JP4247249B2 - 脂質膜センサ - Google Patents

Description

本発明は、物質を検出する脂質膜センサに係り、特に、水中に存在する環境汚染物質を測定するセンサに関する。

水中の毒物（環境汚染物質）をリアルタイムで検出するために、種々の方法が提案されてきている。いずれの方法においても、メンテナンスが必要とされ、毒物の種類や量を決定することは困難であった。

そこで、水中の物質の種類や量を正確に特定することが可能な環境汚染物質検出用センサが、本発明者らによって提案されている（特許文献１参照）。これにおいては、脂質二分子膜を用いることにより、物質を連続的に検出するとともに、該物質の種類や量の正確な測定が可能となった。かかる脂質膜を水中で再生する機構もまた、本発明者らにより提案された（特許文献２参照）。これにおいては、膜の破壊を自動的に検知し、基板の穴内部に自動的に脂質溶液を注入することにより脂質膜を再生して、脆弱性が改善された。

しかしながら、そうした脂質二分子膜を含むセンサシステムを用い、実地下水を流下して連続測定を実施したところ、脂質膜が予想以上に脆弱であることが確認された。しかも、送液ポンプに由来した電気的ノイズが大きく、測定精度および感度にも著しい低下が認められた（例えば、非特許文献１参照）。
特開平１１−５６３８９号公報 特開２００１−９１４９４号公報 成果報告会予稿集「エコセンサシステムによる地下水中のＶＯＣ（揮発性有機塩素化合物）の検出」

本発明では、脂質膜の安定性を維持し、脂質膜のゆらぎに起因した電気的ノイズが低減された脂質膜センサを提供することを目的とする。

本発明の一態様にかかる脂質膜センサは、水中の物質を検出する脂質膜センサであって、表面および裏面を有し、前記表面から前記裏面に達する貫通孔が設けられた基板と、前記基板の前記貫通孔内に配置され、前記物質と相互作用を示す脂質膜と、前記脂質膜に接して、前記基板の表面に設けられた電解質含有高分子ゲルと、前記電解質含有高分子ゲルに直接接してこの上に配置され、前記脂質膜の前記相互作用の情報を獲得する参照電極とを具備することを特徴とする。

本発明によれば、脂質膜の安定性を維持し、脂質膜のゆらぎに起因した電気的ノイズが低減された脂質膜センサが提供される。

以下、図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。
本発明の実施形態にかかる脂質膜センサは、水中に存在する毒物の種類および量を決定するものである。本明細書において、毒物とは環境汚染物質も含むものと定義される。

まず、毒物の作用について説明する。毒物とは、生体に害を及ぼす物質であり、生体「細胞」に害を及ぼす物質であると言い換えることもできる。したがって、毒物の作用は、「細胞膜」にも何らかの影響を及ぼすものと推測される。ここでいう「何らかの影響」とは、細胞膜に接着・吸着されたり、細胞膜内に取り込まれたりすることなどを意味している。

そこで、人工的に作製された擬似細胞膜（人工膜）を、電極などの表面に装着させることによって、擬似細胞膜への毒物の作用をリアルタイムで測定するセンサとして用いることが可能となる。すなわち、毒物との反応により変化する擬似細胞膜の物理情報を測定し、毒物反応前後の出力値の差から毒物の混入を判定することができる。物理情報とは、具体的には、膜電位、電気容量、インピーダンス、イオン透過性、発光、蛍光および発熱・吸熱などが挙げられる。

毒物の種類や量は、次のようにして決定される。一般に細胞膜は、リン脂質を主成分とする脂質二分子膜に蛋白質や糖などの分子が取り込まれたり、表面に接着したりして構成されている。擬似細胞膜は、脂質膜またはそれに代わる高分子膜をベースとし、対象となる毒物と作用する各種の蛋白質や糖などの分子を配合することによって、人工的に作製することができる。毒物の種類によっては、脂質膜のみで応答を示す場合もある。

したがって、用いる脂質や蛋白質・糖などの種類や量、さらには擬似細胞膜の作製方法などを変化させることによって、各種の毒物を測定可能な脂質膜センサが得られる。測定に当たっては、個々の脂質膜センサの毒物応答を予め求めておく。すなわち、毒物の種類や量に応じて出力値がどのように変化するか、想定される混合系を含めて調べておく。こうした応答パターンに基づいて、実際の測定結果（複数の脂質膜センサからの出力値）から毒物の種類および量が決定される。

上述したように構成される脂質膜センサにおいては、ほぼリアルタイムで応答を得ることができる。しかも、構成物が生物あるいは微生物ではないことから、餌を与えるといったメンテナンスは何等必要とされない。また、定常状態からのズレを出力値として用いることにより、広範囲な環境条件でのセンサの使用が可能である。さらに、各脂質膜センサからの出力値を無線で信号処理施設へ転送できるため、河川や海洋などでも制約なしに使用することができる。

しかしながら、脂質二分子膜を含む脂質膜は、物理的振動や静電気などの外力に対して不安定であり、その寿命も精々数日間程度であった。脂質膜センサを実用化するには、より安定なセンサデバイスを開発する必要がある。
まず、脂質二分子膜を作製し、これを用いた従来の脂質膜センサについて確認を行なった。

脂質二分子膜は、脂質を溶媒に溶解してなる脂質溶液を用いて、作製することができる。脂質としては、例えば、モノオレインなどの界面活性剤（擬似脂質）、リン脂質や糖脂質、コレステロール等が挙げられ、溶媒としては、ｎ−デカン、クロロホルム、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ｎ−ヘキサン等を使用することができる。溶媒中に所定の濃度で脂質を溶解して、脂質二分子膜を形成するための脂質溶液が調製される。脂質溶液中には、必要に応じて毒物反応物質を加えてもよい。毒物反応物質としては、例えば、イオノフォア、イオンチャネル、抗体、およびレシチン等を用いることができる。

一方、所定の大きさの貫通孔が設けられた基板を用意する。基板としては、例えば、テフロン（登録商標）製の膜、テフロン被覆したニッケル基板等を用いることができる。デバイスとしての強度および脂質膜の毒物に対する感度などを考慮すると、基板の厚さは、１０〜１００μｍであることが好ましい。また、脂質膜の水中での安定性は表面積に反比例することから、貫通孔の大きさは、直径１ｍｍ以下であることが好ましい。自動的に脂質液を供給するデバイスを考慮すると、貫通孔は基板の中央に設けられていることが望まれる。

基板を緩衝液に浸漬し、微小シリンジを用いて前述の脂質溶液を一定量、注入する。緩衝液としては、例えば、食塩水、リン酸緩衝液等を用いることができる。

所定時間放置することによって、基板に設けられた貫通孔の内部に脂質二分子膜が自然に再構成され、これと同時に毒物反応物質（糖脂質など）はこの膜内に取り込まれる。

以下の手法により、基板の貫通孔内に手動で脂質二分子膜を形成して、実際に脂質膜センサを作製した。基板としては、単一の穴を有するニッケル基板（孔径：０．１〜０．６ｍｍ，厚さ：１０μｍ）を用意した。この基板は、オプトニクス精密社製の特注品であり、表面をテフロン膜で被覆した後、穴の部分を針で破壊して使用した。

次のような試薬を用意した。トリオレイン（別名：グリセリルトリオレエート、分子量：８８５、融点：４〜５℃）およびトリクロロエチレン（通称：トリクレン）は、和光純薬工業社製を使用した。モノオレイン（別名：グリセリルモノオレエート、分子量：３５７、融点：３３〜３４℃）、ｎ−デカンおよびアセトニトリルは、関東化学社製を用いた。また、コレステロール（分子量：３８７、融点：１４９℃）はシグマ社製を使用した。

その他、実験に使用した試薬は、全て市販特級品をそのまま使用した。水としては、イオン交換水を超純水製造装置（ミリポア社製、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）を通して使用した。

図１に、用いた測定装置の模式図を示す。石英ガラス製の測定用セル１１（自社製の特注品）内に、シリコンパッキング（図示せず）を用いてニッケル基板１２を配置した。測定用セル１１内の各パートの容量は、約２５ｍＬである。

ニッケル基板１２に設けられた貫通孔内に、刷毛塗法により脂質二分子膜１３を作製する。刷毛塗法とは、脂質溶液を含ませた絵筆を用いて貫通孔の内部に脂質を注入し、自然放置することによって二分子膜を作製する手法であり、自然薄化法とも呼ばれる。脂質二分子膜１３の作製状況は、キーエンス社製のデジタルマイクロスコープ（ＶＨ−６３００）を用いて観察する。

脂質二分子膜１３で隔てて、測定極であるＡｇ／ＡｇＣｌ電極１５（東亜電波社製、特注品）を溶液内に浸漬し、エレクトロメータ１６（アドバンテスト社、ＴＲ８４１１）を用いて、膜間の電位差（膜電位）を計測する。データは記録計１７（横河ヒューレットパッカード社製、Ｔｙｐｅ：３０４７）で記録する。なお、測定用セル１１および電極１５は、防振台上に載置して物理的な振動を防ぐとともに、全体を電気的絶縁箱の中に収納して測定を行なう。

実験は、以下の手順で行なった。表面をテフロン膜で被覆したニッケル基板１２を、シリコン製パッキン（図示せず）を介して測定用セル１１内にセットした。ニッケル基板１２には、直径０．６ｍｍの貫通孔が設けられている。測定用セル１１の左右の各パート内には、緩衝液１４として２０ｍＬの１０ｍＭ食塩水溶液をそれぞれ添加した。その後、膜電位が安定するまで１５分程度放置する。この段階では、基板１２の貫通孔内には、まだ脂質二分子膜は形成されていない。

次いで、脂質溶液を含ませた絵筆を用いて、ニッケル基板１２の貫通孔の中に適量の脂質を入れ込む。絵筆の先端は、作業をし易くする目的で少し曲げてある。基板１２の貫通孔内に脂質が侵入すると膜抵抗が生じて、膜電位が急激に変化する。その後、静かに放置すると膜電位が一定の値に落ち着き、ニッケル基板１２の貫通孔内に脂質二分子膜１３が形成される。

一方、トリクロロエチレンのアセトニトリル溶液を調製し、右側のパートに１０μＬを添加した。左側のパートには、同量のアセトニトリルを収容し、トリクロロエチレンを添加する毎に膜電位の変化を調べた。なお、攪拌装置からの電気的ノイズおよび物理的振動の影響を避けるため、測定液の攪拌は行なわなかった。

トリクロロエチレン（最終濃度：５ｐｐｍ）の測定結果の一例を、図２に示す。本実験においては脂質としてモノオレインを用い、測定は全て室温で行なった。

図２の結果から明らかなように、トリクロロエチレン溶液を添加すると、膜電位は直ちに減少して極小値に達した後、徐々に増加して一定の膜電位になる。初期の膜電位と比較すると約１ｍＶの減少に相当する。この場合、繰り返してトリクロロエチレンを添加すると、添加の回数、すなわちトリクロロエチレン濃度の増大に伴なって、平衡電位が徐々に低下することも明らかになった。

しかしながら、４回目の添加では、膜電位の変化はほとんど観測されず、しかも、４回目添加後には膜が破壊した。なお、膜電位の絶対値の変化が重要である。極性（＋側あるいは−側）の変化は使用する電極の特性に依存するので、あまり重要ではないものと推測される。

以上から、モノオレインという単一の脂質二分子膜で、毒物としてのトリクロロエチレンに対して膜電位応答を示すことが明らかになり、脂質二分子膜を利用する毒物バイオセンサの基本原理が確認できたということができる。しかしながら、脂質二分子膜の不安定性も再確認されたのである。

上述した刷毛塗法は、自動化して基板の貫通孔内に脂質膜を形成することが可能である。すなわち、一定量の脂質溶液を数μＬレベルの量で、脂質膜を作製するための貫通孔内に自動注入する。図３を参照して、自動脂質膜センサについて説明する。

図示する装置においては、測定用セル２１内にテフロン被覆ニッケル基板２２が配置され、この基板２２に設けられた貫通孔内に脂質二分子膜２３が形成される。

脂質溶液は吐出部２４から吐出され、この吐出部２４にはマイクロポンプ（吐出ポンプ）を用いることができる。吐出部２４には、貯留槽２５内に収容された脂質溶液が供給される。なお、吐出部２４としてインクジェット方式（圧電素子利用）のポンプを採用した場合には、安価に小型化を図れる点で有利である。

測定用セル２１内の各パートには、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極２６が浸漬され、コントローラ２７に接続されている。膜電位をモニターして、脂質膜の状態を検知することができる。脂質膜が破壊されると膜電位が消失するので、このタイミングで脂質溶液を注入して脂質膜が形成される。したがって、光学的な検出法に比べて非常に簡便になる。脂質溶液が貫通孔内に注入されると、±１０ｍＶ以上の膜電位が発生し、安定な脂質膜が形成されるに伴なって、徐々に一定の電位に落ち着いてくる。実際の毒物測定は、膜電位が一定になってから実施される。

図３に示した脂質膜センサを用いて、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ＤＣＥ）を実際に測定した。その結果を図４のグラフに示す。

本デバイスを使用して、５０ｐｐｂオーダーでもＤＣＥが測定できることが明らかになった。その後の検討の結果、孔径を０．１ｍｍにすることにより、１０ｐｐｂまで測定可能であることが示された。しかしながら、図４では示されていないが、４回目のＤＣＥ注入前に脂質膜は破壊してしまい、物理的な振動などに対して非常に脆弱であることが明らかになった。

以上の結果から明らかなように、従来の脂質膜センサにおいては、水中に脂質膜が単独で存在していたために、液や外部の振動を拾い易い。そのため、揺らぎに伴なう大きな電気的ノイズが発生し、かつ物理的振動に伴なって膜が破壊されてしまうことも多かった。

本発明者らは、この問題を解決すべく鋭意検討した結果、脂質膜と電極とを一体構造とすることによって、振動に対する安定性を高めることを可能とした。

図５に、本発明の実施形態にかかる脂質膜センサの一例の模式図を示す。図示するように、表面から裏面にわたって貫通孔が設けられた基板３０の貫通孔内には、脂質二分子膜３１が配置されている。基板３０としては、例えば、サファイア基板、シリコン基板、ガラス基板等を用いることができる。この基板３０の表面には、高分子ゲル３２によって参照電極３３が接合されている。

高分子ゲル３２としては、例えば、寒天およびアクリルアミド等を用いることができ、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの電解質が含有されている。高分子ゲル３２は、基板３０と参照電極３３とを接合するとともに、脂質二分子膜３１に生じた電気化学的相互作用を参照電極３３に伝達するという作用を有する。

高分子ゲル３２上には、参照電極３３が設けられて、本発明の実施形態にかかる脂質膜センサが構成される。参照電極３３は、例えば、銀／塩化銀及び塩化カリウムにより構成することができ、
図示する脂質膜センサを作製するに当たっては、まず、基板３０に設けられた貫通孔を微小な蓋で覆っておく。微小な蓋としては、例えば、シリコン基板等を用いることができる。参照電極３３の表面に電解質を含む高分子ゲル３２を配置し、この上に、貫通孔を有する基板３０を装着する。これによって、基板３０と参照電極３３とは、高分子ゲル３２を介して一体化される。

基板３０の貫通孔内の微小な蓋を精密ピンセットにより除去した後、従来の吐出ポンプなどを利用して一定量の脂質溶液を、基板３０に開けた小孔中に吐出する。この際、基板３０の裏面は、親水処理されていることが望ましい。例えばサファイア基板の場合には、ＳｉＯ₂膜などを配置することによって親水性が高められる。これによって、吐出された脂質溶液の余剰部分が、基板裏面に残りにくくなるという利点が得られる。

なお、基板の貫通孔は、脂質二分子膜が形成される部分を残して、テーパ状を有していてもよい。こうした基板を用いた脂質膜センサの例を図６に示す。図示する例においては、基板３４の貫通孔の高分子ゲル３２側は、テーパ状である。こうした基板を用いることによって、ゲル充填作業が容易になる。しかも、テーパ状とすることにより、光リソグラフィーによる基板加工が可能となり、基板製造コストが低減するという点でも有利である。

テーパ部分の拡大断面図の一例を、図７に示す。テーパ角は、例えば６０°とすることができる。

図７に示した脂質膜センサを地下水流化状態において使用し、脂質膜の安定性について検討した。使用した送液ポンプは、従来の実験に使用していたものと同一とした。脂質膜の存在日数および電気的ノイズの大きさを指標として、脂質膜の安定性を評価し、得られた結果を、下記表１に示す。

上記表１に示されるように、実施例の脂質膜センサは、ほぼ１週間にわたって安定に存在し、毒物の測定が可能であった。従来のセンサの存在時間が最大でも１２時間であったのと比較すると、安全性は著しく高められたことがわかる。検出感度は、従来の脂質膜センサと比較して何等遜色ないものであった。

また、実施例の脂質膜センサは、電気的ノイズが１〜２ｍＶと安定した膜電位を示している。従来例での電気的ノイズは６〜７ｍＶであり、フロー系による測定おいては、ポンプ由来の脂質膜の揺らぎが電気的ノイズの一因であった。

本発明の実施形態にかかる脂質膜センサにおいては、基板の貫通孔内に配置された脂質膜は、高分子ゲルによって電極と一体化されているので、振動に対する安定性を高めることが可能となった。

従来の脂質膜センサの一例を表わす模式図。 膜電位応答例を表わすグラフ図。 従来の自動脂質膜センサの一例を表わす模式図。 膜電位応答例を表わすグラフ図。 本発明の一実施形態にかかる脂質膜センサを表わす模式図。 本発明の他の実施形態にかかる脂質膜センサを表わす模式図。 基板の貫通孔におけるテーパ部分の断面拡大図。

符号の説明

１１…測定用セル； １２…ニッケル基板； １３…脂質二分子膜
１４…食塩水溶液； １５…Ａｇ／ＡｇＣｌ電極； １６…エレクトロメータ
１７…記録計； ２１…測定用セル； ２２…テフロン被覆ニッケル基板
２３…脂質二分子膜； ２４…吐出部； ２５…貯留槽； ２６…Ａｇ／ＡｇＣｌ電極
２７…コントローラ； ３１…基板； ３２…脂質膜； ３２…高分子ゲル
３３…参照電極； ３４…基板。

Claims (1)

1. 水中の物質を検出する脂質膜センサであって、
   表面および裏面を有し、前記表面から前記裏面に達する貫通孔が設けられた基板と、
   前記基板の前記貫通孔内に配置され、前記物質と相互作用を示す脂質膜と、
   前記脂質膜に接して、前記基板の表面に設けられた電解質含有高分子ゲルと、
   前記電解質含有高分子ゲルに直接接してこの上に配置され、前記脂質膜の前記相互作用の情報を獲得する参照電極と
   を具備することを特徴とする脂質膜センサ。

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