JP4256291B2 - Method for detecting target nucleic acid sequence - Google Patents
Method for detecting target nucleic acid sequence Download PDFInfo
- Publication number
- JP4256291B2 JP4256291B2 JP2004093662A JP2004093662A JP4256291B2 JP 4256291 B2 JP4256291 B2 JP 4256291B2 JP 2004093662 A JP2004093662 A JP 2004093662A JP 2004093662 A JP2004093662 A JP 2004093662A JP 4256291 B2 JP4256291 B2 JP 4256291B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- region
- sequence
- probe
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 92
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 92
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 76
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 39
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 14
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 11
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 72
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 40
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108020005224 Arylamine N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 102100038110 Arylamine N-acetyltransferase 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101000884399 Homo sapiens Arylamine N-acetyltransferase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 101150087123 nat gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- AKIZPWSPNKVOMT-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylhexan-1-ol Chemical compound CCCCCC(O)S AKIZPWSPNKVOMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、標的核酸配列の検出技術に関し、詳しくはＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法並びに標的核酸配列の検出に用いるＬＡＭＰ増幅産物に関するものである。 The present invention relates to a technique for detecting a target nucleic acid sequence, and more particularly to a method for detecting a target nucleic acid sequence present in a LAMP amplification product and a LAMP amplification product used for detection of the target nucleic acid sequence.
感染症の原因菌を特定することは、適切な治療薬を選択するために重要である。現状の微生物検査には培養法と核酸増幅法が使われている。
近年培養法は、検出感度の向上や培養日数の短縮のために更なる改良工夫がなされている。特に、抗原抗体反応を用いたイムノクロマトグラフィーは簡便な識別法として急速に普及してきている(例えば、特許文献１及び２参照。)。しかしながら、依然として、菌の発育に数週間かかることから、医療現場のニーズに対応できているとは言い難い。患者は、判定結果がでるまでの間、誤った治療を受けているケースが少なくない。
Identifying the causative agent of the infectious disease is important for selecting an appropriate therapeutic agent. Culture methods and nucleic acid amplification methods are used for the current microbiological tests.
In recent years, the culture method has been further improved in order to improve detection sensitivity and shorten the culture days. In particular, immunochromatography using an antigen-antibody reaction has rapidly spread as a simple identification method (see, for example,
一方、核酸増幅法は、それぞれの微生物に特異的なプライマーを使用し、増幅の有無を調べることで、菌種あるいは耐性菌を判定する方法である。試料調製も含めて、６−７時間程度で結果がわかり、迅速検査法として大変有用である。また、近年のゲノム解析競争の結果、多くの生物の全遺伝子情報が解析されつつあり、今後、幅広い菌種判定に使用されることが期待される。 On the other hand, the nucleic acid amplification method is a method for determining a bacterial species or a resistant bacterium by using primers specific to each microorganism and examining the presence or absence of amplification. Including sample preparation, the results can be understood in about 6-7 hours, which is very useful as a rapid inspection method. In addition, as a result of recent genome analysis competition, all gene information of many organisms is being analyzed, and it is expected that it will be used for a wide variety of bacterial species determination in the future.
核酸増幅技術として一般的に知られている方法がＰＣＲ法(Polymerase Chain Reaction法 Roche社)である。ＰＣＲ法は、遺伝子クローニングや構造決定など遺伝子解析ツールとして幅広く使用されている。しかしながら、ＰＣＲ法においてはサーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なこと、反応時間が２時間以上かかる点が不利である。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。 A method generally known as a nucleic acid amplification technique is a PCR method (Polymerase Chain Reaction method, Roche). The PCR method is widely used as a gene analysis tool such as gene cloning and structure determination. However, the PCR method is disadvantageous in that it requires a complicated temperature control device such as a thermal cycler and the reaction time takes 2 hours or more. In addition, in the PCR method, if complementary strand synthesis is performed by mistake, the product becomes a template and amplifies, which may cause an erroneous determination. Actually, it is difficult to control specific amplification only by one base difference at the end of the primer.
また、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出する場合、生成される産物が２本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪いのが問題であった。そこで、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法がとられているが、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が課題として残されていた。 In general, when the target gene product amplified by the PCR method is detected with a DNA chip, the product produced is a double strand, and therefore when the hybridization reaction with the probe is performed, the complementary strand becomes a competitor to the probe and hybridizes. The problem was that efficiency was low and detection sensitivity was poor. Therefore, in order to make the target single-stranded, methods such as decomposing or separating complementary strands have been taken. However, all of these methods are expensive due to the use of enzymes, magnetic beads, etc., and complicated operations. Sex remained as an issue.
この問題を解決する遺伝子増幅法として、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal amplification法）が開発された。ＬＡＭＰ法は等温条件下、１時間足らずで遺伝子増幅が達成される。最終産物量もＰＣＲ産物と比較し１００−１０００倍多い。また、６箇所のプライマー領域を設定するためＰＣＲ法と比較すると特異性が高いという利点がある（例えば、特許文献３参照）。これらの特徴からＬＡＭＰ法は微生物・ウィルス、さらには遺伝子変異(例えば、特許文献４参照）などを迅速かつ高感度に検出する技術として、期待されている。 As a gene amplification method for solving this problem, a LAMP method (Loop-mediated isothermal amplification method) has been developed. In the LAMP method, gene amplification is achieved in less than 1 hour under isothermal conditions. The final product amount is also 100-1000 times greater than the PCR product. In addition, since six primer regions are set, there is an advantage that the specificity is high as compared with the PCR method (see, for example, Patent Document 3). From these characteristics, the LAMP method is expected as a technique for detecting microorganisms / viruses and gene mutations (see, for example, Patent Document 4) quickly and with high sensitivity.
現在ＬＡＭＰ法を用いた検査としては、増幅の過程で生成される副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定することにより、遺伝子増幅の有無を判定する方法が製品化されている（例えば、特許文献５参照。）。しかしながら、前記副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定する方法では、万が一目的産物以外の増幅が起こってしまった場合の確認方法がない。また複数の標的遺伝子を同時に検出することができないという問題点を有する。
その他、ＬＡＭＰ増幅産物を検出する手法として、インターカレーターを用いるものや光学的特性を利用する方法がある（例えば、特許文献６参照。）。さらに別の方法として、ＬＡＭＰ産物中に存在する１本鎖ループ部分にハイブリダイズするプローブを蛍光標識し、反応液の蛍光偏光度を測定するものや（例えば、特許文献７参照。）、１本鎖ループ部分にハイブリするプライマーの５’末端側に不溶性担体を固定化し、増幅反応に伴う凝集反応を観察するものがある（例えば、特許文献８参照）。
Other methods for detecting LAMP amplification products include those using an intercalator and methods utilizing optical characteristics (see, for example, Patent Document 6). As another method, a probe that hybridizes to a single-stranded loop portion present in the LAMP product is fluorescently labeled, and the degree of fluorescence polarization of the reaction solution is measured (for example, see Patent Document 7). There is one in which an insoluble carrier is immobilized on the 5 ′ end side of a primer that hybridizes to the chain loop portion, and an agglutination reaction accompanying an amplification reaction is observed (for example, see Patent Document 8).
増幅法としてＬＡＭＰ法を採用した場合には、産物中に１本鎖ループ部分が存在する。ＬＡＭＰ増幅産物を検出する手法として、該１本鎖領域に標的配列を設計する技術が開示されていることは上述の通りであるが（例えば、特許文献7、8参照）、１本鎖領域に標的配列が設けられたＬＡＭＰ増幅産物と基板上のプローブとのハイブリダイゼーション反応を利用した検出技術については、複雑な構造上の問題も含め不明確な部分は多く、このためＬＡＭＰ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出する技術の確立が切望されているのが実情である。
When the LAMP method is employed as an amplification method, a single-stranded loop portion exists in the product. As described above, as a technique for detecting a LAMP amplification product, a technique for designing a target sequence in the single-stranded region is disclosed (for example, see
本発明は、かかる実情に鑑み開発されたものであり、簡便且つ短時間での核酸検出を可能とするＬＡＭＰ増幅産物、及びＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法を提供することを目的とする。 The present invention was developed in view of such circumstances, and provides a LAMP amplification product that enables simple and short-time nucleic acid detection, and a method for detecting a target nucleic acid sequence present in the LAMP amplification product. Objective.
本発明者等が前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時においてプローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventors to solve the above-mentioned problems, the complex higher-order structure characteristic of the LAMP product causes a physical obstacle with the substrate to which the probe is bound during the hybridization reaction. As a result, it has been found that the hybridization efficiency is adversely affected, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明により、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、
一端が固相基体表面に結合され且つ前記ターゲット配列部分に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、
前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを特徴とする、ターゲット核酸配列の検出方法が提供される。
That is, according to the present invention, a double-stranded portion comprising a complementary sequence portion at both ends and a target sequence portion existing between the complementary sequence portions, and formed by hybridization of the complementary sequence portions at both ends, and A step of preparing a measurement nucleic acid having a stem-and-loop structure comprising a loop-like single-stranded portion other than
Providing a probe nucleic acid having one end bonded to the surface of a solid phase substrate and having a sequence complementary to the target sequence portion;
A step of specifically hybridizing a target sequence portion of the measurement nucleic acid to the probe nucleic acid by reacting the measurement nucleic acid with the probe nucleic acid;
Detecting the presence or absence of the nucleic acid for measurement hybridized to the probe nucleic acid,
When the probe nucleic acid and the target sequence portion are hybridized, 5 in both the probe nucleic acid and the target sequence portion so that the double-stranded portion of the measurement nucleic acid extends in a direction away from the solid phase surface. There is provided a method for detecting a target nucleic acid sequence, characterized by setting the orientation of the sequence of '→ 3'.
本発明の一態様において、前記測定用核酸及びプローブ核酸はＤＮＡである。
また、本発明の他の態様において、前記プローブ核酸はＤＮＡチップを構成している。
In one aspect of the present invention, the measurement nucleic acid and the probe nucleic acid are DNA.
In another embodiment of the present invention, the probe nucleic acid constitutes a DNA chip.
また、本発明の他の態様において、前記測定用核酸はＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であり、該ＬＡＭＰ産物における前記ターゲット配列は、ＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間、Ｂ１領域とＢ２領域との間、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間に挿入されていることを特徴とする。 In another embodiment of the present invention, the measurement nucleic acid is a LAMP product amplified by a LAMP method, and the target sequence in the LAMP product is between the F1 region and the F2 region of the LAMP product, and the F2c region. It is inserted between the F1c region, between the B1 region and the B2 region, and / or between the B2c region and the B1c region.
本発明においては、前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。 In the present invention, the presence or absence of the measurement nucleic acid hybridized to the probe nucleic acid may be detected based on a fluorescent label, or may be electrically detected using an intercalator that is double-stranded specific and generates a potential difference. May be detected.
また、本発明により、ターゲット配列を検出するためにＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であって、前記ターゲット配列がＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間(Ｆ２領域含む)、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間(Ｆ２c領域含む)、Ｂ１領域とＢ２領域との間(Ｂ２領域含む)、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間(Ｂ２ｃ領域含む)に挿入されていることを特徴とするＬＡＭＰ産物が提供される。 Further, according to the present invention, a LAMP product amplified by the LAMP method for detecting a target sequence, wherein the target sequence is between the F1 region and the F2 region (including the F2 region) of the LAMP product, the F2c region and the F1c It is inserted between the region (including the F2c region), between the B1 region and the B2 region (including the B2 region), and / or between the B2c region and the B1c region (including the B2c region). A LAMP product is provided.
本発明により、ハイブリダイゼーション効率の高いＬＡＭＰ増幅産物の提供が可能となり、また核酸検出におけるハイブリダイゼーション反応において、一本鎖調製工程を経ることなく、なお且つ複雑な温度制御も不要な、簡便且つ短時間での核酸検出が可能となった。 According to the present invention, it is possible to provide a LAMP amplification product with high hybridization efficiency, and in a hybridization reaction in nucleic acid detection, a simple and short process that does not require a single strand preparation step and does not require complicated temperature control. Nucleic acid detection in time has become possible.
以下、本発明の詳細を説明する。 Details of the present invention will be described below.
＜測定用核酸＞
本発明の方法における第一の特徴は、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を対象として、ターゲット核酸配列の検出が行なわれることである。このようなステム・アンド・ループ構造の核酸は、例えば一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが自己ハイブリダイゼーションしたときにも形成されるが、最も典型的な例は、ＬＡＭＰ法による増幅産物として形成される。
<Nucleic acid for measurement>
The first feature of the method of the present invention includes a complementary sequence portion at both ends and a target sequence portion existing between the complementary sequence portions, and is formed by hybridization of the complementary sequence portions at both ends. The target nucleic acid sequence is detected for a measurement nucleic acid having a stem-and-loop structure including a single-stranded portion and a loop-shaped single-stranded portion other than the single-stranded portion. A nucleic acid having such a stem-and-loop structure is also formed, for example, when single-stranded DNA or RNA is self-hybridized, but the most typical example is formed as an amplification product by the LAMP method.
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示している。従来、ＬＡＭＰ増幅産物においては、ターゲット配列が、増幅産物のステム・アンド・ループ構造の中央に位置するように含まれていた(図2)。このようにターゲット配列を増幅・検出しようとする場合は、その両側に位置する配列に基づいて、合計４種類のプライマー配列（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域（ＦＩＰ＝Ｆ１ｃ＋Ｆ２、ＢＩＰ＝Ｂ２＋Ｂ１ｃ）を含んでいる。これらプライマーとして用いられる合計６つの領域を、以下では夫々プライマー領域と称することにする。上記４種類のプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６４８１号公報（特許文献５）を参照されたい。 Here, the primer design in the LAMP method and the obtained amplification product will be described with reference to FIG. 1 and FIG. FIG. 1 shows the double-stranded DNA to be detected. Conventionally, in the LAMP amplification product, the target sequence was included so as to be located in the center of the stem-and-loop structure of the amplification product (FIG. 2). When the target sequence is to be amplified / detected in this way, a total of four types of primer sequences (FIP primer, F3 primer, BIP primer, B3 primer) are set based on the sequences located on both sides thereof. The FIP primer and the BIP primer each contain two regions (FIP = F1c + F2, BIP = B2 + B1c). A total of six regions used as these primers are hereinafter referred to as primer regions. When LAMP amplification is carried out using the above four types of primers, a dumbbell-shaped stem-and-loop structure amplification product as shown in FIG. 2 is obtained from each strand of the double-stranded DNA of FIG. The description of the amplification mechanism is omitted, but if necessary, refer to, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-186482 (Patent Document 5).
一方、本発明では、図２に示したような従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する。即ち、図３に示すように、本発明においては、ターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間(Ｆ２領域含む)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(Ｆ２ｃ領域含む)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(Ｂ２領域含む)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(Ｂ２ｃ領域含む)の何れかに位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されていてもよく、したがって、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれる。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうことにより、図４に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部を得る。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置することとなる。一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成することとなる。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は図４に示すような一本鎖の状態のものが存在することから、変性操作を行なうことなく、図示のように各ターゲット配列に対して相補的なプローブ核酸（ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）との特異的ハイブリダイゼーションにより検出することができる。特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味している。 On the other hand, in the present invention, unlike the conventional target sequence position as shown in FIG. 2, the primer is designed so that the target sequence is located in a single-stranded loop portion. That is, as shown in FIG. 3, in the present invention, the target sequence (any of FPc, FP, BP, and BPc in FIG. 3) is between the primer regions F1 and F2 (including the F2 region), and the primer region F2c. And F1c (including the F2c region), between the primer regions B1 and B2 (including the B2 region), and / or between the primer regions B2c and B1c (including the B2c region), Set up six primer regions. The target sequence may be designed to be located at any part of the single-stranded loop part formed between the above-mentioned respective regions. Therefore, the loop part between the primer regions F1 and F2 , The F2 region itself is also included. Four types of primers are prepared based on the six primer regions thus set, and a LAMP amplification product as shown in FIG. 4 is obtained by performing LAMP amplification using these primers. In this LAMP amplification product, the target sequences FPc, FP, BP, and BPc are located in a single-stranded loop in the dumbbell structure of the amplification product. On the other hand, since the primer regions F1c and F1 and B1c and B1 originally have complementary sequences, self-hybridization occurs with each other to form a double strand. As described above, since the target sequence contained in the amplification product is in a single-stranded state as shown in FIG. 4, it is complementary to each target sequence as shown in the figure without performing a denaturation operation. Can be detected by specific hybridization with a probe nucleic acid (FP, FPc, BP, BPc). Specific hybridization means that in the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or mutations, even slight differences can be detected.
＜プローブ核酸＞
本発明においては、図４で説明したように、ステム・アンド・ループ構造を有する測定用核酸の一本鎖のループ構造内に含まれるターゲット配列を、これと相補的な配列を有するプローブ核酸を用いて検出する。このプローブ核酸は固相基体表面に固定化されたものであり、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものを用いるが、他のマイクロアレイを構成するプローブを用いてもよい。
<Probe nucleic acid>
In the present invention, as described with reference to FIG. 4, the target sequence contained in the single-stranded loop structure of the measurement nucleic acid having the stem-and-loop structure is replaced with the probe nucleic acid having a complementary sequence thereto. Use to detect. The probe nucleic acid is immobilized on the surface of the solid phase substrate, and typically a DNA chip is used, but probes constituting other microarrays may be used.
ＤＮＡチップとは、数センチ角のガラスやシリコン基板上に異なる配列のプローブを数十から数十万種類固定化したもので、一度に複数の配列情報を調べることができる。これにより従来、数週間かかっていた遺伝子発現パターンの解析や一塩基多型などの解析を数日で行うことが可能になった。現在は新しい遺伝子の探索、機能の解明、研究支援技術として主に用いられているが、最近になって病気の診断技術としても普及し始めている。 A DNA chip is obtained by fixing several tens to hundreds of thousands of probes having different arrangements on a glass or silicon substrate of several centimeters square, and a plurality of arrangement information can be examined at a time. As a result, analysis of gene expression patterns, single nucleotide polymorphisms, etc., which previously took several weeks, can be performed in a few days. Currently, it is mainly used as a search for new genes, elucidation of functions, and research support technology, but recently it has begun to spread as a disease diagnosis technology.
ＤＮＡチップの代表的なものとしては、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸの技術が一般的に紹介されている（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, p 5022-5026参照。）。この技術は、蛍光で標識したサンプル遺伝子をチップ上のプローブと反応させ、高感度な蛍光解析装置を使って検出する方式である。また別の検出方法として、電流検出型のＤＮＡチップも開発されている。これは、２本鎖ＤＮＡに特異的に反応する挿入剤を添加し、挿入剤から得られる電気化学的な信号を測定する方法である。電気化学的なＤＮＡチップは標識が不要で検出に高価な装置が必要ないことから第二世代のＤＮＡチップとして期待されている（例えば、特開平５−１９９８９８号公報参照）。 As a typical DNA chip, AFFYMETRIX technology is generally introduced (see, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, p 5022-5026). In this technique, a sample gene labeled with fluorescence is reacted with a probe on a chip and detected using a highly sensitive fluorescence analyzer. As another detection method, a current detection type DNA chip has also been developed. In this method, an intercalating agent that specifically reacts with double-stranded DNA is added, and an electrochemical signal obtained from the intercalating agent is measured. Electrochemical DNA chips are expected as second-generation DNA chips because they do not require labeling and do not require expensive equipment for detection (see, for example, JP-A-5-199898).
＜測定用核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応＞
前記測定用核酸は、その中に含まれる一本鎖のターゲット配列と前記プローブ核酸との特異的ハイブリダイゼーション反応により、前記固体表面に結合される。本発明においては、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを、更なる特徴の一つとする（図５（Ａ）参照）。すなわち、かかる特徴は、プローブ核酸およびターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きが図５（Ｃ）に例示したような向きを有する場合、ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、プローブが結合した基体と立体障害を起こし（図６（Ｂ）参照）、これが要因となってハイブリダイゼーション効率が低下するとの知見に基づき見出されたものであり、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるようにプローブ核酸およびターゲット配列部分双方における５′→３′の配列の向きを図５（Ｂ）に例示したように設定することにより、ＬＡＭＰ産物とプローブ核酸が結合した固相基体との立体障害が回避され（図６（Ａ）参照）、これによりハイブリダイゼーション効率を向上させることを可能としたものである。
<Hybridization reaction between nucleic acid for measurement and probe>
The measurement nucleic acid is bound to the solid surface by a specific hybridization reaction between a single-stranded target sequence contained therein and the probe nucleic acid. In the present invention, when the probe nucleic acid and the target sequence portion are hybridized, 5 in both the probe nucleic acid and the target sequence portion so that the double-stranded portion of the nucleic acid for measurement extends in a direction away from the solid surface. One of the additional features is to set the orientation of the arrangement of '→ 3' (see FIG. 5A). That is, such a characteristic is that when the orientation of the 5 ′ → 3 ′ sequence in both the probe nucleic acid and the target sequence portion has the orientation illustrated in FIG. 5C, the complex higher order characteristic of the LAMP product is obtained. The structure was found based on the knowledge that the substrate is bound to a steric hindrance with the probe (see FIG. 6B), and this causes a decrease in hybridization efficiency. The probe nucleic acid and the target sequence FIG. 5B shows the orientation of the 5 ′ → 3 ′ sequence in both the probe nucleic acid and the target sequence so that the double-stranded portion of the nucleic acid for measurement extends in a direction away from the solid surface when the portions are hybridized. ) Prevents the steric hindrance between the LAMP product and the solid phase substrate to which the probe nucleic acid is bound (see FIG. 6A). By those which make it possible to improve the hybridization efficiency.
＜プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の検出＞
本発明において、プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の有無を検出する手段は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。
<Detection of measurement nucleic acid hybridized to probe nucleic acid>
In the present invention, the means for detecting the presence or absence of the measurement nucleic acid hybridized to the probe nucleic acid is not particularly limited. For example, the detection may be performed based on a fluorescent label, or may be double-strand-specific and You may detect electrically using the intercalator which produces a potential difference.
以下に、本発明による核酸検出方法を実施例を用いてより具体的に説明する。
本実施例では、サンプル用核酸としてＬＡＭＰ増幅産物を製造し、ハイブリダイゼーション反応後、該ＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸を電流検出方式を用いて検出した。ＬＡＭＰ反応は以下に示す２組のプライマーを使用し、N-Acetyltransferase 2 (NAT2) 遺伝子の一部分を増幅させた。
Hereinafter, the nucleic acid detection method according to the present invention will be described more specifically with reference to examples.
In this example, an LAMP amplification product was produced as a sample nucleic acid, and after the hybridization reaction, the target nucleic acid present in the LAMP amplification product was detected using a current detection method. In the LAMP reaction, the following two sets of primers were used, and a part of the N-Acetyltransferase 2 (NAT2) gene was amplified.
（１）合成オリゴヌクレオチド
プライマー１
標的核酸配列がＬＡＭＰ増幅産物の２本鎖領域（ステム領域）に存在するように設計する。図７に周辺ゲノム配列を示す。
(1)
It is designed so that the target nucleic acid sequence is present in the double-stranded region (stem region) of the LAMP amplification product. FIG. 7 shows the peripheral genome sequence.
NAT F3 Primer : 5’ ACAGAAGAGAGAGGAATCTGGT 3’
NAT FIP Primer: 5’ TGTTTCTTCTTTGGCAGGAGATGAGAA-GGACCAAATCAGGAGAGAGCA 3’
NAT B3 Primer : 5’ GATGAAGCCCACCAAACAGTA 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATGAATACATACAGACGTCTCC-CTGGGGTCTGCAAGGAAC 3’。
NAT F3 Primer: 5 'ACAGAAGAGAGAGGAATCTGGT 3'
NAT FIP Primer: 5 'TGTTTCTTCTTTGGCAGGAGATGAGAA-GGACCAAATCAGGAGAGAGCA 3'
NAT B3 Primer: 5 'GATGAAGCCCACCAAACAGTA 3'
NAT BIP Primer: 5 'ATGAATACATACAGACGTCTCC-CTGGGGTCTGCAAGGAAC 3'.
プライマー２
標的核酸配列がＬＡＭＰ増幅産物の１本鎖領域（ループ領域）に存在するように設計する。図８に周辺ゲノム配列を示す。
It is designed so that the target nucleic acid sequence is present in the single-stranded region (loop region) of the LAMP amplification product. FIG. 8 shows the peripheral genome sequence.
NAT F3 Primer : 5’ ACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCAT 3’
NAT FIP Primer: 5’ CGTCTGCAGGTATGTATTCATAGACTCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACC 3’
NAT B3 Primer : 5’ CGACCAGATCTGTATTGTCTT 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCATGAATTTTCTATAGGTGAGGATGA 3’。
NAT F3 Primer: 5 'ACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCAT 3'
NAT FIP Primer: 5 'CGTCTGCAGGTATGTATTCATAGACTCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACC 3'
NAT B3 Primer: 5 'CGACCAGATCTGTATTGTCTT 3'
NAT BIP Primer: 5 'ATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCATGAATTTTCTATAGGTGAGGATGA 3'.
（２）ＬＡＭＰ反応溶液
ＬＡＭＰ反応溶液は以下の組成とした。
滅菌超純水 １．５μＬ
Ｂｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ １ μＬ
バッファー １２．５μＬ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ４０ ｍＭ
ＫＣｌ ２０ ｍＭ
ＭｇＳＯ４ １６ ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０． ２％
Ｂｅｔａｉｎｅ １．６ Ｍ
ＤＮＴＰ ２．８ ｍＭ
Ｆ３−プライマー（１０μＭ） ０．５ μＬ
Ｂ３−プライマー（１０μＭ） ０．５ μＬ
ＦＩＰ−プライマ（１０μＭ） ４ μＬ
ＢＩＰ−プライマ（１０μＭ） ４ μＬ
テンプレート（purified human genome） １ μＬ
合計 ２５ μＬ。
(2) LAMP reaction solution The LAMP reaction solution had the following composition.
Sterile ultrapure water 1.5μL
Buffer 12.5 μL
Tris HCl (pH 8.0) 40 mM
MgSO 4 16 mM
(NH 4 ) 2 SO 4 20 mM
Betaine 1.6 M
DNTP 2.8 mM
F3-primer (10 μM) 0.5 μL
B3-primer (10 μM) 0.5 μL
FIP-Primer (10 μM) 4 μL
BIP-Primer (10 μM) 4 μL
Template (purified human genome) 1 μL
Total 25 μL.
（３）ＬＡＭＰ法による核酸増幅
温度は５８℃、時間は１時間として核酸増幅を行った。この時、テンプレートの代わりに滅菌水を添加したものをnegative controlとした。
(3) Nucleic acid amplification by the LAMP method Nucleic acid amplification was performed at a temperature of 58 ° C. and a time of 1 hour. At this time, a negative control was added with sterilized water instead of the template.
（４）標的核酸の増幅確認
上記の方法で増幅したＬＡＭＰ産物を図９に示すようにアガロースゲル電気泳動で確認した。また、目的産物の有無は制限酵素切断により確認した。図９において、レーン１〜７はそれぞれ以下に示すサンプル１〜７に対応する。
(4) Confirmation of amplification of target nucleic acid The LAMP product amplified by the above method was confirmed by agarose gel electrophoresis as shown in FIG. The presence or absence of the target product was confirmed by restriction enzyme cleavage. In FIG. 9,
電気泳動の結果を以下に示す。
１．100bP ladder (TAKARA)
２．Negative control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
３．Positive control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
４．Negative control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
５．Positive control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
６．PstI 制限酵素処理：二本鎖領域に標的核酸が存在
７．PstI 制限酵素処理：一本鎖領域に標的核酸が存在。
The results of electrophoresis are shown below.
1. 100bP ladder (TAKARA)
2. Negative control: target nucleic acid is present in double-stranded
制限酵素による消化を行った結果、理論通りの断片を得ることができた。さらに、未消化でのバンドの殆どが消化後には推定されるバンドへ変化したことから、非特異的な産物はほとんどないことが示唆された。 As a result of digestion with a restriction enzyme, a fragment as expected was obtained. Furthermore, most of the undigested bands changed to the estimated bands after digestion, suggesting that there were almost no non-specific products.
（５）核酸プローブ固定化電極の作製
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
Positive-probe FP: AACCTCGAACAATTG
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA。
(5) Preparation of nucleic acid probe fixed electrode The base sequence of the nucleic acid probe is shown below.
Positive-probe FP: AACCTCGAACAATTG
Two 3 'SH, 5' SH probes
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT
Two 3 'SH, 5' SH probes
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA.
ＦＰプローブとＦＰｃプローブは互いに相補的な関係にある。ＦＰプローブおよびＦＰｃプローブについて、それぞれ３´ＳＨおよび５´ＳＨ修飾プローブ計４本を検討した。一方、Ｎ−プローブは、ネガティブコントロールとして使用したプローブであり、上記４本のプローブとは無関係な配列を有する。 The FP probe and the FPc probe are complementary to each other. For the FP probe and the FPc probe, four 3′SH and 5′SH modified probes, respectively, were examined. On the other hand, the N-probe is a probe used as a negative control, and has a sequence unrelated to the above four probes.
この標識プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置後、メルカプトヘキサノール溶液に浸し、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。その後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極とした。電極配置は図１０に示した通りである。 The probe solution containing the labeled probe was spotted on a gold electrode, allowed to stand for 1 hour, immersed in a mercaptohexanol solution, and washed with a 0.2 × SSC solution. Thereafter, it was washed with ultrapure water and air-dried to obtain a probe-immobilized electrode. The electrode arrangement is as shown in FIG.
（６）核酸プローブへのＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーション
試料核酸は、上記（３）で増幅したＬＡＭＰ産物を用いた。（４）で作製した核酸プローブ固定化表面を２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。
(6) Hybridization of LAMP product to nucleic acid probe The LAMP product amplified in (3) above was used as the sample nucleic acid. The nucleic acid probe-immobilized surface prepared in (4) was immersed in a LAMP product to which 2 × SSC salt was added and allowed to stand at 35 ° C. for 60 minutes to carry out a hybridization reaction. Thereafter, it was gently washed with ultrapure water. This electrode was immersed for 15 minutes in a phosphate buffer containing 50 μM Hoechst 33258 as an intercalating agent, and then the oxidation current response of Hoechst 33258 molecules was measured.
（７）結果
電流測定の結果を、各プローブを固定した電極における電流値増加量として図１１に示す。二本鎖部分（ステム部分）に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物では、ＮＰ、３´ＳＨ ＦＰ、３´ＳＨ ＦＰｃ、５´ＳＨ ＦＰ、および５´ＳＨ ＦＰｃのすべてにおいてハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかった（図１１（Ａ））。これに対し、一本鎖ループ部分に標的核酸が存在するＬＡＭＰ産物では、ＮＰ、３´ＳＨ ＦＰ、５´ＳＨ ＦＰｃではハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかったが、３´ＳＨ ＦＰｃと５´ＳＨ ＦＰでは、ハイブリダイズに由来すると推測される電流値増加が見られた（図１１（Ｂ））。
(7) Results The results of current measurement are shown in FIG. In the LAMP product in which the target sequence is present in the double-stranded part (stem part), the current value derived from hybridization in all of NP, 3′SH FP, 3′SH FPc, 5′SH FPc, and 5′SH FPc An increase was not seen (FIG. 11 (A)). In contrast, in the LAMP product in which the target nucleic acid is present in the single-stranded loop part, no increase in the current value derived from hybridization was observed in NP, 3′SH FP, and 5′SH FPc, but 3′SH FPc. And 5′SH FP, an increase in current value presumed to be caused by hybridization was observed (FIG. 11B).
ループ状一本鎖部分に標的核酸が存在する産物で、電流値増加が見られなかった３´ＳＨ ＦＰおよび５´ＳＨ ＦＰｃでは、ＬＡＭＰ産物の一本鎖ループ部分とハイブリダイゼーションする場合、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体に近接する方向に伸びることとなり立体障害を起こし（図５（Ｂ）、又は図６（Ａ）参照）、一方電流値増加が見られた３´ＳＨ ＦＰｃと５´ＳＨ ＦＰでは、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体から離間する方向に伸びることとなり立体障害が回避される（図５（Ｃ）、又は図６（Ｂ）参照）。
In 3′SH FP and 5′SH FPc, in which the target nucleic acid is present in the looped single-stranded part and no increase in the current value was observed, when the LAMP product hybridizes with the single-stranded loop part, 3 ′ SH FPc and 5 ′ in which the double-stranded portion of the
これらの結果から、まず、ＬＡＭＰ産物をＤＮＡチップで検出するには、標的核酸をループ状一本鎖部分に設計することが必須であることが明らかになった。さらに、ハイブリダイゼーション反応時におけるＬＡＭＰ産物と基体との立体障害を回避するために、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および標的配列部分の双方における５´→３´の配列の向きを設定することが必要であることが明らかとなった。 From these results, it was clarified that, first, in order to detect the LAMP product with a DNA chip, it is essential to design the target nucleic acid in a looped single-stranded part. Furthermore, in order to avoid steric hindrance between the LAMP product and the substrate during the hybridization reaction, 5 in both the probe nucleic acid and the target sequence portion so that the double-stranded portion of the LAMP product extends away from the substrate surface. It became clear that it was necessary to set the orientation of the arrangement of '→ 3'.
次に本発明による核酸検出方法の応用例として、標的核酸配列の一塩基変異(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)を検出した。 Next, as an application example of the nucleic acid detection method according to the present invention, single nucleotide mutations (Single Nucleotide Polymorphisms: SNPs) of the target nucleic acid sequence were detected.
実施例２では、サンプル用核酸として実施例１と同じくＬＡＭＰ産物を製造し、ハイブリダイゼーション後、該ＬＡＭＰ産物中に存在する標的核酸配列のSNPｓを電流検出方式を用いて検出した。 In Example 2, a LAMP product was produced as a sample nucleic acid as in Example 1, and after hybridization, SNPs of target nucleic acid sequences present in the LAMP product were detected using a current detection method.
（１）検出に用いたＬＡＭＰ産物
ＬＡＭＰ産物については、実施例１、（１）合成オリゴヌクレオチド プライマー２を用い増幅させたものと同一のものを使用した。
(1) LAMP product used for detection As for the LAMP product, the same product as that amplified using Example 1, (1)
（２）検出に用いたプローブ
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
(2) Probe used for detection The base sequence of the nucleic acid probe is shown below.
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT 3’ SH （実施例１で使用したもの）
Positive-probe FPc SNP: CAATTGTTGGAGGTT 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer: ATCTTCAATTGTTCGAGGTTCAAGC 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer SNP: ATCTTCAATTGTTGGAGGTTCAAGC 3’ SH
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA 3’ SH
FPcとNPは実施例１で使用したものと同一のものである。FPc SNPはFPc配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。FPc ２５merはFPcの上流側、下流側にそれぞれ５塩基ずつ標的核酸配列をのばしたものである。FPc ２５mer SNPは、FPc ２５mer配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。上記５本のプローブはすべて３´ＳＨ修飾とした。
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT 3 'SH (used in Example 1)
Positive-probe FPc SNP: CAATTGTTGGAGGTT 3 'SH
Positive-probe FPc 25mer: ATCTTCAATTGTTCGAGGTTCAAGC 3 'SH
Positive-probe FPc 25mer SNP: ATCTTCAATTGTTGGAGGTTCAAGC 3 'SH
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA 3 'SH
FPc and NP are the same as those used in Example 1. FPc SNP is obtained by converting the sequence near the center of the FPc sequence from G to C. FPc 25mer is obtained by extending the target nucleic acid sequence by 5 bases each upstream and downstream of FPc. FPc 25mer SNP is obtained by converting the sequence near the center of the FPc 25mer sequence from G to C. All the five probes were 3′SH modified.
プローブの固定化は、実施例１と同様の方法で行った。電極配置は図１２に示した通りである。 The probe was immobilized in the same manner as in Example 1. The electrode arrangement is as shown in FIG.
（３）核酸プローブへのＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーション
試料核酸は、上記(１)で増幅したＬＡＭＰ産物を用いた。（２）で作成した核酸プローブ固定化表面を２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、３５、４０、４５℃の０．２×ＳＳＣバッファーにそれぞれ４０分間浸漬し、その後、超純水で軽く洗浄したものとハイブリダイゼーション後に超純水で軽く洗浄しただけのもの、計４種類の洗浄条件の基板を作成した。この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。
(3) Hybridization of LAMP product to nucleic acid probe The LAMP product amplified in (1) above was used as the sample nucleic acid. The nucleic acid probe-immobilized surface prepared in (2) was immersed in a LAMP product to which 2 × SSC salt was added and allowed to stand at 35 ° C. for 60 minutes to carry out a hybridization reaction. After that, it was soaked in 0.2 × SSC buffer at 35, 40, and 45 ° C. for 40 minutes, and then lightly washed with ultrapure water and after light hybridization with ultrapure water. A substrate with the following cleaning conditions was prepared. This electrode was immersed for 15 minutes in a phosphate buffer containing 50 μM Hoechst 33258 as an intercalating agent, and then the oxidation current response of Hoechst 33258 molecules was measured.
（４）結果
電流測定の結果を、各プローブを固定化した電極における電流値増加量として図13に示す。ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰについては、(Ａ)ハイブリ後、超純水で軽く洗浄しただけの基板で、ＰＦｃＳＮＰでは電流値増加がみられないが、ＦＰｃでは優位な電流値増加が見られている。さらに、(Ｂ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を３５℃、４０分行った基板では、ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰ共に電流値増加が見られなくなった。このことから、ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰは(Ａ)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。
(4) Results The results of current measurement are shown in FIG. 13 as the amount of increase in current value at the electrode on which each probe is immobilized. As for FPc and PFcSNP, (A) the substrate was only washed lightly with ultrapure water after hybridization, and PFcSNP showed no increase in current value, but FPc showed a significant increase in current value. Furthermore, (B) on the substrate that was washed with 0.2 × SSC solution at 35 ° C. for 40 minutes after hybridization, no increase in current value was observed for both FPc and PFcSNP. This revealed that FPc and PFcSNP can determine single nucleotide mutations under the washing conditions (A).
標的配列を長くしたＦＰｃ２５merとＰＦｃ２５merＳＮＰについては、(Ｃ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を４０℃、４０分行った基板では、ＦＰｃ２５mer、ＰＦｃ２５merＳＮＰ共に電流値増加が見られているが、(Ｄ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を４５℃、４０分行った基板では、ＰＦｃ２５merＳＮＰでは電流値増加がみられないが、ＦＰｃ２５merでは優位な電流値増加が見られている。このことから、ＦＰｃ２５merとＰＦｃ２５merＳＮＰは(Ｄ)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。 For the FPc25mer and PFc25merSNP with a long target sequence, (C) on the substrate that was washed with a 0.2 × SSC solution at 40 ° C. for 40 minutes after hybridization, both FPc25mer and PFc25merSNP showed an increase in current value. (D) On the substrate that was washed with 0.2 × SSC solution at 45 ° C. for 40 minutes after hybridization, no increase in current value was observed with PFc25merSNP, but a significant increase in current value was observed with FPc25mer. From this, it was revealed that FPc25mer and PFc25merSNP can determine single nucleotide mutations under the washing conditions (D).
これらの結果から、プローブの配列の違いによって、ハイブリ、または洗浄条件を適宜選択すること、逆にハイブリ、洗浄条件を定めて、その条件にあった最適プローブを選択することによって一塩基変異を検出できることが明らかになった。 From these results, single nucleotide mutations can be detected by selecting hybridization or washing conditions as appropriate depending on the probe sequence, and conversely by determining hybridization and washing conditions and selecting the optimal probe that matches the conditions. It became clear that we could do it.
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。 Note that the present invention is not limited to the above-described embodiment as it is, and can be embodied by modifying the constituent elements without departing from the scope of the invention in the implementation stage. In addition, various inventions can be formed by appropriately combining a plurality of components disclosed in the embodiment. For example, some components may be deleted from all the components shown in the embodiment. Furthermore, constituent elements over different embodiments may be appropriately combined.
Claims (7)
一端が固相基体表面に結合され且つ前記ターゲット配列部分に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、
前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを特徴とする、ターゲット核酸配列の検出方法。 A double-stranded portion comprising a complementary sequence portion at both ends and a target sequence portion existing between the complementary sequence portions and formed by hybridization of the complementary sequence portions at both ends, and another loop-like one Preparing a nucleic acid for measuring a stem-and-loop structure comprising a chain portion;
Providing a probe nucleic acid having one end bonded to the surface of a solid phase substrate and having a sequence complementary to the target sequence portion;
A step of specifically hybridizing a target sequence portion of the measurement nucleic acid to the probe nucleic acid by reacting the measurement nucleic acid with the probe nucleic acid;
Detecting the presence or absence of the nucleic acid for measurement hybridized to the probe nucleic acid,
When the probe nucleic acid and the target sequence portion are hybridized, 5 in both the probe nucleic acid and the target sequence portion so that the double-stranded portion of the measurement nucleic acid extends in a direction away from the solid phase surface. A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising setting the direction of the sequence of '→ 3'.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004093662A JP4256291B2 (en) | 2003-10-22 | 2004-03-26 | Method for detecting target nucleic acid sequence |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003362197 | 2003-10-22 | ||
| JP2004093662A JP4256291B2 (en) | 2003-10-22 | 2004-03-26 | Method for detecting target nucleic acid sequence |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008119103A Division JP4381457B2 (en) | 2003-10-22 | 2008-04-30 | Method for detecting target nucleic acid sequence |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005143492A JP2005143492A (en) | 2005-06-09 |
| JP4256291B2 true JP4256291B2 (en) | 2009-04-22 |
Family
ID=34703123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004093662A Expired - Fee Related JP4256291B2 (en) | 2003-10-22 | 2004-03-26 | Method for detecting target nucleic acid sequence |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4256291B2 (en) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586474B (en) * | 2005-12-08 | 2014-04-02 | 株式会社东芝 | Method of detecting human papilloma virus by using nucleic acid amplification method and nucleic acid chain-immobilized carrier |
| JP4580875B2 (en) | 2006-01-20 | 2010-11-17 | 株式会社東芝 | Primer design method for nucleic acid detection method |
| JP4516032B2 (en) * | 2006-01-20 | 2010-08-04 | 株式会社東芝 | Nucleic acid detection method and assay kit by hybridization |
| EP1975254A4 (en) * | 2006-01-20 | 2009-12-02 | Olympus Corp | Method of detecting nucleotide sequence with an intramolecular probe |
| US7488581B2 (en) * | 2006-03-20 | 2009-02-10 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method for detecting a target nucleic acid sequence |
| JP2007267636A (en) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | Toshiba Corp | Method for producing nucleic acid and primer set for nucleic acid amplification |
| JP4331216B2 (en) | 2007-02-09 | 2009-09-16 | 株式会社東芝 | Detection method of gene mutation |
| JP4410268B2 (en) | 2007-03-28 | 2010-02-03 | 株式会社東芝 | Nucleic acid primer set and nucleic acid probe for detecting the genotype of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) |
| JP4410269B2 (en) * | 2007-03-28 | 2010-02-03 | 株式会社東芝 | Nucleic acid primer set, kit for detecting genotype of N-acetyltransferase 2 (NAT2), and detection method using the primer set |
| JP4490988B2 (en) * | 2007-04-26 | 2010-06-30 | 株式会社東芝 | Nucleic acid primer set and kit for detecting genotype of serum amyloid A1 (SAA1), and detection method using the primer set |
| JP2009284896A (en) * | 2007-07-26 | 2009-12-10 | Fujifilm Corp | Nucleic acid amplification method |
| JP5546109B2 (en) * | 2008-05-27 | 2014-07-09 | 富士フイルム株式会社 | Nucleic acid base sequence identification method |
| CN102459630B (en) | 2009-06-29 | 2014-04-30 | 株式会社东芝 | Sample analysis method and assay kit for use in the method |
| JP6271076B2 (en) * | 2015-02-27 | 2018-01-31 | 株式会社東芝 | Target nucleic acid detection method, assay kit, and probe immobilization substrate |
| JP6577660B2 (en) * | 2016-03-18 | 2019-09-18 | 株式会社東芝 | Method for detecting multiple types of short-chain nucleic acids in a sample, combination analysis kit, and analysis kit supply management method |
| CN114410754A (en) * | 2022-01-27 | 2022-04-29 | 国科宁波生命与健康产业研究院 | CDA probe primer group and kit for detecting miRNA and application of CDA probe primer group and kit |
-
2004
- 2004-03-26 JP JP2004093662A patent/JP4256291B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005143492A (en) | 2005-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7488581B2 (en) | Method for detecting a target nucleic acid sequence | |
| JP4528885B1 (en) | Sample analysis method and assay kit used therefor | |
| JP4256291B2 (en) | Method for detecting target nucleic acid sequence | |
| CA2811185C (en) | Increasing confidence of allele calls with molecular counting | |
| US20080051568A1 (en) | Capture moieties for nucleic acids and uses thereof | |
| KR20020008195A (en) | Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations | |
| JP2012120542A (en) | Method for determining sequence variant using ultra-deep sequencing | |
| JP2009171969A (en) | Method for assaying microarray hybridization | |
| JP5663491B2 (en) | Target nucleic acid detection method | |
| CN109715798B (en) | Method for preparing DNA library and method for analyzing genomic DNA using DNA library | |
| US20090061433A1 (en) | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of serum amyloid a1(saa1) | |
| JP4381457B2 (en) | Method for detecting target nucleic acid sequence | |
| JPWO2003102178A1 (en) | Gene polymorphism typing method | |
| JP4516032B2 (en) | Nucleic acid detection method and assay kit by hybridization | |
| US20220333167A1 (en) | Combined solution phase and solid phase dna amplification | |
| Rao et al. | Recent trends in molecular techniques for food pathogen detection | |
| JP2011004733A (en) | Microarray for detecting target nucleic acid in a plurality of specimens | |
| Zhussupova | PCR–diagnostics | |
| CN106916882B (en) | Method for dual allele-specific polymerase chain reaction of genotype identification chip for identifying polymorphism of nucleotide gene | |
| JP6515884B2 (en) | Method of preparing DNA probe and genomic DNA analysis method using DNA probe | |
| WO2013085026A1 (en) | Method for detecting nucleotide mutation, and detection kit | |
| WO2002046393A1 (en) | Method of identifying nucleotide polymorphism | |
| JP2005204538A (en) | Method for detecting mutation of cyp2d6 and nucleic acid probe and kit therefor | |
| JP4528889B1 (en) | Sample analysis method and assay kit used therein | |
| JP2010142251A (en) | Probe set for detecting nucleic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080304 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080430 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090127 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090129 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120206 Year of fee payment: 3 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4256291 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120206 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120206 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130206 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140206 Year of fee payment: 5 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |