JP4251557B2 - 高分子分析装置および高分子分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、高分子の分析装置および分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体高分子を赤外線レーザーにより切断し、切断されたフラグメントを質量分析することにより、高分子を分析する装置および方法に関する。
タンパク質や多糖などの高分子を分析するには、これらの高分子を切断して、そのフラグメントを質量分析することが多く行われている。
そして、高分子の切断方法としては、例えば高分子がタンパク質や多糖の場合は、分解酵素を用いることが行われている。
しかし、分解酵素を用いた場合は、質量分析を行う前に、分解酵素を除去する必要があった。
また、高分子を切断する他の方法としては、タンパク質に赤外線レーザーを照射して分解するものが知られている（非特許文献１参照）。これは、タンパク質をイオン化し、真空中で強力なＣＯ２レーザーを照射するものであり、赤外線多光子吸収解離反応（Ｉｎｆｒａ Ｒｅｄ Ｍｕｌｔｉ Ｐｈｏｔｏｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＩＲＭＰＤ）として知られている（非特許文献１参照）。
しかし、ここで用いられる赤外線レーザーは、波長が１０．６μｍに固定されたものであり、高分子中の切断される箇所を変化させることは、困難であった。
Ｌｉｔｔｌｅ，Ｄ．Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、６６巻、ｐ．２８０９−２８１５。
本発明の課題は、高分子を切断して質量分析を行う場合に、切断される箇所を変化させることにより、種々のフラグメントを得、これを質量分析することにより、効率的に高分子を分析することができる装置および方法を提供することにある。
本発明者らは、波長を変化させた赤外線レーザーを高分子に照射することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、イオン化された試料を保持するイオントラップ部と、前記イオントラップ部に保持されたイオン化された前記試料に、波長可変の赤外線レーザーを照射して前記試料を切断する赤外線レーザーを出力するレーザー出力部と、前記赤外線レーザーにより切断された前記試料の質量分析を行なう質量分析部と、を備え、前記赤外線レーザーの波長を変化させることにより、前記試料を特定の箇所で切断することを特徴とする、高分子分析装置である。
また、本発明は、波長可変の赤外線レーザー出力部が、３．５〜９．６μｍの範囲で波長を変化させることができることを特徴とする、上記の分析装置である。
さらに、本発明は、波長可変の赤外線レーザー出力部が、５〜９．６μｍの範囲で波長を変化させることができることを特徴とする、上記の分析装置である。
また、本発明は、赤外線レーザーが、パルスレーザーであることを特徴とする、上記の分析装置である。
また、本発明は、赤外線レーザー出力部が、自由電子レーザー出力装置であることを特徴とする、上記の分析装置である。
また、本発明は、イオントラップ部が、超高真空型イオントラップであることを特徴とする、上記の分析装置である。
また、本発明は、質量分析部が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計であることを特徴とする、上記の分析装置である。
また、本発明は、試料が、タンパク質、ペプチド、糖類、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴する、上記の分析装置である。
また、本発明は、イオン化された試料を保持するイオントラップ工程と、前記イオントラップ工程にて保持したイオン化された前記試料に波長可変の赤外線レーザーを照射し、前記試料を切断する赤外線レーザー照射工程と、前記赤外線レーザー照射工程にて切断された前記試料の質量分析を行なう質量分析工程と、を含み、前記赤外線レーザーの波長を変化させることにより、前記試料を特定の箇所で切断することを特徴とする、高分子分析方法である。
また、本発明は、波長可変の赤外線レーザーが、３．５〜９．６μｍの範囲で波長を変化させることができることを特徴とする、上記の分析方法である。
さらに、本発明は、波長可変の赤外線レーザーが、５〜９．６μｍの範囲で波長を変化させることができることを特徴とする、上記の分析方法である。
また、本発明は、赤外線レーザーが、パルスレーザーであることを特徴とする、上記の分析方法である。
また、本発明は、赤外線レーザーが、自由電子レーザーであることを特徴とする、上記の分析方法である。
また、本発明は、イオントラップ工程が、超高真空型イオントラップにより行なわれることを特徴とする、上記の分析方法である。
また、本発明は、質量分析が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計により行われることを特徴とする、上記の分析方法である。
また、本発明は、試料が、タンパク質、ペプチド、糖類、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴する、上記の分析方法である。
本発明の装置および方法を用いることにより、高分子に赤外線レーザーを照射して切断する場合に、赤外線レーザーの波長を変化させることにより、高分子中の切断される箇所を変化させることができる。これにより、高分子の種々のフラグメントを得ることができ、これらを質量分析することにより、効率的に高分子を分析することができることとなる。
以下、本発明を図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の高分子分析装置の構成を示す図である。図１において、本発明の高分子分析装置１０は、レーザー出力部１、レンズ２、パワーメータ３、質量分析部４、イオン化部５から構成されており、質量分析部４はイオントラップ部８を備えている。イオン化部５は、図示しない高分子の試料をイオン化し、イオン化された試料はイオントラップ部８に保持される。一方、レーザー出力部１から出力された赤外線レーザー１２は、レンズ２、パワーメータ３を通り、イオントラップ部８に保持された試料に照射される。そして、レーザーを照射されることにより高分子の試料が切断されることとなる。ここで、レーザー出力部１は、出力されるレーザーの波長を変えることができるようになっており、波長を変化させることにより、高分子中の切断される箇所を変化させることができる。そして、切断された試料は、質量分析部４により、その分子量が測定される。したがって、赤外線レーザーの波長を変化させることにより、高分子の種々のフラグメントを得ることができ、これを質量分析することにより、効率的に高分子を分析することが可能となる。
本発明に用いられる赤外線レーザー出力部としては、波長を変化させることができるものであれば特に制限はないが、自由電子レーザー出力装置を好ましい例として挙げることができる。
波長を変化させるレーザーの波長範囲としては、高分子を切断できる波長であれば特に制限はないが、３．５〜９．６μｍを好ましい範囲として挙げることができ、さらに好ましくは、５〜９．６μｍの波長領域である。特に、５〜９．６μｍの波長領域は指紋（Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｔ）領域とも呼ばれ、種々の生体高分子に特徴的な赤外吸収を示す領域である。従って、これらの指紋領域の波長の赤外線レーザーを照射することにより、目的とする高分子に特有の箇所で、高分子を切断することが可能となる。
本発明に用いられる赤外線レーザーとしては、パルスレーザーであることが好ましい。この場合のパルス幅としては、切断する高分子や用いる赤外線レーザーの波長に応じて適宜決定されるが、例えば、１フェムト秒〜１００ナノ秒のものを挙げることができる。
本発明に用いられる赤外線レーザーの照射エネルギーとしては、高分子を切断できるものであれば特に制限はないが、例えば、１〜１０００ｍＪ、好ましくは１０〜５００ｍＪを挙げることができる。
また、本発明に用いられるイオントラップ部としては、イオン化された試料を保持でき、レーザーを照射できるものであれば特に制限はないが、超高真空型イオントラップを好ましい例として挙げることができる。
本発明に用いられる質量分析装置としては、切断された試料の質量分析ができるものであれば特に制限はないが、例えば、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計等を挙げることができる。
本発明に用いられる高分子としては、特に制限はないが、タンパク質、ペプチド、糖類、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の生体高分子を好ましい例として挙げることができる。
また、図１において、イオン化部としては、高分子をイオン化できるものであれば特に制限はないが、例えば、ＭＡＬＤＩやＥＳＩを挙げることができる。
図２は、波長可変赤外線レーザーとして、自由電子レーザーを用いた場合の光学系を示す図である。図２（ａ）は正面図、図２（ｂ）は上面図を示す。図２において、自由電子レーザーの出射口１５から放出された赤外線レーザー１２は、ミラーＭ１〜Ｍ８によって反射を繰り返し、レンズ２を通って、質量分析部４に入射される。質量分析部４は、図示しないイオントラップ部を備えており、イオントラップ部には、イオン化された高分子試料が保持されている。そして、高分子試料にレーザー１２が照射されるようになっている。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜ペプチド：サブスタンス Ｐの切断の例＞
図１の高分子分析装置を用いて、以下の手順でサブスタンス Ｐ（配列番号：１、ＳＵＢ Ｐ）を切断した。
なお、サブスタンス Ｐは、神経細胞から放出される化学伝達物質である神経ペプチドとして知られており、そのアミノ酸配列は、「Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ」である。
まず、サブスタンス Ｐ粉末（ＳＩＧＭＡ社製）をＭｉｌｌｉＱ水で溶解して３．７ｐｍｏｌ／μＬ溶液とし、２μＬをｎａｎｏ−ＥＳＩスプレーを用い質量分析装置内の超高真空イオン・トラップにサブスタンス Ｐをイオンとしてトラップした。
図１に示す高分子分析装置を用いて、波長可変赤外線レーザーを特定の発振波長に設定し、レーザー光をトラップされたイオンに３分間照射する測定を２回行い、蓄積されたデータの質量解析を実行することでサブスタンス Ｐの切断箇所を同定した。
なお、質量分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製 ＦＴＭＳ ４．７Ｔ）を用いて行った。
波長可変赤外線レーザーを用いて照射実験を行う際、使用したレーザーは、パルス幅約２ｐｓの極短ミクロパルスであることを特徴とし、このパルスは３５０ｐｓ毎に出力されるものである。これらのミクロパルスから幅１μｓのマクロパルスが形成され、そのマクロパルスは５Ｈｚで出力された。
その結果は、図３に示すとおりである。図３には、２価の親イオン［ＳＵＢ Ｐ＋２Ｈ］２＋（ｍ／ｚ＝６７４．３Ｄａ）に波長可変レーザーを照射することで、フラグメントの波長依存によるＦＴＭＳ質量スペクトラが示されている。
このＦＴＭＳ質量スペクトラでは、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ間のペプチド結合が切断されｍ／ｚ＝１０９４．８Ｄａと２５４．２Ｄａに相当するピーク（ｂ２／ｙ９）が観測され、またｍ／ｚ＝６００．３ＤａにはＬｅｕ−Ｍｅｔ間のペプチド結合が切断され２価にチャージしたｂ１０ ２＋のピークが観測できた。
図４に、サブスタンス Ｐ イオンに照射したレーザーの波長と観測されたイオンの関係を示す。
この図から明らかなように、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ及びＬｅｕ−Ｍｅｔ間のペプチド結合が切断され検出されたフラグメント・ピーク（ｂ２／ｙ９， ｂ１０ ２＋）は、５．９〜８．５μｍの波長の範囲で観測されたが、８．７μｍ波長以上では観測できなかった。特に、ペプチドやタンパク質の赤外スペクトルにおいて強い吸光度を示すバンドとして知られるアミドＩに相当する６．１μｍでは、フラグメント強度が最も強く観測された。
＜糖鎖：シアリル ルィスＸの切断の例＞
実施例１と同様の方法を用い、波長依存性による糖鎖切断部位の選択性を調査した。ここで実験対象としたのは５糖からなるシアリル ルィスＸである。
図５は、１価の親イオン［ＳＬＥＸ＋Ｎａ］＋（ｍ／ｚ＝８４３．４Ｄａ）に０．１μｍ間隔で５．７μｍから９．５μｍまでのレーザー光を照射して得られた、フラグメント・イオンの波長依存性を示した質量スペクトラである。
図６に、シアリル ルィスＸ イオンに照射したレーザーの波長と観測されたイオンの関係を示す。シアリル ルィスＸ イオンでは８．５μｍから９．５μｍにおいては［（Ｍ−ＮｅｕＡｃ）＋Ｎａ］＋（ｍ／ｚ＝５５２．２Ｄａ）や［（Ｍ−ＮｅｕＡｃ−Ｆｕｃ）＋Ｎａ］＋（ｍ／ｚ＝４０６．２Ｄａ）に相当するピークが強く観測された。これらは親イオンからＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）やフコース（Ｆｕｃ）のグリコシド結合が切断されたピークに相当している。この図に示されるように糖鎖では、ペプチドとは異なりアミドＩやアミドＩＩに相当する５．７μｍ〜６．５μｍの波長域の間にフラグメント・ピークを観測できなかったが、グリコシド結合の結合伸縮に相当する９μｍ付近では顕著にフラグメント・ピークを観測できた。この結果はペプチド／タンパク質のペプチド結合と糖鎖のグリコシド結合の波長による選択的切断を意味している。
なお、上記の実験で用いた波長可変赤外線レーザー発振器の波長ごとのレーザー光強度は、図７に示すとおりである。
以上の結果から、本発明の高分子分析装置および高分子分析方法の有用性が確認された。
図１は、本発明の高分子分析装置の構成を示す図である。 図２は、波長可変赤外線レーザーとして、自由電子レーザーを用いた場合の光学系を示す図である。 図３は、サブスタンス Ｐイオンの波長可変レーザーによるＦＴＭＳ質量スペクトラを示す図であり、０．２μｍ間隔で５．７μｍ〜９．５μｍの波長の範囲について波長依存性によるフラグメント解析を実行したものである。 図４は、サブスタンス Ｐ イオンに照射した波長と観測されたイオンとの関係を示す図である。 図５は、シアリル ルィスＸイオンの波長可変レーザーによるＦＴＭＳ質量スペクトラを示す図である。 図６は、シアリル ルィスＸ イオンに照射した波長と観測されたイオンの関係を示す図である。 図７は、実施例における波長可変赤外線レーザー発振器の波長ごとのレーザー光強度を示す図である。
符号の説明
１ レーザー出力部
２ レンズ
３ パワーメータ
４ 質量分析部
５ イオン化部
８ イオントラップ部
１０ 高分子分析装置
１２ 赤外線レーザー
１５ 自由電子レーザーの出射口
Ｍ１〜Ｍ８ ミラー

Claims (7)

  1. イオン化された試料を保持するイオントラップ工程と、
    前記イオントラップ工程にて保持したイオン化された前記試料に波長可変の赤外線レーザーを照射し、前記試料を切断する赤外線レーザー照射工程と、
    前記赤外線レーザー照射工程にて切断された前記試料の質量分析を行なう質量分析工程と、を含み、
    前記赤外線レーザーが、パルスレーザーであり、前記赤外線レーザーの波長を変化させることにより、前記波長に対応する特定の箇所で前記試料を切断することを特徴とする、高分子分析方法。
  2. 波長可変の赤外線レーザーが、３．５〜９．６μｍの範囲で波長を変化させることができることを特徴とする、請求項１に記載の分析方法。
  3. 波長可変の赤外線レーザーが、５〜９．６μｍの範囲で波長を変化させることができることを特徴とする、請求項１に記載の分析方法。
  4. 赤外線レーザーが、自由電子レーザーであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
  5. イオントラップ工程が、超高真空型イオントラップにより行なわれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の分析方法。
  6. 質量分析が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計により行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の分析方法。
  7. 試料が、タンパク質、ペプチド、糖類、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴する、請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
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