおよびインビボアッセイに、また細胞内外の標的分子に利用可能である。
【００１９】
例えば、不活化されたタンパク質の機能性部位の特定は、特表２００２−５３１８１０号公報に記載のように、不活性化されたタンパク質を断片化し、質量スペクトル測定に供することによって可能である。
【００２０】
具体的には、不活性化されたタンパク質は、特定の位置で切断するプロテアーゼを用いて断片化する。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパインなどが挙げられる。タンパク質の化学的切断は、例えば臭化シアン（Ｍｅｔに特異的）、３―ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＮＰＳ−スカトール；Ｔｒｐに特異的）、２−ニトロ−５−チオシアナト安息香酸（Ｃｙｓに特異的）およびＦｅ−ＥＤＴＡによっても行なうことができる。
【００２１】
切断された断片混合物は電気泳動により分別され、次いで、質量スペクトル測定および未処理標的タンパク質との比較により、不活性化された部位を特定することができる。標的タンパク質がＣＡＬＩにより不活化されるとすぐに、タンデム質量スペクトル測定によって、不活化に関与している不活化タンパク質の変性アミノ酸を特定することができる（Rapid Commun.Mass Spectrom.,11,1015-1024,1997；Rapid Commun.Mass Spectrom.,11,1067-1075,1997参照）。質量スペクトル測定による分析は、種々の公知の手法で、例えば、ナノ電子スプレー（Wilm.M.and Mann,M.,Anal.Chem.68,1-8,1996）、マトリックス介助レーザー脱着およびイオン化（ＭＡＬＤＩ）（Siuzdak,G.Mass Spectrometry for Biotechnology,Academic Press Inc.1996）を含めた電子スプレーのようなイオン化源を用いて（Chapman,J.R.,et al.,Methods in Molecular biology,61,JR Chapman editor,Humana Press Inv.Totowa NJ,USA,1996）、またはトリプル、四重極、飛行時間型、磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴および四重極イオン捕捉のような質量分析の組合せを用いて行なうことができる。
なお、上記分析方法の詳細、あるいはこれを自動化した装置については、特表２００２−５３１８１０号公報の記載が参照される。
【００２２】
また、特開２０００−２０６１１６号公報には、ＣＡＬＩ技術を用いた標的リガンドの機能を確認する方法が記載されており、本発明の方法は、そのようなリガンド機能確認法にも応用することができる。
さらに、本発明に係る光増感剤は、効率良く一重項酸素を産生するので、光力学療法用治療薬としての応用も考えられる（特表２０００−５００７４１号公報参照）。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
【００２４】
実験例１： 一重項酸素発生量の比較
アントラセン−９，１０−ジプロピオニック酸(Molecular Probe)と各色素（エオシン、フルオレセインをそれぞれ100μＭになるようにPBS(-)に溶解し100μＬとした。参考のため、各色素の構造式を次に示す。
【００２５】
次いで、得られた各試料について、テラサキプレート(Nalge Nunc)の2穴に20μｌずつ分注し、一方の試料に2W/cm2の488nm レーザー光(Sapphire, Coherent)を60秒照射した。光照射した試料としていない試料それぞれにPBS(-)を300μＬ加えて、石英ガラスキュベットに移し、蛍光光度計（日立）を用いて、380nm励起による430nmの蛍光を測定した。なお、アントラセン−９，１０−ジプロピオニック酸は380nm励起により430nmを極大ピークとする蛍光を発するが、一重項酸素により、酸化され無蛍光性となる。一重項酸素の測定はこの原理に基づいている。
【００２６】
このようにして得られた結果を図１に示す。なお、図１に示すグラフは光照射していない試料の蛍光強度を100%とした時の光照射した試料の蛍光強度を示す。対照として色素を含まない試料を用いた(コントロール)。同様の実験を３回行ない平均値および標準誤差を求めた。図１に示されるように、フルオレセインに最適な４８８nmで励起しているにもかかわらず、エオシンはフルオレセインと比較すると、２．５倍効率よく一重項酸素を発生することが確認された。
【００２７】
実施例１及び比較例１： β−ガラクトシダーゼの不活性化
抗β―ガラクトシダーゼ抗体を濃度が80μg/ｍＬになるように0.5M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH9.5)に溶解した後、40μg/ｍＬのエオシンイソチオシアネート（EITC： Molecular Probe；実施例１）またはフルオレセインイソチオシアネート（FITC： Molecular Probe；比較例１）を加え、遮光し30分インキュベートした。試料をPD-10 プレパックカラム(amasham pharmacia biotech)を用いてゲルろ過し、色素標識された試料を回収した。抗ウサギIgG抗体も同様にFITCにより標識した。β―ガラクトシダーゼ(10μg/ｍＬ)、色素標識された抗β―ガラクトシダーゼ抗体(200μg/ｍＬ)、BSA(120μg/ｍＬ)を含むPBS(-)溶液をテラサキプレート(Nalge Nunc)の2穴に15μＬずつ分注し、一方の試料に2W/cm2の488nm レーザー光(Sapphire, Coherent)を60秒照射した。
【００２８】
β―ガラクトシダーゼ活性は、レポーター溶解バッファー（Reporter Lysis Buffer）を用いたβ―ガラクトシダーゼ・エンザイムアッセイシステム(Promega)を用いて測定した。対照として色素標識されていない抗β―ガラクトシダーゼ抗体およびフルオレセイン標識抗ウサギIgG抗体を用いた。同様の実験を３回行ない平均値および標準誤差を求めた。得られた結果を図２に示す。図２に示すグラフは、光照射していない試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を100%とした時の光照射した試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を示す。なお、図中、（１）は抗β―ガラクトシダーゼ抗体、（２）はフルオレセイン標識抗β―ガラクトシダーゼ抗体、（３）はエオシン標識抗β―ガラクトシダーゼ抗体、（４）はフルオレセイン標識抗ウサギIgG抗体の場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
【００２９】
図２に示されるグラフから明らかなように、エオシンでラベルされた抗β―ガラクトシダーゼ抗体を結合させたβ―ガラクトシダーゼ（実施例１）は、フルオレセインでラベルした場合（比較例１）に比較して、β−ガラクトシダーゼ活性を約３．５倍減弱させたことが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標的物質の生理的機能を光照射によって不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する改良された方法及びその方法に用いられる光増感剤が提供される。本発明の方法では、単時間の光照射あるいは強度の弱い光照射で足りるので、従来法と比較して光毒性による心配がないという利点がある。また、本発明の方法は、より短い時間分解能が要求される生体機能解析研究にも有効に用いることができるという利点もある。
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実験例１における、光照射していない試料の蛍光強度を100%とした時の光照射した試料の蛍光強度を示す。
【図２】図２は、実施例１及び比較例１における、光照射していない試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を100%とした時の光照射した試料のβ―ガラクトシダーゼ活性を示す。
Claims (10)
- 標的物質の生理的機能を不活性化することによってその標的物質の生理的機能を解析する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）：
で表される光活性化合物を標的物質に結合し、該標的物質と該光活性化合物を含む複合体を形成する工程、及び
（ｂ）得られた複合体に光を照射してその光活性化合物が結合した標的物質の機能、あるいは、その光活性化合物が結合した部位における標的物質の機能を不活性化する工程を含む上記標的物質の生理的機能を解析する方法。 - 前記光活性化合物と該標的物質との結合を、該標的物質と結合し得るパートナー物質を介して行う前記請求項１に記載の方法。
- Ｑが、−Ａ−Ｑ1で表される、パートナー物質と結合し得る基であり、ここで、Ａは化学結合又は鎖中に、炭素、酸素及び窒素から選択される１〜９個の原子を含むスペーサー基であり、そしてＱ1はイソシアネート基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される基である、前記請求項１又は２に記載の方法。
- Ｑが、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基又はマレイミド基である前記請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記標的物質が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖及びシグナル伝達物質から選択される、前記請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記パートナー物質が、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖、脂質、リガンド及びシグナル伝達物質から選択される前記請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記標的物質がタンパク質であり、前記パートナー物質が抗体、ｓｃＦｖまたはＦａｂである前記請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 式（Ｉ）：
で表される光活性化合物を含む、標的物質の機能を不活性化させるための光増感剤。 - Ｑが、−Ａ−Ｑ1で表される、パートナー物質と結合し得る基であり、ここで、Ａは化学結合又は鎖中に、炭素、酸素及び窒素から選択される１〜９個個の原子を含むスペーサー基であり、そしてＱ1はイソシアネート基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、４，６−ジクロロトリアジニルアミノ基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される基である前記請求項８に記載の光増感剤。
- Ｑが、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基又はマレイミド基である前記請求項８〜９のいずれかに記載の光増感剤。
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