JP4239666B2

JP4239666B2 - Method for producing sporangia of fungi belonging to Bacillus popilie and method for screening medium components

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Publication number: JP4239666B2
Application number: JP2003123605A
Authority: JP
Inventors: 岳江原; 雅敏木村; 秀治西橋
Original assignee: DIC Corp
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2009-03-18
Anticipated expiration: 2023-04-28
Also published as: JP2004321131A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養することにより、コガネムシ科昆虫の幼虫防除に有用なバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢（以下、単に胞子嚢と言うことがある）を製造する方法、及び該胞子嚢の製造に有効な培地成分をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（コガネムシ幼虫による被害とバチルス・ポピリエに属する菌の防除剤としての利用）
コガネムシ科昆虫の幼虫は、芝や農園芸作物や樹木等の広範囲な植物の根を食餌し、多大な被害を与えることが知られている。これらコガネムシ科昆虫の幼虫は地中に棲息するため、地上から散布する化学農薬では防除効果が得にくく、また幼虫の棲息場所も特定しにくい。このため広範囲に多量の農薬を散布して地中に農薬を浸透させる必要があり、自然環境や人体に対する悪影響が懸念されるため、より有効な防除方法が切望されていた。
バチルス・ポピリエに属する菌はコガネムシ科昆虫の幼虫に経口的に感染して乳化病を発病させ最終的にこれらを死に至らしめることが知られている。このため化学農薬が効きにくいコガネムシ科昆虫の防除に該菌の胞子嚢を利用しようとする試みが古くから行われてきた。
【０００３】
（バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢の難生産性）
バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を生産する方法としては例えば、寄生宿主であるコガネムシ科昆虫の幼虫を利用した方法が従来から知られていた。即ち、胞子嚢を含む腐葉土中で幼虫を飼育して経口的に摂取させる、あるいは直接虫体に胞子嚢を注射するなどして幼虫体内で増殖させ、その後虫体を切開するなり擂り潰すなりして得た体液から胞子嚢を回収する方法である。しかし、この方法ではコガネムシ科昆虫の幼虫を大量に飼育することが必要であり、装置、人員、コストなどの観点から事実上工業生産は難しかった。そこで工業生産に適する、コガネムシ科昆虫の幼虫を必要としない人工培養方法に関する多くの研究がなされてきた。
【０００４】
ところで、バチルス・ポピリエに属する菌は図１の生活環で示すように、まず休眠状態の胞子嚢が発芽して活動状態の栄養細胞へと変化する。次に、これが分裂サイクルを繰り返すことでその数を増やしていき、増殖する。最終的に栄養細胞は再び胞子嚢へと変化し、休眠状態に戻る。このとき、栄養細胞のうち胞子嚢形成のサイクルに移行するものの割合が高ければ高いほど、それだけ多くの胞子嚢を生産できたことになる。よって、胞子嚢の高生産を達成するためには、十分な栄養細胞の増殖と高い胞子嚢化率を両立させることが必要である。しかし実際には、他の微生物に用いられるような培地でバチルス・ポピリエに属する菌の培養を試みても栄養細胞を増殖させることすら困難で、例え栄養細胞を増殖し得たとしてもすぐに急激な死滅を起こし、胞子嚢形成に到達させることは極めて困難であった。
【０００５】
（従来の胞子嚢製造技術）
それでも、選抜された菌株を用いたり、培地成分を工夫したりすることで胞子嚢生産を可能とする技術が一部開発されている。
例えば、バチルス・ポピリエに属する菌のうち、ＮＲＲＬＢ−２３０９ＳやＮＲＲＬＢ−２３０９Ｍといった選抜株を用いて人工培養により胞子嚢が得られたとする報告が知られている。しかし、その生産性は低かった。また、前者においては経口投与でのコガネムシ科昆虫の幼虫に対する防除効果の記述がなく、不明である。後者に至っては、経口投与での効果は全くないことが明らかにされている（例えば非特許文献１参照）。これに対し、培地にグルタミン酸などを含ませることにより胞子嚢が培地１ｍｌ当たり５×１０^７〜１×１０^９個得られ、且つそれが防除効果を有するという技術も開示されている（例えば特許文献１参照）。しかし、工業レベルでの胞子嚢製造という観点では必ずしも満足できる生産性ではなかった。
【０００６】
（従来の培地成分スクリーニング技術）
工業レベルでの胞子嚢製造を可能にするには、バチルス・ポピリエに属する菌の培養方法、特に培地組成の検討、即ち、有効な培地成分のスクリーニングが不可欠である。培地成分のスクリーニング方法としては例えば、ある特定の組成を持つ基本培地を用意して、そこに検討する種々の培地成分を種々の濃度で添加し、これらにバチルス・ポピリエに属する菌を接種して培養した後、基本培地に対する胞子嚢生産性の向上で評価する方法がある。スクリーニングの対象は、必ずしも単一培地成分の添加だけとは限らず、複数成分の組み合わせ、更にはそれぞれの濃度の組み合わせなども考えられ、試験点数は膨大となる。そのため、スクリーニングはフラスコ培養あるいは固体（平板）培養で行うことが望ましい。なぜなら、発酵槽を用いた培養は胞子嚢高生産に有利で評価をしやすい反面、大がかりな装置であり、スクリーニング手法としては非効率的だからである。ところが、従来公知の培地を用いたバチルス・ポピリエに属する菌のフラスコ培養あるいは固体（平板）培養では、比較的高い胞子嚢生産性が得られることがあるものの再現性は必ずしも高くなく、試験の度に値が大きく変動してしまうという問題があった。このような理由から、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢生産に有効な培地成分のスクリーニング用基本培地として従来公知の培地は適しておらず、好適なスクリーニング方法はこれまで存在しなかった。そこで、安定的な（再現性よい）胞子嚢生産が可能で、かつ好ましくは検出・評価しやすくするため比較的生産性の高い培地及びそれを利用したスクリーニング方法が切望されていた。
【０００７】
（従来の培地における遊離型メチオニン含有量）
従来、胞子嚢生産性の安定化を図る方策として培地に０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを添加した例はなかった。但し、遊離型メチオニンは培地成分としてしばしば用いられるペプトン、酵母エキスやラクトアルブミン分解物などにも少量含まれていることから、意図せずとも結果的に培地に含まれていることがあった。しかし、そのような場合にも含有量は非常に低く、０．１質量％よりも遙かに低かった。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３０号公報
【非特許文献１】
イーエスシャーペ、グラントセイントジュリアン、クラレンスクロウェル（E. S. Sharpe, Grant St. Julian, and Clarence Crowell），「アプライドマイクロバイオロジー（Applied Microbiology）」，１９７０年，第１９巻，Ｐ．６８１−６８８
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、胞子とパラスポラルボディとを含み、コガネムシ科昆虫の幼虫に対して優れた防除効果を示すバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢をフラスコ培養や固体（平板）培養でも安定的に製造可能な方法、及び該方法を利用した有効な培地成分のスクリーニング方法、更には該胞子嚢を工業レベルの高い生産性で製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含有した培地を用いてバチルス・ポピリエに属する菌を培養することにより、胞子嚢の安定的生産がフラスコ培養や固体（平板）培養でも可能となりスクリーニング用基本培地として使用できること、及び前記培地で培養することにより胞子嚢が安定高生産されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養し、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を製造する方法であって、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含む培地で培養することを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分をスクリーニングする方法であって、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含む培地を基本培地とすることを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（使用するバチルス・ポピリエに属する菌）
本発明で用いるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌の細菌学的性質は、非特許文献２によれば、長さが１．３〜５．２μｍ、幅が０．５〜０．８μｍのグラム陰性桿菌で、生育温度が２０〜３５℃であり、図２に示す模式図の如く胞子嚢の中に胞子とパラスポラルボディとを有する。しかし、バチルス・ポピリエはパエニバチルス・ポピリエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に再分類されるべきとのパターソンらの学説（非特許文献３）が提示されており、現段階ではその分類扱いが明確になっていないため、本発明においてはバチルス・ポピリエに属する菌とはパエニバチルス・ポピリエに属する菌をも包含するものとする。
【００１４】
（非特許文献２）：アールイーブヒャナン、エヌイーギボンズ（R. E. Buchanan, N. E. Gibbons），「バージェイズマニュアルオブデターミネイティブバクテリオロジー（BERGEY'S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY）」，１９７４年，第８版
【００１５】
（非特許文献３）：バーティルパターソン、カレンイーリップレ、アランエーユーステン、ファーガスジープリースト（Bertil Pettersson, Karen E. Rippere, Allan A. Yousten, Fergus G. Priest），「インターナショナルジャーナルオブシステマティックバクテリオロジー（International Journal of Systematic Bacteriology）」，１９９９年，第４９巻，Ｐ．５３１−５４０
【００１６】
本発明で使用されるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌株としては、バチルス・ポピリエ・セマダラ（ＢａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅＳｅｍａｄａｒａ、ＦＥＲＭＢＰ−８０６８）、バチルス・ポピリエ・マメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅｖａｒ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅＭａｍｅ、ＦＥＲＭＢＰ−８０６９）、バチルス・ポピリエ・ヒメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅｖａｒ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅＨｉｍｅ、ＦＥＲＭＰ−１７６６０）、バチルス・ポピリエ・サクラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅｖａｒ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅＳａｋｕｒａ、ＦＥＲＭＰ−１７６６２）、バチルス・ポピリエ・デュトキ（ＢａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅＤｕｔｋｙ、ＡＴＣＣＮｏ．１４７０６）、バチルス・ポピリエ・メロロンサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅｓｕｂｓｐ．ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａｅ）等が挙げられる。
【００１７】
尚、バチルス・ポピリエ・セマダラは、平成１０年５月２１日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭＰ−１６８１８で寄託され、平成１４年５月２１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０６８が付与されている。また、バチルス・ポピリエ・マメは、平成１１年１１月２５日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭＰ−１７６６１で寄託され、平成１４年６月１０日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８０６９が付与されている。
【００１８】
（遊離型メチオニン）
本発明で使用する培地は遊離型のメチオニンを含ませること以外特に限定はなく、微生物を培養する公知の培地を使用することができる。遊離型メチオニンの培地中濃度は０．１〜１質量％となるよう調整することが好ましい。通常用いられる培地成分、例えばペプトン、酵母エキスやラクトアルブミン分解物により該遊離型メチオニンが供給されることがあるが、その濃度は０．０３質量％前後と低く、不十分であるため、別途０．０７〜０．９７質量％添加することでこれを補うことが好ましい。
【００１９】
（ペプトン、酵母エキス）
本発明で使用する培地はペプトンや酵母エキスを含有することが好ましい。
ペプトンとしては、通常の微生物培養に用いられるものであれば特に限定されないが、「ポリペプトンＳ」（日本製薬社製）や「ポリペプトンＹ」（日本製薬社製）、「細菌用ペプトン」（ＯＸＯＩＤ社製）や「ソイペプトン」（ＯＸＯＩＤ社製）、「トリプトン」（Ｄｉｆｃｏ社製）などが挙げられ、これらのうち胞子嚢形成促進効果が高いことからポリペプトンＳ、ポリペプトンＹが好ましい。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましく、０．１〜１質量％とすることが特に好ましい。
【００２０】
酵母エキスとしては、例えば、ＯＸＯＩＤ社製あるいはＤｉｆｃｏ社製の「酵母エキス」などが挙げられる。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましく、０．１〜１質量％とすることが特に好ましい。
【００２１】
（吸着剤）
本発明で使用する培地は、バチルス・ポピリエに属する菌の生育を阻害する物質の除去を目的とした吸着剤を含んでいてもよい。該吸着剤としては活性炭、吸着樹脂、アロフォサイト又はモレキュラーシーブ等が挙げられる。培養における胞子嚢生産性がより高いことから、活性炭及び吸着樹脂が好ましい。
本発明で使用する活性炭の形状は、粉末状、粒状又はシート状等、いずれであってもよいが、単位質量当たりの分解又は吸着能が最も高い粉末状の活性炭を使用するのが好ましい。
【００２２】
吸着樹脂は、吸着能を有する多孔質重合体を意味し、例えば粒子状に成型された架橋性多孔質重合体で、粒子内部にまで達する細孔構造により水溶液中の生育阻害物質を効率よく吸着しうる合成樹脂である。具体的には、三菱化学社製の芳香族系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮＨＰ２０」、「ＤＩＡＩＯＮＨＰ２１」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ８２５」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ８５０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ７０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ７００」、置換芳香族系合成樹脂吸着剤「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ２０７」、アクリル系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮＨＰ２ＭＧ」などを挙げることができる。
【００２３】
本発明で使用する培地中の吸着剤の含有率は、培地の０．０５〜５質量％が好ましい。０．０５質量％以上であれば菌の生育阻害物質の吸着、除去効果を十分発揮し、５％以下であれば菌の増殖に必要な栄養源の吸着も少ないため、該範囲内で菌の高い増殖促進効果を示す。
【００２４】
（プロリン、グルタミン酸）
本発明で使用する培地はプロリンを含有することが好ましい。プロリンの培地中の含有率は、菌の増殖を促進し、かつ胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の単位体積当たりの生産数を高くできることから培地の０．１〜０．７質量％が好ましく、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。該含有率が０．１質量％未満である場合、及び０．７質量％を超える場合、菌の増殖促進効果が低下するだけでなく培地単位体積当たりの胞子嚢の生産数も低下する。
【００２５】
本発明で使用する培地はグルタミン酸及びその塩を含有していても良い。グルタミン酸及びその塩としては、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グルタミン酸アンモニウム、グルタミン酸塩酸塩等が挙げられる。これらの培地中の濃度は０．２〜４．０質量％であり、より優れた菌の増殖及び胞子嚢化率を呈する点で０．４〜１．０質量％が好ましい。
【００２６】
（ラクトアルブミン分解物）
本発明で使用するラクトアルブミン分解物としては特に限定されないが、例えば「ラクトアルブミン水解物」（和光純薬社製）、「オルプラスＷ１」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ３」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ５」（オルガノ社製）などが挙げられる。但し、加水分解率が１０％以下のラクトアルブミン分解物ではバチルス・ポピリエに属する菌の増殖への効果は小さく、また、加水分解率が２０％以上のものを用いるとフラスコ培養や固体（平板）培養においては胞子嚢化率が低くなり生産性が低下する。よって、フラスコ培養や固体（平板）培養での培地成分スクリーニングにおける基本培地には、これらにおいても比較的高い胞子嚢生産性が得られる加水分解率１０〜２０％のラクトアルブミン分解物を用いることで生産性検討をしやすくすることが好ましい。加水分解率が１０〜２０％のものとしては「オルプラスＷ３」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ５」（オルガノ社製）などが例示される。一方、発酵槽での培養においては胞子嚢形成促進効果が高いことから「ラクトアルブミン水解物」（和光純薬社製）が好ましい。これらの培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましく、０．１〜１．５質量％とすることが特に好ましい。
【００２７】
（トレハロース、ピルビン酸）
本発明で使用するトレハロースは、優れた菌の増殖促進効果が得られることから、培地に対して０．００１〜５質量％添加することが好ましい。
また、ピルビン酸及びその塩としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム等が挙げられる。菌の増殖促進及び胞子嚢生産数を高めるためには培地へのピルビン酸及びその塩の添加濃度を０．００１〜０．５質量％とすることが好ましく、０．０１〜０．３質量％とすることがより好ましい。
【００２８】
（マグネシウム、マンガン、カルシウム）
本発明で使用する培地は、マグネシウム、マンガン、カルシウムを含んでいることが好ましい。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成を強く促進することから、培地中の前記金属の含有濃度をマグネシウムが５０〜１００ｐｐｍ、マンガンが１０〜４０ｐｐｍ、カルシウムが５０〜１００ｐｐｍとなるよう調整することが好ましい。通常用いられる培地成分、例えばペプトン、酵母エキスやラクトアルブミン分解物によりこれらが供給されることがあるが、その濃度は低く不十分であるため、別途金属化合物を添加することでこれを補う必要がある。
【００２９】
マグネシウムを供給するための化合物としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、乳酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及びこれらの水和物、水酸化マグネシウムが好ましく、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．５〜４．１１ｍＭとすることが好ましい。
【００３０】
マンガンを供給するための化合物としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン及びこれらの水和物が好ましく、硫酸マンガン、塩化マンガンがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．１〜０．７３ｍＭとすることが好ましい。
【００３１】
カルシウムを供給するための化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、クエン酸カルシウム、硝酸カルシウム及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、塩化カルシウム、酢酸カルシウム及びこれらの水和物、炭酸カルシウム、水酸化カルシウムが好ましく、塩化カルシウムがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．１〜１．０５ｍＭとすることが好ましい。
【００３２】
以上のことから、本発明で使用する培地に、ペプトン、酵母エキス及び吸着剤を含有することが好ましい。また、グルタミン酸及びその塩、並びにプロリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有すること、及び(1)ラクトアルブミン分解物、(2)トレハロース、(3)ピルビン酸及びその塩、(4)マグネシウム、マンガン、カルシウム及びこれらを含む化合物、からなる群から選ばれる少なくとも一種が含まれることが好ましい。
【００３３】
（液体培地、固体培地）
本発明の製造方法に用いる培地は、液体培地であっても固体（平板）培地であっても良いが、胞子嚢生産性や操作性の観点から液体培地が好ましい。固体培地の場合には、培地組成に寒天などの多糖類を加えればよい。その添加濃度は０．５〜５質量％であり、優れた菌の増殖を呈することから１〜３質量％が好ましい。液体培地による培養は、フラスコまたは発酵槽を用いた回分培養、連続培養、半回分培養又は流加培養など、いずれの方式で行っても良い。
【００３４】
（培養条件）
本発明で使用するバチルス・ポピリエに属する菌の増殖に適した培養温度は２５〜３２℃である。また、培地のｐＨは６．５〜９．０が好ましく、フラスコ（液体）培養及び固体培養の場合には７．５〜８．５がより好ましく、発酵槽を用いた培養の場合には７．０〜８．０がより好ましい。更に好ましくは、発酵槽での培養中、培地のｐＨを常に７．０〜８．０に制御する。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。通気量は０．１〜２ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）に調整することが好ましく、優れた菌の増殖及び胞子嚢生産性が得られることから０．５〜１．５ｖｖｍとすることがより好ましい。これら最も好ましい条件で培養を行うためには、液体培養、特に発酵槽を用いた液体培養が適している。
【００３５】
培地に接種する菌体としてはバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を用いる。接種する菌体の接種量は少なすぎると、単位培地当たりの生産量を増やすことが難しく、逆に接種量を多くしても生産量が接種量に比例して上がらず、生産量は飽和してしまう。このため、接種量としては培地１ｍｌ当たり１×１０^２〜１×１０^８個が好ましく、１×１０^３〜１×１０^７個の胞子嚢の接種が特に好ましい。
培養時間は培養方法、培養温度、培養ｐＨ又は接種菌体量によって異なるが、通常、回分液体培養の場合で５〜１０日である。
【００３６】
（胞子嚢の生産性と回収）
液体培養終了後に培養物から胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を回収する方法は、培養液から遠心分離や濾過等の一般的な分離方法で該胞子嚢を含む菌体を分離し回収すればよい。この際、必要に応じて水や緩衝液を使った洗浄操作を加えてもよい。固体（平板）培養の場合は、培地表面に生えた菌体に水などをかけて懸濁させ、後の操作は液体培養の場合と同様に行えばよい。
【００３７】
本発明の製造方法によれば、フラスコ培養や固体（平板）培養においても安定的に胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を製造することができ、これを基本培地とした培地成分のスクリーニングが可能となる。また本発明の製造方法によれば、胞子嚢の数を、菌数に対し３０〜６０％の割合で製造することができ、かつ該胞子嚢の数を培養液１ｍｌ当たり１．２×１０^９個〜２．５×１０^９個（１２億個〜２５億個）の割合で製造することができる。
【００３８】
（防除対象コガネムシ幼虫）
本発明の製造方法により得られた胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢はコガネムシ科昆虫の幼虫に殺虫活性又は生育抑制等の防除効果を示し、コガネムシ科昆虫の防除剤として有用である。
防除対象のコガネムシ科昆虫としては、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａｃｕｐｒｅａ）、セマダラコガネ（Ｂｌｉｔｏｐｅｒｔｈａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）、ウスチャコガネ（Ｐｈｙｌｌｏｐｅｒｔｈａｄｉｖｅｒｓａ）、チャイロコガネ（Ａｄｏｒｅｔｕｓｔｅｎｕｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ヒメコガネ（Ａｎｏｍａｌａｒｕｆｏｃｕｐｒｅａ）、チビサクラコガネ（Ａｎｏｍａｌａｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄｔｉ）等の幼虫が挙げられる。
【００３９】
（バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢製剤及びその使用方法）
本発明の製造方法により製造した胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢は、それらを懸濁した液のままコガネムシ科昆虫の防除剤として用いても良く、または乾燥して粉末にして散布しても良い。また乾燥した粉末を水あるいは緩衝液との懸濁液とし、土壌に散布しても良い。しかし、通常は該胞子嚢を農薬に用いられる慣用の添加剤と共に通常の微生物農薬の製造方法で製剤化してコガネムシ科昆虫の防除剤として施用することが好ましい。また本発明の製造方法により得られる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を他の微生物製剤に混合して使用することも可能である。前記防除剤中に含まれる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の含有率は、コガネムシ科昆虫に防除効果を示す範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、施用に際して水和剤、乳剤では防除剤１リットル当たり胞子嚢が１×１０^９〜１×１０^１３個程度となるよう調製することが好ましく、粉剤、粒剤では防除剤１ｇ当たり１×１０^８〜１×１０^１２個程度となるよう調製することが好ましい。
【００４０】
防除剤の施用方法としては、剤型や対象作物等によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、施設内施用、土壌混和施用又は土壌潅注施用等の方法を挙げることができる。また、他の薬剤、すなわち殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料又は土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材又はポリビニルアルコール系資材等）等と混合して施用、あるいは混合せずに交互施用または同時施用することもできる。
前記防除剤の施用量は、コガネムシ科昆虫の種類、適用植物の種類及び剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、地上散布する場合、本発明の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の施用量が１アール当たり１０^１０〜１０^１５個、好ましくは１アール当たり１０^１１〜１０^１４個程度となるようにすればよい。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００４２】
（参考例１）
（各培地成分に含まれる遊離型メチオニンの測定）
バチルス・ポピリエに属する菌の培養にしばしば用いられる培地成分に含まれる遊離型メチオニンの含有量を、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたポストカラム法により測定した。
標準試料としてはアミノ酸混合標準液Ｈ型（和光純薬社製、各アミノ酸２．５ｍｍｏｌ／ｌを含む）を使用した。測定した試料は、「ポリペプトンＳ」（日本製薬社製）、「ポリペプトンＹ」（日本製薬社製）、「トリプトン」（Ｄｉｆｃｏ社製）、酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）であった。分析には日立製作所製のアミノ酸自動分析装置「ＬａＣｈｒｏｍ」を使用した。
標準試料及び各測定試料より得られたピークエリアから換算して、各測定試料中に含まれるメチオニンの含有率を算出し表１に示した。
【００４３】
【表１】
（表１）

【００４４】
上記分析値から、バチルス・ポピリエに属する菌の培養に好適な培地組成（例えば、０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ）、１．０質量％ラクトアルブミン水解物、０．５質量％トレハロース、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム、０．５質量％Ｌ−プロリン、０．０５質量％ピルビン酸ナトリウム、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物、０．０１質量％、０．３質量％活性炭素粉末）に含まれるメチオニンの量を算出すると０．０３質量％程度であり、本発明の下限値０．１質量％よりも遙かに低いことが判明した。
【００４５】
（比較例１）
（メチオニン未添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
３００ｍｌ三角フラスコに下記培地（ａ）１００ｍｌを入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約５×１０^８個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液２０μlを前記培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍにて７日間振盪培養した。培養終了後、顕微鏡観察により胞子嚢数を計測した。同様の試験を２０回行い、胞子嚢数の平均値及び標準偏差を求めた。結果を実施例１と併せて図３に示す。メチオニンを添加していない培地でフラスコ培養した場合、得られる胞子嚢数のばらつきが大きかった（平均値４．８３×１０^８個／ｍｌ、標準偏差２．８４×１０^８個／ｍｌ）。
【００４６】
培地（ａ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、０．５質量％オルプラスＷ３（オルガノ社製）（加水分解率；１０％〜２０％）、０．５質量％トレハロース（和光純薬社製特級）、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．２質量％Ｌ−プロリン（和光純薬社製特級）、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物（和光純薬社製特級）、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物（和光純薬社製特級）、０．０１質量％塩化カルシウム二水和物（和光純薬社製特級）、０．３質量％活性炭素粉末（関東化学社製）／水酸化カリウムにてｐＨを８．２に調整。溶媒には蒸留水を使用。
【００４７】
（実施例１）
（メチオニン添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
前記培地（ａ）に０．２質量％Ｌ−メチオニン（和光純薬社製特級）を加えた培地（ｂ）を調製し、比較例１と同様の操作を行った。
結果を比較例１と併せて図３に示す。メチオニンを添加した培地でフラスコ培養した場合、得られる胞子嚢数のばらつきが小さく（平均値７．０４×１０^８個／ｍｌ、標準偏差０．７３×１０^８個／ｍｌ）、安定した胞子嚢生産が可能となることが判明した。
比較例１と実施例１との比較より、フラスコ培養により得られる胞子嚢数の標準偏差は、メチオニンを添加した培地の方が、無添加の培地の約1/3であることわかる。このことから本発明の培地は新たな培地成分のスクリーニングにあたっては、約３倍の検知能力があることが分かる。
【００４８】
（実施例２）
（メチオニン添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
３００ｍｌ三角フラスコに下記培地（ｃ）１００ｍｌを入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約５×１０^８個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液２０μlを前記培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍにて７日間振盪培養した。培養終了後、顕微鏡観察により胞子嚢数を計測した。結果を実施例１の培地（ｂ）で得られた胞子嚢数平均値と共に表２に示す。
【００４９】
【表２】
（表２）

【００５０】
培地（ｃ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス、０．５質量％ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）（加水分解率３６％）、０．５質量％トレハロース、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム、０．２質量％Ｌ−プロリン、０．２質量％Ｌ−メチオニン、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物、０．０１質量％塩化カルシウム二水和物、０．３質量％活性炭素粉末／水酸化カリウムにてｐＨを８．２に調整。溶媒には蒸留水を使用。
【００５１】
フラスコ培養においては、ラクトアルブミン分解物として加水分解率が１０％〜２０％であるオルプラスＷ３を用いた培地（ｂ）の方が、高い胞子嚢生産性が得られた。
【００５２】
（実施例３）
（メチオニン添加／発酵槽培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ、マメ、ヒメ、サクラ／活性炭）
下記培地（ｄ）を１Ｌ作成した。これを、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約１×１０^９個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液を全量発酵槽に接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
バチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラについても同様の操作を行った。
各菌株における胞子嚢生産性を表３に示す。いずれも１．２×１０^９個／ｍｌ以上の胞子嚢、及び３０％以上の胞子嚢化率が得られ、高い生産性が認められた。
【００５３】
培地（ｄ）：０．２質量％Ｌ−メチオニン、０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス、１．０質量％ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）、０．５質量％トレハロース、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム、０．５質量％Ｌ−プロリン、０．０５質量％ピルビン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物、０．０１質量％塩化カルシウム二水和物、０．３質量％活性炭素粉末、０．１質量％消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）／水酸化カリウムにてｐＨを７．６に調整。
【００５４】
【表３】
（表３）

【００５５】
（実施例４）
（メチオニン添加／発酵槽培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ／吸着樹脂）
実施例３の培地（ｄ）の活性炭素粉末の代わりに０．５質量％の吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ８２５（三菱化学社製）を用いた培地（ｄ’）を１Ｌ作成した。これを、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約１×１０^９個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。該胞子嚢液を全量培地（ｄ’）の発酵槽に接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
培地（ｄ’）における胞子嚢生産性を表４に示す。２．１×１０^９個／ｍｌの胞子嚢、及び４８％以上の胞子嚢化率が得られ、高い生産性が認められた。
【００５６】
【表４】

（表４）
【００５７】
（試験例１）
（殺虫活性試験）
本発明の製造方法により得られた胞子嚢によるコガネムシ科昆虫の幼虫の防除効果試験を行った。
実施例３の培地（ｄ）を用いた培養で取得したバチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を蒸留水に２×１０^８個／ｍｌとなるよう懸濁させた。腐葉土を約１５ｇずつ入れた直径６ｃｍのプラスチックカップ２０個に胞子嚢懸濁液を１ｍｌずつ散布し、よく混和した。各カップにドウガネブイブイ２令幼虫を１頭ずつ入れ、２５℃のインキュベーター内で３０日間飼育し、幼虫の死亡率を計測した。
同様の操作をバチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラについても行った。また、対照試験区では胞子嚢懸濁液の代わりに水を用いた。
表５に示した結果から明らかなように、本発明の方法により製造された胞子嚢はいずれの菌株においてもコガネムシ科昆虫の幼虫に対し優れた防除効果を有することが確認された。
【００５８】
【表５】
（表５）

【００５９】
【発明の効果】
本発明により、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢をフラスコ培養や固体（平板）培養でも安定的に製造可能な方法、及び該方法を利用した有効な培地成分のスクリーニング方法を提供できる。また、該胞子嚢を工業レベルの高い生産性で製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バチルス・ポピリエに属する菌の生活環を示した図である。
【図２】胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の模式図である。
【図３】フラスコ培養における胞子嚢生産性（平均値±標準偏差）を示した図である。
【符号の説明】
１胞子嚢
２パラスポラルボディ
３胞子
４栄養細胞[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a spore sac (hereinafter simply referred to as a spore) comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus poppyae and a parasporal body useful for controlling larvae of Scarabaeidae insects by culturing a bacterium belonging to Bacillus popilli in a medium. The present invention relates to a method for producing a sac), and a method for screening a medium component effective for producing the spore sac.
[0002]
[Prior art]
(Damage caused by scarab beetle larvae and use as a control agent for bacteria belonging to Bacillus popilie)
It is known that larvae of Scarabaeidae feed on the roots of a wide range of plants such as turf, agricultural and horticultural crops and trees and cause great damage. Since these larvae of Scarabaeidae live in the ground, chemical pesticides sprayed from the ground are difficult to obtain control effects, and it is difficult to specify the larvae's place of habitation. For this reason, it is necessary to disperse a large amount of agricultural chemicals in a wide area and to infiltrate the agricultural chemicals in the ground, and there is a concern about adverse effects on the natural environment and the human body.
It is known that bacteria belonging to Bacillus popilie orally infect the larvae of Scarabaeidae, cause emulsification disease and eventually cause them to die. For this reason, attempts have been made for a long time to utilize the spores of the fungus for controlling insects of the family Scarabaeidae, which are difficult to treat with chemical pesticides.
[0003]
(Difficult productivity of sporangia of bacteria belonging to Bacillus popilie)
As a method for producing a spore sac of a bacterium belonging to Bacillus popilie, for example, a method using a larva of a scarab beetle that is a parasitic host has been conventionally known. In other words, larvae are bred in mulch containing spores and ingested orally, or they are propagated in the larvae by directly injecting them into the larvae, and then the larvae are incised or crushed. This is a method for recovering sporangia from the body fluid obtained. However, in this method, it is necessary to rear a large number of larvae of the beetles, and industrial production is practically difficult from the viewpoint of equipment, personnel, cost, and the like. Therefore, many studies have been made on artificial culture methods suitable for industrial production and not requiring the larvae of Scarabaeidae.
[0004]
By the way, as shown in the life cycle of FIG. 1, first, a dormant spore spore germinates and changes to an active vegetative cell. Next, it grows by increasing its number by repeating the division cycle. Eventually, the vegetative cells turn into sporangia again and return to dormancy. At this time, the higher the percentage of vegetative cells that shift to the spore formation cycle, the more spores that can be produced. Therefore, in order to achieve high production of sporangia, it is necessary to achieve both sufficient growth of vegetative cells and high sporangia formation rate. However, in reality, even when trying to culture bacteria belonging to Bacillus popilie in a medium used for other microorganisms, it is difficult to grow vegetative cells. It was extremely difficult to cause a complete death and reach sporulation.
[0005]
(Conventional spore manufacturing technology)
Nevertheless, some techniques have been developed that enable the production of sporangia by using selected strains or by devising medium components.
For example, it is known that spores are obtained by artificial culture using selected strains such as NRRL B-2309S and NRRL B-2309M among bacteria belonging to Bacillus popilie. However, its productivity was low. In the former, there is no description of the control effect on the larvae of Scarabaeidae by oral administration, and it is unknown. It has been clarified that the latter has no effect by oral administration (for example, see Non-Patent Document 1). On the other hand, by adding glutamic acid or the like to the medium, the spore sac is 5 × 10 5 per ml of the medium. ⁷ ~ 1x10 ⁹ A technique is also disclosed in which a single piece is obtained and has a control effect (see, for example, Patent Document 1). However, productivity was not always satisfactory from the viewpoint of manufacturing sporangia at an industrial level.
[0006]
(Conventional medium component screening technology)
In order to make it possible to produce sporangia at an industrial level, it is indispensable to cultivate a bacterium belonging to Bacillus popilie, in particular, to examine the composition of the medium, that is, to screen for effective medium components. As a method of screening for medium components, for example, a basic medium having a specific composition is prepared, various medium components to be examined are added at various concentrations, and these are inoculated with bacteria belonging to Bacillus popilie. After culturing, there is a method for evaluating the improvement of spore production with respect to the basic medium. The subject of screening is not necessarily limited to the addition of a single medium component, but a combination of a plurality of components and further a combination of respective concentrations can be considered, resulting in an enormous number of test points. Therefore, screening is preferably performed by flask culture or solid (plate) culture. This is because culturing using a fermenter is advantageous for high production of sporangia and easy to evaluate, but is a large-scale device and inefficient as a screening method. However, flask culture or solid (plate) culture of bacteria belonging to Bacillus popilis using a conventionally known medium may give a relatively high spore productivity but is not necessarily reproducible. There was a problem that the value fluctuated greatly. For these reasons, a conventionally known medium is not suitable as a basic medium for screening for medium components effective for the production of sporangia of bacteria belonging to Bacillus popilie, and no suitable screening method has existed so far. Thus, a stable (highly reproducible) spore sac production is possible, and a medium with a relatively high productivity and a screening method using the medium have been desired to facilitate detection and evaluation.
[0007]
(Free methionine content in conventional media)
Conventionally, there has been no example of adding 0.1 to 1% by mass of free methionine to the culture medium as a measure for stabilizing the sporangia productivity. However, since free methionine is also contained in a small amount in peptone, yeast extract and lactalbumin degradation products often used as a medium component, it was sometimes unintentionally included in the medium as a result. However, even in such a case, the content was very low, much lower than 0.1% by mass.
[0008]
[Patent Document 1]
JP 2002-355030 A
[Non-Patent Document 1]
ES Sharpe, Grant St. Julian, and Clarence Crowell, “Applied Microbiology”, 1970, Vol. 19, p. 681-688
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to cultivate a spore sac of a bacterium belonging to Bacillus popilie, which contains a spore and a parasporal body, and exhibits an excellent control effect against the larvae of Scarabaeidae, in a flask culture or solid (flat plate). ) To provide a method that can be stably produced even in culture, a method for screening effective medium components using the method, and a method for producing the sporangia with high industrial productivity.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have cultivated bacteria belonging to Bacillus popilie using a medium containing 0.1 to 1% by mass of free methionine, thereby producing sporangia. In order to complete the present invention, it has been found that stable production of can be performed in flask culture or solid (plate) culture and can be used as a basic culture medium for screening, and that spore sac can be stably produced at a high level by culturing in the culture medium. It came.
[0011]
That is, the present invention is a method for producing a spore including a spore and a parasporal body by culturing a bacterium belonging to Bacillus popilie in a medium, the medium containing 0.1 to 1% by mass of free methionine And a method for producing a spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie and a parasporal body.
[0012]
The present invention also relates to a method for screening a medium component effective for the production of a spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie and a parasporal body, comprising 0.1 to 1% by mass of free methionine. Provided is a method for screening a medium component effective for producing a spore sac containing a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie and a parasporal body, characterized in that the medium containing is a basic medium.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Bacteria belonging to Bacillus popilie to be used)
According to Non-Patent Document 2, the bacteriological properties of bacteria belonging to Bacillus popillie used in the present invention are 1.3 to 5.2 μm in length and 0.5 to 0.8 μm in width. It is a Gram-negative bacilli, has a growth temperature of 20 to 35 ° C., and has spores and parasporal bodies in the spore as shown in the schematic diagram of FIG. However, the theory of Patterson et al. (Non-Patent Document 3) that Bacillus popilie should be reclassified as Paenibacillus popilliae has been presented, and the classification treatment is not clear at this stage. In the present invention, the bacterium belonging to Bacillus popilli also includes the bacterium belonging to Paenibacillus popilli.
[0014]
(Non-patent document 2): RE Buchanan, NE Gibbons, “BERGEY'S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY”, 1974, 8th edition
[0015]
(Non-Patent Document 3): Bertil Pettersson, Karen E. Rippere, Allan A. Yousten, Fergus G. Priest, “International Journal of Systematic Bacteriology (International Journal) of Systematic Bacteriology), 1999, vol. 49, p. 531-540
[0016]
Examples of strains belonging to Bacillus popilie used in the present invention include Bacillus popilie Semara, FERM BP-8068, Bacillus popili pear pea (Bacillus popilie p. -8069), Bacillus popillie var. Popliae Hime, FERM P-17660, Bacillus popliae chille P Duky, TCC No.14706), Bacillus popilliae-Meroronsa (Bacillus popilliae subsp. Melolonthae), and the like.
[0017]
Bacillus popilie sedara was deposited on May 21, 1998 at the Biotechnology Institute of Industrial Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center) under the accession number FERM P-16818. It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on May 21, 2002, and the accession number FERM BP-8068 was assigned. Bacillus popilie mame was deposited on November 25, 1999 at the Biotechnology Institute of Industrial Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center) under the accession number FERM P-17661. It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on June 10, 2002, and the accession number FERM BP-8069 was assigned.
[0018]
(Free methionine)
The medium used in the present invention is not particularly limited except that it contains free methionine, and a known medium for culturing microorganisms can be used. The concentration of free methionine in the medium is preferably adjusted to be 0.1 to 1% by mass. The free methionine may be supplied by a commonly used medium component such as peptone, yeast extract or lactalbumin degradation product, but its concentration is as low as around 0.03% by mass, and it is insufficient. It is preferable to compensate for this by adding 0.07 to 0.97% by mass.
[0019]
(Peptone, yeast extract)
The medium used in the present invention preferably contains peptone or yeast extract.
The peptone is not particularly limited as long as it is used for normal microorganism culture, but “Polypeptone S” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), “Polypepton Y” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), “Peptone for bacteria” (OXOID) And soy peptone (manufactured by OXOID), “trypton” (manufactured by Difco), and the like. Of these, polyseptone S and polypeptone Y are preferred because of their high effect of promoting spore formation. The concentration added to the medium is preferably 0.001 to 5% by mass, and particularly preferably 0.1 to 1% by mass.
[0020]
Examples of the yeast extract include “yeast extract” manufactured by OXOID or Difco. The concentration added to the medium is preferably 0.001 to 5% by mass, and particularly preferably 0.1 to 1% by mass.
[0021]
(Adsorbent)
The culture medium used in the present invention may contain an adsorbent for the purpose of removing substances that inhibit the growth of bacteria belonging to Bacillus popilie. Examples of the adsorbent include activated carbon, adsorbent resin, allophytosite, molecular sieve, and the like. Activated carbon and an adsorbent resin are preferred because the productivity of sporangia in culture is higher.
The activated carbon used in the present invention may have any shape such as powder, granule or sheet, but it is preferable to use powdered activated carbon having the highest decomposition or adsorption capacity per unit mass.
[0022]
Adsorption resin means a porous polymer that has adsorption ability.For example, it is a crosslinkable porous polymer formed into particles, and it efficiently adsorbs growth inhibitory substances in aqueous solution due to the pore structure reaching the inside of the particles. It is a possible synthetic resin. Specifically, aromatic synthetic resin adsorbents “DIAION HP20”, “DIAION HP21”, “SEPABEADS SP825”, “SEPABEADS SP850”, “SEPABEADS SP70”, “SEPABEADS SP700”, substituted aromatics manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation Examples thereof include a synthetic resin adsorbent “SEPABEADS SP207” and an acrylic synthetic resin adsorbent “DIAION HP2MG”.
[0023]
The content of the adsorbent in the medium used in the present invention is preferably 0.05 to 5% by mass of the medium. If it is 0.05% by mass or more, the effect of adsorbing and removing the fungal growth inhibitory substance is sufficiently exerted, and if it is 5% or less, the adsorption of nutrients necessary for the growth of the fungus is also small. High growth promoting effect.
[0024]
(Proline, glutamic acid)
The medium used in the present invention preferably contains proline. The content of proline in the medium promotes the growth of bacteria and can increase the production number per unit volume of spore sac containing spores and parasporal bodies. Is more preferable, and 0.2 to 0.6 mass% is more preferable. When the content is less than 0.1% by mass and exceeds 0.7% by mass, not only the growth promotion effect of the bacteria is lowered but also the number of spores produced per unit volume of the medium is lowered.
[0025]
The medium used in the present invention may contain glutamic acid and a salt thereof. Examples of glutamic acid and salts thereof include glutamic acid, sodium glutamate, potassium glutamate, ammonium glutamate, glutamic acid hydrochloride, and the like. The density | concentration in these culture media is 0.2-4.0 mass%, and 0.4-1.0 mass% is preferable at the point which exhibits the proliferation of a more outstanding microbe, and a spore sacification rate.
[0026]
(Lactalbumin degradation product)
Although it does not specifically limit as a lactalbumin degradation product used by this invention, For example, "Lactalbumin hydrolyzate" (made by Wako Pure Chemical Industries), "Olplus W1" (made by Organo), "Olplus W3" (made by Organo) "Olplus W5" (manufactured by Organo). However, a degradation product of lactalbumin having a hydrolysis rate of 10% or less has little effect on the growth of bacteria belonging to Bacillus popilie, and if a hydrolysis rate of 20% or more is used, flask culture or solid (plate) In culture, the spore formation rate is low and productivity is reduced. Therefore, by using a lactalbumin degradation product having a hydrolysis rate of 10 to 20%, which can obtain a relatively high spore productivity, as a basic medium in medium culture screening in flask culture or solid (plate) culture. It is preferable to facilitate the productivity study. Examples of those having a hydrolysis rate of 10 to 20% include “Olplus W3” (manufactured by Organo) and “Olplus W5” (manufactured by Organo). On the other hand, “Lactalbumin hydrolyzate” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is preferable because the effect of promoting the formation of sporangia is high in culture in a fermenter. The concentration added to these media is preferably 0.001 to 5 mass%, particularly preferably 0.1 to 1.5 mass%.
[0027]
(Trehalose, pyruvic acid)
Trehalose used in the present invention is preferably added in an amount of 0.001 to 5% by mass with respect to the medium because an excellent effect of promoting the growth of bacteria can be obtained.
Examples of pyruvic acid and salts thereof include pyruvic acid, sodium pyruvate, and potassium pyruvate. In order to promote the growth of bacteria and increase the number of sporangia produced, the concentration of pyruvic acid and its salt added to the medium is preferably 0.001 to 0.5% by mass, and 0.01 to 0.3% by mass More preferably.
[0028]
(Magnesium, manganese, calcium)
The medium used in the present invention preferably contains magnesium, manganese, and calcium. Since it strongly promotes the growth and spore formation of bacteria belonging to Bacillus popilie, the concentration of the metal in the medium is adjusted to 50 to 100 ppm for magnesium, 10 to 40 ppm for manganese, and 50 to 100 ppm for calcium. It is preferable. These may be supplied by commonly used medium components such as peptone, yeast extract or lactalbumin degradation products, but the concentration is low and insufficient, so it is necessary to supplement this by adding a separate metal compound. is there.
[0029]
The compounds for supplying magnesium include magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium hydroxide, magnesium carbonate, magnesium citrate, magnesium lactate, magnesium oxalate, magnesium nitrate, magnesium phosphate, and hydrates thereof. Is exemplified. Magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium acetate and their hydrates, magnesium hydroxide are preferred, and magnesium sulfate and magnesium chloride are more preferred because of the excellent growth and spore formation promoting effect of bacteria belonging to Bacillus popilie . Although the concentration added to the medium varies depending on the medium composition, it is preferably 0.5 to 4.11 mM in order to correspond to the aforementioned concentration range.
[0030]
Examples of the compound for supplying manganese include manganese sulfate, manganese chloride, manganese acetate, manganese carbonate, manganese oxalate, manganese nitrate, manganese phosphate, and hydrates thereof. Manganese sulfate, manganese chloride, manganese acetate, and hydrates thereof are preferred, and manganese sulfate and manganese chloride are more preferred because of the excellent growth and spore formation promoting effect of bacteria belonging to Bacillus popilie. The concentration added to the medium varies depending on the medium composition, but is preferably 0.1 to 0.73 mM in order to correspond to the aforementioned concentration range.
[0031]
Examples of the compound for supplying calcium include calcium chloride, calcium acetate, calcium carbonate, calcium hydroxide, calcium citrate, calcium nitrate, and hydrates thereof. Calcium chloride, calcium acetate and their hydrates, calcium carbonate, and calcium hydroxide are preferred, and calcium chloride is more preferred because of the excellent growth and spore formation promoting effect of bacteria belonging to Bacillus popilie. The concentration added to the medium varies depending on the medium composition, but is preferably 0.1 to 1.05 mM in order to correspond to the aforementioned concentration range.
[0032]
From the above, it is preferable that the medium used in the present invention contains peptone, yeast extract and adsorbent. Further, containing at least one selected from the group consisting of glutamic acid and its salt, and proline, and (1) lactalbumin degradation product, (2) trehalose, (3) pyruvic acid and its salt, (4) magnesium, It is preferable that at least one selected from the group consisting of manganese, calcium and a compound containing these is included.
[0033]
(Liquid medium, solid medium)
The medium used in the production method of the present invention may be a liquid medium or a solid (flat plate) medium, but a liquid medium is preferred from the viewpoint of spore production and operability. In the case of a solid medium, a polysaccharide such as agar may be added to the medium composition. The added concentration is 0.5 to 5% by mass, and preferably 1 to 3% by mass because it exhibits excellent bacterial growth. The culture in the liquid medium may be performed by any method such as batch culture using a flask or a fermenter, continuous culture, semi-batch culture, or fed-batch culture.
[0034]
(Culture conditions)
The culture temperature suitable for the growth of bacteria belonging to Bacillus popilie used in the present invention is 25 to 32 ° C. The pH of the medium is preferably 6.5 to 9.0, more preferably 7.5 to 8.5 in the case of flask (liquid) culture and solid culture, and 7 in the case of culture using a fermenter. 0.0 to 8.0 is more preferable. More preferably, the pH of the medium is always controlled to 7.0 to 8.0 during the culture in the fermenter. For pH adjustment, various commonly used acids such as various buffers, hydrochloric acid or sulfuric acid, or commonly used alkali such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia can be used. The aeration amount is preferably adjusted to 0.1 to 2 vvm (volume / volume / minute), and more preferably 0.5 to 1.5 vvm because excellent bacterial growth and sporangia productivity can be obtained. . In order to perform culture under these most preferable conditions, liquid culture, particularly liquid culture using a fermenter is suitable.
[0035]
As bacterial cells to be inoculated into the medium, sporangia of bacteria belonging to Bacillus popilie are used. If the amount of cells to be inoculated is too small, it is difficult to increase the production amount per unit medium. Conversely, even if the inoculation amount is increased, the production amount does not increase in proportion to the inoculation amount, and the production amount is saturated. End up. For this reason, the inoculation amount is 1 x 10 per ml of medium. ² ~ 1x10 ⁸ Preferably 1 × 10 ³ ~ 1x10 ⁷ Inoculation of individual sporangia is particularly preferred.
The culturing time varies depending on the culturing method, culturing temperature, culturing pH or the amount of inoculated cells, but is usually 5 to 10 days in the case of batch liquid culture.
[0036]
(Productivity and recovery of sporangia)
A method for recovering spores and spores containing parasporal bodies from the culture after completion of liquid culture is performed by separating and recovering cells containing the spores from the culture solution by a general separation method such as centrifugation or filtration. do it. At this time, a washing operation using water or a buffer solution may be added as necessary. In the case of solid (plate) culture, the cells grown on the surface of the medium are suspended with water or the like, and the subsequent operation may be performed in the same manner as in liquid culture.
[0037]
According to the production method of the present invention, it is possible to stably produce a spore sac belonging to Bacillus popilie comprising spores and parasporal bodies even in flask culture or solid (plate) culture, Screening of medium components as a medium becomes possible. Further, according to the production method of the present invention, the number of sporangia can be produced at a ratio of 30 to 60% with respect to the number of bacteria, and the number of sporangia is 1.2 × 10 2 per 1 ml of culture solution. ⁹ Pieces-2.5 x 10 ⁹ It can be manufactured at a rate of 1.2 billion to 2.5 billion.
[0038]
(Control beetle larvae)
A spore sac of a bacterium belonging to Bacillus popilie comprising a spore obtained by the production method of the present invention and a parasporal body exhibits a control effect such as insecticidal activity or growth inhibition on a larvae of a scarab beetle, Useful as a control agent.
The Scarabaeidae insect control target, cupreous chafer (Anomala cuprea), Semadarakogane (Blitopertha orientalis), Japanese beetle (Popillia japonica), Usuchakogane (Phyllopertha diversa), Chairokogane (Adoretus tenuimaculatus), rufocuprea (Anomala rufocuprea), Chibi Sakura Tsurukogane ( Larvae such as Anomala schoenfeldi).
[0039]
(Spore sac preparation of bacteria belonging to Bacillus popilie and method of use thereof)
The spore sac containing the spore and parasporal body produced by the production method of the present invention may be used as a control insect for a scarab beetle in a liquid in which they are suspended, or may be dried and sprayed to form a powder. May be. Further, the dried powder may be made into a suspension with water or a buffer solution and sprayed on the soil. However, it is usually preferable to formulate the spore sac together with conventional additives used for agrochemicals by a conventional method for producing microbial pesticides and apply it as a control agent for scarab beetles. Moreover, it is also possible to use a spore sac containing a spore obtained by the production method of the present invention and a parasporal body by mixing it with another microbial preparation. The content of the spore sac containing the spore and parasporal body contained in the control agent is not particularly limited as long as it is in a range showing a control effect on the scarab beetle, but for example, hydration at the time of application 1 × 10 spores per liter of control agent ⁹ ~ 1x10 ¹³ It is preferable to prepare to be about 1 piece, and in the case of powders and granules, 1 x 10 per gram of the control agent ⁸ ~ 1x10 ¹² It is preferable to prepare so as to be about one.
[0040]
The application method of the control agent is appropriately selected depending on the dosage form, the target crop, etc., for example, surface liquid spraying, ground solid spraying, air liquid spraying, air solid spraying, in-facility application, soil mixing application or soil irrigation application, etc. A method can be mentioned. In addition, other chemicals such as insecticides, nematicides, acaricides, herbicides, fungicides, plant growth regulators, fertilizers or soil improvement materials (peat, humic acid materials or polyvinyl alcohol materials, etc.) They can be mixed and applied, or alternately or simultaneously without mixing.
The amount of the control agent to be applied varies depending on the species of Scarabaeidae, the type of plant to be applied, the dosage form, etc., but for example, when sprayed on the ground, the spores of the present invention and the parasporal body are added. The application rate of sporangia is 10 per are ¹⁰ -10 ¹⁵ 10 pieces, preferably 1 are ¹¹ -10 ¹⁴ What is necessary is just to make it about.
[0041]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0042]
(Reference Example 1)
(Measurement of free methionine contained in each medium component)
The content of free methionine contained in a medium component often used for culturing bacteria belonging to Bacillus popilie was measured by a post-column method using orthophthalaldehyde (OPA).
As a standard sample, an amino acid mixed standard solution H type (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., containing 2.5 mmol / l of each amino acid) was used. The measured samples were “Polypeptone S” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), “Polypeptone Y” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), “Tripton” (manufactured by Difco), yeast extract (manufactured by OXOID), yeast extract (manufactured by Difco). ), Lactalbumin hydrolyzate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The amino acid automatic analyzer “LaChrom” manufactured by Hitachi, Ltd. was used for the analysis.
The content of methionine contained in each measurement sample was calculated from the peak area obtained from the standard sample and each measurement sample, and shown in Table 1.
[0043]
[Table 1]
(Table 1)

[0044]
From the above analysis values, a medium composition suitable for culturing bacteria belonging to Bacillus popilie (for example, 0.75 mass% polypeptone S, 0.75 mass% yeast extract (OXOID), 1.0 mass% lactalbumin hydrolyzate, 0.5 mass% trehalose, 0.64 mass% sodium glutamate, 0.5 mass% L-proline, 0.05 mass% sodium pyruvate, 0.05 mass% magnesium sulfate heptahydrate, 0.05 mass% The amount of methionine contained in manganese sulfate pentahydrate (0.01% by mass, 0.3% by mass activated carbon powder) is calculated to be about 0.03% by mass, and the lower limit of the present invention is 0.1% by mass. Turned out to be much lower.
[0045]
(Comparative Example 1)
(No methionine added / Flask culture / Bacillus popilie sedara)
100 ml of the following medium (a) was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask, sealed with an air-permeable stopper, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
Bacillus popilie sedara sporangia approximately 5 x 10 ⁸ The pieces were suspended in 1 ml of distilled water, placed in a plastic tube, and heat-treated at 70 ° C. for 20 minutes with a heat block. 20 μl of this spore sac solution was inoculated into the above medium and cultured with shaking at 30 ° C. and 100 rpm for 7 days. After completion of the culture, the number of spore capsules was measured by microscopic observation. The same test was performed 20 times, and the average value and standard deviation of the number of spore capsules were obtained. The results are shown in FIG. When the flask culture was performed in a medium to which methionine was not added, the number of sporangia obtained was large (average value 4.83 × 10 6 ⁸ Piece / ml, standard deviation 2.84 × 10 ⁸ / Ml).
[0046]
Medium (a): 0.75 mass% polypeptone S (manufactured by Nippon Pharmaceutical), 0.75 mass% yeast extract (manufactured by OXOID), 0.5 mass% Olplus W3 (manufactured by Organo) (hydrolysis rate: 10 % To 20%), 0.5 mass% trehalose (special grade manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.64 mass% sodium glutamate (special grade manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.2 mass% L-proline (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Made by special grade), 0.05 mass% magnesium sulfate heptahydrate (special grade by Wako Pure Chemical Industries), 0.05 mass% manganese sulfate pentahydrate (special grade by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.01 mass% chloride The pH was adjusted to 8.2 with calcium dihydrate (special grade manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.3% by mass activated carbon powder (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) / Potassium hydroxide. Distilled water is used as the solvent.
[0047]
Example 1
(Methionine addition / flask culture / Bacillus popilie sedara)
A medium (b) in which 0.2% by mass L-methionine (special grade manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the medium (a) was prepared, and the same operation as in Comparative Example 1 was performed.
The results are shown in FIG. When the flask culture is performed in a medium containing methionine, the variation in the number of sporangia obtained is small (average value 7.04 × 10 6 ⁸ Piece / ml, standard deviation 0.73 × 10 ⁸ It has been found that stable sporangia production is possible.
From the comparison between Comparative Example 1 and Example 1, it can be seen that the standard deviation of the number of spore capsules obtained by flask culture is about 1/3 that of the medium with no methionine added. From this, it can be seen that the culture medium of the present invention has about three times the detection capability in screening for new medium components.
[0048]
(Example 2)
(Methionine addition / flask culture / Bacillus popilie sedara)
A 300 ml Erlenmeyer flask was charged with 100 ml of the following medium (c), sealed with an air-permeable stopper and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
Bacillus popilie sedara sporangia approximately 5 x 10 ⁸ The pieces were suspended in 1 ml of distilled water, placed in a plastic tube, and heat-treated at 70 ° C. for 20 minutes with a heat block. 20 μl of this spore sac solution was inoculated into the above medium and cultured with shaking at 30 ° C. and 100 rpm for 7 days. After completion of the culture, the number of spore capsules was measured by microscopic observation. The results are shown in Table 2 together with the average number of spore capsules obtained from the medium (b) of Example 1.
[0049]
[Table 2]
(Table 2)

[0050]
Medium (c): 0.75 mass% polypeptone S, 0.75 mass% yeast extract, 0.5 mass% lactalbumin hydrolyzate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (hydrolysis rate 36%), 0.5 mass% Trehalose, 0.64 mass% sodium glutamate, 0.2 mass% L-proline, 0.2 mass% L-methionine, 0.05 mass% magnesium sulfate heptahydrate, 0.05 mass% manganese sulfate pentahydrate , 0.01 mass% calcium chloride dihydrate, 0.3 mass% activated carbon powder / potassium hydroxide to adjust pH to 8.2. Distilled water is used as the solvent.
[0051]
In the flask culture, a higher spore productivity was obtained in the medium (b) using Olplus W3 having a hydrolysis rate of 10% to 20% as a lactalbumin degradation product.
[0052]
(Example 3)
(Addition of methionine / fermentor culture / Bacillus popilie sedara, bean, bean, cherry / activated carbon)
1 L of the following medium (d) was prepared. This was transferred to a fermentor (manufactured by Maruhishi Bio-Engine) equipped with a pH electrode, and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 60 minutes. Bacillus popilie sedara sporangia approximately 1 x 10 ⁹ The pieces were suspended in 1 ml of distilled water, placed in a plastic tube, and heat-treated at 70 ° C. for 20 minutes with a heat block. The entire amount of this spore solution was inoculated into a fermentor and cultured for 7 days under the conditions of stirring 150 rpm, aeration 1 vvm, 30 ° C., pH 7.6.
The same operation was performed for Bacillus popilie bean, Bacillus popilie hime and Bacillus popilie cherry.
Table 3 shows the spore productivity of each strain. Both are 1.2 × 10 ⁹ High spore sac and more than 30% spore sac were obtained, and high productivity was recognized.
[0053]
Medium (d): 0.2 mass% L-methionine, 0.75 mass% polypeptone S, 0.75 mass% yeast extract, 1.0 mass% lactalbumin hydrolyzate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.5 Mass% trehalose, 0.64 mass% sodium glutamate, 0.5 mass% L-proline, 0.05 mass% sodium pyruvate (special grade manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.05 mass% magnesium sulfate heptahydrate, 0.05% by weight manganese sulfate pentahydrate, 0.01% by weight calcium chloride dihydrate, 0.3% by weight activated carbon powder, 0.1% by weight antifoaming agent (“Dishome CA” manufactured by NOF Corporation) -123 ") / pH adjusted to 7.6 with potassium hydroxide.
[0054]
[Table 3]
(Table 3)

[0055]
(Example 4)
(Addition of methionine / fermentor culture / Bacillus, Popilie, Cemadara / Adsorption resin)
1 L of a culture medium (d ′) using 0.5 mass% of the adsorption resin SEPABEADS SP825 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) instead of the activated carbon powder of the culture medium (d) of Example 3 was prepared. This was transferred to a fermentor (manufactured by Maruhishi Bio-Engine) equipped with a pH electrode, and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 60 minutes.
Bacillus popilie sedara sporangia approximately 1 x 10 ⁹ The pieces were suspended in 1 ml of distilled water, placed in a plastic tube, and heat-treated at 70 ° C. for 20 minutes with a heat block. The spore solution was inoculated into a fermenter of the whole medium (d ′) and cultured for 7 days under the conditions of stirring 150 rpm, aeration 1 vvm, 30 ° C., pH 7.6.
Table 4 shows the productivity of sporangia in the medium (d ′). 2.1 × 10 ⁹ Individual / ml spore sac and a spore sacification rate of 48% or more were obtained, and high productivity was observed.
[0056]
[Table 4]

(Table 4)
[0057]
(Test Example 1)
(Insecticidal activity test)
The control effect test of the larvae of Scarabaeidae was carried out with the spore sac obtained by the production method of the present invention.
The spores of Bacillus popilie sedara obtained by culture using the medium (d) of Example 3 were placed in distilled water at 2 × 10 ⁸ The suspension was suspended to a unit / ml. 1 ml of the spore sac suspension was sprayed onto 20 plastic cups each having a diameter of 15 cm each containing about 15 g of humus and mixed well. One cup of the 2nd instar larvae was put in each cup and reared in an incubator at 25 ° C. for 30 days, and the mortality of the larvae was measured.
The same operation was performed for Bacillus popilie bean, Bacillus popilie hime, Bacillus popilie cherry. In the control test group, water was used instead of the spore suspension.
As is apparent from the results shown in Table 5, it was confirmed that the spore sac produced by the method of the present invention has an excellent control effect against the larvae of Scarabaeidae in any strain.
[0058]
[Table 5]
(Table 5)

[0059]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a method capable of stably producing a spore sac of a bacterium belonging to Bacillus popilie containing spores and parasporal bodies even in flask culture or solid (plate) culture, and an effective medium component using the method Screening methods can be provided. Moreover, the method of manufacturing this spore sac with high productivity of an industrial level can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a life cycle of a bacterium belonging to Bacillus popilie.
FIG. 2 is a schematic view of a spore sac including spores and parasporal bodies.
FIG. 3 is a graph showing spore productivity (average value ± standard deviation) in flask culture.
[Explanation of symbols]
1 Spore sac
2 Parasporal body
3 Spores
4 vegetative cells

Claims

A method for producing a spore sac containing a spore and a parasporal body by culturing a bacterium belonging to Bacillus popilie in a medium, wherein the medium contains 0.1 to 1% by mass of free methionine. A method for producing a spore including a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie and a parasporal body.

The method for producing a spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus poppylier and a parasporal body according to claim 1, wherein the medium contains peptone, a yeast extract and an adsorbent.

The method for producing a spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus poppyae and a parasporal body according to claim 2, wherein the medium contains at least one selected from the group consisting of glutamic acid and a salt thereof, and proline.

The medium contains at least one selected from the group consisting of (1) lactalbumin degradation product, (2) trehalose, (3) pyruvic acid and its salt, (4) magnesium, manganese, calcium and compounds containing these. A method for producing a spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie according to claim 2 or 3 and a parasporal body.

A method for screening a medium component effective in the production of a spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie and a parasporal body, wherein the medium according to any one of claims 1 to 4 is used as a basic medium A screening method for a medium component effective for producing a spore including a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilie and a parasporal body.

6. A spore sac comprising a spore of a bacterium belonging to Bacillus popilli and a parasporal body according to claim 5, wherein the basal medium contains 0.1 to 1% by mass of a hydrolysed lactalbumin having a hydrolysis rate of 10% to 20%. For screening medium components effective for the production of